JPS63276494A - Ｌｆａ−３の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＴ　ＩＪンパ球反応に関するものである。

抗原特異的’ｌ’　リンパ球媒介細胞溶解反応（ｋｉｌ
ｌｉｎｇ）は、細胞溶解性１９７８球（ｃｙｔｏｌｙｔ
　ｉＣＴ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、　ＣＴ　Ｌ　）によ
る抗原認識、ＣＴＬの標的細胞への接着、致死的な打撃
を与えること、および標的細胞の溶解から成る多段階過
程である。

関与していない細胞およびＣ’ｒＬ自身は細胞溶解反応
中に悪影響をうけず、ＣＴＬは分離してさらなる細胞溶
解反応に関与することができる。多数の動因に対する免
疫反応の開始に重要な、ヘルパーＴ細胞の抗原に対する
反応も、抗原を表出している細胞へのＴ　１７２８球の
接着に依存している。

ヘルパーＴ　’Ｊンパ球反応はリンパ球の増殖あるいは
ＩＬ−２産生によってアッセイされる。

ＣＴＩｕ媒介細胞溶解反応とヘルパー’ｌ’　ＩＪンパ
球反応の分子的基礎は、ＣＴＬおよびその標的の双方に
対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を調製し、細胞溶
解反応を阻害するものを選択することによって研究され
てきた。

ＬＦＡ−１（ＬＦＡはリンパ球機能関連（ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｔｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　
）を意味する）、ＣＤ２（また、ＬＦ’Ａ−２、Ｔｌｌ
、めるいＨＥロゼツトレセプターとも呼ばれる）、およ
びＬＦＡ−３抗原分子は細胞溶解反応を阻害しくサンチ
ェス−マドリッド（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ　）
他、７９　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　７４８９．１９８２）、またヘルパーＴ　ＩＪンパ
球依存反応も阻害する。

ヒ）ＬＦＡ−３はほとんど全てのヒトの細胞上で発現し
ている°細胞前−面糖タンパク質であり、平均分子量は
約６ＱＯＯＯである（同上）。ヒ）　ＬＦ’Ａ−３は特
異的ＭＡｂによって免疫沈降される。

ＬＦＡ−３は標的細胞上および抗原表出系細胞上で見ら
れ、エフェクターＣＴＬによる標的細胞の細胞溶解１あ
るいは、ヘルパーＴ細胞による抗原表出細胞の認識は、
標的細胞あるいは抗原表出細胞に対するＬＦＡ−３ＭＡ
ｂの結合によって阻害される。

特に、単球、顆粒球、ＣＴＬＸ　Ｂリンパ芽球細胞系、
血小板、胸腺上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋、および
繊維芽細胞上にＬＦＡ−３は見られる（クレンスキー（
Ｋｒｅｎｓｋｙ　）他、“ヒト細胞溶解性Ｔ”Ｊンパ球
クローンおよびその機能関連細胞表面分子”　（Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ス
プリンガ−（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　）他編集、プレナム・
プレス、ニューヨーク、１９８５））。

第一の態様として、本発明は、ＬＦＡ−３を含む液を抗
ＬＦＡ−３抗体を含むアフィニティーカラムと接触させ
てＬＦＡ−３をＬＦＡ−３抗体に結合させ、次に酸性緩
衝液を用いてアフィニティーカラムからＬＦＡ−３を溶
出させることから成るＬＦ’Ａ−３の精製法に関するも
のである。

望ましい態様において、本方法はさらに、ＬＦＡ−３以
外の非特異的に結合するタンパク質を除去するために上
記液をアフィニティーカラムと接触させる前にＬＦＡ−
３を含む溶液を無関係な抗体を含むカラムを通過させる
こと；溶出段階に先立ち、非ＬＦＡ−３タンパク質は除
去されるがＬＦＡ−３は保持されるようなｐＨの緩衝液
、望ましくはｐＨが１０と１１の間である緩衝液でアフ
ィニティーカラムを洗浄すること；酸性緩衝液のｐＨが
望ましくは２．５と４．０の間であること；　ＬＦＡ−
３が哺乳動物の赤血球、単球、顆粒球、ＣＴＬ、ＢＩＪ
ンパ芽球細胞系、血小板、血管内皮細胞、平滑筋、ある
いは繊維芽細胞、またはＬＦＡ−３遺伝子を発現してい
る他の細胞から精製されること；抗ＬＦＡ−３抗体がモ
ノクローン性であること：　ＬＦ’Ａ−３を含む液を７
フイニテイカラムに通過させる前に、界面活性剤あるい
は、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣなど
のホスホリパーゼでＬＦＡ−３を可溶化すること：望ま
しくは該界面活性剤が非イオン性であること；および無
関係な抗体がＩｇＧであることを含む。

