JPH03201995A - 活性内皮細胞に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体およびそれらの抗原を用いた医薬品および治療法ならびに該モノクローナル抗体を用いた診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モノクローナル抗体および炎症性過程へのそ
れらの応用に関する。より詳細には、本発明は、インビ
トロ（試験管内）およびインビボ（生体内）で活性内皮
細胞を指向する新規なモノクローナル抗体に関する。

本発明はまた、ＩＬ−１処置の結果として誘発される新
規な内皮細胞表面抗原に関する。それら抗原の一つに対
する完全なｃＤＮＡ配列を開示する。それらの新規モノ
クローナル抗体ならびに新規抗原は、内皮細胞が関与す
る急性および／または慢性炎症性反応を処置するための
医薬として有用であり、本発明は、かかる医薬ならびに
かかる炎症性反応を処置する方性に関するものでもある
。

さらに、本発明は、初期の移植片拒絶反応、無症状感染
、脈管炎なとの内皮細胞関連炎症性反応を検知する方法
に関する。

従来の技術 内皮細胞（Ｅ　Ｃ）は、慢性および急性の炎症の主要関
与因子である。それらは、血流と血管外空間との間の細
胞および液体の輸送を調節する。さらに、それらは、諸
因子を分泌することによって炎症性の刺激に対して反応
するが、それら因子は、造血〔クウエセンベリ（Ｑｕｅ
ｓｅｎｂｅｒｒ７）とジンブロン（Ｇ　ｉｍｂｒｏｎｅ
）、ブラッド、５６巻１０６０〜１０６７頁、１９８０
年〕、化学走性〔ストライター（Ｓ　＋ｒｅｉｆｅｒ）
ら、サイエンス、２４３巻１４６７〜１４６９頁、１９
８９年〕および凝固〔ベヴイラクア（Ｂ　ｅｖｉｌａｃ
ｑｕａ）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メデイシン（Ｊ　、　　Ｅ　ｘｐ。

Ｍｅｄ、）、１６０巻６１８〜６２３頁、１９８４年〕
に対して挿々の影響を及ぼす。インターロイキン−１（
ＩＬ−１）は、障害に対する細胞のほぼ普遍的な反応と
して広範囲の各種タイプの細胞によって分泌される（ネ
タ（Ｎｅｆａ）とオッペンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ
）　、アナルズ・オヴ・インターナル・メデイシン（Ａ
ｎｎ、　　Ｉ　ｎｔ、　Ｍｅｄ、）、１０９巻１〜３１
頁、１９８８年〕。適当な刺激を受けると多くのタイプ
の細胞がこの因子を分泌し、多くのタイプの細胞が、そ
れも種々の方式で、反応する。

ＩＬ−１は、炎症部位に見出され、精製蛋白質として注
射すると、紅斑および血流からの顆粒球の流入をきたし
、二次的には組織破壊をきたす〔ベック（Ｂｅｃｋ）ら
、ジャーナル・オヴ・インムノロジー（Ｊ　、　　Ｉ　
ｍｍｕｎｏｌ、　）、１３６巻３０２５〜３０３１頁、
１９８６年；ペティフ７−　（Ｐ　ｅＨｉｐｈｅｒ）ら
、プロシーディングズ・オウ゛・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オヴ・サイエンシズ（ＰｒｏｃＮ　ａｆｔ、　
Ａ　ｏｄ、　Ｓ　ｃｉ、　）、８３巻、８７４９〜８７
５３頁、１９８６年〕。

数ケ所の研究室が、内皮細胞がＩＬ−１に対して速かに
反応することを示しているが、このことは、炎症性反応
におけるそれらの細胞の補助的性質と一致している。最
もよく記述されている反応のうちの二つは、前駆凝固剤
（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性の増大〔ベヴイラク
アら、１９８４年、上掲〕およびそれに随伴しての白血
球に対する粘着能の増大〔ベヴイラクアら、ジャーナル
・オヴ・クリニカル・インヴエスティゲイション（Ｊ、
Ｃｌ１ｎＩｎｖｅｓ＋、）　、７６巻２００３〜２０１
１頁、１９８５年〕である。

血管の内層として、内皮細胞は、炎症性細胞およびそれ
らの反応性副生物における物質輸送を制御するよう、ユ
ニークな配置をとっている。その上、内皮細胞は、それ
自身、新しく合成された蛋白質を血流中へ分泌するが、
それら蛋白質は炎症過程の初期指標であるかもしれない
。この主要な役割にもかかわらず、このタイプの細胞の
役割を直接的に取扱った治療法」二のアプローチや診断
指示薬はほとんど展開、開発されていない。内皮細胞の
生物学は、実験室内でのこれらの細胞の培養に最近成功
したために、やっとより詳細に理解されはじめたところ
である。

上述の通り、炎症性反応の主要な媒介物質（メゾイエイ
タ）はＩＬ−１である。ＩＬ−１は、マクロファージ（
大食細胞）その他多くのタイプの細胞により分泌される
１７Ｋｄのポリペプチドで、発熱から炎症性細胞の増殖
や骨髄中での前駆体からの成熟白血球の漸増（レクルー
トメント）まで幅広い反応を惹起させることができる〔
ディナレｏ　（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ）の総説：　ＦＡＳ
ＥＢジャーナル、２巻１０６〜１１５頁、１９８８年〕
。

内皮細胞は、炎症過程の極めて初期の段階でＩＬ−１に
反応し、ＩＬ−１を分泌する。ダラム陰性菌による細菌
感染の一副産物として、内毒素の産生とその結果として
のＩＬ−１の二次的産生があるが、機楓的障害がＩＬ−
１の放出の引き金となりうるかどうかという問題は、ス
ポーツにより誘発された炎症を研究する者にとっては重
要ではあるが、まだ回答が与えられていない。

過去１０年間のいくつかの研究室での業績に基いて、イ
ンビトロで内皮細胞のＩＬ−１処理によって模擬の可能
なプロセスである血管壁への白血球の結合が、組織膜へ
の白血球の漏出の第一段階であると、考えられる。しか
し、このプロセスのいくつかの側面は、とくにそれらが
現用抗炎症剤の使用と関係があるのかもしれないため、
不明のままである。

ＩＬ−１は、培養ヒト内皮細胞の膜の性質の速かな変化
を惹起する。このことは、処理された細胞の白血球結合
能、それらによる前駆凝固剤活性の獲得および機能的性
質未知のものも含めて新しい細胞表面抗原の発現から叩
らかである。研究されたこれらの語例では、記載された
新しい性質の発現がアクチノマイシンＤおよびシクロヘ
キシミドの作用に対して感受性で、新しい伝達暗号（メ
ツセージ）、新しい蛋白質の合成の上での−要件が示唆
されている。

白血球および造血器起源の腫瘍細胞の、基底および活性
内皮細胞へのならびに毛細血管の「高い」内皮細胞への
結合が、いくつかの研究室によって研究されている。顆
粒球、単球、Ｔ細胞およびＢ細胞はいずれも、生理的濃
度のＩＬ−１による刺激ののちに内皮細胞に結合できる
ことが証明されている〔ベヴイラクアら、ジャーナル・
オウ゛・クリニカル・インヴエスティゲイション、７６
巻、２００３〜２０１１頁、１９８５年；キャヴエンダ
ー（Ｃａｖｅｎｄｅ＋）ら、ジャーナル・オヴ・インム
ノロジー　１３６巻２０３〜２０７頁、１９８６年；ポ
ールマン（Ｐ　ｏｈ　１ｍａｎ）ら、ジャーナル・オヴ
・インムノロジー　１３６巻４５４８〜４５５３買、１
９８６年〕。Ｔ細胞結合は、ＩＦＮ−ガンマによる内皮
細胞の前処理によっても〔ニー（Ｙｕ）ら、クリニカル
・アンド・エクスベリメンタル・インムノロシー（ＣＩ
ｉｎ、　ｅｘｐ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）、６２巻５
５４〜５６０頁、１９８５年；マスヤマおよびカッ、ジ
ャーナル・オヴ・クリニカル・インウ゛エステイゲイジ
ョン、７７巻１５９６〜１６０５頁、１９８６年〕、ま
たＩＬ−１による前処理によっても〔キャウ゛エンダー
ら、ジャーナル・オブ・インムノロジー　１３６巻２０
３〜２０７頁、１９８６年；ベンダー（Ｂｅｎｄｅｄ）
ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴエスティゲ
イション、７９巻１６７９〜１６８８頁、１９８７年〕
１ｐｓによる前処理によっても〔ニーら、ジャーナル・
オヴ・インムノロジ−１３６巻５６９〜５７３頁、１９
８６年〕、さらにＴＮＦによる前処理によっても〔キャ
ヴエンダーら、ジャーナル・オウ゛・インムノロジー　
１３９巻１８５５〜１８６０頁、１９８７年〕誘発でき
る。静止期内皮へのこれらサイトカイン類の前駆イ・１
否作用は、広く、炎症の血管外遊出成分における初期事
象のモデルとみなされている。高内皮小静脈（ＲＥ　Ｖ
）の場合、構成成分内皮細胞は、既に何らかの方式で活
性化されていて、ＴおよびＢ細胞の再循環におけるそれ
らの役割が容易になっているものと思われる〔総説：イ
エドノック（Ｙｅｄｏｎｏｃｋ）ら、アドヴアンシズ・
イン・インムノロジー（Ａｄｙ、ｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、
　）　、４４巻３１３〜３７８頁、１９８９年〕。他の
刺激を受けていない培養内皮細胞への単球の結合〔パヴ
ロフスキ（Ｐ　ａｗｌｏｗｓｋｉ）ら、ジャーナル・オ
ウ゛・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｃｄ、）、１６８巻１８６５〜１８８２頁、１９
８８年；ウォリス（Ｗａｌｌｉｓ）ら、ジャーナル・オ
ヴ・インムノロジー　１３５巻２３２３〜２３３０頁、
１９８５年〕および顆粒球の結合〔ロー（Ｌｏｌら、ジ
ャーナル・オウ゛・エクスベリメンタル・メデイシン、
１６９巻１７７９〜１７９３頁、１９８９年〕は、循環
系内でのこれらのタイプの細胞の辺縁趨向のモデルとみ
なされてきた。

白血球の再循環および炎症の初期段階を研究する」二で
の基本となる一前提は、各種白血球の結合および血管外
遊出に対して選択的な機構が存在することである。かか
る機構の存在は、白血球の粘膜器官および末梢リンパ器
官を通っての再循環に差のあること〔総説：イエドノッ
クら、アドヴアンシズ・イン・インムノロジー、４４巻
３１３〜３７８頁、１９８９年〕、好中球、単球および
リンパ球の炎症時管外遊出の速度に差のあること〔イツ
セクツツ（Ｉ　５ｓｅｋｕｔｚ）ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オウ゛・パソロジ−（Ａｍ、　Ｊ、　　Ｐａｆ
ｈｏｌ、）１０３巻４７頁、１９８１年〕およびアテロ
ーム発生時の単球の選択的な結合および蓄積〔ティラー
（Ｔａｙｌｏｒ）とルイス（Ｌｅｗｉｓ）　、アメリカ
ン・ジャーナル・オヴ・パソロシー　１２５巻１５２″
ｒＥ、１９８６年〕カラ推定サレルすＴ細胞は、炎症性
障害、とくに慢性形態で継続するものの後期の、しかし
存続性の、要素である。自己免疫疾患の病因におけるＴ
細胞の役割〔ウォフシ（Ｗ　ｏ　Ｉ　ｓ　ｙ　）とジー
マン（Ｓ　ｅａｍａｎ）、ジャーナル・オヴ・エクスペ
リメンタル◆メディシン、１６１巻３７８〜３９Ｆ頁、
１９８５年；レインジズ（Ｒａｎｇｅｓ）ら、ジャーナ
ル・オヴ・エクスペリメンタル・メデイシン、１６２巻
１１０５〜１１１０頁、１９８５年；トーログ（Ｔａｕ
ｒｏｇＪら、セルラー・インムノロジ−（Ｃｅ１１．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、）、７５巻２７１〜２８２Ｍ、１９８３
年；マロン（Ｍａｒｏｎ）ら、ジャーナル・オヴ・イン
ムノロジ１３１券２３１６〜２３２２頁、１９８３年；
ロッシーニ（Ｒｏｓｓｉｎｉ）ら、アニュアル・レヴユ
ー・オヴ・インムノロジ−（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）、３巻２８９〜３２０頁、１９
８５年〕から、最終的組織障害部位へのそれらの移行に
興味がもたれ、とくに活性化されたまたは前駆付着性内
皮細胞要素との相互作用が強調されている。

直接的および間接的証拠は、基底内皮細胞または活性化
内皮細胞への白血球の付着が複雑なプロセスであること
を強く示唆している。活性化内皮細胞表面の４種の明白
に区別される構造が記載されている〔ハーゲマイヤ（Ｈ
ａｇｅｍｅｉｅｒ）ら、インタナショナル・ジャーナル
・オヴ・キャンサー（Ｉｎｆ、　　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）
、３８巻４８１〜４８８頁、１９８６年；ゲルト（Ｇｏ
ｅｒｄ＋）ら、エクスベリメンタル・アンド◆セルラー
・バイオロジー（Ｅｘｐｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、
）　、５５巻１１７〜１２６頁、１９８７年；ドゥアイ
ヴエンスティライン（Ｄｕｉｊｖｅｓ目１ｉｊｎ）ら、
アメリカン・ジャーナル・オヴ・バソロジ−１３０巻１
４７〜１５５頁、１９８８年；レーウウエンベルグ（Ｌ
　ｅｅ＋ｒｅｎｂｅｒｇ）ら、ヨーロピアン　ジャーナ
ル・オウ゛・インムノロジー（Ｅｕ＋、　　Ｊ、　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、）、１９巻７１５〜７２０頁、１９８９
年〕が、少なくとももう２種の十分に特性が明らかにさ
れた分子が、付着事象に直接的に関係ありとされている
。ＥＬＡＭ−１蛋白質は、サイト力イン活性化内皮への
顆粒球の付着を主として媒介する〔ポウバー（Ｐ　ｏｂ
ｓｒ）ら・ジャーナル・オウ゛◆インムノロジー　１３
６巻１６８０〜１６８７頁、１９８６年；ベヴイラクア
ら、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オヴ・サイエンシズ、８４巻９２３８〜９２４
２頁、１９８７年；ベヴイラクアら、サイエンス、２４
３巻１１６０〜１１６５頁、１９８９年）、ＩＣＡＭ−
１蛋白質は、活性内皮細胞へのある秤の単核細胞〔ダス
ティン（［）ｕｓｔｉｎ）とスプリンガ−（Ｓ　ｐｒｉ
ｎｇｅｒ）、ジャーナル・オヴ・セルラー・バイオロジ
ー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、１０７巻３２１〜３
３１頁、１９８８年〕および顆粒球〔スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴエステ
ィゲイション８３巻２００８〜２０１７頁、１９８９年
、同８２巻１７４６〜１７５６頁、１９８８年〕の付着
の部分的原因となる。これらおよびその他の研究〔）＼
スカート（Ｈａｓｋａｒｄ）ら、ジャーナル・オウ゛・
インムノロジ−１３７在２９０１〜２９０６頁、１９８
６年〕における重要な一致点は、活性内皮細胞への白血
球の付着のためのＩＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ−１非依
存性の経路が存在することについてである。

それにもかかわらず、単核細胞の結合におけるこれらお
よび他の分子の役割は未だ明らかにされていない。

発明が解決しようとする課題 従って、本発門の一目的は、インビトロおよびインビボ
で活性化ヒト内皮細胞上の抗原に特異的な新規モノクロ
ーナル抗体を開発することである。

本発門の第二の目的は、白血球の結合をブロックし、そ
れによって活性化内皮細胞関連炎症性反応を防止するた
めの医薬として、またそのための方法において有用な、
新規モノクローナル抗体を開発することである。

本発明の第三の目的は、活性化内皮細胞関連炎症性反応
を防止するための医薬として、またそのための方法にお
いて有用な、活性化内皮細胞上に発現される新規な抗原
および／または新規な抗原エピトープを提供することで
ある。

本発明の第四の目的は、活性化内皮細胞関連炎症性反応
を検知できる検出法を提供することである。

課題を解決するための手段 これらおよびその他の目的は、ＩＬ−１活性化内皮細胞
に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合
部位含有断片であって、該モノクローナル抗体が下記モ
ノクローナル抗体（Ａ）　　　（Ｂ）および（Ｃ）から
なる群より選ばれたものであることを特徴とする前記モ
ノクローナル抗体またはその断片を提供することによっ
て、達成された：（Ａ）同定のための次の特性を持つモ
ノクローナル抗体： （１）正常な休止内皮細）泡には有意には結合せず、■
正常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトあ
るいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意に
は結合せず、 ■休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒球混合物また
はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞には有
意には結合せず、 ■インビトロで、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への
結合を阻害しないかまたは部分的に阻害し、 ０インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への
結合を阻害せず、 （６）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に在在し、
第３４Ａ〜３４Ｄ図によって規定される１Ｅ７／２Ｇ７
シアロ糖蛋白質抗原に特異的に結合する；（Ｂ）同定の
ための次の特性を持つモノクローナル抗体： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒球混合物また
はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞には有
意には結合せず、 ■休止及びＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞質中及びＩＬ
−１活性化内皮細胞の表面に存在するＣＭＰ−１７０抗
原に特異的に結合する；及び（Ｃ）同定のための次の特
性を持つモノクローナル抗体： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止のまたはＩＬ−１活性化された顆粒球混合物また
はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞には有
意には結合せず、 ■インビトロで、Ｔ細胞の活性化内皮細胞への結合を部
分的に阻害し、 ０インビｌ、口で、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞へ
の結合を完全にまたは部分的に阻害し、（６）　Ｉ　Ｌ
　−１活性化内皮細胞の表面に存在するＥＬＡＭ−１シ
アロ糖蛋白質抗原のＮ末端２０％に特異的に結合し、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在する
１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原には結合しない。

他の一実施態様として、本発明は、上記モノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。

好ましい実施態様にあっては、該モノクローナル抗体は
、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ細
胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ７
、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢＩＯ１３７のハイブリドーマ細
胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ７
、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドーマ細
胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３Ａ２
、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細
胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９
およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドー
マ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３
Ｂ７又はこれらのモノクローナル抗体の結合部位含有断
片である。

さらに一つの実施態様にあっては、本発明は、活性化内
皮細胞関連炎症性反応を処置するための薬剤を提供する
ものであって、該薬剤は、（１）インビトロでのＴ細胞
の活性化内皮細胞への結合を部分的に阻書する前記モノ
クローナル抗体（Ａ）、またはモノクローナル抗体（Ｃ
）の少なくとも１種またはその結合部位含有断片あるい
は該モノクローナル抗体または断片の薬学的に許容しう
る塩の医薬としての有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる。

好ましい一実施態様では、該モノクローナル抗体は、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリドーマ細胞株
２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ７、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢＩＯＩ３５のハイブリドーマ細胞株
７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９およ
びＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドーマ細
胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３Ｂ７
、またはこれらのモノクローナル抗体の結合部位含有断
片である。

さらに他の一実施態様として、本発明は、活性内皮細胞
関連炎症性反応を処置する方法を提供するものであって
、該方法は、前記薬剤に関して上記したモノクローナル
抗体またはその結合部位含有断片あるいは該モノクロー
ナル抗体または断片の医薬として許容しうる塩の医薬と
しての有効量を処置の必要な患者に投与することからな
る。

好ましい一実施態様では、該モノクローナル抗体は、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３７のハイブリドーマ細胞
株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ７、
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢＩＯＩ３５のハイブリドーマ細胞
株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９お
よびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドーマ
細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３Ｂ
７またはこれらのモノクローナル抗体の結合部位含有断
片である。

本発明はさらに、ＩＬ−１活性内皮細胞上に見出される
実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片を提供するも
のであり、該抗原または抗原性断片は下記の（Ａ）　　
　（Ｂ）および（Ｃ）よりなる群から選ばれる： （Ａ）同定のための次の特性をもつ１Ｅ７／２Ｇ７抗原
： （１）シアロ糖蛋白質である、 ■還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により求めた分子質量 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）　　：（ａ）約１１
４１ｃＤａに強いバンド、（ｂ）約９５　ｋ　Ｄ　ａに
弱いバンド、■非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により求めた分子質量：（ａ）約１
００ｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９３　ｋ　Ｄ　ａに弱いバンド、■還元条件下
でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により求
めた分子質量は、Ｏ結合糖鎖除去後、約１〜２ｋＤａ減
少、 ０２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４，９
． ０構戊性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、顆粒
球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発現
されず、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞上での発現が、大
腸菌リポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン
（ＩＦＮγ）によっては刺激されず、 （１１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリド
ーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体
１Ｅ７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７
のハイブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノク
ローナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しなが
ら長時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によっ
てインビトロで測定した場合、慢性動態を示し、■慢性
または急性炎症の状態にある組織の血管中での抗原発現
によりインビボで／１ｌ１１定した場合、慢性または急
性動態を示し、 （１０１Ｅ　ＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に
結合する抗体には結合せず、 （１１）該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該
モノクローナル抗体２Ｇ７に結合し、（１２）第３４Ａ
〜３４Ｄ図に示したｃＤＮＡ配列によりトランスフェク
トされたＣＯ８細胞によって発現される； （Ｂ）同定のための次の特性をもつＣＭＰ−１７０抗原
： （１）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により求めた分子質ｈｔ：約１７
０ｋＤａ。

■休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆粒球、繊
維芽細胞またはケラチノサイト上では発現されず、 ■休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞質中に
存在し、 ■活性化内皮細胞の細胞表面での発現がシクロヘキシミ
ドおよびアクチノマイシンＤにより阻害され、 （０内皮細胞内のワイベル−パラド体（Ｗ　ｅ　ｉ　ｂ
　ｅ　ｌ　−Ｐａｌａｄｅ　ｂｏｄｉｅｓ）に局在する
ことなく、（５）　Ｉ　Ｌ−１刺激内皮細胞中のＥＬ、
ＡＭ−１と細ｊ抱表面で会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）　
Ｌ、、（７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブ
リドーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル
抗体３Ａ２が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間
前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビ
トロで測定した場合、急性動態を示し、 ■該モノクローナル抗体３Ａ２に結合する；及び （Ｃ）同定のための次の特性をもっＥＬＡＭ−１抗原の
抗原性断片からなる抗原； （＋）ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、（
２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ
細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ
９に結合する、 （３）　Ａ　Ｔ　ＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブ
リドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル
抗体３Ｂ７に結合する、 ■構成性またはｌ・ロンビン刺激末梢血液単核細胞、顆
粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発
現されない、 （！５）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞上での発現が、
大腸菌リポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ
（ＴＮＦ）により刺激されるが、ガンマインターフェロ
ン（ＩＦＮγ）によっては刺激されない。

本発明は、 （１）」二記の１Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗
原およびＥＬＡＭ−１抗原性断片からなる群より選ばれ
た少なくとも１種の実質的に純粋な抗原またはその抗原
性断片あるいは該抗原または断片の医薬として許容しう
る塩の医薬としてのｆｉ効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための薬剤をも提供する。

本発明はさらに、薬剤について上記した実質的に純粋な
抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原または断片の
医薬として許容しうる塩の医薬としての有効量を処置の
必要な患者に投与することからなる活性化内皮細胞関連
炎症性反応の処置方法を提供する。

本発明はさらに、 （１）生体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ）を
上記モノクローナル抗体またはその結合部位含有断片の
いずれかと接触させる工程、及び （ＩＩ）該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体ま
たはその結合部位含有断片の特異的結合をアッセイする
工程 を包含する活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する方
法をも提供する。

好ましい一実施態様では、該モノクローナル抗体が、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ細胞株
１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ７、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢＩＯＩ３７のハイブリドーマ細胞株
２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ７、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドーマ細胞株
３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３Ａ２、Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ細胞株
７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ９およ
びＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドーマ細
胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３Ｂ７
である。

最後に、本発明は、抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃ
ＤＮＡ配列またはその断片および該ｃＤＮＡ配列または
その断片を含むベクターを提供する。

該ｃＤＮＡ配列は、第３４Ａ〜３４Ｄ図に実質的に示さ
れているｃＤＮＡ配列を含むものである。

該ベクターは、第３４Ａ〜３４Ｄ図に実質的に示されて
いるｃＤＮＡ配列を含むベクターからなる。

１９８９年５月２３日提出の別件アメリカ特許出願第０
７／３５５７０１号の明細書全体をここに明示的に引用
して挿入に代えるものである。

本発明は、上記および後記実施例記載の同定用特性を持
つ新規なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）モノクローナル抗体を
生産する新規ハイブリドーマを提供する。

本発明は、該モノクローナル抗体が特異的に結合する新
規な抗原をも提供する。

本発明の新規モノクローナル抗体について言う「有意に
は結合しない」とは、結合の起らない対照と比較すると
き結合が統計的に有意ではないことを意味する。

本発明の新規モノクローナル抗体について言う「結合を
阻害しない」とは、阻害の起らない対照と比較するとき
阻害が統計的に有意ではないことを意味する。

本発明の新規モノクローナル抗体について言う「結合を
部分的に阻害する」とは、阻害の起らない対照と比較す
るとき阻害が統計的に有意であるが、阻害が完全阻害に
は至らないことを意味する。

本発明の新規モノクローナル抗体について言う「結合を
完全に阻害する」とは、実験誤差の範囲内で阻害が完全
であることを意味する。一般に、Ｔ細胞、顆粒球および
／または単球のごとき細胞の結合の阻害に関しての実験
誤差は、約±１０％である。

本発明の新規モノクローナル抗体および抗原について言
う「活性化内皮細胞関連炎症性反応」とは、内皮細胞お
よびそれらがその中に存在する血管が白血球の安定な結
合および／または血流からの組織への遊出に関与するこ
とにより特徴付けられる炎症性反応を意味する。結合が
局所血管系に対する白血球介在障害（ｄａｍａｇｅ）を
もたらすならば、炎症は結合のみに存在するかもしれな
い。障害は実際の血管通過から生じ、異なる白血球サブ
タイプのいずれかとの周囲組織との相互作用によってそ
れら組織に障害をきたす可能性もある。

本川納置で言う「シアロ糖蛋白質」とは、ツニカマイシ
ンによるグリコジル化の阻害および免疫沈降物または活
性内皮細胞の前処理によるシアル酸の除去の結果として
ポリアクリルアミドゲルでの移動度が増すところの３５
８−システィン取込み能によって定義される蛋白質を意
味する。

本発明のモノクローナル抗体によって定義される抗原に
ついて言う「実質的に純粋な」とは、該抗原が天然の状
態にはないことを意味する。すなわち、それらは、それ
ら抗原を呈示する細胞あるいはそれら抗原が存在するい
ずれの体液とも関連をもたない。

本発明の新規モノクローナル抗体により定義される抗原
について言うインビトロアッセイに関しての「慢性動態
」とは、それら抗原がヒト内皮細胞上でＩＬ−１の存在
下に約７２〜９６時間発現され続け、その発現がＩＬ−
１添加時に到達する初期レベルより上のまたはほぼ等し
いレベルにあることを意味する。かかる挙動の２例を、
モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７により定義され
る抗原について第１１図に、モノクローナル抗体７Ａ９
により定義される抗原について第２２図に示す。

本発明の新規モノクローナル抗体により定義される抗原
について言うインビトロアッセイに関しての「急性動態
」とは、初期のＩＬ−１の添加から約２４時間以内にＩ
Ｌ−１存在下でのヒト内皮細胞の表面からそれら抗原が
減少し、場合により完全に消失することもあることを意
味する。かかる挙動の１例を、モノクローナル抗体３Ａ
２により定義される抗原について第１１図に示す。

本発明のモノクローナル抗体により定義される抗原につ
いて言うインビボアッセイに関しての「慢性動態」とは
、慢性炎症を経験している組織の血管中で該抗原が発現
されることを意味する。

これは、患者の病歴を知っている熟練した病理学者によ
りなされる通例的判定であり、湿潤白血球（ｉｎｆｉｌ
ｔｒａｔｉｎｇ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）の数および性
質およびその他の標準的判定基準に基くものである。

本発明の新規モノクローナル抗体により定義される抗原
について言うインビボアッセイに関しての「急性動態」
とは、急性炎症が起きている組織の血管中で該抗原が発
現されることを意味する。

これは、患者の病歴を知っている熟練した病理学者によ
りなされる通例的判定であり、湿潤白血球の数および性
質およびその他の標準的判断基準に基いている。

ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体本発明のハイ
ブリドーマは、木切納置中実施例１で詳細に記載したよ
うに、確立された方法に従ってルーチンの実験によって
再現可能に生産できる。