第２の態様において、本発明は、細胞に対するＬＦＡ−
３の結合を侠出することから成る、ＣＤ−２抗原を有す
る細胞の検出法に関するものである。

第３の態様において、本発明は細胞混合液をＬＦＡ−３
に含有する固体担体と接触させてＣＤ−２を有する細胞
を該担体に結合させることから成る、細胞混合液中の他
の細胞からＣＤ−２抗原を有する細胞全分離する方法に
関するものである。

第４の局面としては、本発明は実質的に純粋な、生物学
的活性を有するＬＦＡ−３に関するものである。

第５の局面においては、ＬＦＡ−３は免疫反応を阻害あ
るいは増大させるための治療用薬剤として剛いられる。

本発明の診断法および治療法は、’ｌ’　ＩＪンパ球接
着におけるＬＦＡ−３の特異的役割はＴ　’Ｊンパ球表
面分子ＣＤ２のためのリガンドとして働くことであると
いう我々の発見から生じるものである。

ＣＤ２は分子ｔ５ＱＯＯＯＭｒの塘タンパク質であり、
全てのＴ　ＩＪンパ球、胸腺細胞、および自然細胞溶解
活性を有する細胞を含む一群の大顆粒リンパ球上で発現
されている。ＣＤ２はＴ　ＩＪンパ球が胸腺に入る前の
分化の早い段階で発現される。

ＭＡｂとＣＤ２の組み合わせにより、１９７８球、胸腺
細胞および自然細胞溶解細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌ
ｅｒ　ｃｅｌｌ　）の増殖および機能を誘導する。

従って、我々はＣＤ２の生物学的リガンドはＬＦＡ−３
であり、同様の効果を有することを提案する。

ＬＦＡ−３およびＣＤ２は、それぞれ標的細胞およびＣ
ＴＬ上の、第１の抗原の組であり、結合するペアとして
同定される。すなわち、該２つの抗原は相互作用して２
つの細胞型の認識全可能にする。上記抗原のいずれかを
Ｍ　Ａ　ｂでしゃ断することにより、この細胞間相互作
用は阻害される。

ＬＦＡ−３の役割に関する我々の発見、およびＬＦＡ−
３を多量に与える我々の新しい精製方法によシ、ＣＴＬ
および細胞表面にＣＤ２分子を有する他の細胞の検出が
可能となシ、また、抗体を使用せずに精製ＬＦＡ−３に
よるＣＤ２分子の特異的しゃ断が可能となる。ＬＦＡ−
３は人体の天然の構成成分であるため、免疫反応を誘導
することなく人体に導入することができる。一方、ヒト
以外の種で産生されるＭＡｂは抗体産生を刺激し、無力
化される。ＬＦＡ−３は広く寄与しており、Ｔリンパ球
接着と再循環、管外移動、および１９７８球の発生にお
いて一般的な役割を果たしている可能性がある。

本発明の他の特徴および利点は以下の望ましい態様の説
明および前述の特許請求の範囲から明らかになるであろ
う。

方法 以下で使用した方法の多くはプルンケット（Ｐｌｕｎｋ
ｅｔｔ　　）他、　　（１３６Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。

４１８１．１９８６）およびサンチェス−マドリッド（
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ　）　（前出）に詳細に
述べられている。

概述すると、本発明によって、ＬＦＡ−３はアフィニテ
ィーカラムの通過によって精製される。我々は、ＬＦＡ
−３はアルカリ性のｐＨでさえ、ＬＦＡ−３に対するモ
ノクローナル抗体と非常に安定な複合体を形成すること
を見出した。これにより、一段階で、生物学的に活性な
ＬＦＡ−３の精製が可能になる。

我々はまた、ヒト赤血球が多量のＬＦＡ−３抗原を含有
し、その精製源として用いられることも発見した。ヒト
赤血球は合理的な費用で容易に入手できる最も豊富な人
体物質源である。新鮮なヒト赤血球は、−細胞あたり約
５，０００のＬＦＡ−３部位を有する。これは、Ｂリン
パ芽球細胞上のＬＦＡ−３分子数（約２０ＱＯＯＯ）よ
りははるかに少ないが、この部位数の概算によると１ユ
ニツトの古い赤血球細胞は約２５０μ？のＬＦＡ−３を
含有する。当然、適当な細胞系が入手可能ならば、赤血
球の場合について以下に述べるのと類似の方法で該細胞
系からＬＦＡ−３を抽出し精製することが可能である。

ＬＦＡ−３は疎水性領域で赤血球膜と結合しており、界
面活性剤を用いて０Ｔ溶化することが必要である。タン
パク質を変性させないため、穏やかな、非変性界面活性
剤（例えば、トリトンＸ−１００）を使用することが望
ましい。もしくは、ＬＦＡ−３は細胞に糖脂質で堅く結
合しているので、界面活性剤を用いずに、ホスファチジ
ルイノシトールホスホリパーゼＣで可溶化することが可
能である。

一般に、赤血球は集めた体積の５０％あるいはそれ以下
の体積の中性のｐＨである緩衝化した界面活性剤あるい
はホスホリパーゼ溶液で、４℃以下、６０分間で溶解さ
せることができる。ＬＦＡ−３の分解を阻害するために
プロテアーゼ阻害剤が用いられる。溶解した赤血球は次
に、不溶物質を除去するために高速で遠心し、上清（ラ
イセード）ヲクロマトグラフイーのために保存しておく
。

アフィニティークロマトグラフィーは、ライセードを不
活性な基質に結合した抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体
から成るアフイニテイ力ラムを約２−２０■抗ＬＦＡ−
３／ｍｌで通過させることによって行なう。ライセード
はまず非特異的に結合する物質を吸着させるために、無
関係な抗体（すなわち、ＬＦＡ−３に結合しないもの）
が結合した不活性な基質を含むカラムを通過させ、次に
抗ＬＦＡ−３ＭＡｂを有するカラムを通過させることが
望ましい。（２ｍｌ　ＭＡ　ｂ／ｍ／てこのカラムはラ
イセード１リツトル中の全てのＬＦＡ−３に結合可能で
ある。）次にカラムを０．１５　Ｍ塩（ＮａＣ１あるい
はＫｃｔ）を含む数倍量の中性緩衝液、および非イオン
性界面活性剤で洗浄する。（界面活性剤は洗浄および溶
出緩衝液で残存することも可能であるが、ＬＦＡ−３の
収量は減少することがある。）一般に、ＬＦＡ−３の精
製および次の溶出のために、カラムをアルカリ性緩衝液
（ｐＨ１０−１１）で洗浄し、次に中和させる。アルカ
リ性洗浄で溶出した物質は、後に回収可能なＬＦＡ−３
を若干含んでいるため、保存し中和させる。アルカリ性
のｐＨでの洗浄はカラムからほとんど全ての混入してい
るタンパク質を除去する。この精製法はアルカリ性ｐＨ
でのＬＦ’Ａ−３−ＭＡｂ複合体の非常な高安定性を基
礎としているので、これは重要な過程である。ＬＦＡ−
３は酸性緩衝液を用い、低流速度でカラムから溶出させ
る。ＬＦＡ−３は約−カラム体積以内で溶出し、直ちに
中和させる。（カラムも中和し、何度も再使用すること
ができる。）画分中のＬＦＡ−３は各両分が少量ずつ結
合したニトロセルロース紙に対する１２５Ｉ抗ＬＦＡ−
３ＭＡｂの結合によって決定される（ドツト・プロット
・アッセイ、プルンケット、前出、１１９）・ウケス（
Ｈａｗｋｅｓ　）他、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　１４２．１９８２）。

以下はＬＦＡ−３の精製法の例である。本分野の技術に
熟達した者は、本発明は本実施例で用いた条件に制限さ
れるものではなく、本発明の本質を変えることなく抗体
、緩衝液、カラムおよび環境的要因は容易に変えられる
ことを確認するであろう。

具 マウス抗ヒトＭＡｂ　　ＴＳ２／９　（抗ＬＦＡ−３、
ＩｇＧ　１　％サンチェスーマドリッド、前出）を精製
ＩｇＧあるいは細胞培養液上清の希釈液として用いた。

略述すると、抗ＬＦＡ−３は、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＨ
ＬＡ−ＤＲＣＴＬ系由来の細胞を注射し、該マウス由来
の震域細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３あるいはＮＩＳ
と融合させ、ＣＴＬによる標的細胞の細胞溶解反応を３
０％以上阻害することを示したハイプリドーマ培養を行
なうことにより調製した。一つのハイプリドーマはＬＦ
Ａ−３に対する抗体を産生じた。他のＬＦＡ−３に対す
るＭＡｂは、ＬＦＡ−３でマウスを免疫し、抗ＬＦＡ−
３産生ハイプリドーマクローンを単離することによる、
全て慣奢的な方法で炸裂することが可能である。モノ′
クローナル抗体は標的細胞に結合することでＣＴＬ細胞
系による細胞溶解反応を阻害し、分子景６〇−７０，０
００のタンパク質を沈殿させることで選択される。ＴＳ
２／９　ＭＡｂは、（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿およびＡタ
ンパク質アフィニティークロマトグラフィーによるハイ
プリドーマ培養液上清から標準的方法（同上）で精製し
た。