通常は、免疫細胞調製のための免疫原はＩＬ１活性化ヒ
ト内皮細胞である。

ヒト内皮細胞は、既知の方法〔ジャッフェ（Ｊ　ａｌｆ
ｅ）ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴエステ
ィゲイション、５２巻２７４５〜２７５７頁、１９７３
年〕に従って調帯から得ることができる。簡単に言えば
、細胞を血管壁からコラゲナーゼ処理によってはがし、
ゼラチン被覆組織培養フラスコ中、２０％の低内毒素ウ
シ胎児血清、９０μｇ　／　ａｌｌの保存剤不含ブタヘ
パリン、２０μｇ／−の内皮細胞成長用添加物（ＥＣＧ
Ｓ）、グルタミンおよび抗生物質を含有するＭ１９９倍
地中で培養する。ＥＣＧ５は、ウシ視床下部から得られ
る粗製の成長因子製剤で、主要成分は繊維芽細胞成長因
子である。ＥＣＧ５は市販品を入手できる。

内皮細胞を、ＩＬ−１ベータを１　ｎｇ／−添加して４
時間活性化する。ＩＬ−１ベータは当業者ならば市販品
またはその他のものを容易に入手できる。

ハイブリドーマの生産を予期して免疫する特定の宿主は
マウスとすべきである。Ｂａ１ｂ／ｃマウスが好ましい
。

免疫スケジュールおよびマウスの免疫に用いる活性内皮
細胞の量は、当業者なら容易に決定できる。たとえば、
Ｂａ１ｂ／ｃマウスの場合の適当な免疫スケジュールの
１例は、ＩＬ−１活性化内皮細胞３Ｘ１０６個を１０日
おきに４回注射し、最後の／１Ｅｎ４は融合の３〜４０
前とするものである。

感作された細胞、たとえば免疫された肝細胞を分離し、
肝細胞を、十分に確立された技術〔ケーラー（Ｋ５ｈｌ
ｅｒ）、ジー、とミルスティン（Ｍｉｌｒｌｅｉｎ）、
シー、ネイチャー、２５６巻４９５〜４９７頁、１９７
５年およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｗ−Ｗら、ジャーナ
ル・オヴ・エクスペリメンタル・メデイシン、１５０巻
１００８〜１０１９頁、１９７９年〕により、Ｓ　Ｐ　
２１０骨髄肝細胞株また他の適当な骨髄腫細胞株と融合
させる。融合はポリエチレングリコールを用いて行うの
が好ましい。

免疫宿主の感作肝細胞との融合のために本発明では特定
の骨髄肝細胞を採用したが、それらに限定されるもので
はなく、マウス起源のハイブリドーマ調製に有用な既知
の骨髄腫細胞のいずれであってもよい。かかる骨髄肝細
胞の例としては、ＮＳ／１、ＳＰＩおよびＳ　Ｐ　２１
０細胞などのＨＡＴ感受↑生マウス骨髄腫細胞がある。

融合した細胞を、当業者の容易に定めうる条件下で培養
する。

適当な培養期間後、ＩＬ−１活性化内皮細胞とは反応す
るが、正常な休止内皮細胞とは反応しないモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローン化し、またサブクローン化する。

通常は、休止またはＩＬ−１活性化内皮細胞のコンフル
エント（ｃｏｎｌｌｕｅｎｊ）な単層についてスクリー
ニングを行う。培養上澄みを単層の細胞に添加し、適当
な期間、たとえば６０分間、４℃でインキュベートして
、培養上澄み中のモノクローナル抗体を単層の細胞と反
応させる。抗原被覆ウェルに結合した抗体は、通常、二
次抗体、たとえばビオチニル化（ｂｉｏｌｉｎｙｌａｌ
ｅｄ）抗マウスＴｇＭおよびＩ　ｇ　Ｇヤギまたはウサ
ギ抗体およびそれに続く族１．１性プローブ、たとえば
１２５Ｉ−ストレプトアビジン（ｓｌ＋ｅｐｌａｖｉｄ
ｉｎ）により検出する。

本発明に従いこのようにして単離されたハイブリトーマ
により生産されるモノクローナル抗体は、大型バッチの
ハイブリドーマ細胞培養を増殖させ、上層みから抗体を
精製するか、そのハイプリドーマ株をマウスに注射して
腹水の生産を刺激することにより、大量に生産できる。

両方法共、当業界で周知である。

上記の方法に従って、好ましいモノクローナル抗体を生
産する５種のハイブリドーマが生産された。それら好ま
しいモノクローナル抗体をＩＦ５．２Ｇ７．３Ａ２．７
Ａ９および３Ｂ７と名付けた。

これらのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
をハイブリドーマ１Ｅ７．２Ｇ７．３Ａ２．７Ａ９およ
び３Ｂ７と名付け、メリーランド州ロックヴイルのアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した
が、それぞれのＡＴＣＣ寄託番会はＨＢ１０１３６、Ｈ
Ｂ１０１３７、ＨＢ１０１３８、ＨＢ１０１３５および
ＨＢ１０３９１である。

本発明のモノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７は、ハ
イブリドーマ細胞株１Ｅ７および２Ｇ７によって生産さ
れ、本発明のモノクローナル抗体群（Ａ）に属する２種
の好ましいモノクローナル抗体をなす。（Ａ）群モノク
ローナル抗体は次の同定特性を持つ： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性比顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細
胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意には
結合せず、 ■インビトロで、Ｔ細胞のＩＩ、−１活性化内皮細胞へ
の結合を阻害しないかまたは部分的に阻害し、０インビ
トロで、顆粒球のＩＬ−１活性内皮細胞への結合を阻害
せず、 （６）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在し、
第３４Ａ〜３４Ｄ図に示したｃＤＮＡ配列によって定義
される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原に特異的に結
合する。

上記同定特性のうち、モノクローナル抗体１Ｅ７を包含
するモノクローナル抗体のサブグループは、インビトロ
で、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害せ
ず、モノクローナル抗体２Ｇ７を包含するモノクローナ
ル抗体のサブグループは、インビトロで、Ｔ細胞のＩＬ
−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害する。

（Ａ）群モノクローナル抗体のサブグループのその他の
同定特性としては、インビトロで、ＴＨＰ−１骨髄単球
性細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻
害することが含まれる。この特性は、好ましいモノクロ
ーナル抗体２Ｇ７を包含する（Ａ）群モノクローナル抗
体のサブグループが示すものである。

好ましいモノクローナル抗体１Ｅ７のその他の同定特性
は、該モノクローナル抗体がマウス（ｍｕｒｉｎｅ）モ
ノクローナル抗体であって、ＩｇＧ２ａのアイソタイプ
をもつことである。

好ましいモノクローナル抗体２Ｇ７のその他の同定特性
は、該モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体
であって、ＩｇＧ１のアイソタイプをもつことである。

モノクローナル抗体２Ｇ７は、インビトロで、ＴＨＰ−
１骨髄単球性細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を
やはり部分的に阻害する。

本発明のモノクローナル抗体３Ａ２は、ハイブリドーマ
細胞株３Ａ２によって生産され、本発明の（Ｂ）　？ｆ
ｆモノクローナル抗体に属する好ましい一モノクローナ
ル抗体をなす。（Ｂ１群モノクローナル抗体は次の同定
特性を持つ： （１）正′ｉ：（な休止内皮細胞には有意には結合せず
、■正常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイ
トあるいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には０
意には結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性比顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細
胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意には
結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞質中におよ
びＩＬ−１活性化内皮細胞の表面に存在するＣＭＰ−１
７０抗原に特異的に結合する。

（Ｂ）群モノクローナル抗体のその他の同定特性として
は、それらが休止繊維芽細胞および白血球に存在するＣ
ＭＰ−１７０に特異的に結合する性質を挙げることがで
きる。

好ましいモノクローナル抗体３　Ａ　、２のその他の同
定特性は、該モノクローナル抗体がマウスモノクローナ
ル抗体であって、ＩｇＭのアイソタイプをもつことであ
る 本発明のモノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７は、ハ
イブリドーマ細胞株７Ａ９および３Ｂ７によって生産さ
れ、本発明の（Ｃ１群モノクローナル抗体に属する２種
の好ましいモノクローナル抗体をなす。（Ｃ）群モノク
ローナル抗体は次の同定特性を持つ： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性化顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細
胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意には
結合せず、 ■インビトロで、Ｔ細胞の活性内皮細胞への結合を部分
的に阻害し、 ０インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への
結合を完全にまたは部分的に阻害し、（６）　Ｉ　Ｌ　
−１活性化内皮細胞の表面に存在するＥＬＡＭ−１シア
ロ糖蛋白質抗原のＮ末端２０％に特異的に結合し、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在する
１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原には結合しない。

」二記同定特性に関して、モノクローナル抗体７Ａ９を
包含するサブグループのモノクローナル抗体は、インビ
トロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完
全に阻害し、モノクローナル抗体３Ｂ７を包含するサブ
グループのモノクローナル抗体は、インビトロで、顆粒
球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害す
る。

好ましいモノクローナル抗体７Ａ９のその他の同定特性
は、それがマウスモノクローナル抗体であり、そのアイ
ソタイプがＩｇＧ１であるということである。

好ましいモノクローナル抗体３Ｂ７のその他の同定特性
は、それがマウスモノクローナル抗体であり、そのアイ
ソタイプがＩｇＧ２ａであるということである。

上記モノクローナル抗体のいずれかの結合部位含有断片
は、当業界で既知の多くの方法、たとえばＦ（ａｂ’）
２断片を製出するために用いられるペプシン消化によっ
て得ることができる。パーハム（Ｐａｒｈａｍ）、ジャ
ーナル・オヴ・インムノロジー　１３１巻２８９３〜２
０９２頁、１９８３年を参照されたい。

正常体止内皮細胞への結合を測定するための特定の一ア
ッセイ法を、実施例２Ｂに記載しである。

しかし、一般的には、このアッセイは、たとえばり、　
Ｍ、ウェア（Ｗｅｉｒ）編「ハンドブック・オヴ・エク
スペリメンタル・インムノロジー」、第４版、１９８６
年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック
・パブリケーションス、オックスフォード、英国に記載
されているものなどの、当業界で既知のいくつかの操作
法に従って実施することができる。

正常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトあ
るいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞への結合を
測定するための特定の一アッセイ法を実施例３（Ｂ）に
述べである。

しかし、このアッセイは、一般には、たとえばり９Ｍ、
　ウェア編「ハンドブック・オヴ・エクスペリメンタル
・インムノロジー」、第４版、１９８６年、１〜４巻、
ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーシ
ョンズ、オックスフォード、英国に記載されているもの
などの当該技術分野で既知の諸方法に従って実施できる
。

休止またはＩＬ−１活性化顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細胞
および単球を包含する単核細胞の混合物に上記モノクロ
ーナル抗体が結合するかどうかを知るための一アッセイ
法を実施例３（Ｂ）に記載する。

しかし、一般的には、この測定には、たとえばり、　Ｍ
、ウェア編「ハンドブック・オヴ・エクスペリメンタル
・インムノロジー」、第４版、１９８６年、１〜４巻、
ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーシ
ョンズ、オックスフォード、英国に記載されているもの
などの、いくつかの既知の方法を使用できる。

インビトロでのＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結
合を上記モノクローナル抗体が阻害するかどうかを知る
ための特定の一アッセイ法を実施例２（Ｅ）に示した。

しかし、たとえばマスヤマとカッ、ジャーナル・オヴ・
クリニカル・インヴエスティゲイション（Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　、７７巻１５９６〜１６０５
頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの既知の方
法のいずれもが適当である。

インビトロでの顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結
合を上記モノクローナル抗体が阻害するかどうかを知る
ための特定の一方法を実施例２（Ｄ）に記載した。

しかし、たとえばポウバー（Ｐ　ｏｂｅｒ）ら、ジャー
ナル・オヴ・インムノロジー　１３６巻１６８０〜１６
８７頁、１９８６年に記載のものなどのいくつかの既知
の方法のいずれもが適している。

１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原、ＣＭＰ−１７０抗
原およびＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原に上記モノク
ローナル抗体が特異的に結合するかどうかは、実施例２
（Ｂ）に記載したように、フローサイトメトリーを行う
ことによって知ることができる。

上記モノクローナル抗体がＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質
抗原のＮ末端２０％に結合するかどうかを知るための一
方法を実施例５に記載した。

新規抗原および抗原性断片 本発明は、ＩＬ−１活性化内皮細胞上に見出される新規
な実質的に純粋な抗原およびその抗原性断片をも提供す
る。それら抗原および抗原性断片は、１Ｅ７／２Ｇ７、
ＣＭＰ−１７０と名付けたもの、および既知の抗原ＥＬ
ＡＭ−１の抗原性断片である新規な抗原である。

１Ｅ７／２Ｇ７抗原は次の同定特性を持つ：（１）シア
ロ糖蛋白質である、 ■還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により求めた分子質ｆｉｔ　（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｓｓ）　　： （ａ）約１１４ｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９５ｋＤａに弱いバンド、 ■非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量： （ａ）約ＩＱＱｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９３　ｋ　Ｄ　ａに弱いノくンド、■還元条件
下でのＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動により求
めた分子質量は、０結合糖鎖除去後、約１〜２　］＜　
Ｄ　ａ減少、 ０２−Ｄゲル分析により求めた等電点的４．８〜４．９
． ０構成性またはトロンビン刺激誘発性末梢血液単核細胞
、顆粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上
で発現されず、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞上での発現が、大
腸菌リポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン
（ＩＦＮγ）によっては刺激されず、（１１）ＡＴＣＣ
寄託番号ＨＢ　１０１３６のハイブリドーマ細胞株１Ｅ
７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ７および／
またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリドー
マ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２
Ｇ７が、ＩＬｌで時間を順次増しながら長時間前処理し
たヒト内皮細胞に結合する能力によってインビトロで求
めるとき、慢性動態を示し、 ■慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での抗
原発現によりインビボで求めるとき、慢性または急性動
態を示し、 （１０）ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結
合する抗体には結合せず、 （１１）該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該
モノクローナル抗体２Ｇ７に結合し、（１２）第３４Ａ
〜３４Ｄ図に示したｃＤＮＡ配列によりトランスフェク
トされたＣＯＳ細胞によって発現される。

１Ｅ７／２Ｇ７抗原の有用な断片には、モノクローナル
抗体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗体２Ｇ７には
結合しないエピトープを含む抗原性断片ならびにモノク
ローナル抗体２Ｇ７には結合するがモノクローナル抗体
１Ｅ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片があ
る。

１Ｅ７／２Ｇ７抗原のその他の同定特性としては、炭水
化物付加（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ａｔｔａｃｈｍ
ｅｎｔ）を阻止するためのツニカマイシン処理ののちに
還元条件下でのＳＤＳ〜ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって求めたそれの分子質量が約３　Ｑ　ｋ　Ｄａ
であることがあげられる。

ＣＭＰ−１７０抗原は次の同定特性を持つ：（１）還元
および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により求めた分子質量：約１７０ｋＤａ。

■休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆粒球、繊
維芽細胞またはケラチノサイトの表面では発現されず、 ■休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞質中に
存在し、 ■活性化内皮細胞の細胞表面での発現がシクロヘキシミ
ドおよびアクチノマイシンＤにより阻害され、 ０内皮細胞内のワイベル−パラド（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａ
ｌａｄｅ）体に局在することなく、（ｆ５）　Ｉ　Ｌ　
−１刺激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表面で会合し
、 （７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３８のハイブリド
ーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体
３Ａ２が、ＩＬ＝１で時間を順次槽しながら長時間前処
理したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビトロ
で求めたとき、急性動態を示し、 ■該モノクローナル抗体３Ａ２に結合する；ＥＬＡＭ−
１抗原の抗原性断片からなる抗原は次の同定特性をもつ
： （１）ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、（
２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ
細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７Ａ
９に結合する、 （３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドー
マ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３
Ｂ７に結合する、 ■構成性またはトロンビン刺激末梢血液単波細胞、顆粒
球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発現
されない、 （５１Ｌ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リポ
多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）
により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ
γ）によっては刺激されない。

還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドケル電気泳動による分子質量測定法は当該技術分野で
は周知であり、たとえばポニー・ニス・ダンパー（Ｂｏ
ｎｎｉｅ　Ｓ、　Ｄｕｎｂｅｒ）、二次元電気泳動およ
び免疫学的技法（Ｔｗ。

Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ　ａｎｄＩ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｔ　
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、プレナムプレス、ニューヨーク
、１９８７年に記載されている。

分子質量を記述するに当っての「強いバンド」および「
弱いバンド」とは、ある一定の実験においてのバンドの
強度に基いた相対的な用語である。

しかし、当業者であれば、たとえば本出願書類中の図面
を観察することによって、あるバンドが強いバンドであ
るか弱いバンドであるかを容易に決定できるのである。

該抗原の等電点も、ガレルズ（Ｇ　ａｒｒｅｌｓ）　、
メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍ　ｅ　ｆ　ｈ　ｏ
　ｄ　ｓＥ　ｎｚｙｍｏｌ、　）、１００巻４１１〜４
２３頁、１９８３年およびポニー・ニス・ダンパー、二
次元電気泳動および免疫学的技法、プレナムプレス、ニ
ューヨーク、１９８７年に記載されている２−Ｄゲル分
析のような当該技術分野で周知の諸方法によって測定す
る。

〇−結合糖鎖は、実施例４（Ｆ）記載の方法などの既知
の諸方法によって除去できる。

〇−結合糖鎖除去のために使用できる他の諸方法は、Ｄ
、　Ｍ、　　ウェア編「ハンドブック・オヴ・エクスペ
リメンタル・インムノロジー」、第４版、１９８６年、
１〜４在、ブラックウェル・サイエンティフィック・パ
ブリケーションズ、オックスフォード、英国に記載され
ている。

本発明の抗原が、休止状態のあるいはｌ・ロンビンまた
はＩＬ−１で刺激された末梢血単核細胞、顆粒球、血小
板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発現されるか
されないかを知るためのアッセイの特定の一例を実施例
４（ｊ）および（Ｍ）に示した。

休止あるいはトロンビンまたはＩＬ−１刺激細胞上で該
抗原が発現されるかされないかを知るために用いうる他
の方法は、Ｄ、　Ｍ、　　ウェア編ハンドブック・オヴ
・エクスペリメンタル・インムノロジー、第４版、１９
８６年、１〜４巻、ブラックウェル・サイエンティフィ
ック・パブリケーションズ、オックスフォード、英国に
記載されている。

本発明の抗原の発現がＩＬ−１活性化内皮細胞上で１ｐ
ｓＳＴＮＦおよび／またはＩＦＮγによって刺激される
かどうかを知るための特定の一方法を実施例４（Ｋ）に
示す。

本発明の抗原がインビトロで慢性動態および／または急
性動態を示すかどうかを知るための一方法を実施例３（
Ｃ）および４（１）に示す。

本発明の抗原がインビボで慢性動態および／または急性
動態を示すかどうかは、慢性あるいは急性の炎症を経験
している組織の血管中での該抗原の発現を観測すること
によって知ることができる。

これは、患者の病歴を知っている熟練した病理学者によ
り行われる常法的な判断であり、湿潤白血球の数および
本質ならびに他の標準的判断基準に基くものである。

該抗原が特定のモノクローナル抗体に結合するかどうか
は、実施例２（Ｂ）に記載のようにフローサイトメトリ
ーを行うことにより決定できる。

休止内皮細胞の細胞質内に抗原が存在するかどうかを知
るための特定の一方法を実施例４（Ｐ）に示した。

要約すると、細胞を、たとえばアセトンまたはエタノー
ルにより、透過性とし、抗体が細胞質内に存在する抗原
と反応できるようにする。つぎに、細胞を、該抗体と反
応する間接的プローブと反応させたのち、常法により可
視化する。たとえば、ヤギ抗マウス抗体に結合させたア
ルカリホスファターゼを間接的プローブとして用いた第
２６図を参照されたい。

活性化内皮細胞表面での抗原の発現がシクロヘキシミド
およびアクチノマイシンＤにより阻害されるかどうかを
知るための特定の一方法を実施例４（０）に示す。

上記方法にかえて使用できる他の方法としては、実施例
２（Ｂ）に記載のようにして行われるフローサイトメト
リーの採用があげられる。

抗原がワイベル−パラド体に局在するかどうかの判定に
は、常法を使用できる。それらの方法は、該抗原が、ワ
イベル−パラド体の主要成分であるフォンーウィリプラ
ン（ｗｏｎ−Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ）因子（ｖ　Ｗ　Ｆ
　）と共に局在するかどうかを判定する（光学顕微鏡に
より観察して）ことを包含する。

要約すると、休止ヒト内皮細胞などの適当な細胞を培養
し、たとえばＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いてはがし、顕微鏡
のガラススライド上へ吐き出す。

細胞をアセトンで固定し、乾燥して細胞を透過性にする
。つぎに細胞を、当該抗体および抗−ｖＷＦ抗体（市販
されている）を用いて、実施例４（Ｐ）記載のように、
二重染色プロトコールによって染色する。染色された細
胞についてｖＷＦの二重染色を調べる。

なお、当該抗体のみによって染色された細胞から、当業
者ならば、その抗体がワイベル−パラド体の中にあるか
どうかを容易に判定できる。

抗原がＩＬ−１刺激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表
面で会合するかどうかを知るための特定の２方法を実施
例４（Ｑ）に記載する。

上記の方法にかえて使用できる他の方法は、Ｄ。

Ｍ、ウェア編、「ハンドブック・オヴ・エクスペリメン
タル・インムノロジー」、第４版、１９８６年、１〜４
巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケ
ーションズ、オックスフォード、英国に記載されている
ように、細胞表面での架橋試薬の使用および免疫共沈を
包含する。

新規な抗原および抗原性断片は常法によって調製、精製
でき、そのいくつかを実施例で詳細に記述する。

ＥＬＡＭ−１断片の精製は、実施例４（Ｂ）記載の免疫
沈降プロトコールによって行いうる。より大きいスケー
ルでの精製には、１Ｅ７または２Ｇ７モノクロ一ナル抗
体（たとえば５ｍｇ）を、メーカー提供の標準プロトコ
ールによってアフィゲル−１０ビーズ（たとえば５−）
（市販品）に結合させ、抗体被覆ビーズに液体（ＥＬＡ
Ｍ−１断片産生細胞の上澄み）を反応させることができ
る。

ビーズをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮによって洗って、非特異的
に結合された物質を除き、マーリン（Ｍａｒｌｉｎ）ら
、ネイチャー、３４４巻７０〜７２頁、１９９０年にＩ
　ＣＡＭ−１断片について記載されているようないくつ
かの標準的手法によって抗原断片を溶出する。

可溶性の形で使用するには、抗原または抗原性断片を合
成的に製造すべきである。抗原を、既知の方法に従って
（たとえばベヴイラクアら、サイエンス、２４３巻１１
６０〜１１６４頁、１９８９年参照）、クローン化し、
配列決定できる。活性部位（単数または複数）の決定も
、ペプチド断片の合成と同様に、標準的手法〔たとえば
ピーターリン（Ｐ　ｅｌｅｒｓｏｎ）とシード（Ｓｅｅ
ｄ）、セル、５４巻６５〜７２頁、１９８８年参照〕に
よる。

新規な抗原および抗原性断片は、本発明のモノクローナ
ル抗体が白血球の活性内皮細胞への結合をブロックする
かどうかを実証するために、そのような結合のブロッキ
ングをアッセイするのに使用できる。当業者ならば、適
当なアッセイ条件を容易に決定できる。

１例として、結合をアッセイしようとする単核細胞を、
抗原または抗原性断片と共に、適当な緩衝液中で適当な
潰度および温度で、全ての抗原結合部位が飽和されるの
に十分な時間、ブレインキュベートする。ブレインキュ
ベーションののち、それら単核細胞を、ひき続いてのペ
プチドの存在下に、活性内皮細胞に加える。非粘着性単
核細胞を緩衝液で洗い去り、活性内皮細胞に結合した細
胞の数を求める。対照として、活性化していない内皮細
胞を用いて並行アッセイを実施できる。

結合を調べようとする細胞の細胞質中へ放射トレーサー
、たとえば５１Ｃｒを、当業界に既知の諸方法により導
入し、細胞外カウントがあれば洗って除き、これらの標
識された細胞を内皮細胞の単層の上に置くことによって
、検出を定量的に行うことができる。

白血球の活性内皮細胞への結合のブロッキングを検知す
るための本発明によるーアッセイ法を実施例４（Ｕ）に
記載する。

本発明の新規抗原は、それらの可溶性の形で、以下の「
炎症性反応を処置するための医薬および方法」と題した
部分で詳述するように、白血球と活性内皮細胞との相互
作用をブロックするのに有用である。

炎症性反応を処置するための医薬および方法本発明はま
た、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置するための医
薬および方法を提供する。

一実施態様では、該薬剤は、 （１）共に先に記載したものであるが、インビトロでの
Ｔ細胞の活性内皮細胞への結合を部分的に阻害する（Ａ
）群のモノクローナル抗体、または（Ｃ）群のモノクロ
ーナル抗体の少なくとも１種またはその結合部位含有断
片あるいはそのモノクローナル抗体または断片の医薬と
して許容しうる塩の医薬としての有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる。

第二の実施態様では、該薬剤は、 （１）前記１Ｅ７／２Ｇ７抗原、ＣＭＰ−１７０抗原お
よびＥＬＡＭ−１の抗原性断片からなる群より選ばれた
少なくとも１柿の実質的に純粋な抗原またはその抗原性
断片あるいは該抗原または断片の医薬として許容しうる
塩の医薬としての有効量を含有してなる。

同様に、一実施態様では、該方法は、上記のインビトロ
でＴ細胞の活性内皮細胞への結合を部分的に阻害する（
Ａ）群のモノクローナル抗体、または上記（Ｃ）群のモ
ノクローナル抗体の少なくとも１種またはその結合部位
含有断片あるいはそのモノクローナル抗体または断片の
医薬として許容しうる塩の医薬としての有効量を処置の
必要な患者に投与することからなる。

第二の実施態様では、該方法は、上記の１Ｅ７／２Ｇ７
抗原、ＣＭＰ−１７０抗原、およびＥＬＡＭ−１の抗原
性断片から選ばれた少なくとも１種の実質的に純粋な抗
原またはその抗原性断片あるいはその抗原または断片の
医薬として許容しうる塩の医薬としての有効量を処置の
必要な患者に投与することからなる。

医薬として、また上記処置法において有用なモノクロー
ナル抗体は、インビトロで白血球のＩＬ−１活性内皮細
胞への結合をブロックできる上記のものと同じであり、
好ましい実施態様では、該モノクローナル抗体は、上記
の２Ｇ７．７Ａ９および３Ｂ７である。

本発明の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）および適当な
ヒト免疫グロブリンの非ＣＤＲ領域からなるキメラ抗体
も使用可能である〔クウィーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、プロ
シーディング・オヴ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ヴ・サイエンシズ、ＵＳＡ、８６巻１００２９〜１００
３３頁、１９８９年〕。

医薬として、また該処置法において有用な抗原は、上記
の新規抗原の全てである。しかしながら、モノクローナ
ル抗体２Ｇ７．７Ａ９および３Ｂ７が特異的に結合する
上記抗原がとくに−Ｇ用であると期待される。

適当な、医薬として許容しうる塩は、当業者が容易に決
定できる。

適当な、薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤
は、当業者が容易に決定できる。例としては、等優性食
塩水（０，１５Ｍ　　ＮａＣｊ７）およびリンゲルの静
脈内注射用グルコース溶液がある。

該薬剤は、当業者により容易に決定される方法により、
たとえば静脈内に、投与できる。

投与すべき適当な用量は、炎症性疾患の性格によっても
異なりうるが、当業者が容易に決定できるところである
。

一般には、ヒトへの静脈内注射に適した用量は、モノク
ローナル抗体またはその結合部位含有断片あるいは抗原
またはその抗原性断片として約２０〜５０ｍｇである。

第１図は、本発明の医薬および処置法がどのように作用
すると考えられるかを、単純化して模式％式％ 該医薬および処置法は、いずれの活性内皮細胞関連炎症
性反応にも適用でき、急性ならびに慢性の炎症に使用で
きる。

該新規抗原を一薬剤中でそれに対応するモノクローナル
抗体と組合せることをしない限り、種々の薬物の組合せ
使用が常に可能なことはもちろんである。

当業者ならば、本発明の医薬および処置法が有用であろ
う炎症性反応を決定することは容易にできる。たとえば
、ｌ１ＩＴｉ瘍細胞介在血管障害、慢性関節リウマチ、
再池流後の心筋障害（顆粒球による障害）および成人呼
吸困難症候群（マクロファージおよび顆粒球）がある。

シンプソン（Ｓ　ｉｍｐｓｏｎ）Ｐ、　　Ｊ、　　ら、
ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴエスティゲイシ
ョン、８１在６２４〜６２９頁、１９８８年：ヴエダー
（Ｖｅｄｄｅ＋）、Ｎ、　　Ｂ。

ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴエスティゲ
イション；サイモン（Ｓ　ｉｍｏｎ）とウォード（Ｗａ
ｒｄ）、炎症；基礎原理および臨床上の相関（Ｉ　ｎｆ
ｌａｍｍａ目ｏｎ：Ｂａ５ｉｃ　　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ
ｓ　ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）
　（Ｊ、　　１．ガリン（Ｇａｌｌｉｎ）、１９Ｍ、　
　ボルドスタイン（Ｇ　ｏｌｄｓｌｅｉｎ）およびＲ，
スナイダマン（Ｓ　ｎｙｄｅｒｍａｎ）編、レイヴン（
Ｒａｖｅｎ）プレス、ニューヨーク、１９８８年〕中の
「成人呼吸困難症候群」、８１５頁；カジソン（Ｋａｄ
ｉｓｏｎ）とバートン（Ｂａｒｊｏｎ）　ｒ脈管炎：血
管損傷の機序」、同上、７０３頁；およびハリス（Ｈａ
ｒｒｉｓ）　ｒ慢性関節リウマチの病因：機能不全性免
疫調節関連疾患」、同上、７５１頁にも、例が開示され
ている。

炎症性反応検知法 本発明は、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する方
法をも提供するものであり、該方法は、（１）生体−皮
を、上記（Ａ）　、（Ｂ）または（Ｃ）群のモノクロー
ナル抗体またはその結合部位含有断片の少なくとも１挿
と接触させ、 （ＩＩ）該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体ま
たはその結合部位含有断片の特異的結合をアッセイする
こと からなる。

該モノクローナル抗体の製造および精製の方法は、既に
上で述べた。

「生体７夜」とは、血清、尿、滑液およびその他の、炎
症から生じる抗原を含有すると予想される体液のすべて
を意味する。

検知は、インビトロでもインビボでも行ないうる。イン
ビトロ検知は、ヤング、Ｗ、Ｗ、ら、ジャーナル・オウ
゛・エクスベリメンタル・メデイシン、１５０巻１００
８〜１０１９百（１９７９年）およびカンナギ（Ｋａｎ
ｎａｇｉ）　、Ｒ，ら、キャンサー・リザーヂ、４３巻
４９９７〜５００５頁（１９８３年）に記載されている
ものなどの、周知のインビトロ免疫アッセイ法のいずれ
を用いても実施できる。さらに、インビボでの検知は、
バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ）、Ｊ、ら、インターナ
ショナル・ジャーナル・オヴ・キャンサー、３４巻７６
３〜７６８頁（１９８４年）；エペネトス（Ｅ　ｐｅｎ
ｅ　１ｏｓ）、Ａ、Ａ、　　ら、ランセット、２巻９９
９〜１００４頁（１９８２年）；チャタル（Ｃｈａｌａ
ｌ）、Ｊ、　−Ｆ、　　ら、ジャーナル・オヴ・ニュク
リアー・メデイシン、２６巻５３１〜５３７頁（１９８
５年）に記載のものなどの、周知のインビボ免疫アッセ
イ法のいずれを用いても実施できる。

生体ｌ戊申の抗原を検知するためのとくに好ましい一方
法はサンドイッチＥＬＩＳＡ手法である。

この方法は、その好ましい形では、当該蛋白質の一エピ
トープに対するモノクローナル抗体をプラスデック製Ｎ
ＵＮＣＥＬＩＳＡデイツシュに付着させることからなる
。これに続いて、生体液中の蛋白質の非特異的結合をブ
ロックするために、ウシ血清アルブミンの１％溶液を加
える。ウェルを洗って未結合蛋白質を除いたのち、生体
液（血液、尿など）をデイツシュに加えて１時間おく。

洗って未結合生体液を除去したのち、当該蛋白質の他の
エピトープに対する第二のモノクローナル抗体を加える
。第二のモノクローナル抗体は、アルカリホスファター
ゼなどの適当なリポータ−分子と結合させておく。一定
のインキュベーション期間ののち、ウェルを洗って未結
合蛋白質を除き、適当な酵素基質（リポータ−分子が酵
素のとき）、たとえばアミノエチルカルバゾールを加え
、反応生成物をＥＬＩＳＡプレートリーダーで定量する
。

サンドイッチＥＬＩＳＡ法実施の一例がロケシスワ−（
Ｌ　ｏｋｅｓｈｗａ＋）とリン（Ｌｉｎ）、ジャーナル
・オヴ・インムノロジカル・メソッズ、１２３巻１２３
〜１２９頁（１９８９年）に記載されている。

該方法は、たとえば、初期移植片拒絶反応あるいは無症
状感染または脈管炎の検知に使用できる。

本発明はまた、抗原１Ｅ７／２Ｇ７をコードするｃＤＮ
Ａ配列、またはその断片、ならびに該ｃＤＮＡ配列また
はその断片を運ぶベクターをも提供する。

該ｃＤＮＡ配列は、実質的に第３４Ａ〜３４Ｄ図に示す
通りの配列からなる。ただし、塩基９５２〜１２２７は
実質的に第３４Ｂ図に示す通りに在在するものとする。

「実質的に示す通り」とは、第３４Ａ〜Ｂ４Ｄ図に示さ
れたｃＤＮＡ配列が塩基の欠失、付加および／または置
換を含んでいてもよいことを意味する。ただし、 （１）該ｃＤＮＡ配列が、抗原１Ｅ７／２Ｇ７またはそ
の抗原性断片の合成を指示するｍ　ＲＮ　Ａを単離する
ためのプローブとして依然として使用できるか、または ■該ｃＤＮＡ配列がコードするリガンドのリガンド結合
性が維持される範囲内とする。

第３４Ａ〜３４Ｄ図に示された通りのまたは実質的に示
された通りのｃＤＮＡ配列の断片とは、リガンド結合性
を維持する１Ｅ７／２Ｇ７抗原の断片をコードする該ｃ
ＤＮＡ配列の断片である。

ｃＤＮＡ配列またはその断片を、抗原１Ｅ７／２Ｇ７ま
たはその抗原性断片の合成を指示する０１ＲＮＡを単離
するためのプローブとしてなお使用できるかどうかは、
当業者ならば、常法によって、必要以上の実験を行わず
に、容易に判定できる。

ｃＤＮＡ配列またはその断片が、リガンド結合性を維持
する蛋白質をコードしているかどうかは、やはり当業者
ならば、以下のように、とくに必要以上の実験をせずに
、常法によって容易に刊断できる。

まず、当業者ならば、可溶化された形態の１Ｅ７／２Ｇ
７ができることおよびその形態でそれが細胞に結合する
ことを証明するであろう。可溶性形態は、細胞質領域お
よびトランスメンブレン領域を欠失させることによりつ
くられる。基本的には、コードする配列の中ヘストップ
コドンを挿入して、これらの領域が翻訳されるのを防ぐ
。この欠失させた形のｃＤＮＡによってＣＯ８細胞を常
法により、たとえばＣａ”＋ショックによりトランスフ
ェクトし、システィンおよびメチオニンの３５Ｓアイソ
トープの存在下で生育させ、これを生育中のＣＯ８細胞
内へ、従って翻訳された抗原の中へ取り込ませる。４８
時間後にこれら細胞の上澄みを集め、抗原の細胞表面へ
の結合を、模擬的にトランスフェクトした細胞と比較し
て、次のように、測定する。

ＡＴＣＣから入手しうる細胞株ＲＡＭＯ３お上びＪＵＲ
ＫＡＴあるいは正常ヒト末梢血単核細胞群（百万個）の
ような適当なタイプの細胞を、模擬またはトランスフェ
クトされた細胞の培養上澄み１　ｍｆｌと共に氷上で約
１時間インキュベートする。

インキュベーション細胞を、ＲＩＡ級ＢＳＡを１％含有
するダルベツコのＰＢＳと共に遠心して洗う。洗った細
胞を、１％ＳＤＳ洗剤１００μｇ中に置いて、室温で５
分間溶解させる。つぎに、溶解細胞ペレットの全体を適
当なシンチレーション液に加え、結合放射能をシンチレ
ーションカウンターで測定する。模擬的にトランスフエ
フｌ−した細胞から得たｃｐｍから上澄み在住下にイン
キュベ−１−した細胞から得たＣｐｎｌを差引いて、特
異的に結合したｃｐｍを求める。

つぎに、ストップコドンをＮ末端に次第に近付けながら
一連の欠失ｃＤＮＡ分子を構築し、蛋白質を発現させ、
その結合を」−記アッセイでテストすることにより、最
小寸法の結合断片を求める。

該ｃＤＮＡ配列は、実施例５記載のようにして、プラス
ミドｐＣＤＮ−１に代えて、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＥＵＫ
−Ｃ２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの市販の哺乳動物用発現
ベクターを用いて、調製できる。

該ｃＤＮＡ配列を運ぶベクターは、当該技術分野で既知
の多くのベクターのいずれであってもよい。

単にｃＤＮＡ配列の増幅が目的のときは、該ベクターは
、いずれも市販されているｐＢＲ３２２、ｐＳＰ７２、
ｐＵＣなどの多くの既知ベクターのいずれであってもよ
い。

ｃＤＮＡ配列の発現を目的とするときは、該ベクターは
、いずれも市販されているｐＥＵＫＣｌ、ｐＥＵＫ−Ｃ
２、ｐＭＡＭ−ｎｅｏなどの、発現制御配列を含有する
多くの既知の哺乳動物用発現ベクターのいずれであって
もよい。

ｃＤＮＡ配列は、常法によってベクターに押入てき、そ
れらベクターは常法によって増殖、発現させることがで
きる。

実施例 以下、特定の実施例によって本発明を説明するが、それ
ら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

特に断わらない限り、パーセント、比、部などは全て体
積基準のものである。

実施例で使用した試薬の入手および／または処理の方法
は下記の通りであるニドライドンＸ１１４はコダックか
ら入手した。これを１０ｍＭトリス緩衝ｌ夜ｐＨ７，４
，０，１５Ｍ　　ＮａＣρで３回抽出して不純物を除い
た。トライトンＸ−１００、ブタ腸ヘパリンおよびコラ
ゲナーセタイプ１はシグマから購入した。トウィーン２
０はアルドリッチから購入した。フェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）はカルビオケムから同人
した。セラチンはバイオラドから同人した。

ビオチニル化ヤギ抗マウス軽鎖試薬およびＦＩＴＣ−ヤ
キ抗マウス試薬はジャクソン・ラボラトリーズから購入
した。アフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇＧはカークガ
ード・アンド・ぺり−・ラボラトリーズから、　１２５
Ｉ−ストレプトアビジンおよび３５Ｓ−システィンはア
マ−ジャムから購入した。組換えヒトＩＬ−１ベータは
、徳島研究所のＹ、ヒライ博士からの恵贈品であった。

この材料は大腸菌から精製すると、還元条件下でのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド）電
気泳動で、１７　ｋ　Ｄ　ａのところに単一のバンドを
与えた。以下の実施例に使用するのに適したＩＬ−１は
市販品を人手することもできる。潰瘍壊死因子アルファ
（ＴＮＦ）はジエンザイムから購入した。比活性３００
８Ｕ／ｍｇ蛋白質のヒトαトロンビンは、ジョン・Ｗ、
フェントン（Ｆｅｎｌｏｎ）の好意により入手した。大
腸菌リポ多糖（Ｉｐｓ）はデイフコから入手した。Ｂ２
同族体としてのツニカマイシンはベーリンガー・マンハ
イムから購入した。Ｔ４、Ｔ８、Ｂ１およびＭ　ｏ　２
モノクロ一ナル抗体は、コールタ−社から購入した。Ｗ
６／３２抗体は、アキュレット・ケミカル・アンド・サ
イエンティフィック社から購入し、ＲＲ／１抗体はティ
モジ・スプリンガー（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ）博士からの
恵贈品、１０Ｅ５抗体はバリー・コラ−（Ｃｏｆｆｅｒ
）博士からの恵贈品であり、ＭＯＰＣ−２１骨髄腫蛋白
質はＡＴＣＣから入手したＰ３ｘ６３Ａｇ８細胞株の培
養上澄みから精製した。

実施例１ 活性ヒト内皮細胞に特異的な モノクローナル抗体の調製 （Ａ）細胞培養：病院の検閲部の許可を得て入手した廃
棄脈帯を、ジャッフエ（Ｊａｌｌｅ）　　（ジャーナル
・オヴ・クリニカル・インヴエステイゲイション、５２
巻２７４５〜２７５６頁、１９７３年）の操作法に従い
、これを若干改良して、ヒト晒静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ
Ｃ）を得た。要約すると、細胞をコラゲナーゼ処理によ
って血管壁からはがし、ゼラチン被覆組織培養フラスコ
を用い、下記の培地中で培養した。ワイベル−パラド体
の存在および生細胞によるアセチル化低密度リポ蛋白質
の取込みによって、細胞が９５％以上内皮細胞であるこ
とを確認した。細胞を、２０％の低内毒素ウシ胎児血清
（ＥＣ８、ハイクローン）、９０μｇ／−の保存剤不含
ブタヘパリン、２０μｇ／−の内皮細胞成長用補足物（
ＥＣＧＳ）（コラボラティヴ・リサーチから入手）、グ
ルタミンおよび抗生物質を含有するＭ１９９培地（以下
「生育培地」）山で培養した。ウシ視床下部から冷却ブ
レングー中での食塩水抽出、４°Ｃでの２時間撹拌およ
び不溶物除去のための１４０００ｇまでの遠心分離によ
ってＥＣＧ５を調製した。脂質の除去および０．４５ミ
クロンフィルターでの濾過ののち、アリコートを凍結乾
燥した。ヒト顆粒球ヲ、フィコール−ハイバック（ＦＩ
ＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ）を用いての遠心分離により
単核細胞を除去したヘパリン化末梢血から取得した。顆
粒球／赤血球ペレットを３％デクストラン上で沈降させ
て赤血球の大部分を除去した。残留赤血球は、必要によ
り、低張食塩水で溶解させた。顆粒球の純度は、ウェイ
トーギームザ染色で求めるとき、９５％以上であった。

フィコール−ハイパツクｌ後の単核層からヒトＴ細胞を
調製した。これらの細胞から、ナイロン−羊毛カラムを
通すことによってＢ細胞および単球を除いた。得られた
細胞は、市販のモノクローナル試薬を用いてのフローサ
イトメトリーで求めたところ、Ｍ　ｏ　、１７またはＢ
１陽性細胞含量５％未満であった。正常ヒト表皮ケラチ
ノサイトはクローネティック社から人手した；繊維芽細
胞はヒト包皮組織からの外植によって得、ヒト血小板は
、正常供血者の酸−クエン酸塩−デキストロース抗凝固
性化血から得た。血小板は数回洗い、１％ＢＳＡ含有Ｃ
ａ＋＋不含ＰＢＳに再懸濁した。

（Ｂ）ハイブリドーマ産生：８迎合の雌性Ｂａ１ｂ／　
ｃ　７ウスに、３×１０６個のＩＬ−１（４時間）活性
化ＨＵＶＥＣを１０日問おきに４回、腹腔内注射した。

最後の注射は融合の３〜４日前とした。

牌臓を無菌的に摘出し、注射器のプランジャーで細かく
ほぐし、洗い、融合相手の５Ｐ２１０　（ファゼカス◆
デ・セント◆グロス（Ｆａｘｅｋａｓ　ｄｅＳ　ｌ、　
Ｇｒｏｌｈ）　、Ｓ、　　とシャイブツガ−（Ｓｃｈｅ
ｉｄｅｇｇｅｔ）　、Ｄ、　、ジャーナル・オヴ・イン
ムノロジカル・メソッズ、３５巻１〜２１頁、１９８０
年〕と５＝１の割合で混合した。これら細胞を、前述〔
コーラ−１Ｇ、とミルスティン、Ｃ１、ネイチャー　２
５６巻４９５〜４９７頁、１９７５年〕のように、ポリ
エチレングリコールを用いて融合させ、フィーダー層と
してＢａｌｂ／Ｃマウスからの内在腹膜滲出液細胞を含
む９６ウ工ルマイクロタイタープレート６〜８枚に植え
た。やはり９６ウエルプレート中の休止またはＩＬ−１
活性化（１ｎｇ／−のＩＬ−１の添加により４時間活性
化）ＨＵＶＥＣのコルフルエンドな単層上で、スクリー
ニングを行った。培養上澄みを単層のＨＵＶＥＣと４°
Ｃで６０分間反応させたのち、細胞を洗い、ビオチニル
化ヤギ抗マウス軽鎖抗体と共に４℃で３０分間インキュ
ベートした。

さらに３回洗ったのち、細胞を、ウェル当り０．３μＣ
ｉの】２５■−ストレプートアビジンと共に４°Ｃで１
５分間インキュベートした。最後に洗ったのち、細胞を
、１％トライトンＸ−１００洗剤溶液で溶解させ、アリ
コートをガンマ−カウンターで計７１１１１した。ハイ
ブリドーマを、ＩＬ−１処理ＨＵＶＥＣとのみ反応し、
無処理ＨＵＶＥＣとは反応しない抗体を分出する能力に
基いて、選択した。

この方法により、所望のモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマ細胞株５株を得た。これらのハイブリド
ーマ細胞株およびそれらが生産するモノクローナル抗体
をＩＦ５．２Ｇ７．３Ａ２．７Ａ９および３Ｂ７と名付
けた。それらハイブリドーマは、メリーランド州ロック
ヴイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンに寄託されていて、寄託番号はそれぞれＨＢ１０１３
６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８、ＨＢ１０１３５
およびＨＢ１０３９１である。

さらに、上記のプロトコールを、１３回にわたり、合計
７１枚のマイクロタイタープレートのハイブリドーマ候
補について実施した。最初の融合で、１Ｅ７ハイブリド
ーマ細胞株を得た。８回目の融合で、２Ｇ７および３Ａ
２ハイブリド一マ細胞株を得た。７Ａ９ハイブリド一マ
細胞株は１０回目の、３Ｂ７ハイブリド一マ細胞株は１
３回目の融合で得られた。それゆえ、１３回の実験のう
ち２回が、発明の詳細な説明に記載の（Ａ）群モノクロ
ーナル抗体の所望の特性を持つモノクローナル抗体（１
Ｅ７および２Ｇ７）を与えた；１３実験のうちの１回が
、詳細な説明に記載した（Ｂ）群モノクローナル抗体の
望ましい特性をもつモノクローナル抗体（３Ａ２）を与
えた；１３実験のうちの２回が、詳細な説明に記載した
（Ｃ）群モノクローナル抗体の所望特性をもつモノクロ
ーナル抗体（７八９および３Ｂ７）を与えた。これは、
当業者にとっては不適当な実験ではなく、この実験操作
において決定的に重要な段階が欠けているということも
ない。かくして、上記および発明の詳細な説明に記載し
た（Ａ）　　　（Ｂ）および（Ｃ）　ｆｆＹモノクロー
ナル抗体製造法は、再現性のある方法である。

特に断わらない限り、以下の実施例で使用したモノクロ
ーナル抗体は全て、ＤＥＡＥイオン交換カラムてのＨＰ
ＬＣまたはＡ蛋白−セファロースでのアフィニティクロ
マトグラフィーにより、・常法に従って精製したもので
ある。

実施例２ モノクローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７． ３Ａ２．７Ａ９および３Ｂ７の特性 （Ａ）アイソタイプの決定：インディアナ州インデイア
ナポリスのベーリンガー・マンハイムから入手した、必
要な試薬を全て含んでいるキット「スクリーンタイプ」
を用いて、アイソタイプを決定した。アイソタイプ決定
は、メーカーの指示に従って実施した。

結果を第１表にまとめたが、次の通りであった：１Ｅ７
−１ｇＧ２ａ　；２Ｇ７−ＩｇＧ１　；３Ａ２−ＩｇＭ
；７Ａ９−１ｇＧ１　；３Ｂ７−１ｇＧ２０ （Ｂ−１）休止またはＩＬ−１活性化内皮細胞へのモノ
クローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７．７Ａ９および３Ｂ７の
結合： 抗体１Ｅ７．２Ｇ７．７Ａ９および３Ｂ７は、実施例１
記載のようにして、ＩＬ−１処理対未処理ＨＵＶＥＣを
用いたプレート結合アッセイで見出されたものである。

それらの対照またはＩＬｌ内皮細胞との反応性を、下記
のように、フローサイトメトリーによって解析し、抗Ｈ
ＬＡモノクローナル抗体Ｗ６／３２およびＩ　ＣＡＭ−
１に対する抗体ＲＲ／１と比較した。抗体は全て、予備
実験で求めた飽和用量で使用した。

要約すると、ＩＬ−１で４時間活性化した内皮細胞をマ
イクロタイターウェル中０．　１〜１０ｔｔｇ／ｒｄＪ
の濃度の抗体で処理し、洗い、つぎにＦＩＴＣ−ヤギ抗
マウス間接試薬と共にインキュベートシた。細胞をフロ
ーサイトメトリーによって解ＩＪ↑し、極大蛍光が得ら
れる最小用量を飽和用量とした。

フローサイトメトリーは次のように行った：内皮細胞を
培養器から２ｍＭ　　ＥＤＴＡ含Ｙ″′ＴＰ　ｒ″Ｓを
用いて３７℃で５分間かけてはがした。脱着細胞を、冷
却した１％放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）用ＢＳＡおよび
０、（６）２％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ／Ｅ
ＤＴＡを用いておだやかにピペッティングして、単個細
胞懸濁液をつくった。丸底９６ウエルプレートを用い、
５０万個の細胞を、１％ＢＳＡおよび０、（６）２％す
トリウムアジド含有ＰＢＳ　（洗浄緩衝波）中に飽和用
量のモノクローナル抗体を含有する１００μｇ中で、イ
ンキュベーションた。４°Ｃで３０分間のインキュベー
ションののち、細胞を３回洗い、１．５μｇ／−のＦＩ
ＴＣ−ヤギ抗マウス試薬（ジャクソン・インムノリサー
チ・ラボラトリーズ）を含有する洗浄緩衝波１００μρ
中でインキュベートした。対照として、細胞を第２段階
の試薬のみとインキュベ−１−した。さらに４℃で３０
分間のインキュベーションののち、細胞を３回洗い、再
懸濁して分析に付した。実際には、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マ
ウス試薬を用いて、蛍光のバックグランウドレベルを見
積る。ＦＩＴＣ−アビジンのみで処理された細胞の９５
％を含むようにカットオフ点を定める。

特定のりガント結合ののちに蛍光強度増大方向ヘシフト
した細胞の割合によって、陽性細胞のパーセントが定ま
る。フローサイトメトリーは、アルゴンレーザーおよび
石英フローセルを備えたコールタ−５４１型で実施した
。

結果を第２表に示すが、そこでは、上記ＦＩＴＣ−ヤギ
抗マウス（ＦＧａＭ）試薬（第２Ａ図＃１）またはＷ６
／３２抗ＨＬＡプラスＧａＭ（第２Ａ図＃２）あるいは
モノクローナル抗体１Ｅ７（第２Ｂ図）、２Ｇ７（第２
Ｃ図）、７Ａ９（第２Ｄ図’）　、３Ｂ７　（第２Ｅ図
）またはＲＲＩ（ＩＣＡＭ−１）（第２Ｆ図）に続いて
ＦＧａＭて染色された脱着細胞が示されている。試薬は
全て飽和用量で使用した。各ヒストグラムは２５０００
細胞の分析粘果を示す。横軸の各２５チヤンネル当り、
蛍光強度ａ、ｕ、　　−任意単位がほぼ２倍になる。任
意単位で表わした細胞数が縦軸に表わされている。誘起
なしく・・・）、ＩＬ−１誘起（−）ＵＶＥＣ０ 第２図は、刺激しなかったＨＵＶＥＣ上にＩＣＡＭ−１
蛋白質が存在し、先に報告されているように（ダスティ
ンとスプリンガー、ジャーナル・オヴ・セルラー・バイ
オロジー　１０７８３２１〜３３１頁、１９８８年）、
ＩＬ−１刺激後に約８倍に増加するが、ＩＬ−１刺激後
にはＨＡＬ蛋白質は増加しないことを示している。しか
し、アッセイした４種の新規抗体のいずれもが無刺激細
胞上には検出できず、刺激ＨＵＶＥＣ母集団内では弱い
ないし強い陽性の不均一な抗原分布を示している。これ
らの抗原はいずれも、それらの極大蛍光強度において、
はぼチャンネル１５０のところに平均蛍光強度をもつＨ
ＬＡ蛋白質（第２Ａ図＃２）に量的に匹敵している。Ｈ
ＵＶＥＣのこれら活性化抗原の発現の不均質のため、意
味のあるスキャッチャードの細胞当り部位数の分析はで
きなかった。この不均一性は、カバーストップ上の単層
中の細胞を調べたときにも確認され、ＩＬ−１曝露の時
間または用量には影響されなかった（データは示されて
いない）。

（Ｂ−２）１Ｅ７／２Ｇ７　　ｃＤＮＡでトランスフェ
クトされたＣＯ８細胞へのモノクローナル抗体１Ｅ７．
２Ｇ７および３Ｂ７の結合： 実施例５記載のように調製された、１Ｅ７／２Ｇ７　　
ｃＤＮＡ形質転換又は模擬形質転換ＣＯ３細胞を用いて
結合を実施した。ＣＯ８細胞（２×１０４／ウエル）を
、アッセイの２４時間前、トランスフェクションの４８
時間後に、９６ウエル平底マイクロタイタープレートに
植えた。細胞を、培地のみと（対照）またはそれぞれ５
μｇ／−の各モノクローナル抗体と、４℃で６０分間イ
ンキュベートした。３回洗ったのち、細胞をビオチニル
化ヤギ抗マウス抗体と共に４℃で３０分間インキュベー
トした。３回洗ったのち、細胞を、ウェル当り０．３μ
ｇの１２５■−ストレプトアビジンと共に、４℃で１５
分間インキュベートシた。最後に洗浄後、１％トライト
ンＸ−１００で細胞を溶解し、アリコートをガンマ−カ
ウンターで計測した。

結果を第３図に示す。第３図は、モノクローナル抗体１
Ｅ７および２Ｇ７は、１Ｅ７／２Ｇ７ｃＤＮＡでトラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞に結合するが、３Ｂ７（抗
ＥＬＡＭ−１）は結合しないことを示している。

（Ｃ）モノクローナル抗体のブロッキング活性：廃棄縛
帯から内皮細胞を実施例１記載のようにして採取し、培
養した。細胞は急速に増殖し、恐らくはインビトロ生育
条件の結果としてそれらを区別する性質が減退するまで
に、６回まで他のフラスコに分割（継代）した。２回目
の植継ぎにより、ブロッキングアッセイを行うのに十分
な細胞が得られていた。組換えヒトＩＬ−１ベータを、
濃度１ｎｇ／ａｌｌとなるように細胞に加え、通例通り
細胞を６％ＣＯ２，９４％空気を含有する加湿培養室中
に維持しながら４〜６時間培養した。対照は、ＩＬ−１
不存在下に内皮細胞を培養することからなっていた。培
養期間後、細胞を培地で洗って使われなかったＩＬ−１
を除き、それぞれのモノクローナル抗体を０、（６）０
１６〜１０μｇ／ｍｌＪの範囲内の濃度で加え、３７℃
に１時間保った。

常法で得たモノクローナル抗体２Ｇ７のＦ（ａｂ′）２
回片もこのアッセイに使用した。

結合を調べんとする細胞を３０〜６０分間上にのせて付
着させた。使用した細胞は、ヒト単球、顆粒球、または
Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる単核細胞混合物
であった。これらの細胞は当業界で既知の方法により単
離、精製した。非付着性細胞を生育培地で洗い落し、無
処理またはＩＬ１処理内皮細胞（Ｅ　Ｃ）に結合された
細胞の数の差を観測した。

このアッセイを、放射性トレーサー、たとえば５１Ｃｒ
を当業界で既知の方法によって結合研究対象細胞の細胞
質内へ導入し、細胞外のカウントを洗い除き、これらの
標識細胞をＥＣの単層上に置いた。この目的で用いた５
　１　Ｃｒ標識は、３０〜６０分間の結合アッセイの間
に極小の漏出しか示さなかった。洗って非付着性細胞を
除去したのち、単層を洗剤で可溶化した。各ウェルから
カウントされた放射能を結合細胞数の尺度とした。

モノクローナル抗体２Ｇ７のＦ（ａｂ’）２回片の種々
用量および１０μｇ／−のモノクローナル抗体１Ｅ７に
よる単核細胞結合の阻害を示す結果を第４図に示す。そ
れらの結果は、ＩＬ−１活性化内皮細胞の前処理に使用
するとき、モノクローナル抗体２Ｇ７は、ヒト単核細胞
の内皮細胞への結合の用量依存的部分阻害を惹起するが
、モノクローナル抗体１Ｅ７はそうでないことを示して
いる。モノクローナル抗体７Ａ９の Ｆ（ａｂ’）２断片も、第１表に示すように、用量依行
的細胞阻害を示した。