精製ＩｇＧはマーチ（Ｍａｒｃｈ）他（６０Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４９．１９７４　）の方法の修飾
法によってセファロースＣＬ−４Ｂに結合させた。略述
すると、洗浄したセファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマ
シア、ウプサラ、スウェーデン）を１ＭＮａ２ＣＯ３中
４０　Ｗ　／　ｍｌ　ＣＮＢｒで、氷上１０分間活性化
し、次に蒸留水と０．１　ｍｌ　ＨＣｔで洗浄した。活
性化したセファロースは湿った固まりとなるよう濾過し
、０．０５　Ｍ　ＮａＣ！および０．１　Ｍ　ＮａＨＣ
Ｏ３゜ｐＨ８，４中２−４■／ｍｌ　ＩｇＧ　（Ｔ　Ｓ
　２／　９あるいはマウスＩｇＧ）を含む精製抗体溶液
に加えた。懸濁液を２０時間均一に混合し、エタノラシ
ンを５０ｍＭまで加え、１時間インキュベートすること
により、残存した反応基をしゃ断した。上清は２８０ｎ
ｍでの吸光度を測定することによって抗体について検定
した。カップリングは通常９０％の水準であった。セフ
ァロースをカラムに注ぎ、アフィニティークロマトグラ
フィーに使用する前にｐＨ１１およびｐＨ３の緩衝液（
以下参照）で洗浄した。

ＬＦＡ−３はアフィニティークロマトグラフィーにより
トリトンＸ−１００ミセル中に精製された。

全ての操作は４℃で行なった。古くなったヒト赤血球を
米国光十字に−ド・・ム、ＭＡ）から得た。

２ユニツトの全血液由来の細胞ｋ　ＩＪン酸緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、固くなった細胞を約５
００　ｍｌにペレット化した。２％トリトンＸ−１００
，１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、５ｍＭ
ヨードアセタミドおよび１５０ｍＴＩＵ／−のアプロチ
ニンを含む５００ｍｔＰＢＳをさらに攪拌しながら赤血
球懸濁液に加えた。１時間後ライセードを２時間１５Ｑ
ＯＯＯｒで遠心し、クリヤードライセードを流速２０　
ｍｅ　／　ｈ　ｒで２つの抗体カラムに連続してかけた
。

第１のカラムは混入物質を吸着し、個々の微粒子からな
る物質を戸田させるため、マウスＩｇＧＣＮＢｒセファ
ロースＣＬ−４Ｂ　（２’９７ｍ１で２ゴ）を含んでい
た。第２のカラムはＴＳ２／９ＭＡｂＣＮＢ　ｒセファ
ロースＣＬ−４Ｂ　（２！／ｄで５−１０ｍ／）であっ
た。通過させた後、第２のカラムをカラム体積の５倍の
５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７２、（１０２５Ｍ　Ｎ
ａＣ２％　　０．　１　　％　ト　リ　ト　ンＸ−１０
０、カラム体積の５倍の２０ｍＭトリメチルアミンｐＨ
１１，０，２５ＭＮａＣ２，０，１％トリトンＸ−１０
０、およびカラム体積の２倍のリン酸緩衝液で、全て流
速１ｍ１１分で洗浄した。次に残存して結合しているＬ
ＦＡ−３をカラム体積５倍の５０ｍＭグリシンｐ）（３
，０，２５Ｍ　ＮａＣ２，０，１％トリトンＸ−１００
で流速２０ｍ＋／／ｈｒで溶出させた。ＬＦＡ−３は通
常１力ラム体積以内に溶出され、０．１体積の１Ｍトリ
スｐＨ８，５、Ｑ、１％トリトンＸ−１００中に回収す
ることにより中和した。ＬＦＡ−３精製に続き、　　Ｉ
　−ＴＳ　２／９　ＭＡｂを用いた“ドツト・プロット
１アツセイを半定量的に行なった。

上述の７フイニテイー精製法は、アフィニティーカラム
から多くのタンパク質が溶出するアルカリ性ｐＨ（ｐＨ
１１）までのＬＦＡ−３ＭＡｂ複合体の非常な安定性を
利用したものである。この高ｐＨはまた、カラム基質か
ら多くの混入タンパクＸを可溶化させる効果を持ち、ま
たおそらく混入物とＬＦＡ−３との執ような相互作用を
破壊する。

この洗浄過程は一段階の単離法でアフィニティーカラム
から均質で純粋なＬＦＡ−３の精製を可能にする。しば
しば少量のヘモグロビン（１０％以下）がｐＨ３でＬＦ
Ａ−３とともに溶出されるが、必要ならば、同じアフイ
ニテイ力ラムを再度通過させることにより容易に除去さ
れる。赤血球から精製されたＬＦＡ−３は５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で４０，０００−７ＱＯＯＯＭｒの広いバンドと
して移動する。

これはＢ　’Ｊンパ芽球細胞由来のＬＦＡ−３よシも低
分子量であるが、類上皮癌由来のＬＦＡ−３と同程度で
ある。

可溶性ＬＦＡ−３ 精製ＬＦＡ−３は１９７３球上のＣＤ２分子と結合し、
ＣＤ２の細胞表面ＬＦ’Ａ−３との相互作用を阻害する
ことができる。図は異なる濃度のＬＦＡ−３が抗ＣＤ２
ＭＡｂの結合を阻害する能力を示している。このデータ
は可溶性ＬＦＡ−３が直接ＣＤ２に結合し、約１４０ｎ
Ｍの濃度でＣＤ２を飽和させることを示唆している。

第１図を参照し、精製ＬＦＡ−３の抗ＣＤ　２　ＭＡｂ
との結合阻害能は、以上の様に流動微量螢光測定法によ
って決定された。ＭＡｂはジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ
　）および末梢血リンパ球に対して適定し、ＭＡｂが最
適の染色を与える最低濃度を決定した。ジュルカットＴ
リンパ胛細胞（Ｍ−にホー（Ｈｏ）博士より、デュポン
／ＮＥＮ、ボストン。

ＭＡ）および末梢血Ｔ細胞は、組織培養液処理をしたべ
）　Ｉ）皿中で２　Ｘ　１０’　ｉＢＭＦＱ／　１０　
ｃｍｍベト皿で６０分間、末梢血液単核細胞を１０％ウ
シ胎児血清を含む完全培地（ＲＰＭＩ　１６４０　（サ
ンチェス−マドリッド、前出）中で２にインキュベート
して穏やかに接着細胞を除去し、接着細胞を減少させる
ことによって得られた；末梢血液単核細胞は全血液のデ
キストラン沈降およびフィコール−ハイパツク（ｄ＝１
．０７７、　シグマ）遠心によって調製された。全ての
操作は４℃で行なった。細胞（１０５）をウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＨＢＳＳ１５％Ｂ５Ａ２０μを
中のＬＦＡ−３あるいは対照用緩衝液と６０分間インキ
ュベートした。

ＭＡｂを同じ緩衝液さらに２０μを中に加え、懸濁液を
１５分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、螢光
ＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ。

ザイムド、サンフランシスコ、（Ａ）と３Ｃ１間’ｆン
キュベー卜し、３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド
で固定し、コールタ−・エピツクスＶ流動細胞計測計で
１週間以内に分析した。

上記細胞を、指示された濃度のＬＦＡ−３（白四角：ジ
ュルカットＴ細胞、黒四角：末梢細胞）、ＬＦＡ−３を
含む溶液と同じ組成の対照緩衝液（“０”ＬＦＡ−３の
点）あるいは精製ＬＦＡ−１膜タンパク質（白丸および
黒丸）のいずれかと氷上で１時間インキュベートした。

抗ＣＤ−２ＭＡｂの添加後、細胞を洗浄し、螢光ヤギ抗
マウスＩｇＧとインキュベートし、ＭＡｂの結合を分析
し定量した。非結合および結合対照ＭＡｂを、特異的螢
光および抗ＣＤ２結合に対するＬＦＡ−３効果の特異性
を決定するために、全ての実験で使用した。

結果は、精製ＬＦＡ−３は投与量に依存する抗ＣＤ２　
ＭＡｂ結合の阻害を引き起こし、おそらくＬＦＡ−３は
１４０　ｎＭ以下でＣＤ２を飽和させることを示唆する
。対照の膜タンパクは抗ＣＤ２ＭＡｂ結合に影響を与え
ず、ＬＦＡ−３は対照として用いた抗ＬＦＡ−Ｉ　ＭＡ
ｂ　（プルンケット、（前出）の示した方法で調製）に
は影響を及ぼさなかった。

以下の表は、精製ＬＦＡ−３がヒトＴリンパ球とヒツジ
赤血球とのＣＤ２に依存する相互作用を阻害できること
を示している。これは、ＣＤ２依存依存着接路について
の便利なアッセイである。ジュルカットＴリンパ芽胛細
胞（１０５）を界面活性剤を吸収させるため、１５％Ｂ
ＳＡを含む等張渡１０μを中でヒツジ赤血球（１０７）
と混合した。