試験した４種のモノクローナル抗体量てについての結果
を第１表にまとめた。

第１表は、本発明のモノクローナル抗体の性質を公表さ
れている極めて近い抗体の性質と比較している。Ｈ４／
１８は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対して報告された最初
の抗体である（ポーバーら、ジャーナル・オヴ・インム
ノロジ−１３６巻１６８０〜１６８７頁、１９８６年）
。Ｈ１８／７は、ＩＬ−１刺激内皮細胞に対して生じる
モノクローナル抗体で、ＩＬ−１刺激内皮細胞への顆粒
球の付置を部分的にブロックする（ベヴイラクアら、プ
ロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカデミ−
、オヴ・サイエンシズ、８４在９２３８〜９２４１頁、
１９８７年）。Ｓ１２は、活性血小板に結合するモノク
ローナル抗体で、本発明のモノクローナル抗体３Ａ２に
最も近いと考えられる〔マツケウ゛アー（ＭｃＥｖｅｒ
）とマーティン（Ｍａｒｌｉｎ）、ジャーナル・オヴ・
バイオロジカル・ケミストリー　２５９巻９７９９〜９
８０４頁、１９８４年〕。しかし、予想外なことに、モ
ノクローナル抗体３Ａ２はＩｇＭのアイソタイプをもち
、一方Ｓ１２のアイソタイプはＩｇＧ１である。ＩｇＭ
というアイソタイプは、モノクローナル抗体としては若
干異例である。ＫＣ４は、抗血小板モノクローナル抗体
である〔スーーリン（Ｈｓｕ−Ｌｉｎ）ら、ジャーナル
・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５９巻、９
１２１〜９１２６頁、１９８４年〕。既発表のモノクロ
ーナル抗体のうち、ＫＣ４は、本発明のモノクローナル
抗体３Ａ２の特異性に最も近い特異性をもつ。

しかし、モノクローナル抗体ＫＣ４のアイソタイプはＩ
ｇＧ１であるが、モノクローナル抗体３Ａ２は予想外の
アイソタイプＩｇＭをもつ。４Ｄ１０は、ＩＬ−１刺激
内皮細胞に対して特異性をもつラットモノクローナル抗
体である（ゲルトら、エクスペリメンタル・セル・バイ
オロジー　５５券１１７〜１２６頁、１９８７年）。モ
ノクローナル抗体４Ｄ１０は、本光叩のモノクローナル
抗体とは門白な関係を持ってはいない。しかし、モノク
ローナル抗体４Ｄ１０が結合する抗原が、モノクローナ
ル抗体７Ａ９が結合する抗原と分子量において極めて近
い。

第１表の比較は、本発明のモノクローナル抗体が、公表
されている近似のモノクローナル抗体と比較して、予想
外の性質をもつことを明らかにしている。

（Ｄ）顆粒球結合の阻害： ＩＬ−１活性化ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃへの未刺激顆粒球の付
着における２秤の蛋白質１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ７／
７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）の４９のエピトープの相対的
重要性を、次のようにして調べた。

第４代またはそれ未満のＨＵＶＥＣをゼラチンをプレコ
ートした２４ウエルプレー１・に植え、４８時間または
コンフルエントになるまで培養した。細胞培養を、１０
％ＦＣ３自有ＲＰＭ１１６４０中で１　ｎｇ／−のＩＬ
−１に曝露するか、または、細胞をＲＰＭＩ−１６４０
プラス１０％ＦＣ８（洗浄培地）のみで培養した。３７
°Ｃで４時間のＩＬ−１曝露ののち、培養を洗浄培地で
１回洗った。この時点で単層を、洗浄培地で希釈した抗
体のＦ　（ａｂ’）２回片と共に３７°Ｃで３０分間イ
ンキュベートした。（予備実験の結果、ＨｌＪＶＥＣと
顆粒球が後者のＦＣＳレセプターを介して架橋するのを
避けるためにＦ　（ａｂ’）２回片を使用することの必
要性が判明していた。）対照ウェルは、洗浄培地のみま
たは１０μｇ／−の精製骨髄腫蛋白質ＭＯＰＣ−２１を
含有していた。全ての実験を３回ずつ行った。単層を、
抗体の存在下に、０、　５−中の５１Ｃｒ標識顆粒球約
１０”個と重ねた。３７℃で４５分後、単層を、室温で
洗浄培地により２回静かに洗った。残った付着性顆粒球
を、１％トライトンＸ−１００のＰＢＳ７８液３００μ
ｌにより溶解させた。この半ｆｆ１（１５０μＱ）をガ
ンマ−カウンターで計算した。モノクローナル抗体によ
る顆粒球結合阻害百分率を次のように計算した＝［（実
験−基礎ｃｐｍ）÷（ＩＬ−１誘発ｃｐｍ−基礎Ｃｐｍ
）］　Ｘ１００゜ＩＬ−１基礎の値は、誘発可能な結合
度を表わす。

１００個の洗った顆粒球によって取込まれる”Ｃｒｆｆ
１を用いて、データをｃｐｍ／ウェルから結合細胞数／
ウェルに換算した。溶解に先立って常に単層を点検して
、ＨＵＶＥＣの脱離が起っていないことを確認した。

Ｆ　（ａｂ’）２回片は、パーハム（Ｐａｔｈａｍ）の
方法（ジャーナル・オヴ・インムノロジー　１３１巻２
８９５〜２９０２頁、１９８３年）に従って調製した。

ペブンンを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）中の
精製モノクローナル抗体に＼ｖ　／　ｗ比１：５０で添
加した。／ｉ′１化は３７°Ｃて一夜進行させた。ペブ
ンンの除虫はイオン交換クロマトグラフィーによって達
成した。還元性および非還元性ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドケル（１０％アクリルアミド）により消化をモニタ
ーし、１Ｌ−１活性化ＨＵＶＥＣの結合活性をフローサ
イトメトリー（上述の通りに実施）で求めたところ、未
消化抗体を用いて得られたものと同等であることが証明
された。

還元的および非還元的ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を実施するための方法および試薬は、ポニー・
Ｓ・ダンパー　「二次元電気泳動および免疫学的手法」
、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８７年中に記載
されている。

代表的な一実験の結果を第５図に示す。結果は、ウェル
当りの結合細胞数士ｓ、ｅ、ｍ、　（ＩＩ＝１３）で表
わされている。

結果は、抗ＥＬＡＭ−１抗体が抗体１Ｅ７および２Ｇ７
よりもより阻害的であることを示している。６９の実験
の結果を要約すると、試験に用いた最大容量（１０μｇ
／−）でＩＦ５および２Ｇ７は０％および３％の顆粒球
結合用害を示したが、一方、３Ｂ７抗体は平均８１％の
、７Ａ９抗体は平均９５％の、すなわち完全な阻害を、
共に１０μｇ／−で示した。３Ｂ７および７Ａ９抗体は
、ＥＬＡＭ−１の重複しないエピトープを規定するもの
であるが、それらの作用は相加的とは思われない（デー
タは示さない）。７Ａ９および３Ｂ７ともに、０．４μ
ｇ／ｒ！ｉｆＩという低用量で、有意の顆粒球結合阻害
が見られた。顆粒球は１Ｅ７／２Ｇ７抗原も３Ｂ７／７
Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原も発現しないので（第４表
）、当業者ならば、観察されたそれらの作用は内皮細胞
レベルでの抗体の作用によるものである、と結論できる
。

（Ｅ）Ｔ細胞結合の阻害： モノクローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７．７Ａ９および３Ｂ
７がＩＬ−１活性化内皮細胞へのＴ細胞の結合を阻害す
る能力を、顆粒球結合阻害について述べ方法によって求
めた。ただし、顆粒球に代えてナイロン−羊毛非付着性
Ｔ細胞を用い、各ウェルに０．９Ｘ１０８個のＴ細胞を
加えた。

これら４種のモノクローナル抗体についてＩＬ１活性化
内皮細胞への無刺激、ナイロン−羊毛非付着性Ｔ細胞の
付着におけるブロック能をテストして得られた結果を、
代表的な一実験について第６図に示す。第６図の右に示
した併用実験において、各抗体の最終濃度は１０μｇ　
／　ｍｌＪであった。

表現型解析の結果は、５４％ＣＤ４＋、３２％ＣＤ８＋
、２％Ｍ　ｏ　２　＋　（ＣＤ　１４　）および４％Ｂ
１＋（ＣＤ２０）であった。結果は、ウェル当り結合細
胞数±ｓ、ｅ、ｍ、　（ＩＩ＝３）として表わされてい
る。

第６図は、顆粒球の場合と同様に、１Ｅ７抗体は試験し
た最大用量（１０μｇ　／ｒｎＩＪ）で結合阻害を示さ
ないことを示している。ＭＯＰＣ−２１骨髄肺蛋白質（
ＩｇＧ１）も、別の実験で、Ｔ細胞結合阻害を示さなか
った（データは示さない）。

しかし、他の３種の抗体の各々について、用量依存性の
部分的阻害が一貫してみられた。６実験においての平均
阻害率は、２Ｇ７抗体で３４％であり、３Ｂ７および７
Ａ９抗体については、それぞれ２１％および３７％とい
う値が得られた。これらの抗体が異なる構造上の異なる
エビ）・−ブを規定しており、４種のうちの３柿が阻害
性であるので、混合実験を行った。代表的な一実験を第
６図の右方に示す。ここで、２種の抗ＥＬＡＭ−１抗体
、３Ｂ７および７Ａ９は、各々１０ｔｔｇ／−で、３１
％の阻害を示したが、これは３Ｂ７　（１９％）または
７Ａ９（４０％）を用いて個々に得られた結果を加算し
た値ではない。しかし、抗ＥＬＡＭ１抗体のいずれかを
２Ｇ７抗体と組合せると（３１０μｇ／−で）、相加的
な値が得られた。

すなわち、２Ｇ７プラス７Ａ９の組合せは６８％のド■
書を生じ（２Ｇ７での２９％および７Ａ９での４０％と
いう個々の結果に対し）、２Ｇ７プラス３８７は６６％
の阻害を示した（２Ｇ７での２９％、３Ｂ７での１９％
に対し）。これらの結果は、さらに２回の実験で確認し
た。ＩＬ−１に関して第６図で個々の抗体について見ら
れる阻害を比較するためのｐ値は、２Ｇ７．３Ｂ７及び
７Ａ９抗体が個々に統計上有意な阻害を与えることを示
している（それぞれのｐ値０、（６）００９、（６）、
（６）１および０、（６）０２）。２Ｇ７と３Ｂ７また
は７Ａ９との組合せは、それぞれ単独の抗体よりも有意
に優れている。（いずれの組合せのｐ値も０、（６）０
１未満）。

３Ｂ７プラス７Ａ９の組合せは、各抗体単独に比して有
意に優れてはいない。１Ｅ７／２Ｇ７抗原も３Ｂ７／７
Ａ９抗原も７０％がＴ細胞である末梢血リンパ球上には
存在しないので、第１５図に示された作用は、内皮細胞
」二の抗原の役割に帰することができる。

実施例３ 本発明のモノクローナル抗体と公表されている抗体との
特異性比較 （Ａ）抗原サイズ： 植継ぎ回数の少ない（ｐ６未満）のヒト杭静脈内皮細胞
（ＨＵＶＥＣ）の１００ｍｍ組織培養皿中のコンフルエ
ントな培養を一夜、低メチオニン含有培地中に置いた。

翌日、ＩＬ−１を１　ｎｇ／−となるよう加え、３５Ｓ
−メチオニン（アマ−ジャム）を、２５０μＣｉ／１０
’細胞の割合で加えた。

対照にはＩＬ−１を加えなかった。３７℃で６時間培養
後、単層を水冷したダルベツコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ
−ＰＢＳ）で３回洗い、１％トライトンＸ−１００細胞
溶解用緩衝溶液２５０μＱで溶解させた。

ナンクＥＬＩＳＡ用９６ウエルマイクロタイタープレー
！・を、０、（６）５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）１０
０μＱ中のアフイニティ精製ヤギ抗マウス抗体２５　Ｉ
Ｚ　ｇと共に、室温で１時間インキュベートした。ウェ
ルをＰＢＳ−０，０５％トウィーン２０で１０回洗い、
続いて、１％Ｂ５Ａ１００μＱを室温で１時間加えた。

各ウェルに、ＢＳＡの存在下に、精製モノクローナル抗
体５μｇを室温で次の１時間加えた。ＰＢＳ−トウィー
ンで１０回洗ったのち、細胞溶解物１〜３×１０ｅｃｐ
ｍを各ウェルに４°Ｃで２時間、ゆるやかに揺り動かし
ながら加えた。ウェルをＰＢＳ−トウィーンで洗い、乾
燥し、還元性試料緩衝液で抽出し、還元性または非還元
性のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）にかけた。

ゲルは、３Ａ２および７Ａ９試料の場合は８％アクリル
アミド、ＩＦ５および２Ｇ７試料の場合は１０％アクリ
ルアミドとした。

結果を第７図および第８図に示すと共に、第３表にまと
めた。結果は次の通りであった（カッコ内の値は３回の
実験の結果の平均値である）＝（１）モノクローナル抗
体１Ｅ７およびモノクローナル抗体２Ｇ７処理溶解物は
、還元条件下で１２５　（１１４）ｋＤａに強いバンド
を、９７（９５）ｋＤａに弱いバンドを、非還元条件下
で９９　（１００）ｋＤａに強いバンドを、８７（９３
）　ｋ　Ｄ　ａに弱いバンドを示した（還元条件下での
結果は図面には示されていない）；（２）モノクローナ
ル抗体３Ａ２処理溶解物は、還元および非還元条件下で
１７７　（１７０）ｋＤａに１本のバンドを示した； （３）モノクローナル抗体７Ａ９処理溶解物は、還元条
件下で１００　ｋ　Ｄ　ａに１本のバンドを、非還元条
件下で９０　ｋ　Ｄ　ａに１本のバンドを示した。

後述の実施例４に示したように、モノクローナル抗体１
Ｅ７および２Ｇ７が特異的に結合する抗原は、モノクロ
ーナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が特異的に結合する抗原
と同じ抗原である。

（Ｂ）抗原分布ニ 一般的な結合アッセイを次のように実施した：２０、０
ＯＯＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃを、９６ウエルマイクロタイター
プレートの各ウェルのゼラチン被覆表面上に植えた。培
養を一夜生育培地（実施例１参照）中に置いて十分に付
着させた。次の日、細胞を１　ｎｇ／−のＩＬ−１に４
時間曝露し、洗い、個々に５μｇ／−の各モノクローナ
ル抗体と共にインキュベートした。対照は、ＩＬ−１に
曝露しないＨＵＶＥＣまたはＩＬ−１に曝露したが抗体
には曝露しなかったＨＵＶＥＣからなっていた。４℃で
１時間のインキュベーションののち、細胞を洗い、１／
１０００希釈のビオチニル化ヤギ抗マウス試薬と共にイ
ンキュベートした。４℃で３０分間ののち、細胞を洗い
、１／１０希釈の１２５１−ストレプトアビジンに曝露
した。４℃で１５分間ののち、細胞を洗い、トライトン
Ｘ−１００洗剤（１％）で溶解し、アリコートをガンマ
−カウンターで計測した。

Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球などの非付着性細胞のアッセイ
には、培地除去前にプレートを遠心分離機にかけて細胞
をペレット化した。細胞を適当な培地に再ｇＨして次の
インキュベーションに用いた。

結果を第９図に示す。第９図は、４種のモノクローナル
抗体１Ｅ７．３Ａ２．７Ａ９および２Ｇ７の全てがＩＬ
−１活性化ヒト内皮細胞（ＨＥＣ）に結合するが、正常
な休止ＨＥＣには有意には結合しないことを示している
。このことは、モノクローナル抗体１Ｅ７．３Ａ２．７
Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原が、実施例２で報告し
た結果と合致して、ＩＬ−１活性化ＨＥＣ上に存在する
ことを意味する。

４種のモノクローナル抗体の各々に対応する抗原の行在
を、上記の一般的な結合アッセイと同様にして調べた。

ただし、内皮細胞に加えて、他の細胞タイプも使用し、
ＩＬ−１とのインキュベーションの時間は（上と同様）
４時間とした。他の細胞タイプは、ヒト線維芽細胞（Ｍ
ＲＨＦ）　、ケラヂノサイ１−（ＫＨＥＩＯおよび内皮
細胞（ＨＵＶＥＣ）であった。

結果を下記第２表に示す。

第２表のデータは、４種のモノクローナル抗体１Ｅ７．
３Ａ２．７Ａ９および２Ｇ７の全てがＩＬ−１活性化Ｈ
ＥＣに結合するが、正常な休止またはＩＬ−１活性化表
皮ケラチノサイトあるいは休止またはＩＬ−１活性化ヒ
ト線維芽細胞には有意には結合しないことを示している
。このデータは、モノクローナル抗体１Ｅ７．３Ａ２．
７Ａ９および２Ｇ７が結合する抗原がＩＬ−１活性化Ｈ
ＥＣ上にあることを示す。

上記の一般的な結合アッセイと同じプロトコールを用い
た。ただし、内皮細胞を用いる代りに、顆粒球および単
核細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）を用いた。顆粒球
および単核細胞は、既知の方法に従って、ヒトヘパリン
化血からフィコールハイバック分離によって単離した。

結果を第１０図に示す。第１０図は、４種のモノクロー
ナル抗体１Ｅ７．３Ａ２．７Ａ９および２Ｇ７が、正常
な休止またはＩＬ−１活性化ヒト顆粒球または単核細胞
の混合物に有意には結合しないことを示している。

このデータは、第９図および第２表のデータと共に、モ
ノクローナル抗体１Ｅ７．３Ａ２．７Ａ９および２Ｇ７
がＩＬ−１活性化ＨＥＣに対して特異的であることを示
す。

（Ｃ）インビトロでの抗原動態： それぞれのペトリ皿（直径３５ｍｍ）に、プラスチック
をゼラチン被覆したのち、ＨＵＶＥＣを植えた。生育培
地（実施例１に記載）を加え、細胞をｌｎｇ／ａｌｌの
ＩＬ−１を加えた生育培地中で、実験期間中培養した。

細胞を最初に植える時期を前後させて、ＩＬ−１添加の
時期を異ならせて細胞によってＩＬ−１に最後の１２時
間だけ、または全９６時間中あるいは途中のある期間曝
露させるようにしたあとでも、同じ日に全ての細胞を採
取するようにした。ＨＵＶＥＣをペトリ皿からＰＢＳ／
ＥＤＴＡを用いて脱離させ、ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗い
、丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに７５、（
６）００細胞ずつ入れた。これらのウェルに個々に４種
のモノクローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７．３Ａ２および７
Ａ９の各々を５μｇ／−加え、４°Ｃに３０分間おいた
。３回洗ったのち、細胞を１／４０希釈のＦＩＴＣ−ヤ
ギ抗マウス試薬に４℃で３０分間曝露した。さらに３回
洗ったのち、細胞の蛍光度をコールタ−５４１ＥＰＩＣ
８型フローサイトメーターによりメーカー指定の確立さ
れたルーチンの操作法に従って測定した。結果は第１１
図に示したが、陽性（細胞）％対ＩＬ−１曝露時間で表
わされている。

第１１図のデータは、モノクローナル抗体１Ｅ７および
２Ｇ７によって規定される抗原がＩＬ−１の存在下に増
加し、ＩＬ−１の存在下に発現され続けることを示して
いる。これとは対照的に、モノクローナル抗体３Ａ２に
よって規定される抗原は経時的に消失する。この図には
ゼロ時は示されておらず、最初の時点は４種の抗原が極
大を示すに至る４時間時点である。

モノクローナル抗体１Ｅ７および２Ｇ７によって規定さ
れる抗原が示す挙動を、これら抗原が慢性の炎症と関連
している可能性を示唆するために、「慢性動態」と名付
けた。一過性の発現を、これら抗原が急性の炎症と関連
している可能性を示唆するために、「急性動態」と名付
けた。

実施例３のデータは、本発明のモノクローナル抗体およ
び本究明の新規抗原を特徴付ける追加の特性をなすもの
である。それらデータを第３表にまとめ、極めて近い既
知の公表されているモノクローナル抗体についての類似
のデータと比較した。

名称 第　　　　３　　　　表 本発明のモノクローナル抗体と発表されている抗体との
特異外の比較 抗原サイズ（Ｋｄ）’ゝ 還元条件　非還元条件　抗原分布２′　　　抗原動態　
　注３Ａ２　　　１？７　　　　１？？ ７Ａ９　　　１００　　　　９０ ＩＩ　４／１８・１１５．９７”　　不検出ＩＩ　１８
／７ ０１０ １２ Ｅ１／６ 未知　　　８１６′ １４８９１　１３８　”’ ｎｏ　１２＋　　不検出 ＩＬ−１−ＥＣ急性 ＩＬ−１−ＥＣ慢性 ＩＬ−１−ＥＣ”　　急性５）公知 ＩＬ−１−ＥＣ’ゝ　　急　性８′ 血小板　ＥＣＩＩ＋未　知 不検出　　　　慢　性 細胞） ；ＥＣ（休止内皮細胞） 第３表のデータは、本発明のモノクローナル抗体が、最
も近い公表されている既知のモノクローナル抗体と予想
外に相異していることを明らかにしている。

実施例４ 抗原１Ｅ７／２Ｇ７、ＩＡ７／３Ｂ７およびＣＭＰ−１
７０の詳細な解析 （Ａ）休止およびＩＬ−１刺激ＨＵＶＥＣからの膜蛋白
質の２−Ｄゲル分析： ＩＬ−１への短期曝露後の内皮細胞によって合成される
新規膜蛋白質の数を推定するために、トライトンＸ−１
１４で溶解した細胞からの洗剤ペレットを、以下の通り
、２−Ｄゲル分析によって調べた。

植継ぎ回数の少ない（ｐ６未満）ＨＵＶＥＣを１００ｍ
ｍ組織培養皿でコンフルエントになるまで培養したもの
を、システィン不含Ｄ−ＭＥＭ　（ギブコ）プラス２０
％透析つシ胎児血清およびその他の内皮細胞生育培地成
分を含有する生育培地中に一装置いた。翌日、１　ｎｇ
／−のＩＬ−１および２５０μＣ１／１０７細胞の割合
の３５３−システィン（アマ−ジャム）を加えた。３７
℃で６時間培養後、単層を水冷ダルベツコリン酸緩衝食
塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗い、１０ｍＭトリス（ｐＨ
７，４）　、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，２ｍＭＰＭＳＦ
を含有する細胞溶解用１％トライトンＸ−１１４の緩衝
液溶液２５０μρで溶解させた。

ボルディエ（Ｂｏｒｄｉｅｒ　）　、ジャーナル・オヴ
◆バイオロジカル・ケミストリー、２５６巻１６０４〜
１６０７頁、１９８１年の記載に準じて、水相蛋白質か
らの疎水性蛋白質の分離を行った。５分後、細胞溶解物
を皿から１．５−エッペンドルフ管へかき取って集め、
１２，０００ｇ、　４℃で１ｏ分間遠心し、上澄みを６
％スクロース、１０ｍＭｈｌＪス（ｐＨ７，４）　、０
．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０６％トライトンＸ−１１４
からなる溶液３００μρ上に積層した。この勾配を３７
°Ｃに正確に１分間おいて相分離を起こさせたのち、８
５０ｇ、室温で１０分間遠心分離した。上澄みの水相を
取出し、４℃で新しい１０％トライトンＸ−１１４と合
せて、洗剤濃度を１％とした。この再抽出上層みを、も
とのスクロース勾配／トライトンＸ−１１４洗剤ペレツ
ト上に置き、１分間３７℃とし、先と同様に再遠心分離
した。この操作は、最終的には、最初の洗剤相と水相と
の分離および続いての洗剤再添加による水相の３回の再
抽出からなっていた。各試料について集めた洗剤ペレッ
ト１部に対し９部の緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７，
４，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１）を加えることにより、希
釈した。この材料を、スクロースクツション上に置き、
３７°Ｃで１分間インキュベートシ、上記の通り再遠心
分離することにより、再抽出した。最後の水相およびス
クロースクツションを捨て、洗剤ペレットを、２−Ｄゲ
ル分析まで一７０℃で凍結しておいた。

この操作法は、膜蛋白質は、それらが疎水性トランスメ
ンブレン領域をもつので、水相よりもむしろ疎水性（洗
剤）相に分配されるのを助けることを示している（ボル
ディエ、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミス！
・ソー１２５６巻１６０４〜１６０７頁、１９８１年）
。これは、ミドコンドア、血漿および他の膜蛋白質につ
いても言える。膜蛋白質が水相抽出波か洗剤相抽出液か
に見出だされる選択性の予備測定を、Ｎ−ヒドロキシ−
スクシンイミドビオチン１００μｇ／ｄを含有する蛋白
質不含ＰＢＳ中で１０７個の細胞を氷上（４°Ｃ）で３
０分間インキュベートして表面をビオチニル化した細胞
の分画によって行った。

１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を加え、遠心分離によって細胞
を洗い、再懸濁して未反応薬品を除くことによって、反
応を停止させた。トライトンＸ−１００により細胞を溶
解させ、１０％還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
上で処理した。つぎに、このゲルを、２相からの等量の
蛋白質を用いてのニトロセルロース上へのウェスタンブ
ロッティングに付した。これに続いて、ストレプトアビ
ジン−β−ガラクトシダーゼを用いて検出を行った。こ
れは、定量的ではないが、ビオチンの大部分が洗剤層と
会合することを示した（データは示さない）。

先に記載されているように（ガレルス、ジャーナル・オ
ヴ・バイオロジカル・ケミストリー２５４巻７９６１〜
７９７７頁、１９７９年；ガレルス、メソッズ・イン・
エンサイモロジ−１００巻４１１〜４２３頁、１９８３
年）、プロティン・データベース・インク（ＰＤＩ）に
より２−Ｄゲル分析が行われた。要約すると、細胞蛋白
質（５〜２０μｇ）中へ導入された３５Ｓ−システィン
４００、（６）００　ｄ　ｐ　ｍを含有する２０ｔｔｆ
１以下の試料を、ＬＫＢアンフオライトを用いたｐＨ３
，５〜１０の一次元勾配ゲルにかけた。二次死目は、ア
クリルアミド１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で還元条
件下に実施した。フィルムを乾燥したゲルおよび一連の
デンシトメリー標準試料に時間を変えて曝露した。既知
の値をもつ蛋白質との比較で、分子量および等電点を決
定した。

ゲルのコンピューター解析を、文献記載通りに行なった
（カレルス、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２６４巻５２６９〜５２８２頁、１９８９年
）。

結果を第１２Ａおよび１２Ｂ図に示す。３５Ｓシステイ
ン標識内皮細胞からの膜蛋白質が第１１Ａ図に、ＩＬ−
１活性化内皮細胞からのものが第１１Ｂ図に示されてい
る。各ゲル当り、４００、（６）００ｃｐｍを用いた。

この図では、フィルムを乾燥ゲルに２２日間曝露してい
る。見掛けの分子量および等重点を、データベース中の
既知蛋白質との比較に基づいて示しである。

第１２Ａ図は、６時間経過後の休止およびコンフルエン
ト細胞中の３５８−システィン取込み蛋白質のパターン
を示す。右側に、ＩＬ−１および３５Ｓ−システィンに
６時間曝露された細胞により合成された蛋白質が示され
ている。第１２Ａ図左上方の３本の矢印は、未誘発細胞
には見られないが、誘発細胞には存在するスポット群を
指している。これらのパターンは、このような６回の分
析で極めて再現性がよく、代謝標識として３５Ｓ−メチ
オニンを用いて得られた結果と本質的に均等である。こ
の代表的な実験では、コンピューター解析で２枚のフィ
ルムに計６５２のスポットが確認され、うち３００が毎
分当り崩壊数（ｄｐｍ）が３０を超えていた。これら３
０ｄｐｍを超えるＩＬ−１誘発２−Ｄゲルのスポットの
うち、１９が、未誘発２−Ｄゲル中のレベルの２倍以上
のｄｐｍ値を示した。それら１９スポツトの大部分を含
む３つのクラスターが、全６回の実験での認められる限
りの主要誘発蛋白質であった。

（Ｂ）１Ｅ７／２Ｇ７抗原の特性： ＩＬ−１活性化または未活性化ＨＵＶＥＣのトライトン
Ｘ−１１４溶解産物（上記と同様にして調製）を分画し
て、洗浄ペレットを得た。ＩＬ−１活性化膜ペレツトの
一部を用いて、ＩＦ５および２Ｇ７抗原の免疫沈降を行
った。