ＭＡｂおよび／あるいは精製ＬＦＡ−３の添加を１０μ
ｔの同じ溶液中で行ない、溶液を氷上で１５分間インキ
ュベートし、２００？で５分間遠心し、氷上で１時間置
いた後細胞を穏やかに再懸濁し、３個以上の赤血球接着
体を有する、核となっている細胞の百分率を計算した。

結果は、抗ＣＤ２　ＭＡｂはこのロゼツト化現象を阻害
することを示唆している。（ヒツジ赤血球上のＬＦＡ−
３類似物質は抗ヒ）ＬＦＡ−３ＭＡｂに認識されないた
め、ロゼツト化は抗ＬＦＡ−３に阻害されない。）精製
されたＬＦＡ−３タンパク濁は、このロゼツト化を完全
に阻害し、抗ＬＦＡ−３ＭＡｂは溶液中でＬＦＡ−３と
結合することによりＬＦ’Ａ−３活性を無力化すること
が示されている。

対照　　　　　　　　　　　　８０　　　　３０抗ＣＤ
２ＭＡｂ　　　　　　　　　ＯＯＬＦＡ−３（７０ｎＭ
）　　　　　　　　ＯＯ抗ＬＦＡ−３ＭＡｂ　　　　　
　　７６　　　　３２ＬＦＡ−３＋ＱＬＦＡ−３ＭＡｂ
　　　　７４　　　　　３６ＬＦＡ−１（１０００ｎＭ
）　　　　　　８１　　　　　２９別の実験において、
抗ＬＦＡ−３による、ＬＦＡ−３の、ＣＤ２を含む細胞
に対する結合の阻害が示すした。ＬＦＡ−３を標識する
ために、トリトンＸ−１００ミセル中のＬ　Ｆ　Ａ　−
３をホウ酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ８，２）に対して透
析し、フレイカー（Ｆｒａｋｅｒ　）他の方法（８０Ｂ
ｉｏｃ、Ｂｉｏｐ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　１８４９．１９７８　）によりＬａ４，６
−チトラクロロー３ａ、６−ジフェニルグリフルリル（
ヨードゲン；ピアス、ロックフォード、工Ｌ）を用いて
１２５工で標識し、ＰＢＳに対して透析した。

ヨード化したＩＪ’Ａ−３の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より８０％以上であり、比活性は１７０　Ｃｉ／ｉｎｍ
ｏｌであると概算された。結合アッセイを３％ＢＳＡを
含むＨＢ　Ｓ　Ｓ中８ＱＯＯＯｃｐｍの投入巣ヲ有する
１００μを中の２×１０　細胞について行なった。

４℃で６０分間後、０．８＋＋＋／１５％ＢＳＡ緩衝物
を通して遠心し、アッセイを終了させた。上清を完全に
吸い出し、ペレットを含む遠心チューブの先を切断して
カウントした。ＭＡｂｋ、　　Ｉ　ＬＦＡ−３を加える
１５分前に加えた。

我々は、ヨード化したＬＦＡ−３がジュルカット細胞に
結合し、この結合の８０％が過剰量の非標識ＬＦＡ−３
および、ＴＳ２／１８　（ＣＤ−２抗原を有する細胞系
、プルンケット：前出）によって阻害可能であることを
見出した。

１２５Ｉ　ＬＦＡ−３は８０％純粋であり、投入カウン
トの約２％が本実験で結合しているので、“特異的゛結
合がＴＳ２／９エピトープを有する物質によるものであ
ることを示すことは重要である。

アッセイでＴＳ２／９とＴＳ２／１８を含んでいると、
片方のみの場合よりも結合阻害能が低下し、双方のＭＡ
ｂが同じ棟の結合を阻害していることを示唆している。

さらに、我々は、５ＫＷ３細胞系（ｐ、フレスウェル（
Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ　）博士より、デューク大学、ドユ
アハム、　　ＮＣ，）には、他の細胞系と比較して５Ｋ
ＷＢ上でのＣＤ２発現が低レベルであることに対応して
、他の細胞より低レベルでヨード化ＬＦＡ−３が結合し
たことを見出した。

別の流動微量螢光測定実験によシ、可溶性ＬＦＡ−３が
ＣＤ２上で、ＴＳ２／１８　ＭＡｂと同じ部位と相互作
用することが示された。さらに、我々はＬＦＡ−３がジ
ュルカット細胞の集合を引き起こすこと、および抗ＣＤ
２　ＭＡｂによってこの集合が阻害されることを発見し
た。