免疫沈降は次のように行った。ヌンクＥＬＩＳＡ用９６
ウエルプレートを、０．１Ｍ炭酸緩衝演（ｐＨ９，５）
１００μＤ中のアフィニティ精製ヤギ抗マウス抗体２５
μｇと共に室温で１時間インキュベートした。ウェルを
ＰＢＳ−０，０５％トウィーン２０で１０回洗ったのち
、１％Ｂ５Ａ２００μρを室温で１時間加えておいた。

各ウェルに、ＢＳＡの存在下に、精製モノクローナル抗
体５μｇを次の１時間加えておいた。ＰＢＳ−トウィー
ンで５回洗ったのち、１〜３Ｘ１０ｅｃｐｍの溶解産物
を各ウェルに加え、ゆっくり揺り動かしながら４℃に２
時間おいた。ウェルをＰＢＳ−トウィーンで洗い、過剰
の液体を除去した。免疫沈降材料を２％ＳＤＳ、２％２
−メルカプトエタノールで抽出し、これら沈降物の各々
の一部を、！・ライドンＸ−１１４溶解産物膜画分と混
合して２−Ｄゲル分析に付した。

第１３図は、ＩＦ５および２Ｇ７免疫沈降物単独および
未誘発（−ＩＬ−１）および誘発（＋ＩＬ−１）ＨＵＶ
ＥＣからの絶膜蛋白質との混合物の２−Ｄゲル分析結果
を示す。８個の正方形の各々に、第１２図で分析された
ゲル全体の左上方４分の１に対応する２−Ｄゲル部分が
示されている。

第１３Ａおよび１３Ｂ図は、ＩＦ５（上部）または２Ｇ
７（下部）抗体のみとの免疫沈降物である。

これらのゲルの他の部分には、それ以上のスポットは見
られなかった。第１３Ｃおよび１３Ｄ図は、免疫沈降物
を添加しないときの未誘発（−１Ｌ−１、上方）マタハ
誘発（■Ｌ−１、下方）ＨＵＶＥＣからの絶膜蛋白質を
示す。第１３Ｅおよび１３Ｆ図は、未誘発ＨＵＶＥＣの
膜蛋白質への１Ｅ７（上方）または２Ｇ７（下方）免疫
沈降物の添加の影響を示す。第１３Ｇおよび１３Ｈ図は
、ＩＬ−１誘発ＨＵＶＥＣからの膜蛋白質へのＩＦ５（
上方）または２Ｇ７（下方）免疫沈降物の添加の影響を
示す。プラス（＋）は各ゲルの酸性末端を、マイナス（
−）は塩基性末端を示す。

第１３図からいくつかの結論を導くことができる。まず
、ＩＦ５および２Ｇ７抗原により免疫沈降したスポット
のパターンは区別できない（第１３Ａ図、それぞれ上方
および下方）。第二に、ＩＦ５または２Ｇ７免疫沈降物
との混合実験は、それらが、絶膜溶解産物の他のスポッ
トと比較して、サイズおよび電荷に関して同じ位置を占
めることを示している。これは、ＩＦ５または２Ｇ７免
疫沈降物を未誘発（−１Ｌ−１）溶解産物に加えたとき
に極めて容易に見ることができる（第１３Ｅおよび１３
Ｆ図）。第三に、ＩＦ５および２Ｇ７抗原が同じであり
、これらの免疫沈降物をＩＬ−１誘発溶解産物に加えた
ときにそれらが重なり合う誘発膜溶解産物中に存在する
蛋白質を規定する。（第１３Ｇおよび１３Ｈ図）。これ
らのスポットは、常にシスティン（またはメチオニン）
標識細胞からの２−Ｄゲルの最も顕著な一組のセットで
ある第１１図の中央の矢印に対応する。これらの混合実
験および第１２図に示した２−Ｄゲルからの、１０％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル上で処理した既知
蛋白質の分子質量および等電点に基づいての結論は、１
Ｅ７／２Ｇ７抗原の分子質量はほぼ１１０ｋＤａを中心
とし、等電点の範囲は４．８〜４．９であるということ
になる。

（Ｃ）３Ｂ７／７Ａ９抗原と１Ｅ７／２Ｇ７抗原との比
較： ３Ｂ７および７Ａ９抗原の免疫沈降物の２−Ｄゲル中で
の予備分析により、それらが同一で且つ混合実験で重な
るプロフィールをもつことが示された。免疫沈降、２−
Ｄゲル電気泳動および混合実験は、すぐ上に述べた通り
に行った。各沈降物はほぼ１０個のスポットからなり、
それらの分子質量範囲は約１１０〜１２０　ｋ　Ｄ　ａ
、等電点範囲は約４．３〜５、（６）であった。それゆ
え、仮説として、３Ｂ７および７Ａ９抗体は各々同じポ
リペプチドを規定すると結論できた。１Ｅ７／２Ｇ７蛋
白質と３Ｂ７／７Ａ９およびＩＣＡＭ−１蛋白質との関
係を試験し、第１１図に示したＩＬ−１誘発可能膜蛋白
質との関係でこれらの各々を位置付けるために、異なる
免疫沈降物の混合物の２−Ｄゲル分析を、上記と同様に
して行った。ＩＬ−１活性化、３５Ｓ−システィン標識
ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物の各等ｃｐｍ（約１０４）
を分析した。免疫沈降に用いた抗体は、ＲＲＩ（抗ＩＣ
ＡＭ−１）　、２Ｇ７．７Ａ９、ＲＲＩ　＋２Ｇ７、Ｒ
ＲＩ＋７Ａ９および２Ｇ７＋７Ａ９であった。

結果を第１４図に示す；第１４Ａ図−ＲＲＩ（抗ＩＣＡ
Ｍ−１）；第１４Ｂ図−２Ｇ７；第１４Ｃ図−７Ａ９；
第１４Ｄ図−ＲＲＩ＋２Ｇ７；第１４Ｅ図−ＲＲＩ　＋
７Ａ９　；第１４Ｆ図−２６７＋７Ａ９゜６９の２−Ｄ
ゲルの各々の左上４分の１のみを示した。他の領域には
他のスポットはなかった。

Ｉ　ＣＡＭ−１，２Ｇ７および７Ａ９についての個々の
免疫沈降物をそれぞれ第１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃ図
に示す。第１４Ｄ図は、２Ｇ７およびＩＣＡＭ−１両蛋
白質の相異性およびそれらの相互関係を示している。第
１４Ｅ図は、７Ａ９とＩＣＡＭ−１との比較を、第１４
Ｆ図は、２Ｇ７と７Ａ９との比較を示す。最後の場合に
のみ、僅かに酸性度がより高く、分子量もより高いプロ
フィールを示す７Ａ９とのスポットの部分的型なりがあ
る。結果は、第１２図の３本の矢印の同定を可能にする
ものである。最も左の矢印は、３Ｂ７／７Ａ９蛋白質の
酸性末端を、中央の矢印は１Ｅ７／２Ｇ７蛋白質の領域
を、右側の矢印は、ＩＣＡＭ−１領域を同定するもので
ある。対応する誘発蛋白質は、第１２図に明らかである
（十ＩＬ−１）。１Ｅ７／２Ｇ７および３Ｂ７／７Ａ９
蛋白質の差およびそれらと先に同定されたＥＬＡＭ−１
構造（ベヴイラクアら、プロシーディングズ・オヴ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オヴ・サイエンシズ、８４
巻９２３８〜９２４２頁、１９８７年；ベヴイラクアら
、サイエンス、２４３巻１１６０〜１１６５頁、１９８
９年）との関係を、次の実験でテストした。

ポリメラーゼ連鎖反応によりクローン化されたＥＬＡＭ
−１ｃＤＮＡのコード配列をｐＣＤＮ−１発現ベクター
（第１５図）へ挿入し、ＣＯＳ細胞のトランスフェクシ
ョンに用いた。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＥＬＡＭ−１ｃ
ＤＮＡクローニングは次のように行った。

ＥＬＡＭ−１コード領域を増幅するために次のＰＣＲプ
ライマーを用いたニ ブライマー１５’　−ＧＧＧＧＧＧＣＴＣＧ　ＡＧＴＧ
ＡＡＧＴＣ＾ＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴ
ＣＴＣ−３’プライマー２５’−ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＣ
ＧＴ＾＾ＣＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＴＡＡＧＡ　ＡＧＧＣ
ＴＴＴＴＧＧＴＡ−３’これら２本のプライマーは、Ｅ
ＬＡＭ−１ｍＲＮＡのコード領域をかこみ、開始コドン
または終止コドンを含むように選んだ。ＰＣＲ増幅産物
の発現ベクタへのクローニングを容易にするために、こ
れらブライマーに、制限酵素部位Ｘｈｏ−ＩおよびＭ　
］　ｕ　−１も組込んだ。ＰＣＲ増幅ＥＬＡＭ−１ｃＤ
ＮＡを、２挿の異なるアプローチ法により調製した。第
１法では、ＩＬ−１活性化ＨＵＶＥＣからのポリＡ　　
ＲＮＡを用い、インヴイトロゲンコピーキットを使用し
てｃＤＮＡを作成した。

ＨＵＶＥＣの総ＲＮＡを酸性フェノール抽出［コムチン
スキ（ＣｈｏｍｃＢｎ−ｓｋｉ）とサクリ（Ｓａｃｃｒ
ｉ）、アナリティカル・バイオケミストリー　１５２巻
１５６〜１５９頁、１９８７年］により単離した。

ポリＡ　　ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラ
フィー［アヴイヴ（Ａｖｉｖ）とレダー（Ｌｅｄｅｒ）
、プロシーディングズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オヴ・サイエンシズ、６９巻１４０８〜１４１２
頁、１９７２年］により単離した。つぎにそのｃＤＮＡ
を用い、上記２柿のプライマーおよびシータス社から入
手した遺伝子増幅キラ）・を使用して、ＰＣＲによるＥ
ＬＡＭ−１コ一ド配列の増幅［サイキ（Ｓａｉｋｉｌら
、サイエンス、２３９巻４８７〜４９１頁、１９８８年
］を行った。ＰＣＲ増幅は、次の条件を用いて３０サイ
クル行った二変性二９４℃、１分間；アニーリング：５
０℃、２分間；伸長＝７２℃、３分間。最後のサイクル
の間には、伸長時間を７分間とした。第２法では、ＩＬ
−１活性化ＨＵＶＥＣからのポリＡ　　ＲＮＡ５００ｎ
ｇを、ＰＣＲプライマー１およびＢＲＬから人手したＭ
　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素により販売者規定の条件を用い
て全反応体積２０μ夏中で逆転写させた。このｃＤＮＡ
をつぎに、第１法の条件に従って、ＥＬＡＭ−１コ一ド
配列を増幅するのに用いた。両方法からのＰＣＲ増幅産
物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。両場合
共、ＥＬＡＭ−１コ一ド配列の予想される、１．８５Ｋ
ｂ産物が得られた。

こ（７）１．８５Ｋｂバンドを電気溶出し、ＤＮＡポリ
メラーゼ■のクレノー断片（ＢＲＬ）で処理し、プラス
ミドｐＳＰ７２Ａに連結し、ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム）で処理した。

プラスミドｐＳＰ７２Ａは、プロメガバイオチクから人
手したプラスミドｐＳＰ７２の修飾体である。詳しくは
、ｐＳＰ７２　（プロメガバイオチク；カタログ番号Ｐ
２１９１）を、その多重クローング部位（ＭＣ８）を次
の部位を含有する新しい多重クローニング部位で置換え
ることによって修飾した：ＮｄｅｌＳＮｏｔｌ、Ｘｈｏ
ｌ、Ｈｉｎｄｍ、ＮｒｕｌＳＣｌａｌＳＭｌｕｌ。

ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩＳＳｍａ　Ｉ。

５ａｃＩＩ、５ｎａＢＩ、Ｓａ　ＩＬ　ＥａｇＩおよび
Ｂｇｌｎ。修飾されたＭＣ３をコードするオリゴヌクレ
オチドの合成は、標準的プロトコールを用いて遺伝子合
成機中で行った。このオリゴヌクレオチドを、Ｎｄｅｌ
／ＢｇｌＩＩ消化ｐＳＰ７２に挿入して、ベクターｐＳ
Ｐ７２Ａを導いた。

ＥＬＡＭ−１コ一ド配列押入片を含むクローンを、ＥＬ
ＡＭ−１ｃＤＮＡのコード領域内の合成オリゴマークロ
ーンを用いてのコロニーハイブリダイゼーションによっ
て得た。６クローンを単離し、ＥＬＡＭ−Ｉ　　ｃＤＮ
Ａ（７）コード領域に沿って一定間隔で配置される８種
の異なる合成オリゴマープローブを用いて配列訣定した
。全てのクローンが、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡの公表され
ている配列（ベヴイラクア、サイエンス、２４３巻１１
６０〜１１６５頁、１９８９年）とは異なるランダム分
布の異称配列を含んでいた。これは、ＰＣＲ増幅の間の
誤りによると考えることができた。しかし、ＰＣＲ増幅
ＥＬＡＭ−１コ一ド配列のクローンの全てに、公表され
ている配列の１５１８位および１９１６位のヌクレオチ
ドにおける２秤の変押が存在していた。それゆえ、正し
い配列はこの新しい配列であると信じられる。クローン
の一つＳＰＥＬＡＭ−４は、１５１８位および１９１６
位のヌクレオチドにおける相違を除いて、公表されてい
る配列と同じ配列を含んでいた。このクローンから、Ｎ
ｏｔｌおよびＳｍａｌによる消化に続いて、ＥＬＡＭ−
１コ一ド配列挿入片をとり出し、発現ベクターｐＣＤＮ
−１中へクローン化した。

得られたＥＬＡＭ−１発現プラスミドを第１５図に示す
。第１５図は、ｐｓＶ２ＮＥｏ　［ササン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）とバーブ（Ｂｅｒｇ）　、ジャーナル・オヴ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス
、１巻３２７〜３４１頁、１９８２年］から導いたＳＶ
４０初期プロモーター（斜線域）、ＳＶ４０　“ｔ”ス
プライス配列およびポリＡ付加配列（点領域）を含有す
るプラスミドｐＣＤＮ１　［Ｔ、　Ｖ、　ゴパル（Ｇｏ
ｐａｌ）、未発表業績］を示している。プラスミドの残
りはｐＢＲ３２２（−）配列を含んでいる。重要な制限
部位は図に示しである。ＭＣ３は多重クローニング部位
を示す。ＣＯ３細胞におけるＥＬＡＭ−１の一過性発現
の研究には、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＥＵＫ−Ｃ２、ｐＭＡ
Ｍ−ｎｅｏ（クロンチックラボラトリーズ、カリホルニ
ア）などの他の普通に人手できるｌ１ｆｉ乳動物用発現
ベクターをｐＣＤＮ−１に代えて使用できる。

４種のモノクローナル抗体の反応性の試験に、模擬的に
またはＥＬＡＭ−１でトランスフェクトしたＣＯ３細胞
を用いた。ここには示さない予備実験で、ＥＬＡＭ−１
でトランスフェクトした細胞の約２〜５％がＨＬ−６０
腫瘍標的に結合するが、模擬的にトランスフェクトした
細胞は時々しかＨＬ−６０への結合を示さないことが示
された。

模擬的にトランスフェクトされたおよびＥＬＡＭｌでト
ランスフェクトされた細胞を、実施例１記載のものと同
様のプレート結合アッセイでスクリーニングした。

要約すると、ＣＯ８細胞（２Ｘ１０４／ウエル）を、ア
ッセイ２４時間前、トランスフェクション４８時間後に
、マイクロタイターウェルに植えた。

細胞を、培地のみ（対照）または４種の精製モノクロー
ナル抗体の各々１μｇ／−と共にインキュベートし、続
いてビオチニル化ヤギ抗マウス抗体および１２５！−ス
トレプトアビジンと共にインキュベートシた。

トランスフェクション（形質転換）は次のように行った
。ｐＣＤＮ　　ＥＬＡＭ−１プラスミドＤＮＡ２０μｇ
で約１×１０６ＣＯ３細胞を、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅ
ｒ）ら（セル、１６巻７７７〜７８５頁、１９７９年）
のＤＮＡ−Ｃ：ａＰＯ４共沈法によりトランスフェクト
した。ＤＮＡ−ＣａＰＯ４沈澱を添加してから４時間後
、細胞を１５％グリセロールにより、パーカー（Ｐａｒ
ｋｅｒ）とスターク（Ｓｌａｒｋ）　（ジャーナル・オ
ヴ・ヴイロロジー、３１巻３６０〜３９６頁、１９７９
年）の方法に従い、室温で２分間処理した。挿入断片を
有さないベクタープラスミドＤＮＡを対照として同量用
いて、１×１０６細胞をトランスフェクトして、模擬的
にトランスフェクトされた細胞を得た。グリセロールシ
ョックから約４８時間後に細胞を集め、抗体結合研究に
用いた。ＥＬＡＭｌでトランスフェクトした細胞はＨＬ
６０細胞を効果的に結合したが、模擬的にトランスフェ
クトされた細胞はそうではなかった（データは示さない
）。

同じ結果を与えた３回の実験の一つからのデータを第１
６図に示す。この図で、結果は、ウェル当りの総ｃｐｍ
の平均（±ｓ、　ｅ、　ｍｏ、ｎ＝３）として表わされ
ている。この図は、１Ｅ７抗体も２Ｇ７抗体もＥＬＡＭ
−１遺伝子産物と反応しないが、３Ｂ７および７Ａ９は
共に反応することを示している。この反応性パターンは
、代謝性標識後のこれらと同じ細胞の免疫沈降解析によ
って確認された。３Ｂ７および７Ａ９抗原のみが、ＥＬ
ＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞からの約１００
ｋＤａの分子質量の蛋白質を沈降させたが、模擬的にト
ランスフェクトされた細胞からのそれは沈降させなかっ
た（データは示さない）。それゆえ、簡単化のため、２
Ｇ７および７Ａ９抗体のみを、これら２挿の蛋白質の以
下の比較の大部分で用いた。

（Ｄ）ツニカマイシン処理後のＩＣＡＭ−１，２Ｇ７お
よび７Ｇ９蛋白質の比較： Ｎ結合糖鎖の程度についてＩ　ＣＡＭ−１，２Ｇ７およ
び７Ａ９蛋白質をさらに比較した。コンフルエントＨＵ
ＶＥＣを、ＩＬ−１１ｎｇ／ａｌｌの存在下に、ツニカ
マイシンＢ２　１μｇ／−の存在下または不存在下に６
時間処理した。ツニカマイシンは、ＩＬ−１および３５
Ｓ−システィンの添加時に添加した。トライトンＸ−１
００溶解産物を、上記と同様に、ただしウェルを６０℃
の湯浴中還元性試料緩衝液で５分間抽出して、免疫沈降
させた。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド還元性ゲルで分析した。トライトンＸ１００溶解産物
は、上記のトライトンＸ−１１４溶解産物の場合と同様
にして調製した。ただし、相分離操作は省略した。

結果を第１７図に示す。第１７図は、ＩＣＡＭ−１糖蛋
白質が、ツニカマイシン処理後に、天然およびコア蛋白
質（１４造の混合物として存在し、コア蛋白質構造は５
０ｋＤａのところにあることを示している。１１４ｋＤ
ａおよび９５ｋＤａの強いおよび弱いバンドを有する２
Ｇ７免疫沈降物は、ツニカマイシン処理後に、天然の１
１４ｋＤａおよび８０ｋＤａのコア蛋白質の混合物とし
て存在していた。１１４ｋＤａバンドの発現の減少は、
ツニカマイシンがこの蛋白質の合成を若干低下させた可
能性を示唆している。２−Ｄゲルに見られる複雑なパタ
ーンと一致する７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原は、１１
０ｋＤａ領域の幅広いバンドであり、これはツニカマイ
シン処理後にほとんど完全に分子質量約６７ｋＤａの蛋
白質へと減成される。

（Ｅ）２Ｇ７および７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原のシ
アル酸含量： ２Ｇ７および７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原の免疫沈降
物の２−Ｄゲル分析で示されたスポットのパターン（第
１２図および第１３図）は、シアル酸含量の相異による
のかもしれないところの電荷不均一性を示唆する。それ
ゆえ、ＨＵＶＥＣを３５Ｓ−システィンの存在下にＩＬ
−１で６時間活性化し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ　（対照）ま
たはノイラミニダーゼ処理によって脱着させた。このよ
うな細胞の生育力は常に９５％以上であった。これらの
細胞のトライトンＸ−１００抽出物（上記と同様にして
得た）を２Ｇ７または７Ａ９抗体により上記の方法で免
疫沈降させた。これらの免疫沈降物の２−Ｄゲル分析（
上記と同様に実施）を行った。

ＨＵＶＥＣのノイラミニダーゼ処理は次のように行った
。細胞を１回Ｄ−ＰＢＳで洗い、０、（６）５Ｕのノイ
ラミニダーゼのＰＢＳ溶液を約３Ｘ１０”個の細胞に３
７℃で２０分間加えておいた。

脱離して完全に生育力のある細胞を遠心分離で集め、上
述のように１％トライトンＸ−１１４の添加によって溶
解させた。

第１８図は、４９の２−Ｄゲルの各々の一部を示す。両
抗原について、検出可能なスポットの数に有意の減少が
あり、同時に、分子量が約５ｋＤａ減少し、等電点とし
て約０．５だけ電荷の増大した新しいスポット（単数ま
たは複数）が出現した。これは、両法白質が種々の置換
度でシアル酸を含有することの証拠である。

（Ｆ）２Ｇ７および７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原の〇
−結合糖含量： 両抗原の３５８−システィン免疫沈降物（マイクロタイ
ターウェル中で上記の通り調製）をまず消化用緩衝液の
みまたはノイラミニダーゼ（ベーリンガーマンハイム）
ＩＵ／−含有緩衝液により３７℃で１時間処理した。消
化用緩衝液は、１ｍＭ酢酸カルシウムを含有する０、１
５５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，Ｏからなっていた。

消化用緩衝波はこのほかに、ロネットら［ロネット（Ｒ
ｏｎｎｅｌｌＪら、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル
・ケミストリー、２５９巻４５６６〜４５７５頁、１９
８４年］記載通りのプロテアーゼカクテル（ロイペプチ
ン、ベンズアミジン、アプロチニン、アンチパイン、ペ
プスタチンおよびキモスタチンからなる）を含んでいた
。ノイラミニダーゼ処理後、ウェルを未処理のままでお
くかまたはノイラミニダーゼ処理に用いたのと同じ緩衝
液中の２５ｍＵ／−のエンド−アルファー−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ（Ｏ−グリヵナーゼ）で処理し
た。０−グリカナーゼ処理は３７℃で一夜続けた。翌日
、ウェルをＰＢＳ−トゥイーンで２回洗い、試料緩衝液
で上記と同様に抽出し、抽出物を１０％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミド還元性ゲルで分析した。

結果を第１９図に示す。第１９図に示したように、無傷
の細胞の処理によって得られた結果（第１８図）と一致
して、ノイラミニダーゼ処理後に２Ｇ７および７Ａ９　
（ＥＬＡＭ−１）両抗原について約５ｋＤａの質量減少
があった。〇−結合糖除去処理は、２回の実験で、２Ｇ
７および７Ａ９両抗原について、約１〜２　ｋ　Ｄ　ａ
の僅かな質量減少を惹此しただけであった。

（Ｇ）抗原合成の動態： ２Ｇ７および７Ａ９糖蛋白質の類似点および差をさらに
示すため、それら糖蛋白質を、ＨＵＶＥＣ培畏にＩ培養
１を添加したのちの種々の時点で上記と同様にして免疫
沈降させた。ＩＬ−１添加時に３５８−システィンを加
えた。トライトンＸ−１００溶解物をつくり、２Ｇ７ま
たは７Ａ９抗体によって免疫沈降物を形成させた。免疫
沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル
を用いて分（Ｊ７シた。

第２０図に示した結果は、１時間目にのみ弱いながらも
７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原を検出できることを示し
ている。それは、この時点でのその質量が、ツニカマイ
シン処理後の６７ｋＤａではなく、約７９　ｋ　Ｄ　ａ
であるので、恐らく既にある程度のグリコジル化を受け
ているのであろう。２時間後には、２Ｇ７免疫沈降物は
、約９５ｋＤａおよび１１４ｋＤａのところに強度の等
しい２本ノハンドを示し、一方、この時点で、７Ａ９　
（ＥＬＡＭ−１）抗原は９５ｋＤａ付近の幅広いバンド
という「成熟」形になっている。６時間後、２Ｇ７抗原
は１１４ｋＤａに強いバンドを示す。

（Ｈ）競合結合アッセイ： これら２種の蛋白質上で異なるモノクローナル抗体によ
って規定される４９のエピトープの空間的関係を調べる
ために、精製モノクローナル抗体の各々をＦＩＴＣと結
合させ、それらの間挿および異種の組合せにおける競合
能をフローサイトメトリーによって調べる競合結合アッ
セイを行った。

各モノクローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７．７Ａ９．３Ｂ７
のＦＩＴＣ結合物を、ＩＬ−１活性化内皮細胞に作用さ
せて、飽和を僅かに下まわる用量を求めた。この用量の
ＦＩＴＣ抗体を未結合モノクローナル抗体４種の各々の
５０倍過剰と予備混合した。この混合物を次に、１％Ｂ
ＳＡおよび０、（６）２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ
中でＩＬ１活性化ＨＵＶＥＣの単細胞懸液に４°Ｃで３
０分間加えておいた。細胞を同じ緩衝液で３回洗い、再
ＱＪしてフローサイトメトリー分析に用いた。

ｐＨ９，５の０．１Ｍ炭酸緩衝液中４　ｍｇ／−でのモ
ノクローナル抗体のＦＩＴＣとの結合は文献記載通りに
［バーデイ　（）ｔａｒｄｙ）、ハンドブック・オヴ・
エクスペリメンタル・インムノロジー第４版１春、１９
８６年（Ｄ、Ｍ、　　ウェア（Ｗｅｉｒ）編、ブラック
ウェル・サイエンティフィック・パブリケインヨンズ、
オックスフォード、英国、３１０１〜３１１２買］行っ
た。

結果を第２１図に示す。図に示した４実験の各々に用い
た特定のＦＩＴＣ−抗体は次の通りであった：第２１Ａ
図：１Ｅ７；第２１Ｂ図：　２Ｇ７　。

第２１Ｃ図：　３Ｂ７　、第２１Ｄ図ニアＡ９゜縦軸は
陽性細胞％を示す。

結果は、５０倍過剰でＩＦ５．２Ｇ７および３Ｂ７は同
種ＦＩＴＣ−モノクローナル抗体の結合に対してのみ競
合することを示している。７Ａ９抗体は、２Ｇ７抗体の
結合を再現性よく妨害し、２Ｇ７　：　７Ａ９モル比１
：５０のとき極大６２％である点で、異なっている。

（Ｉ）細胞表面での抗原発現の動態： ＨＵＶＥＣを１　ｎｇ／−のＩＬ−１中挿々の時間培養
し、本質的にハイブリドーマスクリーニングアッセイの
ために行ったと同様の９６ウ工ルプレート結合アッセイ
法により２Ｇ７および７Ａ９抗原について分析した。全
ての細胞を同時に分析した。

結果を第２２図に示す。図での黒丸は抗体２Ｇ７を黒三
角形は抗体７Ａ９を表わす。結果は平均ｃ、　ｐ、　ｍ
、±ｓ、ｅ、ｍ、　　（ＩＩ＝３）として表わしである
。

第２２図に示した結果は、２時間までに７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）蛋白質が極大に発現され、一方２Ｇ７抗原は極
大の半分しか発現されないことを示している。４時間後
には、２Ｇ７抗原が極大レベルに達している。この結果
は、生合成標識実験（第２０図）での７Ａ９　（ＥＬＡ
Ｍ−１）蛋白質の若干早い発現と一致している。興味あ
ることには、ひき続いてのＩＬ−１の存在下で、両法白
質が７日間まで細胞表面で高レベルに発現されている。

ＩＬ−１を除去すると、それらは２４時間以内に基線レ
ベルへもどる（データは示さない）。

（Ｊ）２Ｇ７および７Ａ９抗原の細胞分布：挿々の初代
培養細胞を、ＩＬ−１処理を行いまたは行わずに、２Ｇ
７または７Ａ９糖蛋白質の発現について試験した。これ
らの実験は、実質的にハイブリッド−マスクリーニング
アッセイで行った通りに、９６ウエルブレー１・中で行
った。ずなわち、所定の細胞タイプを９６ウエルプレー
トに置いた。アッセイの２４時間前に次の細胞を記載の
濃度で播いた：線維芽細胞、ケラチノサイトおよびＨＵ
ｖＥＣ１２Ｘ１０’／ウェル；アッセイの日に、末梢血
モノクローナル細胞を５Ｘ１０’／ウエル、顆粒球を１
０５／ウエル、血小板を１０５／ウエル接種した。血小
板は、抗原発現アッセイ前の１時間にわたりＩＵのヒト
アルファートロンビンにより刺激した。

結果を第４表に示す。

弔 表 ２Ｇ７および７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）蛋白質の細胞分
布細胞タイプ ｔＪＶＥＣ 顆粒球 末梢血単核細胞 ケラチノザイト 線紺芽細胞 血小板 結合ｃｐｍ。

ＩＬ−１なし １６５０±６２ １９７１±２８１ １６７２±３５１ １３８３±２９５ ２０４７±２９５ ２２１０±３４６ ８４９±４５ ８３２±４２ ５２１±３５ ４４８±１７ ５６８８±２２８ ５１４１±１５５ ６２４１±３６ １７２６７±７６ 結合ｃｐｍ、　ＩＬ−１ ４７１６１±１３６７ ５９３０９±６４０ １２９８±１５７ １２１５±１６６ １５１１±　６９ １５７５±　３７ ８１３±　２９ ８００±　２９ ５１１±　１６ ５１３±　２２ ５７３６” ５３７７＊ ６８４３” １７４５５“ 本 ＩＵ／ｍｆｆ）ロンビン刺激 第４表の結果は、線維芽細胞、顆粒球、未分画末梢血単
核細胞、ケラチノサイトまたは血小板（トロンビン刺激
ありまたはなし）上ではこれらの抗原が検出可能なレベ
ルでは発現されないことを示している。血小板は、高レ
ベルの非特異的１２５Ｉ−ストレプトアビジン結合を示
すようであった。

（Ｋ）１Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／３Ｂ７抗原発現に
対するＴＮＦ、ＬＰＳおよびＩＦＮγの影響： ４時間の１ｐｓ刺激、６時間のＴＮＦ刺激および長期Ｉ
ＦＮγ刺激が１Ｅ７／２Ｇ７抗原および７Ａ９／３Ｂ７
抗原の発現に及ばず影響を検討した。すなわち、ＨＵＶ
ＥＣを次の通り押々の誘発剤に曝露した：ガン？　−Ｉ
　Ｆ　Ｎ、　１００　ｔｔ　ｇ／ｍｆｌ。

２．５日間；１ｐｓ、ｌμｇ／ｍＮ、６時間、ＴＮＦ、
１μｇ／ｒＩｉＩＪ、４時間、ＩＬ−１、ｌｎｇ／ｍｆ
ｆ１．４時間。これらの誘発剤を洗い除いたのち、所定
の抗体を飽和用量で用いてプレート結合アッセイでの抗
原発現を調べた。

結果を第５表に示した。平均±ｓ、ｅ、ｍ、　（ＩＩ＝
３）として表現されている。

第　　　５　　　表 １Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／３Ｂ？抗原発現に及ぼす
種々の薬物の影響抗体　ＩＦＮ−Ｇａｍｍａ　　１ｐｓ
　　　ＴＮＦ　　　ＩＬ−１対照　１８１＋　１９　２
４４＋　２０　６４４＋　４２　２５３＋　３１Ｅ７　
　８１８＋４４　３２１７＋２０７　１２，７２６＋３
５ＣＩ　　　９，０６９＋４５７２Ｇ７　　７６３＋　
　５　４６８４＋２９２　１３．３３５＋２３２　１０
．４８３＋１１１５３Ｂ７　　　　山　　　ｎｄ　　　
１８，３１９±４５０　２１，５９６±２２９７７Ａ９
　　　　　ｎｄ　　　　　　ｎｄ　　　　２０，０６７
±４０２　２６．５６３±８９８１１ＬＡ−ＤＲ５１４
０±３７４　　１７８±１２　　　　　ｎｄ　　　　　
２２６±　４”ｎｄ−実施せず 先にＥＬＡＭ−１について示したように、ｆｆｐＳおよ
びＴＮＦ刺激は１Ｅ７／２Ｇ７蛋白質の発現をもたらし
た。しかし、ＩＦＮγは、２．５日間のインキューベー
ション後に、ＨＬＡ−ＤＲを予期通り発現させたが、１
Ｅ７／２Ｇ７誘発には無効であった。

（Ｌ）３Ａ２抗原の表面発現： ｌｎｇ／−のＩＬ−１で４時間前処理し、５０μｇ／ｍ
ｆｌの３Ａ２抗体で染色した内皮細胞のフローサイトメ
トリー分析を行った。相対蛍光強度から任意単位での細
胞数を求めた。比較のため、ＨＬＡおよびＩＣＡＭ−１
抗原の発現も、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原および抗ＩＣＡ
Ｍ−１抗体ＲＲ／１を用いて調べた。フローサイトメ１
へり−は上記と同様に行った。染色は、ＦＩＴＣ標識抗
体を用いて常法により行った。

結果を第２３図に示す。第２３図は、間接試薬のみ（第
２３Ａ図）　、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ抗原（第２３Ｂ図）
、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ／１（第２３Ｃ図）および３
Ａ２抗体（第２３Ｄ図）で染色した休止（−−−−）ま
たはＩＬ−１刺激（−）内皮細胞を示している。

３Ａ２抗体によって規定される抗原は、休止内皮細胞の
表面には検出されないが、ＩＬ−１に曝露後は、２時間
以内に検出可能となる。結果は、ＨＬＡまたはＩＣＡＭ
−１蛋白質とは異なり、３Ａ２抗体がチャンネル５０か
らチャンネル１５０にわたる、蛍光強度約８倍範囲の、
不均一分布の抗ＪＪｋを検出することを示している。最
も強く陽性の細胞は、蛍光強度で、ＩＣＡＭ−１よりは
低いが、ＨＬ　Ａ抗原と同等である。先に報告されてい
るように（ダスティンとスブリンガー、ジャーナル・オ
ウ′・バイオロジカル・ケミストリー１０７を３２１〜
３３１頁、１９８８年）、ＩＣＡＭ−１は、４時間のＩ
Ｌ−１曝露ののち内皮細胞トで約８倍の増加を示してい
る。

（Ｍ）３Ａ２抗原の組織発現： 顆粒球、末梢血単核細胞（ＰＢＬ）、ケラチノサイトお
よび線維芽細胞について、１　ｎｇ／−のＩＬ−１に４
時間曝露する前および曝露後の３Ａ２抗原の膜発現を調
べた。使用した方法は、１Ｅ７／２Ｇ７および７Ａ９／
３Ｂ７抗原について上記した方法である。ただし、細胞
をトロンビンの代りにＩＬ−１で刺激した。

結果を第６表に示す。

第６表 細胞タイプ ＵＶＥＣ 顆粒球 ＢＬ ケラチノサイ 線維芽細胞 １Ｌ−１なし ９４３±　２８ １．６０７±　７０ ２．４５９±３０６ ト　　　　　１　６５１±　１９１ ６０８±　４０ 結合ｃｐｍ、　ＩＬ−１ ４４、３８１±１８７５ １．４２９±　１５７ ２０６７±　１４２ １．５７０±　１０６ ６３８±　　５３ 第６表は、内皮細胞のみが３Ａ２抗原発現誘発性を示し
たことを示している。

（Ｎ）３Ａ２抗原の特性決定： 初期継代内皮細胞を、ｌｎｇ／−のＩＬ−１および２５
０μＣｉの３５Ｓ−システィンの存在下または不存在下
に、４時間培養し、３５８−システィン標識細胞を１％
トラインＸ−１００で溶解し、上記と同様にして、内皮
Ｔ細胞付着構造指向性の抗体３Ａ２．７Ａ９（抗ＥＬＡ
Ｍ−１）または２Ｇ７で免疫沈降させた。免疫沈降物を
、還元条件下の８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
で泳動させた。

結果を第２４図に示す。図中、（−）は無処理の、（＋
）はＩＬ−１処理細胞を示す。結果は、ＩＬ−１未処理
細胞はＥＬＡＭ−１抗原を示さないが、ＩＬ−１処理細
胞は、予期通り７Ａ９抗体と反応する１１０〜１２０ｋ
Ｄａの分子および上記の通り２Ｇ７抗体と反応する１　
１４　ｋ　Ｄ　ａの蛋白質を沈降させることを示してい
る。３Ａ２抗体は、ＩＬ−１の存在下および不存在下に
１７０ｋ　Ｄ　ａの蛋白質を沈降させる。さらに、３Ａ
２抗体は、ＩＬ−１処理細胞のみから、２Ｇ７および７
Ａ９蛋白質の領域に弱い１本のバンドを沈降させる。こ
の結果は、３Ａ２抗原複合体が２種の蛋白質またはサブ
ユニットからなり、そのうちの−方が構成性、他方が誘
導性である可能性を示唆する。細胞表面でのＩＬ−１に
よる３Ａ２抗原の発現は誘導性であるが（第２３図）、
細胞質内での抗原の発現は構成性であるかもしれない。

（０）細胞膜での３Ａ２．２Ｇ７および７Ａ９（ＥＬＡ
Ｍ−１）抗原の発現はＲＮＡおよび蛋白質の合成を必要
とする： ９６ウエル平底プレート中の単層培養中の内皮細胞を、
１μｇ／−のシクロへキンミドで３０分間または１μｇ
／−のアクチノマインンＤで１５分間、ＩＬ−１の添加
に先立って前処理した。

ＩＬ−１活性化の間、薬品を培養内に残しておいた。４
時間後、培養物を洗い、上記通りのプレート結合アッセ
イにおいて、相当するモノクローナル抗体と共にインキ
ュベートした。単層培養中の生細胞について、これら３
種の蛋白質の表面発現を調べた。

結果を第２５図に示す；第２５Ａ図：　ＩＬ−１±シク
ロヘキシミド；第２５Ｂ図：ＩＬ−１士アクチノマイシ
ンＤ　（ａｃｔ　Ｄ）。

第２５図は、試験した全ての抗原がＲＮＡおよび蛋白質
合成への発現の依存性を示したことを示している。

（Ｐ）３Ａ２抗原の光学顕微鏡評価： 休止およびＩＬ−１刺激内皮細胞について、３Ａ２抗原
の細胞質発現を調べた。ＨＵＶＥＣを１μｇ／−の存在
下または不存在下に４時間培養した。

培養したＨＵＶＥＣは、ＰＢＳ−ＥＤＴＡへの短時間曝
露によって脱着され、ガラス製顕微鏡スライド上に吐き
出した。細胞をアセトンにより室温で１０分間固定し、
風乾して、細胞を透過性とし、３Ａ２および７Ａ９抗体
で染色した。

染色のためには、抗体０．１μｇを含有する抗体溶液１
００μρを固定した細胞上に室温で３０分分間中た。細
１泡をＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗い、アルカリホスファタ
ーゼ結合ヤギ抗マウス抗体５ｔｔｇ／−と共に３０分間
インキュベートした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗ったのち
、スライドを色素原ＡＥＣと共にインキュベートして発
色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。カバースリッ
プをのせたのち、スライドを観察した。

結果を第２６図に示す。第２６Ａ図＋ＩＩ、−１なし、
抗体７Ａ９で染色；第２６Ｂ図：＋ＩＬ１、抗体７Ａ９
で染色；第２６Ｃ図：ＩＬ−１なし、抗体３Ａ２で染色
；第２６Ｄ図：＋ＩＬ−１、抗体３Ａ２で染色。第２６
Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄ図の大きい斑点は染色の赤色に
よるもので、この赤りは対応する抗原の存在を示す。第
２６Ａ図の小さい１鳴色のスポットは青く染色された核
であるが、赤い細胞質染色によってとり囲まれてはいな
い。

第２６図に示したように、無処理および！Ｌ１処理細胞
の両者に３Ａ２による染色が見られたが、７Ａ９（抗Ｅ
ＬＡＭ−１）による染色はＩＬ−１処理ＨＵＶＥＣにの
み見られた。ＩＩ、−１処理細胞と無処理細胞とを比較
しての３Ａ２抗原の強度および分布の上での差に注目さ
れたい。ＩＬ＝１処理細胞での染色はより小斑点で、場
合によって膜と関連しているのを認めることができる。

追加の実験で、フォノ・ウィレブラント因子に対する抗
体を、ＩＬ−１無処理内皮細胞上での３Ａ２抗体との二
重染色プロトコール（２挿のマウス−次抗体用のデイメ
ド（２７ｍｅｄ）二重染色キットを使用し、メーカーの
指示書に従う）に使用した；これらの抗原はワイベル・
パラド体に共局在することかない。従って、第２４図の
免疫沈降実験により示唆されているように、３Ａ２抗原
は１−７０ｋＤａのポリペプチドとして細胞内に前から
存在しているにちがいない。この理山から、この蛋白質
は細胞質−膜蛋白質１７０　（ＣＭＰ−１７０）と名付
けられている。

（Ｑ）ＣＭＰ−１７０共沈降構造の本質二本実施例の目
的は、ＩＬ−１処理内皮細胞中のＣＭＰ−１７０と会合
する１１０〜１２０ｋＤａの物質を同定することである
。トライトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳＯ，オクチルグル
コシド、トライトンＸ−１１４、ＣＨＡＰＳ、デオキシ
コール酸塩などの一連の洗剤を用いての予備研究により
、ＩＬ−１処理細胞からの３Ａ２抗原の可溶化は通例的
であるが、時によってはより低分子量のバンドの共沈降
を伴うことが示された。この共沈降は洗剤トライトンＸ
−１１４の存在下で最適かつ再現性のあることが見出さ
れた。従って、未処理またはＩＬ−１処理内皮細胞を１
％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解し、３Ａ２抗体また
は対照としてのヤギ抗マウス１ｇＭ試剤のみを用いて、
上記の方法により免疫沈降させた。これらの免疫沈降物
の一部を、非還元性または還元性条件下に８％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。３Ａ２免疫沈
降物を含有する追加のウェルをトライトン 抗原体を解離させ、７Ａ９または２Ｃ７抗体を入れたウ
ェルへ移し、第二の免疫沈降を行わせた。

これらの試料を、還元条件下に８％ＳＤＳーポリアクリ
ルアミド上で泳動させた。

結果を第２７図に示す。ここに、（−）は無処理の、（
＋）は処理した内皮細胞を示す。第２７Ａ図．非還元条
件下で操作したゲル：第２７Ｂ図；還元条件下で操作し
たゲル：第２７Ｃ図、第一および第二レーン：ＩＬ−１
活性化細胞からの７Ａ９および２Ｃ７抗体どの免疫沈降
物（対照として）；第２７Ｃ図、第三および第四レーン
ニアＡ９または２Ｃ７抗体による第二の免疫沈降。

第２７Ａおよび２７Ｂ図に示した結果は、まず、３Ａ２
抗原の分子量が、非還元および還元条件下で１７０ｋＤ
ａであることを示している。還元条件下で３Ａ２抗原が
シャープになることは、この抗原の多量化が若干起りう
ろことを示唆する。溶解および試料用の緩衝液中でのヨ
ードアセトアミドの存在から、この効果が人為的である
とは考えられない。第二に、第２７Ａおよび２７Ｂ図の
結果は、共沈降構造が、分子質量１１０〜１２０ｋＤａ
で、ＣＭＰ−１７０と共有結合によって会合しているの
ではないことを示す。何故なら、非還元条件下でも還元
条件下でもそれが現われるからである。

７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）および２Ｇ７抗原のサイトカ
イン誘発性および分子量の類似性（１１０〜１２０ｋＤ
ａの範囲内）から、それらを共沈降構造の候補と考えた
。該追加のバンドの本質を、それらの会合を助長しない
トライトンＸ−１００で共沈時材料を抽出し、２Ｇ７ま
たは７Ａ９抗体で免疫沈降させることにより調べた。第
２７Ｃ図に示した結果は、７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）蛋
白質が共沈降し、２Ｇ７蛋白質は共沈降しないことを示
している。７Ａ９および２Ｇ７抗原の免疫沈降物をパネ
ルＣの最初の２レーンに比較のために示した。

ＣＭｒ’−１７０：　ＥＬＡＭ−１会合を確認するため
に、もう一つのアプローチも行った。これは、予備実験
で、未処理ＣＯ８細胞の細胞質中にもＣＭｌ−１７０が
存在することが示されたために、可能となったものであ
る。これにより、代謝的に標識され、！・ライドンＸ−
１１４で溶解されたＥＬＡＭ−１ｈランスフエクトＣＯ
８細胞がＣＭＰ−１７０とＥＬＡＭ−１との間の会合 （ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を示すかどうかについてテ
ストできた。

すなわち、ＣＯＳ細胞（内因性ＣＭＰ−１７０を有する
サル腎細胞株）を模擬（ｍｏｃｋ）　　トランスフェク
ションに付すかまたはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡＭ−
１ｃＤＮＡにより常法でトランスフェクトした。トラン
スフェクションから４８時間後に、３×１０６細胞を、
２５０　ｔｔ　Ｃｉの３５Ｓ−システィンで６時間代謝
的に標識し、上述の方法でトライトンＸ−１１４により
溶解し、抗体７Ａ９または３Ａ２により上述の方法で免
疫沈降させた。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元ゲル上で泳動させた。

結果を第２８図に示す。図中、（−）は模擬トランスフ
ェクションを、（＋）はＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡによるト
ランスフェクションを示す。

第２８図に示した結果は、予期した通り、ＥＬＡＭ−１
蛋白質が、先行実験の通り（ベヴイラクアら、サイエン
ス、２４３券１１６０〜１１６５頁、１９８９年’）　
、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯ３細胞か
らは沈降するが、模擬トランスフェクションの細胞から
は沈降しないことを示している。レーン５では、３Ａ２
抗体が、レーン３（対照レーン）では見られない１７０
ｋＤａ構造を免疫沈降させた。興味あることに、対照レ
ーンでは見られない約１００ｋＤａの顕著な追加のバン
ドがある。右端のレーン（レーン６）では、３Ａ２抗体
が、１７０ｋＤａ構造に加えて、ＥＬＡＭ−１抗原を明
瞭に共沈降させた。レーン５の１００ｋＤａのところに
見られる内因性３Ａ２関連ＣＯ８蛋白質が、トランスフ
ェクトされた細胞中のＥＬＡＭ−１によって置換されて
いるかどうかは、それらの分子量が近似しているため決
定できなかった。レーン１から知りうる通り、７Ａ９抗
体は模擬的にトランスフェクトされたＣＯ８細胞からの
蛋白質を沈降させなかった。また、ＣＯ８細胞（第２８
図のレーン２）および内皮細胞（第２７Ｃ図のレーン１
）からの７Ａ９を用いての免疫沈降データも、１７０ｋ
Ｄａで共沈降するバンドを示さなかった。それゆえ、Ｅ
ＬＡＭ−１とＣＭＰ−１７０との共沈降は一方向性であ
る。

（Ｒ）３Ａ２　：　ＥＬＡＭ−１会合の動態：３×１０
６の内皮細胞を２５０μＣｉの３５Ｓ−システィンと共
に４５分間または１２０分間パルスに付し、直ちに上記
の方法でトライトンＸ−１１４により溶解するか、その
前に１または２時間チエイスした。溶解物を３Ａ２また
は７Ａ９抗体により上記の方法で免疫沈降させ、免疫沈
降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲル上
で泳動させた。さらに、ＩＬ−１に４時間曝露した内皮
細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡで脱着させ、下記のラクトペル
オキシダーゼ法によって１２５■で標識した。

細胞をトライトンＸ−１１４洗剤によって溶解し、３Ａ
２または７Ａ９抗体を用いて免疫沈降物を作成した。そ
れら免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還
元性ゲル上で泳動させた。

細胞表面沃素化には、５００万の内皮細胞をＰＢＳ−Ｅ
ＤＴＡ処理によって脱着し、２回洗い、４℃で２００μ
ＤのＰＢＳに再懸濁させた。この管に、０．５ｍＣ１の
１２５１．５０μｇのラクトペルオキシダーゼ（０，２
■／ａｌｌ）を加え、続いて、バーデイにより記載され
た方法（Ｒ，Ｒ。

Ｈａｒｄｌ、ハンドブック・オヴ・エクスペリメンタル
・インムロノジー、第１巻２０．８頁、Ｄ、　Ｍ。

ウェア編、ブラックウェル・サイエンティフィック・パ
ブリケイションズ、オックスフォード、英国）により、
３０％Ｈ２Ｏ２２０μρを１分間隔で、１／２７，００
０．１／９，０００，１／３、（６）００および１／１
、（６）００の希釈率で、加えた。細胞を３回洗い、０
．１５Ｍ　　ＮａＣ，Ｑ、１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４
）　、２ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍＭヨードアセトアミド
を含有する１％トライトンＸ−１１４洗剤で溶解させた
。

結果を第２９図に示す。第２９Ａ図は、４５分間後に溶
解させた３５Ｓ−システィンパルス標識細胞（ｐｕｌｓ
ｓ　、最初の２レーン）またはさらに１または２時間チ
エイス（ｃｈａｓｅ）　Ｉ、たちの（それぞれレーン３
および４またはレーン５および６）についての結果を示
す。第２９Ｂ図は細胞表面沃素化の結果を示す。

第２９Ａ図に示した結果は、ＩＬ−１添加４５分後に、
免疫沈降可能な発生期の７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）蛋白
質があることを示している。同様に、同じ７９ｋＤａ分
子質量の蛋白質がＣＭＰ−１７０により共沈降する。細
胞を２時間パルスし、もう１または２時間チエイスする
とき、３Ａ２抗体は、７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗体に
より沈降する同じ分子質量の物質をひき続き共沈降させ
る。それゆえ、ＣＭＰ−１７０／ＥＬＡＭ−１℃合を、
ＥＬＡＭ−１合成の最も早い時点からそれが成熟サイズ
に達するまで、検出できる。第２９Ｂ図に示した結果は
、３Ａ２抗体も細胞表面からの７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１
）蛋白質を共沈降させるが、見られるように、３Ａ２抗
原はそれ自身はあまりよく標識されないようである。

（Ｓ）ＣＭＰ−１７０および７Ａ９　（ＥＬＡＭｌ）抗
原の細胞表面での発現の動態二手底マイクロタイタープ
レート中でコンフルエントになるまで生育させた内皮細
胞を０〜４８時間ｌｎｇ／ａｌｌのＩＬ−１に曝露し、
つぎにハイブリドーマによる生産について上記したのと
類似のプレート結合アッセイで、７Ａ９および３Ａ２抗
原の発現を調べた。

結果を第３０図に示す。第３０図において、白抜きの円
は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形は３Ａ２抗原を表わす
。第３０図の結果かられかるように、両法白質の発現が
同時に起り、２〜４時間あたりにピークとなる。しかし
、７Ａ９　（ＥＬＡＭ−１）抗原は、ＩＬ−１が存在す
る限り高いレベルに維持され、一方、３Ａ２抗原は４８
時間で基礎レベルまで低下する。追加の実験（詳述しな
い）により、ＥＬＡＭ−１と同様に、ＣＭＰ−１７０が
、ＴＮＦおよびリポ多糖への内皮細胞の曝露によって誘
発されるが、ガンマ−インターフェロンへの曝露によっ
ては誘発されないことが示されている。

（Ｔ）モノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７が結合す
るＥＬＡＭ−１のエピトープの決定および可溶形態のＥ
ＬＡＭ−１の調製：第３１図は、モノクローナル抗体７
Ａ９および３Ｂ７が結合するエピトープを決定すべく調
製したＥＬＡＭ−１の種々の截頭形態（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ　ｙｅｔｓｉｏｎｓ）を示す。

それらのＥＬＡＭ−１截頭形は、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡ
の欠失形の３′末端の終止コドン、たとえばＴＡＡまた
はＴＡＧを含むＰＣＲプライマーを用いて、この実施例
の（Ｃ）で記載したようなＰＣＲプライマーによって構
築した。かかるプライマーの構築は常法に属する。Ｃ０
ＯＨ末端を、ＥＬＡＭ−１分子の截頭形がレクチンドメ
イン（ＬＥＬＡＭ−１）　、レクチン十ＥＧＦドメイン
（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）　、レクチン＋ＥＧＦ十補体調
節ドメイン（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ！　ｒｅｇｕｌａｔａ
ｒｙ　ｄｏｍａｉｎ）の一部（ＬＥＣ−ＥＬＡＭ−１）
およびレクチン十ＥＧＦ十補体調節ドメインの全部マイ
ナスＥＬＡＭ−１分子のトランスメンブレンおよび細胞
質テイル（ＥＬＡＭ−ＩＴｍ−）をそれぞれ含むように
選択した。Ｌ−ＥＬＡＭ−１、ＬＥ−ＥＬＡＭ−１、Ｌ
ＥＣ−ＥＬＡＭ−１および成熟形ＥＬＡＭ−１を、外来
遺伝子（ＥＬＡＭ−１の截頭形）を駆動するＲ８Ｖプロ
モーターおよび別の優性選択マーカー５Ｖ２ＤＨＦＲを
含む発現ベクター中へクローン化した。このようなベク
ターは、ＡＴＣＣから人手可能なプラスミド（ｐＲ３Ｖ
ｎｅ。

（ＡＴＣＣＮ０．３７１９８）およびｐＳＶ２ＤＨＦＲ
（ＡＴＣＣＮｏ、６７１１０）　）を用いて常法により
構築できる。トランスメンブレン欠失形ＥＬＡＭ−１、
すなわちＥＬＡＭ−ＩＴｍ−はｐＣＤＮ＝１ベクター中
ヘクローン化した。それらプラスミドを、本実施例の（
Ｃ）に記載したＤＮＡ−ＣａＰＯ４共沈法によってＣＯ
３細胞へ導入した。ＤＮＡトランスフェクションから４
８時間後に、トランスフェクトされた細胞の一部を用い
て、ＥＬＡＭ−１特異抗体７Ａ９および３Ｂ７ならびに
抗体３Ａ２との免疫沈降（本実施例の（Ｃ）に記載と同
様）を行った。トランスフェクトされた細胞の上澄みな
らびに細胞溶解物を用いて、３５Ｓ−システィンによる
細胞の代謝性標識ののち、免疫沈降を行った。

これらの細胞の上澄みを用いた免疫沈降実験の結果を第
３２図に示す。結果は、レクチンおよびＥＧＦ様ドメイ
ンにより規定される分子のＮ末端３０．７％という小さ
い断片（ＬＥ−ＥＬＡＭ−１）が７Ａ９および３Ｂ７抗
体の両方と反応することを示している。

（υ）白血球の活性内皮細胞への結合のブロッキングを
検出するアッセイ：実施例１記載のようにして、廃棄腑
帯から内皮細胞を得て、培養する。

細胞は速かに増殖し、それらの分化された性質が低減す
るまでに６回まで他のフラスコへ分割（継代）する。２
回目の植継ぎにより、ブロッキングアッセイを行うのに
十分な細胞を人手できる。組換えヒ）ＩＬ−１ベータを
ｌｎｇ／ｍｆＩ濃度で細胞に加え、細胞を通常通り６％
ＣＯ２，９４％空気含有加湿培養室中に維持しながら４
〜６時間培養する。対照は、ＩＬ−１の不存在下に内皮
細胞を培養するものとする。培養期間後、細胞を培地で
洗い、使用されなかったＩＬ−１を除く。

単核細胞、たとえば単球、顆粒球、またはＴ細胞、Ｂ細
胞およびＮＫ細胞を包含する単核細胞の混合物をヒトか
ら得て、当該技術分野で既知の方法にまり単離、精製す
る。

単核細胞を、抗原１Ｅ７／２Ｇ７またはＥＬＡＭ−１の
抗原性断片類の存在下に、３７℃で３０分間ブレインキ
ュベートする。抗原は、単核細胞上のりガント結合部位
を飽和させるのに十分な量だけ用いる。

単核細胞をつぎに、引続いて抗原の存在下に、内皮細胞
に３０〜６０分間加えておいて、付着させる。非付着性
細胞を生育培地で洗い去り、未処理またはＩＬ−１処理
内皮細胞（Ｅ　Ｃ”）に結合した細胞の数の差を調べる
。

このアッセイは、放射性トレーサー、たとえば５１Ｃｒ
を既知の方法によって、結合研究対象細胞の細胞質中へ
導入し、細胞外カウントを洗い去り、これらの標識した
細胞をＥＣの単層上にのせることによって、定量的に行
う。この目的で用いた５１Ｃｒ標識は、３０〜６０分間
の結合アッセイの間は極小の漏出しか示さない。洗って
非付着性細胞を除去したのち、単層を洗剤で可溶化する
。各ウェルからカウントされた放射能を結合細胞数の尺
度とする。