ＬＦＡ−３は通常疎水性領域で膜に結合したタンパク質
として機能する。従って精製タンパク質が脂質２重膜中
で機能することを示すのは重要なことである。

ＬＦ”Ａ−３はオクチルグルコシド（ＯＧ）透析（ゲイ
（Ｇａｙ）他、１３６　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０
２６゜１９８６）によってリポソーム（人工膜）中に再
構成し、リポソームをカバーグラス上で融合させて細胞
結合を観察できるようにした。概述すると、ＬＦＡ−３
をトリトンＸ−１００のかわりに３４ｍＭ（１％）ＯＧ
存在下でアフィニティーカラムから溶出した。クロロホ
ルム中で脂質を、卵ホスファチジルコリン：コレステロ
ールが７＝２の比で混合した。次に脂質（０５■）を窒
素流下で乾燥させ、残存したクロロホルムを除去するた
めに約１時間減圧下に置いた。脂質膜を２０−３０μ？
タンパク質と３４ｍＭ０Ｇを含む１−のタンパク質溶液
中に取り出し、ＰＢＳで２回、ＨＢＳＳで１回透析外液
を交換して３６−４８ｈ透析した。対照として、ヒトグ
リコフォリン（シグマ）も同様の方法で再構成した。

以下の実験で、末梢血液単核細胞をＲＰＭＩ−１６４０
２０％ＦＢＳ中で１μｒ／ｄのＣｏｎ、　Ａと共に５　
Ｘ　１０５細胞／−で３日間培養することによりコンカ
ナバリン細胞（Ｃｏｎ　Ａプラスト（ＣｏｎＡ　ｂｌａ
ｓｔ　）　）を調製した。Ｃｏｎ　Ａを洗浄し、細胞を
１ｎ？／ｍｅ組み換えＩＬ−２中で少なくとも３日間培
養した。これらの細胞は５１Ｃｒで標識しく１０７細胞
を３ゴ中３００　μＣｉのＮａ５０ＣｒＯｉと９０分間
インキュベートすることによる）、定量可能にしておき
、メチル−〇−Ｄ−マンノピラノシドで洗浄し、細胞表
面から残存していたＣｏｎＡを除去した。

平らな膜は、プライアン（Ｂｒｉａｎ）他、８１Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　６１５９．１９
８４の方法によって調製した。概述すると、円形のカバ
ーグラス（１１ａａ＋）を１：６７Ｘリンプロ界面活性
剤液中で１５分間煮沸した。それを次に２４ｈ以上蒸留
水で完全に洗浄し、７０％エタノール中に一晩浸し、乾
燥させた。脂質０．１ｍＭから０．２ｍＭに希釈したリ
ボンーム懸濁液を一滴（１００μｔ）、２４ウエルクラ
スタープレート（ファルコン）のウェル上にのせた。カ
バーグラスを穏やかに脂質懸濁液水滴上に置き、２０−
３０分室温で放置した。ウェルをアッセイ培地（ＲＰＭ
１１６４０．１０％ＦＢＳ、　　２５　ｍＭ　Ｈｅｐｅ
ｓ　）で３回洗浄し、融合していないリポソームを除去
した。脂買表面は決して空気中にさらされなかった。

Ｃｏｎ　Ａブラストを上記平板膜上で穏やかに遠心し、
３７℃で１５分間、あるいは４℃で１時間インキュベー
トすると、細胞の９０％以上がＬＦＡ−３を発現してい
る平板膜に結合したが、ヒトグリコフォリンを含む膜に
は結合しなかった。ＣｏｎＡプラストのＴＳ２／１８で
の前処理あるいは、ＬＦＡ−３を有する平板２重膜のＴ
　Ｓ　２　／　９　Ｆ（ａｂ”）ｚ（Ｆｃ以外のＩｇＧ
断片）での前処理によシ、観察された結合の９５％以上
、実質的にヒトグリコフォリンを有する平板膜で見られ
た水準まで阻害された。ＬＦＡ−３を有する平板膜をＴ
Ｓ２／９で処理し、全ての結合していないＭＡｂを洗い
流した場合、ＴＳ２／９の阻害効果は依然として９０％
以上であり、ＴＳ２／９の阻害効果は平板２重膜に対ス
る結合によるものであり　Ｔ　ＩＪ　ｙｚＱ３１ｅニ対
ｆるものではないことが示された。（対照のグリコフォ
リン平板膜および、ＴＳ２／１８およびＴＳ２／９存在
下でのＬＦＡ−３平板膜に見られる低レベルの結合は、
おそらくカバーガラス下の細胞のトラッピングおよび結
合していない細胞の不完全な除去によるものと思われる
。） 接着分子として、ＬＦＡ−３は細胞粘合について極度の
高アフィニティー金有する。媒介する細胞接着における
非常に高い数個で相互作用することを考慮すると、はと
んどの接着分子の予想される解離定数は１μＭあるいは
それ以上のオーダーとなることがわかる。我々のデータ
はＬＦＡ−３が１０　ｎＭのオーダーの解離定数で細胞
に結合することを示す。

赤血球ＬＦＡ−３が上記の再構成実験で用いた高密度で
存在する場合には、ＣＤ２の潜在的なリガンドとして働
くことができるのは明らかである。

従って、赤血球由来ＬＦＡ−３は、Ｔリンパ球接着に関
与するより古典的な標的細胞由来の同等なＬＦＡ−３と
機能的に類似していることがわかった。

赤血球由来ＬＦＡ−３の分子量も、Ａ４３１株などの類
上皮細胞由来のＬＦＡ−３と類似している。

使用法 精ＭＬＦＡ−３、あるいは人工膜に結合したＬＦＡ−３
は、１２５Ｉ−ＬＦＡ−３あるいは人工膜中のＬＦＡ−
３に結合した細胞を用いたラジオイムノアッセイなどの
、上述の標準的技術を用いて、Ｔ細胞サブセットおよび
ＣＤ２抗原を有する細胞の検出に使用することができる
。さらに、人工膜内の「Ａ−３は上述の様にカバーグラ
スなどの固体担体に結合させ、Ｂ細胞とＴ細胞の分離に
用いることができる。これは、ある集団内のＴＭ胞の割
合の決定を可能にし、自己免疫病、同種移殖片拒絶反応
、移殖片対宿主病などの、Ｔ細胞が過剰になることに特
徴づけられる疾患の臨床的診断および追跡に有用である
。Ｔ細胞は本技術によって精製することが可能である。

精製ＬＦＡ−３はまた、１９７８球の他の細胞との反応
を競合的に阻害することに使用し得る。生理食塩水など
の生理学上適合性のある緩衝液中の、治療上効果的な量
のＬＦＡ−３は、ＣＤ２レセプタ一部位を飽和させるた
めにヒト患者に注射することが可能であり（５０−５０
０μ？／患者のｋｒ／日）、それによってリューマチ様
関節炎などの自己免疫病；同種移殖片拒絶反応；および
移殖片対宿主病などの過度に反応するＴ細胞に特徴づけ
られる疾患の治療に用いることができる。さらに、本発
明の精製ＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体は、標
的細胞あるいは表出細胞上のＬＦＡ−３のしゃ断に使用
し、それらと一部のＴＩＪンパ球の相互作用を阻害する
ことにも使用できる。

他の態様は前述の特許請求の範囲に述べられている。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製ＬＦＡ−３の活性を示すグラフである。図
中口はジュルカットＴ細胞、■は末梢細胞を各々示す。 ○および・は精！！！ＬＦＡ−１膜タンパク質を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＬＦＡ−３を含む液を抗ＬＦＡ−３抗体を含むアフ
   イニテイーカラムと接触させて該ＬＦＭ−３を該抗ＬＦ
   Ａ−３抗体に結合させ、次に緩衝液を用いて該アフイニ
   テイーカラムから該ＬＦＡ−３を溶出させることから成
   るＬＦＡ−３の精製法。 ２、該液を該アフイニテイーカラムと接触させる前に、
   該ＬＦＡ−３を含む液を関連性のない抗体を含むカラム
   に通過させて該液からＬＦＡ−３以外のタンパク質を除
   去することをさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３、上記溶出段階に先立ち、非ＬＦＡ−３タンパク質は
   除去されるがＬＦＡ−３は保持されるようなｐＨの緩衝
   液で該カラムを洗浄する段階をさらに含む特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４、該ｐＨが１０と１１の間である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５、該緩衝液のｐＨが２．５と４．０の間である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ６、該ＬＦＡ−３が哺乳動物の赤血球、単球、顆粒球、
   ＣＴＬ、Ｂ−リンパ芽球細胞系、骨髄性細胞系、血小板
   、血管内皮細胞、上皮細胞、平滑筋、あるいは繊維芽細
   胞から精製される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、該抗ＬＦＡ−３抗体がモノクローン性である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ８、該液を該カラムと接触させる上記段階に先立ち、該
   ＬＦＡ−３を界面活性剤あるいはホスホリパーゼによっ
   て可溶化する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、該界面活性剤が非イオン性である特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １０、該関連性のない抗体がＩｇＧである特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 １１、ＬＦＡ−３の、ＣＤ−２抗原を有する細胞に対す
   る結合を検出することを含む、該細胞の検出法。 １２、細胞混合液中の他の細胞からＣＤ−２抗原を有す
   る細胞を分離する方法であつて、該細胞混合液を該ＬＦ
   Ａ−３を含む固体担体と接触させてＣＤ−２を有する細
   胞を該担体に結合させることを含む方法。 １３、実質的に純粋な、生物学的活性を有するＬＦＡ−
   ３。