実施例５ １Ｅ７／２Ｇ７抗原のｃＤＮＡ配列 最近、ＶＣＡＭ−１と呼ばれる付着分子が記述されてい
る〔オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎ）ら、セル、５９巻１２
０３〜１２１１頁、１９８９年〕。ｃＤＮＡ発現クロー
ニングによって１Ｅ７／２Ｇ７抗原をクローン化する試
みに先立って、１Ｅ７／２Ｇ７抗原がＶＣＡＭ−１と関
係があるかないかを知る目的で、ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡ
をクローン化した。ＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡは、ＩＬ−１
活性化ＨＵＶＥＣからのポリＡ”　ＲＮＡを用いて、実
施例４（Ｃ）記載のように、ＰＣＲプライマーによって
クローン化した。次のＰＣＲプライマーを、約２、Ｏｋ
ｂの大きさに対応するＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡの公表され
ているコード配列を増幅するだけの目的で選んだ′ニ ア５　イア−１５’ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＱＡ
ＡＣＴＴＡＡＡＡＴＧＯＺＴＧＯＱＡＡＱＡＴＧ３’７
　ライ７−　２５’ＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＴＡ
ＧＣＴＡＣＡＣＴｎ了ＧＡＴＴＴＣＴＧＴＱＡ３’約２
、（６）ｋｂのコード配列を得る代りに、ＰＣＲ増幅の
主産物として、２．３ｋｂバンドを、得た。この２．３
ｋｂバンドを、実施例４（Ｃ）記載の方法で、発現ベク
ターｐＣＤＮ−１中へクローン化し、いくつかのクロー
ンを単離した。５クローンについて、実施例４　（Ｂ−
２）記載の方法で、ＣＯ３細胞を用いる一過性発現アッ
セイにより１Ｅ７／２　Ｇ　７抗体の結合を試験した。

５クローン全てが、モノクローナル抗体１Ｅ７および２
Ｇ７に対して強い結合を示した。

これらクローンの常法を用いて行った制限分析により、
ＰＣＲ増幅クローンが発表されているＶＣＡＭ−１配列
と同じ配列を含んでいるとすれば予想されるバンドとは
異なるパターンが示された。

これらの研究は、発表されている遺伝子のほぼ中央に約
２８２ｂｐの挿入配列のあることも示唆した。１クロー
ンをサンガー法（Ｓ　ａｎｇｅｒ　ら、プロシーディン
グズ・オヴ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オヴ・サイ
エンシズ、ＵＳＡ、７４巻５４６３〜５４６７頁、１９
７７年）に従って配列決定したところ、ＶＣＡＭ−１分
子の３０８番アミノ酸位置に９４アミノ酸からなる挿入
配列が示された（第３３図）。かくして、１Ｅ７／２Ｇ
７抗原は、発表されているＶＣＡＭ−１分子とは異なる
。１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコードするｃＤＮＡ配列および
相当する分子のアミノ酸配列を第３４Ａ〜３４Ｄ図に示
す。

以上、本発明を詳細に、また特定の実施例を挙げて説明
したが、当業者ならば、本発明の精神および範囲を逸脱
することなく、種々の変更、装飾をなしうろことは明ら
かであろう。

寄託の記述 ハイブリドーマ１Ｅ７．２Ｇ７．３Ａ２および７Ａ９は
、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダ
ペスト条約の条項に従い、１９８９年５月９日に、メリ
ーランド州２０５８２、ロックヴイル市パークローンド
ライヴ９２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はそれぞれ
ＨＢＩ０１３６、ＨＢ１０１３７、ＨＢ１０１３８およ
びＨＢ１０１３５である。ハイブリドーマ３Ｂ７は、１
９９０年３月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号はＨＢ１
０３９１である。本出願に対して米国特許が付与された
ときは、入手に対する全ての制限が取消し不能的に除か
れるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規モノクローナル抗体（ＭＡｂ）
が白血球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合をブロック
する機構および本発明の新規抗原（ペプチド）が炎症を
ブロックするように働く機構を模式的に示したものであ
る。 第２図は、未誘導（・・・）およびＩＬ−１誘導（−）
ヒト杭静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のフローサイトメト
リー分析を示す。横軸上の各２５チヤンネルは蛍光強度
ａ、　ｕ、−任意単位がほぼ２倍になることを意味する
。任意単位での細胞数を縦軸に示す。第２Ａ図で、１は
、間接蛍光ヤギ抗マウス試薬のみで染色した内皮細胞上
の蛍光強度を示す。２は、以降の図と比較するための標
準であるＷ６／３２抗ＨＬＡ試薬の強度を示す。第２Ｂ
図で、実線は１Ｅ７抗体による染色を示す。第２Ｃ１２
Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ図は、それぞれ抗体２Ｇ７．７Ａ９
．３Ｂ７およびＲＲＩ（抗ＩＣＡＭ−１）による染色を
示す。第２Ｂ〜２Ｆ図の点線は未誘導ＨＵＶＥＣの示さ
れたモノクローナル抗体による染色を意味する。 第３図は、モノクローナル抗体１Ｅ７．２Ｇ７および３
Ｂ７の１Ｅ７／２Ｇ７　　ｃＤＮＡトランスフェクトＣ
Ｏ３細胞との反応性を示すヒストグラムである。結果は
、ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体に続いての１２５Ｉ−
ストレプトアビジンのＣＰＭｘｌＯ−３で表わされてい
る。 第４図は、モノクローナル抗体２Ｇ７のＦ　（ａｂ’　
）２断片の種々の用量で又は本発明のモノクローナル抗
体１Ｅ７の１０μｇ／−で前処理されたＩＬ−１活性化
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのヒト単核細胞の結合の阻害
を示すグラフである。 第５図は、ＨＵＶＥＣへの顆粒球の付着に対するモノク
ローナル抗体の影響を示すヒストグラムである。結果は
、ウェル当り結合細胞数±ｓ、ｅ３ｍ（ＩＩ　＝　３）
で表わされている。 第６図は、ＨＵＶＥＣへのＴ細胞の付着に対するモノク
ローナル抗体の影響を示すヒストグラムである。結果は
、ウェル当り結合細胞数±ｓ、　ｅ、　ｍ（ＩＩ　＝　
３）で表わされている。 第７図は、本発明のモノクローナル抗体１Ｅ７および２
Ｇ７によって規定される抗原の非還元条件下でのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）パターン（１０％アクリルアミド）である。分子量標
準も示す。 第８図は、本発明のモノクローナル抗体３Ａ２および７
Ａ９によって規定される抗原の還元条件下（第８Ｂ図）
および非還元条件下（第８Ａ図）でのＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動パターン（８％アクリルアミド
）である。分子量標準も示す。 第９図は、正常な休止およびＩＬ−１活性化内皮細胞（
Ｅ　Ｃ）への本発明のモノクローナル抗体の結合（ＥＣ
抗原発現に対するＩＬ−１の効果）を示すグラフである
。 第１０図は、ＩＬ−１不存在下での正常なヒト白血球、
顆粒球又は単核細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）への
本発明のモノクローナル抗体の結合（白血球上での内皮
抗原発現）を示すグラフである。 第１１図は、２〜９６時間の種々の時間ＩＬ１に曝露さ
れた内皮細胞への本発明のモノクローナル抗体の結合を
示すグラフである。 第１２図は、３５Ｓ−システィンで標識された休止（第
１２Ａ図）およびＩＬ−１活性化（第１２Ｂ図）内皮細
胞からのトライトンＸ−１１４洗剤ペレツト（膜蛋白質
）の２−Ｄゲルパターンである。未誘起細胞（−１Ｌ−
１）２−Ｄゲル（第１２Ａ図）の左上方の３本の矢印は
、右側（＋ＩＬ１）の誘起ゲル（第１２Ｂ図）中で誘発
蛋白質が現われる領域を示す。データベース中の既知蛋
白質との比較に基いて、見掛けの分子量および等電点を
示した。 第１３図は、ＩＦ５および２Ｇ７免疫沈降物単独ならび
に未誘起（−ＩＬ−１）および誘起（＋ＩＬ−１）ＨＵ
ＶＥＣからの絶膜蛋白質と混合したときのＩＦ５および
２Ｇ７免疫沈降物の２−Ｄゲルパターンである。８つの
正方形の各々には、第１２図で分析された総ゲルの左上
方の４分の１に相当する２−Ｄゲルの部分が示されてい
る。第１３Ａおよび１３Ｂ図は、ＩＦ５（上方）または
２Ｇ７（下方）抗体による免疫沈降物のみである。 これらのゲルの他の部にはそれ以上のスポットは見られ
なかった。第１３Ｃおよび１３Ｄ図は、免疫沈降物を加
えていない、未誘起（−１Ｌ−１、上方）または誘起（
ＩＬ−１、下方）ＨＵＶＥＣからの絶膜蛋白質を示す。 第１３Ｅおよび１３Ｆ図は、未誘起ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃの
膜蛋白質へのＩＦ５（上方）または２Ｇ７（下方）免疫
沈降物添加の影響を示す。第１３Ｇおよび１３Ｈ図は、
！Ｌ１誘起ＨＵＶＥＣからの膜蛋白質へのＩＦ５（上方
）または２Ｇ７（下方）免疫沈降物添加の影響を示す。 プラス（＋）は各ゲルの酸性末端を、マイナス（−）は
塩基性末端を意味する。 第１４図は、免疫沈降物の単独および組合せの２−Ｄゲ
ルパターンである。免疫沈降に用いたモノクローナル抗
体は次の通りである：第１４Ａ図、ＲＲＩ（抗ＩＣＡＭ
−１）；第１４Ｂ図、２Ｇ７；第１４Ｃ図、７Ａ９；第
１４Ｄ図、ＲＲ１千２Ｇ７；第１４Ｅ図、ＲＲ１＋７Ａ
９　；第１４Ｆ図、２Ｇ７＋７Ａ９゜６９の２−Ｄゲル
の各々左上方４分の１のみを示した。他の領域には、追
加のスポットはなかった。 第１５図は、ｐＣＤＮ−ＥＬＡＭ−１発現プラスミドの
ダイアグラムである。ＥＬＡＭ−Ｉ　　ｃＤＮＡを、ｐ
ＳＶ２　　ＮＥＯ（サザンとハーグ、ジャーナル・オヴ
・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネティック
ス、１巻３２７〜３４１頁、１９８２年）から導いた、
ＳＶ４０初期プロモーター（斜線部）ならびにＳＶ４０
″ｔ”スプライス配列およびポリＡ付加配列（点を打っ
た領域）を含むプラスミド（ｐＣＤＮ−１；Ｔ、ｖ。 コハル、未発表）中にクローン化した。プラスミドの残
余はｐＢＲ３２２（）配列を 含んでいた。重要な制限部位は図中に示しである。 ＭＣ３は多重クローニング部位を意味する。 第１６図は、ＥＬＡＭ−１で、および模擬的にトランス
フェクトされたＣＯ３細胞のモノクローナル抗体結合ア
ッセイのヒストグラムである。結果はウェル当り総Ｃｐ
ｍの平均（±ｓ、　（ｍ、　ｎ　＝　３）で表わされて
いる。 第１７図は、ツニカマイシンＢ２なしでまたは用いてＩ
Ｌ−１で処理され、２Ｇ７または７Ａ９モノクロ一ナル
抗体で免疫沈降させられたコンフルエントＨＵＶＥＣの
１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元性ゲルパターン
である。 第１８図は、ＩＬ−１で活性化され、３５Ｓ−システィ
ンで代謝的に標識されたＨＵＶＥＣの２−Ｄゲルパター
ンである。細胞は無処理のままか、溶解前に３０分間ノ
イラミニダーゼ処理した。トライトンＸ−１００溶解物
を２６７（第１８Ａ図）または７Ａ９（第１８Ｂ図）抗
体で免疫沈降させた。４９の２−Ｄゲルの各々の一部を
図に示した。 第１９図は、７Ａ９または２Ｇ７抗体で免疫沈降させた
ＩＬ−１活性化３５Ｓ−システィン標１ＨＵＶＥＣのト
ライトンＸ−１００溶解物の１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド還元性ゲルパターンである。免疫沈降物は、緩
衝液のみ、ノイラミニダーゼ（Ｎ’　ａｓｅ）またはノ
イラミニダーゼおよびそれに続くエンド−α−Ｎ−アセ
チルガラクトサミニダーゼ（０−ｇｌｙ’　ｃａｓｅ）
により処理した。 第２０図は、指定の期間ＩＬ−１と共にインキュベート
したＨＵＶＥＣの１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド還
元性ゲルパターンである。トライトンＸ−１００溶解物
の免疫沈降物は、２Ｇ７または７Ａ９抗体を用いて形成
させた。 第２１図は、フルオレセイン結合モノクローナル抗体１
Ｅ７．２Ｇ７．３Ｂ７または７Ａ９を用いて行った競合
アッセイのヒストグラムを示す。 第２１Ａ図、１Ｅ７；第２１Ｂ図、２Ｇ７・第２ｌＣ図
、３Ｂ７；第２１Ｄ図、７Ａ９゜縦軸に陽性細胞百分率
をとっである。データはフローサイトメトリーから導い
たものである。 第２２図は、指定の期間ＨＵＶＥＣをＩＬ−１に曝露し
た結果を示すグラフである。抗体２Ｇ７（・）または７
Ａ９（ム）を飽和濃度でサンドイッチ結合アッセイに用
いた。結果は、平均ｃｐｍ±ｓ、ｅ、ｍ、　（ＩＩ＝３
）として表わされている。 第２３図は、間接試薬のみ（第２３Ａ図）、Ｗ６／３２
抗ＨＬＡ抗原（第２３Ｂ図）、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＲＲ
／１　（第２３Ｃ図）および３Ａ２抗体（第２３Ｄ図）
で染色した休止（・・・）またはＩＬ−１刺激（−）内
皮細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 第２４図は、無処理で（−）またはＩＬ−１で処理しく
＋）、１％トライトンＸ−１００で溶解し、指定の抗体
で免疫沈降させた代謝標識内皮細胞からのＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド還元性ゲル（８％アクリルアミド）パタ
ーンを示す。図中、ＭＡｂ７およびＭＡｂ３はそれぞれ
モノクローナル抗体７Ａ９および３Ｂ７を表わす。 第２５図は、ＩＬ−１およびアクチノマイシンＤまたは
シクロヘキシミドで処理したのち、プレート結合アッセ
イで２Ｇ７．７Ａ９（抗ＥＬＡＭ−１）または３Ａ２抗
原の発現を調べた内皮細胞のヒストグラムを示す。第２
５Ａ図、Ｉ　Ｌ−１±シクロヘキシミド；第２５Ｂ図、
ＩＬ−１±アクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ）。 第２６図は、３Ａ２抗原の光学顕微鏡評価を示す。第２
６Ａ図、生育培地のみで培養し、抗体７Ａ９で染色した
内皮細胞；第２６Ｂ図、ＩＬ−１で活性化し、抗体７Ａ
９で染色した内皮細胞；２６Ｃ図、生育培地のみで培養
し、抗体３Ａ２で染色した内皮細胞；第２６Ｄ図、ＩＬ
−１で活性化し、抗体３Ａ２で染色した内皮細胞。第２
６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄ図の大きい斑点は、対応する
抗原の在在を示す染色由来の赤色による。第２６Ａ図の
小さい暗スポットは、青く染色されたが、赤い細胞質染
色には囲まれていない核である。 第２７図は、３Ａ２抗体（ＭＡｂ３）または対照のヤギ
抗マウス１ｇＭ試薬のみ（ＭＡ　ｂ−）で免疫沈降させ
た未処理（−）またはＩＬ−１処理（＋）内皮細胞のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルパターンを示す。これら
の免疫沈降物の一部を、非還元（第２７Ａ図）または還
元（第２７Ｂ図）条件下に８％ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で泳動させた。第２７Ｃ図、第一および第二
レーン：　ＩＬ−１活性化細胞からのモノクローナル抗
体７Ａ９または２Ｇ７（それぞれＭＡｂ７、ＭＡｂ２）
による免疫沈降物（対照として）；第２７Ｃ図、第三お
よび第四レーン＝３Ａ２免疫沈降物からの７Ａ９または
２Ｇ７抗体による免疫沈降物。 それゆえ、第二のバンドは、第２７Ａおよび２７Ｂ図の
モノクローナル抗体３Ａ２　（１７０ｋＤａ）および７
Ａ９と共沈降したが、２Ｇ７抗原とはしなかった。 第２８図は、模擬トランスフェクションに付した（−）
、またはＣＤＮプラスミド中のＥＬＡＭｌｃＤＮＡによ
りトランスフェクトした（＋）ＣＯ３細胞の７Ａ９また
は３Ａ２免疫沈降物のＳＤＳ−ポリアクリルアミド還元
性ゲル（１０％アクリルアミド）パターンである。モノ
クローナル抗体７Ａ９はＥＬＡＭ−１蛋白質を沈降させ
、モノクローナル抗体３Ａ２はＣＯ８細胞内因性１７０
ｋＤａ抗原を沈降させ、ＥＬＡＭ−１を共沈降させる。 第２９図は、３５Ｓ−システィンと４５または１２０分
間パルス（ｐｕｌｓｅ）　Ｌ、４５分後に溶解するか（
第２９Ａ図、最初の２レーン）または溶解前に１または
２時間さらにチエイス（ｃｈａｓｅ）　シた（第２９Ａ
図、残りのレーン）内皮細胞の免疫沈降物のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド還元性ゲル（１０％アクリルアミド）
パターンを示す。第２９Ｂ図の場合、内皮細胞をＩＬ−
１に４時間曝露したのち、１２５Ｉで表面標識しておい
た。ゲルは３Ａ２　：　ＥＬＡＭ−１会合の動態を示す
。図中、ＭＡｂ３およびＭＡｂ７はそれぞれモノクロー
ナル抗体３Ａ２および７Ａ９を意味する。 第３０図は、ＣＭＰ−１７０および７Ａ９　（ＥＬＡＭ
−１）抗原の細胞表面発現の動態を示すグラフである。 白抜きの円は７Ａ９抗原を、白抜きの三角形は３Ａ２抗
原を表わす。 第３１図は、抗原ＥＬＡＭ−１の種々の截頭形態のダイ
アグラムを示す。 第３２図は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）　ＥＬＡＭ−１抗
原および抗原ＥＬＡＭ−１の種々の截頭形の、モノクロ
ーナル抗体３Ａ２．３Ｂ７および７Ａ９との共沈降パタ
ーンを示す。抗原性断片は、所定のＥＬＡＭ−１構築物
でトランスフェクトし、４８時間後に、３５Ｓ−システ
ィンで１４時間標識したＣＯ８細胞の上澄みのみから得
た。截頭形の各構造を第３１図に示す。 第３３図は、ＶＣＡＭ−１抗原および１Ｅ７／２Ｇ７抗
原のダイアグラムである。 第３４Ａ〜３４Ｄ図は、１Ｅ７／２Ｇ７抗原をコードす
る分子の２４番目〜２２４３番目塩基（コード領域）の
ｃＤＮＡ配列を示す。対応するアミノ酸配列も、アミノ
酸の標準的な１文字記号を用いて示した。 （以　上） 鵬鴎の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ　２Ａ ＦＩＧ　２Ｂ ＦＩＧ、２Ｃ ＦＩＧ、　１ 刃 ＱＱ ５０ ００ ５０ ＦＩＧ、２Ｄ ＦＩＧ、２Ｅ ＦＩＧ　２Ｆ ＦＩＧ　５ ＦＩＧ６ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ　４ ＦＩＧ、７ ＭＡｂ　　　１Ｅ７　２Ｇ７　− ＩＬ−１＋　　　　＋　　　＋ Ｅ７ Ｇ７ ＦＩＧ、８Ａ ＭＡｂ 遣尤 Ａ２７Ａ９ 郭− １− ｏ／、描へ′生 ＦＩＧ、８Ｂ ３Ａ２−７Ａ９ ＦＩＧ　９ ＦＩＧ　１０ 末頁粒エネ゛ 単　↑支　糸１）８乞 ま〆″Ａ　完 ＦＩＧ、ｌ２Ａ ＦＩＧ、１２Ｂ ４Ｂ　　ｊｊ　１Ａ、％　　（＝Ｚ　　６’Ｊ　　７Ｃ
つＮ トｌも＋４１） ト１０Ｉ→ヒ ＦＩＧ、１４Ｆ ＦＩＧ　、１５ ＦＩＧ、＋６ モノクローナル↑た俸 ＦＩＧ、＋７ ＩＯＡＭ−１２Ｇ７　　７Ａ９ ツニカマイシ”；−＋　　−十−＋ ｆＬＩ　　　　　　　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　
　＋轟Ａｔ・ 徊吻艷 ＦＩＧ、　１８Ａ ＦＩＧ、１８Ｂ ＦｉＧ、１９ ＦＩＧ　２１Ａ ＦＩＧ、２ＩＣ ８７−Ｆ Ｅ７ ２Ｇ？ Ａ９ ３Ｂ？ Ｆ　Ｉ　Ｇ、２０ ＝２００ ＦＩＧ、２１Ｂ ＦＩＧ、２１Ｄ Ａ９−Ｆ Ｅ７ ２Ｇ？ Ａ９ ３Ｂ？ ＦＩＧ　２３Ａ ＦＩＧ、２３Ｂ ＦＩＧ、２３Ｃ ＦＩＧ、２３Ｄ ０ ００ ＋５０ ００ ５０ ＦＩＧ、２４ ＦＩＧ　２２ ＭＡｂ７７　−−３３ ＣＯＳ　　　−＋−＋　　−＋ Ａｒ ０．２５　　　２　　　　４ 工し−１ヌ５王里 ２４　　７２ （時間） ＋２０ ６８ ７５４ ＦＩＧ、２５Ａ ＦＩＧ　２５Ｂ モノクローナルゴたイ杢 ＦＩＧ、２６Ａ ＦＩＧ、２ｂｕ ＦＩＧ、２Ｂ Ａｂ ０８ ７Ａ９７Ａ９− 十 ＋ ３Ａ２３Ａ２ ＋ ｒ ＦＩＧ、２６Ｂ ＦＩＧ、２７Ａ ＦＩＧ、２７Ｂ ＦＩＧ、２７Ｃ Ａｂ −３ ＭＡＩ） ｕｌｓｅ ｈ　ａｓｅ ７３７３７ ４５４５１２０１２０１２０１２０ −−６０６０１２０’１２０ 紳 ００− ５− ４５〜 ＦＩＧ、３２Ａ ＦＩＧ、３２Ｂ 顎（Ｖト□ＱＪｐ−○〜ｔ−ｃ５）・ 就Ｓ五Ｍは計律 ニド読方１）正常（自発） 平成２年７月４０ 平成２年特許願第１３５１３１号 ２　発門の名称 活性内皮細胞に対するモノクローナル抗体、該モノクロ
ーナル抗体およびそれらの抗原を用いた医薬品および治
療法ならびに該モ補正の内容 １　明細書の「特許請求の範囲」を別紙の通り訂正する
。 （以　上） 大塚製薬株式会社 ４代理人 大阪市中央区平舒町２−１−２沢の鶴ビルｆｆ１０６　
（２０３）　０９４１ 自　　発 ６　補正の対象 明細書中「特許請求の範囲」の項 特許請求の範囲 ■　ＩＬ−１活性化内皮細胞に特異的に結合するモノク
ローナル抗体またはその結合部位含有断片であって、該
モノクローナル抗体が下記モノクローナル抗体（Ａ）（
Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選はれたものであるこ
とを特徴とする前記モノクローナル抗体またはその断片
：（Ａ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗
体： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には−Ｇ意に
は結合せず、（３）休止またはＩＬ−１活性比顆粒球ま
たはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混
合物には−Ｇ意には結合せず、 （４）インビトロで、Ｔ細胞の１Ｌ−１活性化内皮細胞
への結合を阻害しないかまたは部分的に阻害し、 ■インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への
結合を阻害せず、 ＠　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在し、第３
４Ａ〜３４Ｄ図によって規定される１Ｅ７／２Ｇ７シア
ロ糖蛋白質抗原に特異的に結合する； （Ｂ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体
： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性比顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細
胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意には
結合せず、 ■休止及びＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞質中及びＩＬ
−１活性化内皮細胞の表面に存在するＣＭＰ−１７０抗
原に特異的に結合する；及び （Ｃ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体
： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、■正
常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
結合せず、 ■休止またはＩＬ−１活性化顆粒球またはＴ細胞、Ｂ細
胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意には
結合せず、 ０インビトロで、Ｔ細胞の活性内皮細胞への結合を部分
的に阻害し、 ０インビトロで、顆粒球のＩＩ、−１活性化内皮細胞へ
の結合を完全にまたは部分的に阻害し、 （６）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在する
ＥＬＡＭ−１シアロ糖蛋白質抗原のＮ末端２Ｏ％に特異
的に結合し、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞の表面に存在する
１Ｅ７／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原には結合しない。 ■　該モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体（Ａ
）である請求項１記載のモノクローナル抗体またはその
結合部位含有断片。 ■　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しないも
のである請求項２記載のモノクローナル抗体またはその
結合部位台り断片。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体またはその
結合部位含有断片。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドーマ
細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１Ｅ
７またはその結合部位含有断片。 ■　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害
するものである請求項２記載のモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片。 ■　該七ツクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％まで
部分的に阻害するものである請求項６記載のモノクロー
ナル抗体またはその結合部位含有断片。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリドーマ
細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ
７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体またはその
結合部位台６断片。 ■　ＡＴＣＣ寄託番０ＨＢ１０１３７のハイブリドーマ
細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２Ｇ
７またはその結合部位含有断片。 （１０）　該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体
（Ｂ）である請求項１記載のモノクローナル抗体または
その結合部位含有断片。 （１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３８のバイプリド
ーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体
３Ａ２の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
その結合部位含有断片。 ＠　　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドー
マ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３
Ａ２またはその結合部位含有断片。 ０　該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（Ｃ）
である請求項１記載のモノクローナル抗体またはその結
合部ｆ）″を含有断片。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１を工性化内皮細胞への結合を完全に阻害
するものである請求項１３記載のモノクローナル抗体ま
たはその結合部位含有断片。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％まで
部分的に阻害するものである請求類１４記載のモノクロ
ーナル抗体またはその結合部位含を断片。 （１０）　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片。 ＠　　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドー
マ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７
Ａ９またはその結合部位含有断片。 （１０）　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロ
での顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的
に阻害するものである請求項１３記載のモノクローナル
抗体またはその結合部位ＶＳｆｊ断片。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％まで
部分的に阻害するものである請求項１８記載のモノクロ
ーナル抗体またはその結合部位含有断片。 （１０）　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロ
でのＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１
％まで部分的に阻害するものである請求項１９記載のモ
ノクローナル抗体またはその結合部位含有断片。 ｏ　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドーマ
細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３Ｂ
７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体またはその
結合部位含有断片。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドーマ
細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３Ｂ
７またはその結合部位含有断片。 ０　請求項１記載のモノクローナル抗体（Ａ）　、（Ｂ
）または（Ｃ）を生産するハイブリドーマ細胞株。 （１０）　モノクローナル抗体（Ａ）を生産するもので
ある請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 ■　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を附書しないも
のである請求項２４記載のハイブリドーマ細胞株。 （１０）　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリ
ドーマ細胞株１Ｅ７の同定特性を全て持つバイプリドー
マ細胞株。 （１０）　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３６のハイブ
リドーマ細胞株１Ｅ７゜ ■　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害
するものである請求項２４記載のハイブリドーマ細胞株
。 ■　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％まで
部分的に阻害するものである請求項２８記載のハイブリ
ドーマ細胞株。 Φ　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３７のハイブリドー
マ細胞株２Ｇ７の同定特性を全て持つハイブリドーマ細
胞株。 ■　該モノクローナル抗体（Ｂ）を生産するものである
請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３８のハイブリドー
マ細胞株３Ａ２の同定特性を全て持つハイブリドーマ細
胞株。 ＠　　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３８のハイブリド
ーマ細胞株３Ａ２゜ ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）を生産するものである
請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全にブロッ
クするものである請求項３５記載のハイブリドーマ細胞
株。 （１０）　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロ
でのＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７
％まで部分的に阻害するものである請求項３６記載のハ
イブリドーマ細胞株。 （１０）　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９の同定特性を全て持つハイブリドー
マ細胞株。 ■　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドーマ
細胞株７Ａ９゜ （１０）　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロ
での顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的
に阻害するものである請求項３５記載のハイブリドーマ
細胞株。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％まで
部分的に阻害するものである請求項４０記載のハイブリ
ドーマ細胞株。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％まで
部分的に阻害するものである請求項４１記載のハイブリ
ドーマ細胞株。 ＠　　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドー
マ細胞株３Ｂ７の同定特性を全て持つハイブリドーマ細
胞株。 ＠　　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１（７）ハイブリ
ドーマ細胞株３Ｂ７゜ ＠（１）インビトロでのＴ細胞の活性内皮細胞への結合
を部分的に阻害する請求項１記載のモノクローナル抗体
（Ａ）または請求項１記載のモノクローナル抗体（Ｃ）
の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその結合
部位含有断片あるいは該モノクローナル抗体または断片
の薬学的に許容しうる塩の医薬としての有効量および（
ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 （１０）　該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロ
でのＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４
％まで部分的に阻害するものである請求項４５記載の医
薬。 ＠　　（１１ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブ
リドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル
抗体２Ｇ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体ま
たはその結合部位含有断片の医薬としての有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 ＠　　（＋）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブ
リドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル
抗体２Ｇ７またはその結合部位含有断片の医薬としての
有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 ■　モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（Ｃ）で
ある請求項４５記載の医薬。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全に阻害す
るものである請求項４９記載の医薬。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％まで
部分的に阻害するものである請求項４９記載の医薬。 ｏ　（１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片の医薬としての有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 （９（＋）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９またはその結合部位含有断片の医薬としての有
効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 ■　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害
するものである請求項５０記載の医薬。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％まで
部分的に阻害するものである請求項５４記載の医薬。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％まで
部分的に阻害するものである請求項５５記載の医薬。 Ｑ　　（＋）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢＩ○３９１のハイブ
リドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル
抗体３Ｂ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体ま
たはその結合部位含有断片の医薬としての有効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 （９（＋）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリ
ドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗
体３Ｂ７またはその結合部位含有断片の医薬としての有
効量および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 ０　インビトロでのＴ細胞の活性内皮細胞への結合を部
分的に阻害する請求項１記載のモノクローナル抗体（Ａ
）または請求項１記載のモノクローナル抗体（Ｃ）の少
なくとも１種のモノクローナル抗体またはその結合部位
断片あるいは該モノクローナル抗体または断片の薬学的
に許容しうる塩の医薬としての有効量を処置の必要な患
者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞関連炎
症性反応を処置する方法。 Ｏ該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでのＴ細
胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％まで部
分的に阻害するものである請求項５９記載の方法。 （（６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリ
ドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗
体２Ｇ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体また
はその結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の
必要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細
胞関連炎症性反応を処置する方法。 （６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリド
ーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体
２Ｇ７またはその結合部位含有断片の医薬としての有効
量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、活
性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 ０　モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（Ｃ）で
ある請求項５９記載の方法。 Ｏ該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆粒
球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全に阻害する
ものである請求項６３記載の方法。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ
細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％まで
部分的に阻害するものである請求項６４記載の方法。 （６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
ーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体
７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
その結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の必
要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞
関連炎症性反応を処置する方法。 （（６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリ
ドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗
体７Ａ９またはその結合部位含有断片の医薬としての有
効量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、
活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻害
するものである請求項６３記載の方法。 ０　該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆
粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％まで
部分的に阻害するものである請求項６８記載の方法。 Ｏ該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロでのＴ細
胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％まで部
分的に阻害するものである請求項６９記載の方法。 （６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
３Ｂ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
その結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の必
要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞
関連炎症性反応を処置する方法。 （６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
３Ｂ７またはその結合部位含有断片の医薬としての有効
量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、活
性内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 ０　該炎症性反応が、腫瘍細胞媒介血管障害、慢性関節
リウマチ、顆粒球により惹起される再潅流後心筋障害お
よび成人呼吸困難症候群からなる群より選ばれたもので
ある請求項５９記載の方法。 ＠　　ＩＬ−１活性化内皮細胞上に存在する実質的に純
粋な抗原またはその抗原性断片であって、該抗原または
抗原性断片が下記の（Ａ）　　　（Ｂ）および（Ｃ）か
らなる群より選ばれたものであることを特徴とする荊記
抗原または抗原性断片：（Ａ）同定のための次の特性を
もつ１Ｅ７／２Ｇ７抗原： （１）シアロ糖蛋白質である、 ■還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により求めた分子質量 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）　　：（ａ）約１１
４ｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９５ｋＤａに弱いバンド、 ■非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により求めた分子質量：（ａ）約１００ｋＤａに
強いバンド、 （ｂ）約９３ｋＤａに弱いバンド、 ■Ｏ結合糖鎖除去後の還元条件下でのＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により求めた分子質量は、約１〜
２ｋＤａ減少、（！５）　２−　Ｄゲル分析により求め
た等電点約４．８〜４．９． ０構成性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、顆粒
球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で発現
されず、 （７）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞上での発現が、大
腸菌リポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン
（ＩＦＮγ）によっては刺激されず、 （１１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリド
ーマ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体
１Ｅ７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７
のハイブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノク
ローナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しなが
ら長時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によっ
てインビトロで求めるとき、慢性動態を示し、 ■慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中での抗
原発現によりインビボで求めるとき、慢性または急性動
態を示し、 （１０）ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結
合する抗体には結合せず、 （１１）該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該
モノクローナル抗体２Ｇ７に結合し、（１２）第３４Ａ
〜３４Ｄ図に示したｃＤＮＡ配列によりトランスフェク
トされたＣＯ８細胞によって発現される； （Ｂ）同定のための次の特性をもつＣＭＰ−１７０抗原
： （１）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０
ｋＤａ。 ■休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆粒球、繊
維芽細胞またはケラチノサイト上では発現されず、 （３）休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞質
中に存在し、 （４）ＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞表面での発現がシ
クロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻害さ
れ、 ０内皮細胞内のワイベル−パラド体 （Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐ　ａｌａｄｓ　ｂｏｄｉｅｓ）に局
在することなく、 （［５）　Ｉ　Ｌ　−１刺激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１
と細胞表面で会合し、 （７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　１０１３８のハイブリド
ーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体
３Ａ２が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間前処
理したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビトロ
で求めたとき、急性動態を示し、 ＠該モノクローナル抗体３Ａ２に結合する；及び （Ｃ）同定のための次の特性をもつＥＬＡＭ−１抗原の
抗原性断片からなる抗原： （＋）ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、 （２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドー
マ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７
Ａ９に結合する、（３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９
１のハイブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノ
クローナル抗体３Ｂ７に結合する、■構成性またはトロ
ンビン刺激末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板、繊維芽
細胞またはケラチノサイト上で発現されない、 （５）　Ｉ　Ｌ　−１活性化内皮細胞上での発現が、大
腸菌リポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン
（ＩＦＮγ）によっては刺激されない。 ■　該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請求項
７４記載の抗原またはその抗原性断片。 （１０）　該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、該モノクロ
ーナル抗体１Ｅ７に結合するが該モノクローナル抗体２
Ｇ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片である
請求項７５記載の抗原またはその抗原性断片。 ０　該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、該モノクローナル
抗体２Ｇ７に結合するが該モノクローナル抗体１Ｅ７に
は結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項
７５記載の抗原またはその抗原性断片。 ０　該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）である請求項
７４記載の抗原またはその抗原性断片。 ０　該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である請求
項７４記載の抗原またはその抗原性断片。 ＠　　（１）ｍ求１１４記Ｍの１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ
）、ＣＭＰ−７０抗原（Ｂ）およびＥＬＡＭ−１抗原断
片（Ｃ）からなる群より選ばれた少なくとも１柿の実質
的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原ま
たは断片の薬学的に許容しうる塩の医薬としての有効量
および （ＩＩ）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
するための医薬。 ０　該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請求項
８０記載の医薬。 ０　該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナル抗
体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗体２Ｇ７には結
合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項８１
記載の医薬。 ０　該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナル抗
体２Ｇ７に結合するがモノクローナル抗体１Ｅ７には結
合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項８１
記載の医薬。 ０　該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ３である請求項
８０記載の医薬。 ０　該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である請求
項８０記載の医薬。 Ｏ請求項７４記載の１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）ＣＭＰ−
１７０抗原（Ｂ）およびＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）か
らなる群より選ばれた少なくとも１種の実質的に純粋な
抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原または断片の
薬学的に許容しうる塩の少なくとも１種を、医薬として
の有効量で処置の必要な患者に投与することを特徴とす
る、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 ０　該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請求項
８６記載の方法。 ０　該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナル抗
体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗体２Ｇ７には結
合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項８７
記載の方法。 ０　；亥１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナル
抗体２Ｇ７に結合するがモノクローナル抗体１Ｅ７には
結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項８
７記載の方法。 Ｏ該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）である請求項８
６記載の方法。 ０　該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である請求
項８６記載の方法。 Ｏ該炎症性反応が、腫瘍細胞媒介血管障害、慢性関節リ
ウマチ、顆粒球による惹起される再潅流後心筋障害およ
び成人呼吸困難症候群からなる群より選ばれたものであ
る請求項８６記載の方法。 Ｑ９　　（１）生体液を、請求項１記載のモノクローナ
ル抗体またはその結合部位含有断片の少なくとも１種と
接触させる工程、及び （ＩＩ）該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体ま
たは結合部位含有断片の特異的結合をアッセイする工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
方法。 ＠（１）生体液を、請求項４．８．１１．１６または２
１のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその結
合部位含有断片の少なくとも１種と接触させる工程、及
び （ＩＩ）該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体ま
たは結合部位含有断片の特異的結合をアッセイする工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
方法。 ０（１）生体液を、請求項５．９．１２．１７または２
２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその結
合部位含有断片の少なくとも１種と接触させる工程、及
び （ＩＩ）　’Ｊ生体液中の抗原への該モノクローナル抗
体または結合部位含有断片の特異的結合をアッセ・了す
る工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
方法。 ０　実質的に第３４Ａ〜３４Ｄ図に示す通りのｃＤＮＡ
配列または塩基９５２〜１２２７が実質的に第３４Ｂ図
に示す通りに存在することを条件とするその断片。 ０　第３４Ａ〜３４Ｄ図に示す通りのｃＤＮＡ配列また
は塩基９５２〜１２２７が実質的に第３４Ｂ図に示す通
りに存在することを条件とするその断片。 ０　そのＤＮＡに請求項９６記載のｃＤＮＡ配列または
その断片が連結されてなるベクターＯ請求項９６記載の
ＤＮＡ配列またはその断片が発現調節配列に効果的に連
結されてなるベクター Ｑ□□□そのＤＮＡに請求項９７記載のｃＤＮＡ配列ま
たはその断片が連結されてなるベクター■請求項９７記
載のＤＮＡ配列またはその断片が発現調節配列に効果的
に連結されてなるベクター 手続補正書坊式）　　Ｆ 平成２年１２月２８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＩＬ−１活性化内皮細胞に特異的に結合するモノ
   クローナル抗体またはその結合部位含有断片であって、
   該モノクローナル抗体が下記モノクローナル抗体（Ａ）
   、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選ばれたものであ
   ることを特徴とする前記モノクローナル抗体またはその
   断片： （Ａ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体
   ： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、の正
   常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
   いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
   結合せず、（３）休止またはＩＬ−１活性化顆粒球また
   はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合
   物には有意には結合せず、 （４）インビトロで、Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞
   への結合を阻害しないかまたは部分的に阻害し、 （５）インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞
   への結合を阻害せず、 （６）ＩＬ−１活性化内皮細胞の表面に存在し、第３４
   Ａ〜３４Ｄ図によって規定される１Ｅ７／２Ｇ７シアロ
   糖蛋白質抗原に特異的に結合する； （Ｂ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体
   ： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、の正
   常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイトある
   いは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意には
   結合せず、（３）休止またはＩＬ−１活性化顆粒球また
   はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合
   物には有意には結合せず、 （４）休止及びＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞質中及び
   ＩＬ−１活性化内皮細胞の表面に存在するＣＭＰ−１７
   ０抗原に特異的に結合する；及び （Ｃ）同定のための次の特性を持つモノクローナル抗体
   ： （１）正常な休止内皮細胞には有意には結合せず、（２
   ）正常な休止またはＩＬ−１活性化表皮ケラチノサイト
   あるいは休止またはＩＬ−１活性化繊維芽細胞には有意
   には結合せず、 （３）休止またはＩＬ−１活性化顆粒球またはＴ細胞、
   Ｂ細胞および単球を包含する単核細胞の混合物には有意
   には結合せず、 （４）インビトロで、Ｔ細胞の活性内皮細胞への結合を
   部分的に阻害し、 （５）インビトロで、顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞
   への結合を完全にまたは部分的に阻害し、 （６）ＩＬ−１活性化内皮細胞の表面に存在するＥＬＡ
   Ｍ−１シアロ糖蛋白質抗原のＮ末端２０％に特異的に結
   合し、 （７）ＩＬ−１活性化内皮細胞の表面に存在する１Ｅ７
   ／２Ｇ７シアロ糖蛋白質抗原には結合しない。 （２）該モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体（
   Ａ）である請求項１記載のモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （３）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでの
   Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しない
   ものである請求項２記載のモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （４）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドー
   マ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１
   Ｅ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （５）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドー
   マ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１
   Ｅ７またはその結合部位含有断片。 （６）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでの
   Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に阻
   害するものである請求項２記載のモノクローナル抗体ま
   たはその結合部位含有断片。 （７）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロでの
   Ｔ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％ま
   で部分的に阻害するものである請求項６記載のモノクロ
   ーナル抗体またはその結合部位含有断片。 （８）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリドー
   マ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２
   Ｇ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （９）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリドー
   マ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体２
   Ｇ７またはその結合部位含有断片。 （１０）該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（
   Ｂ）である請求項１記載のモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （１１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリド
   ーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ａ２の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片。 （１２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリド
   ーマ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ａ２またはその結合部位含有断片。 （１３）該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（
   Ｃ）である請求項１記載のモノクローナル抗体またはそ
   の結合部位含有断片。 （１４）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全に阻
   害するものである請求項１３記載のモノクローナル抗体
   またはその結合部位含有断片。 （１５）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％
   まで部分的に阻害するものである請求項１４記載のモノ
   クローナル抗体またはその結合部位含有断片。 （１６）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体
   ７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片。 （１７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体
   ７Ａ９またはその結合部位含有断片。 （１８）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に
   阻害するものであるモノクローナル抗体またはその結合
   部位含有断片。 （１９）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％
   まで部分的に阻害するものである請求項１８記載のモノ
   クローナル抗体またはその結合部位含有断片。 （２０）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％
   まで部分的に阻害するものである請求項１９記載のモノ
   クローナル抗体またはその結合部位含有断片。 （２１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ｂ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片。 （２２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ｂ７またはその結合部位含有断片。 （２３）請求項１記載のモノクローナル抗体（Ａ）、（
   Ｂ）または（Ｃ）を生産するハイブリドーマ細胞株。 （２４）モノクローナル抗体（Ａ）を生産するものであ
   る請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 （２５）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を阻害しな
   いものである請求項２４記載のハイブリドーマ細胞株。 （２６）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリド
   ーマ細胞株１Ｅ７の同定特性を全て持つハイブリドーマ
   細胞株。 （２７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリド
   ーマ細胞株１Ｅ７。 （２８）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に
   阻害するものである請求項２４記載のハイブリドーマ細
   胞株。 （２９）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％
   まで部分的に阻害するものである請求項２８記載のハイ
   ブリドーマ細胞株。 （３２）該モノクローナル抗体（Ｂ）を生産するもので
   ある請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 （３３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリド
   ーマ細胞株３Ａ２の同定特性を全て持つハイブリドーマ
   細胞株。 （３４）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリド
   ーマ細胞株３Ａ２。 （３５）該モノクローナル抗体（Ｃ）を生産するもので
   ある請求項２３記載のハイブリドーマ細胞株。 （３６）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を完全にブ
   ロックするものである請求項３５記載のハイブリドーマ
   細胞株。 （３７）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％
   まで部分的に阻害するものである請求項３６記載のハイ
   ブリドーマ細胞株。 （３８）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９の同定特性を全て持つハイブリドーマ
   細胞株。 （３９）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９。 （４０）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に
   阻害するものである請求項３５記載のハイブリドーマ細
   胞株。 （４１）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％
   まで部分的に阻害するものである請求項４０記載のハイ
   ブリドーマ細胞株。 （４２）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％
   まで部分的に阻害するものである請求項４１記載のハイ
   ブリドーマ細胞株。 （４３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７の同定特性を全て持つハイブリドーマ
   細胞株。 （４４）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７。 （４５）（ I ）インビトロでのＴ細胞の活性内皮細胞
   への結合を部分的に阻害する請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体（Ａ）または請求項１記載のモノクローナル抗
   体（Ｃ）の少なくとも１種のモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片あるいは該モノクローナル抗体ま
   たは断片の薬学的に許容しうる塩の医薬としての有効量
   および（II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦
   形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （４６）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％
   まで部分的に阻害するものである請求項４５記載の医薬
   。 （４７）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
   イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
   ナル抗体２Ｇ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗
   体またはその結合部位含有断片の医薬としての有効量お
   よび （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （４８）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハ
   イブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロー
   ナル抗体２Ｇ７またはその結合部位含有断片の医薬とし
   ての有効量および （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （４９）モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（Ｃ
   ）である請求項４５記載の医薬。（５０）該モノクロー
   ナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆粒球のＩＬ−１活
   性化内皮細胞への結合を完全に阻害するものである請求
   項４９記載の医薬。 （５１）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％
   まで部分的に阻害するものである請求項４９記載の医薬
   。 （５２）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハ
   イブリドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクロー
   ナル抗体７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗
   体またはその結合部位含有断片の医薬としての有効量お
   よび （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （５３）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハ
   イブリドーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクロー
   ナル抗体７Ａ９またはその結合部位含有断片の医薬とし
   ての有効量および （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （５４）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に
   阻害するものである請求項５０記載の医薬。 （５５）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％
   まで部分的に阻害するものである請求項５４記載の医薬
   。 （５６）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％
   まで部分的に阻害するものである請求項５５記載の医薬
   。 （５７）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハ
   イブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクロー
   ナル抗体３Ｂ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗
   体またはその結合部位含有断片の医薬としての有効量お
   よび （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （５８）（ I ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハ
   イブリドーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクロー
   ナル抗体３Ｂ７またはその結合部位含有断片の医薬とし
   ての有効量および （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （５９）インビトロでのＴ細胞の活性内皮細胞への結合
   を部分的に阻害する請求項１記載のモノクローナル抗体
   （Ａ）または請求項１記載のモノクローナル抗体（Ｃ）
   の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその結合
   部位断片あるいは該モノクローナル抗体または断片の薬
   学的に許容しうる塩の医薬としての有効量を処置の必要
   な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞関
   連炎症性反応を処置する方法。 （６０）該モノクローナル抗体（Ａ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３４％
   まで部分的に阻害するものである請求項５９記載の方法
   。 （６１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリド
   ーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体
   ２Ｇ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の必
   要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞
   関連炎症性反応を処置する方法。 （６２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７のハイブリド
   ーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクローナル抗体
   ２Ｇ７またはその結合部位含有断片の医薬としての有効
   量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、活
   性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 （６３）モノクローナル抗体がモノクローナル抗体（Ｃ
   ）である請求項５９記載の方法。（６４）該モノクロー
   ナル抗体（Ｃ）が、インビトロでの顆粒球のＩＬ−１活
   性化内皮細胞への結合を完全に阻害するものである請求
   項６３記載の方法。 （６５）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約３７％
   まで部分的に阻害するものである請求項６４記載の方法
   。 （６６）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体
   ７Ａ９の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の必
   要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞
   関連炎症性反応を処置する方法。 （６７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリド
   ーマ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体
   ７Ａ９またはその結合部位含有断片の医薬としての有効
   量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、活
   性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。 （６８）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を部分的に
   阻害するものである請求項６３記載の方法。 （６９）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   の顆粒球のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約８１％
   まで部分的に阻害するものである請求項６８記載の方法
   。 （７０）該モノクローナル抗体（Ｃ）が、インビトロで
   のＴ細胞のＩＬ−１活性化内皮細胞への結合を約２１％
   まで部分的に阻害するものである請求項６９記載の方法
   。 （７１）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ｂ７の同定特性を全て持つモノクローナル抗体または
   その結合部位含有断片の医薬としての有効量を処置の必
   要な患者に投与することを特徴とする、活性化内皮細胞
   関連炎症性反応を処置する方法。 （７２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリド
   ーマ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体
   ３Ｂ７またはその結合部位含有断片の医薬としての有効
   量を処置の必要な患者に投与することを特徴とする、活
   性内皮細胞関連炎症性反応を処置する方法。（７３）該
   炎症性反応が、腫瘍細胞媒介血管障害、慢性関節リウマ
   チ、顆粒球により惹起される再潅流後心筋障害および成
   人呼吸困難症候群からなる群より選ばれたものである請
   求項５９記載の方法。 （７４）ＩＬ−１活性化内皮細胞上に存在する実質的に
   純粋な抗原またはその抗原性断片であって、該抗原また
   は抗原性断片が下記の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から
   なる群より選ばれたものであることを特徴とする前記抗
   原または抗原性断片：（Ａ）同定のための次の特性をも
   つ１Ｅ７／２Ｇ７抗原： （１）シアロ糖蛋白質である、 （２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
   電気泳動により求めた分子質量 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ）： （ａ）約１１４ｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９５ｋＤａに弱いバンド、 （３）非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動により求めた分子質量： （ａ）約１００ｋＤａに強いバンド、 （ｂ）約９３ｋＤａに弱いバンド、 （４）Ｏ結合糖鎖除去後の還元条件下でのＳＤＳ−ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動により求めた分子質量は、
   約１〜２ｋＤａ減少、 （５）２−Ｄゲル分析により求めた等電点約４．８〜４
   ．９、 （６）構成性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、
   顆粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で
   発現されず、 （７）ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リ
   ポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ
   ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦ
   Ｎγ）によっては刺激されず、 （８）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３６のハイブリドー
   マ細胞株１Ｅ７により生産されるモノクローナル抗体１
   Ｅ７および／またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３７の
   ハイブリドーマ細胞株２Ｇ７により生産されるモノクロ
   ーナル抗体２Ｇ７が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら
   長時間前処理したヒト内皮細胞に結合する能力によって
   インビトロで求めるとき、慢性動態を示し、 （９）慢性または急性炎症の状態にある組織の血管中で
   の抗原発現によりインビボで求めるとき、慢性または急
   性動態を示し、 （１０）ＥＬＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に特異的に結
   合する抗体には結合せず、 （１１）該モノクローナル抗体１Ｅ７および／または該
   モノクローナル抗体２Ｇ７に結合し、 （１２）第３４Ａ〜３４Ｄ図に示したｃＤＮＡ配列によ
   りトランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって発現され
   る； （Ｂ）同定のための次の特性をもつＣＭＰ−１７０抗原
   ： （１）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動により求めた分子質量：約１７０
   ｋＤａ、 （２）休止またはＩＬ−１刺激末梢血単核細胞、顆粒球
   、繊維芽細胞またはケラチノサイト上では発現されず、 （３）休止内皮細胞、繊維芽細胞および白血球の細胞質
   中に存在し、 （４）ＩＬ−１活性化内皮細胞の細胞表面での発現がシ
   クロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤにより阻害さ
   れ、 （５）内皮細胞内のワイベル−パラド体 （Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅｂｏｄｉｅｓ）に局在す
   ることなく、 （６）ＩＬ−１刺激内皮細胞中のＥＬＡＭ−１と細胞表
   面で会合し、 （７）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３８のハイブリドー
   マ細胞株３Ａ２により生産されるモノクローナル抗体３
   Ａ２が、ＩＬ−１で時間を順次増しながら長時間前処理
   したヒト内皮細胞に結合する能力によってインビトロで
   求めたとき、急性動態を示し、 （８）該モノクローナル抗体３Ａ２に結合する；及び （Ｃ）同定のための次の特性をもつＥＬＡＭ−１抗原の
   抗原性断片からなる抗原： （１）ＥＬＡＭ−１抗原のＮ末端約３１％からなる、 （２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３５のハイブリドー
   マ細胞株７Ａ９により生産されるモノクローナル抗体７
   Ａ９に結合する、 （３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０３９１のハイブリドー
   マ細胞株３Ｂ７により生産されるモノクローナル抗体３
   Ｂ７に結合する、 （４）構成性またはトロンビン刺激末梢血液単核細胞、
   顆粒球、血小板、繊維芽細胞またはケラチノサイト上で
   発現されない、 （５）ＩＬ−１活性化内皮細胞上での発現が、大腸菌リ
   ポ多糖（１ｐｓ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ
   ）により刺激されるが、ガンマインターフェロン（ＩＦ
   Ｎγ）によっては刺激されない。 （７５）該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請
   求項７４記載の抗原またはその抗原性断片。 （７６）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、該モノクロー
   ナル抗体１Ｅ７に結合するが該モノクローナル抗体２Ｇ
   ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片である請
   求項７５記載の抗原またはその抗原性断片。 （７７）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、該モノクロー
   ナル抗体２Ｇ７に結合するが該モノクローナル抗体１Ｅ
   ７には結合しないエピトープを含む抗原性断片である請
   求項７５記載の抗原またはその抗原性断片。 （７８）該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）である請
   求項７４記載の抗原またはその抗原性断片。 （７９）該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である
   請求項７４記載の抗原またはその抗原性断片。 （８０）（ I ）請求項７４記載の１Ｅ７／２Ｇ７抗原
   （Ａ）、ＣＭＰ−７０抗原（Ｂ）およびＥＬＡＭ−１抗
   原断片（Ｃ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の
   実質的に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗
   原または断片の薬学的に許容しうる塩の医薬としての有
   効量および （II）薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤 を含有してなる、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置
   するための医薬。 （８１）該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請
   求項８０記載の医薬。 （８２）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナ
   ル抗体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗体２Ｇ７に
   は結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項
   ８１記載の医薬。 （８３）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナ
   ル抗体２Ｇ７に結合するがモノクローナル抗体１Ｅ７に
   は結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項
   ８１記載の医薬。 （８４）該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）である請
   求項８０記載の医薬。 （８５）該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である
   請求項８０記載の医薬。 （８６）請求項７４記載の１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）、
   ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）およびＥＬＡＭ−１抗原断片
   （Ｃ）からなる群より選ばれた少なくとも１種の実質的
   に純粋な抗原またはその抗原性断片あるいは該抗原また
   は断片の薬学的に許容しうる塩の少なくとも１種を、医
   薬としての有効量で処置の必要な患者に投与することを
   特徴とする、活性化内皮細胞関連炎症性反応を処置する
   方法。 （８７）該抗原が該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）である請
   求項８６記載の方法。 （８８）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナ
   ル抗体１Ｅ７に結合するがモノクローナル抗体２Ｇ７に
   は結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項
   ８７記載の方法。 （８９）該１Ｅ７／２Ｇ７抗原（Ａ）が、モノクローナ
   ル抗体２Ｇ７に結合するがモノクローナル抗体１Ｅ７に
   は結合しないエピトープを含む抗原性断片である請求項
   ８７記載の方法。 （９０）該抗原が該ＣＭＰ−１７０抗原（Ｂ）である請
   求項８６記載の方法。 （９１）該抗原が該ＥＬＡＭ−１抗原断片（Ｃ）である
   請求項８６記載の方法。 （９２）該炎症性反応が、腫瘍細胞媒介血管障害、慢性
   関節リウマチ、顆粒球による惹起される再潅流後心筋障
   害および成人呼吸困難症候群からなる群より選ばれたも
   のである請求項８６記載の方法。 （９３）（ I ）生体液を、請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体またはその結合部位含有断片の少なくとも１種
   と接触させる工程、及び （II）該生体液中の抗原への該モノクローナル抗体また
   は結合部位含有断片の特異的結合をアッセイする工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
   方法。 （９４）（ I ）生体液を、請求項４、８、１１、１６
   または２１のいずれかに記載のモノクローナル抗体また
   はその結合部位含有断片の少なくとも１種と接触させる
   工程、及び（II）該生体液中の抗原への該モノクローナ
   ル抗体または結合部位含有断片の特異的結合をアッセイ
   する工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
   方法。 （９５）（ I ）生体液を、請求項５、９、１２、１７
   または２２のいずれかに記載のモノクローナル抗体また
   はその結合部位含有断片の少なくとも１種と接触させる
   工程、及び（II）該生体液中の抗原への該モノクローナ
   ル抗体または結合部位含有断片の特異的結合をアッセイ
   する工程 を包含する、活性化内皮細胞関連炎症性反応を検知する
   方法。 （９６）実質的に第３４Ａ〜３４Ｄ図に示す通りのｃＤ
   ＮＡ配列または塩基９５２〜１２２７が実質的に第３４
   Ｂ図に示す通りに存在することを条件とするその断片。 （９７）第３４Ａ〜３４Ｄ図に示す通りのｃＤＮＡ配列
   または塩基９５２〜１２２７が実質的に第３４Ｂ図に示
   す通りに存在することを条件とするその断片。 （９８）そのＤＮＡに請求項９６記載のｃＤＮＡ配列ま
   たはその断片が連結されてなるベクター。 （９９）請求項９６記載のＤＮＡ配列またはその断片が
   発現調節配列に効果的に連結されてなるベクター。 （１００）そのＤＮＡに請求項９７記載のｃＤＮＡ配列
   またはその断片が連結されてなるベクター。 （１０１）請求項９７記載のＤＮＡ配列またはその断片
   が発現調節配列に効果的に連結されてなるベクター。