JPS63290A - 異種遺伝子の発現用ベクタ− - Google Patents

異種遺伝子の発現用ベクタ−

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JPS63290A
JPS63290A JP62073948A JP7394887A JPS63290A JP S63290 A JPS63290 A JP S63290A JP 62073948 A JP62073948 A JP 62073948A JP 7394887 A JP7394887 A JP 7394887A JP S63290 A JPS63290 A JP S63290A
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （３）　　ユニーク制限部位はＰＳｔ１部位である、特
許請求の範囲第２項記載のベクター。
（４）　　異種遺伝子は３　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲΔ３遺伝子である、特許
請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載のベ
クター。
（５ン　ＵＲＡ３遺伝子を有するＤＮＡ断片はＶＩＰ５
プラスミドのＤＮＡである、特許請求の範囲第４項記載
のベクター。
（６１ｐｋＤ１プラスミドの１．７キロベース艮のＤＮ
Ａ断片を含有し、この断片は酵素［３ａＩＩＨＩにより
得られ、ＹＩＰ５プラスミドのユニーク［３ａｍ）４１
部位に挿入する、特許請求の範囲第５項記載のベクター
。
（７）特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項
に記載のベクターにより形質転換された酵母。
（Ｉ’ｌｌ　　Ｋ　Ｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｃｓａに属す
る、￥１訂品求の範囲第７項記載の酵母。
（９１Ｋ　Ｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓに
属する、特、′ｒ請求の範囲第８項記載の酵母。
３、発明の詳細な説明 本発明は酵母において異種遺伝子のりＯ−ニングおよび
発現用ベクター、ならびにこのベクターにより形質転換
したＮ母に関する。
更に詳述すると、本発明は酵母の形質転換用ベクターニ
関し、このベクターにはＫ　ＩＬＩＩ／ＶｅｒＯＩＤｌ
／Ｃ０３ｄｒｏｓｏｐｈｉ　Ｉａｒｕｍの１）ｋＤ１プ
ラスミドの全スクレオチド配列又はその一部が存在する
。更に、本発明はこのベクターにより形質転換された Ｋ　１ｕｙＶｅｒｏｌｙｃｅｓ属の酵母に関する。
周知のように、現在まで酵母の形質転換はある種に限ら
れていた。形質転換ベクターの構築に必要な酵母プラス
ミドの入手性に乏しかったからである（Ｇｕｎｇｅ、　
Ｎ、　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
３７．２５３−２７６．１９８３　：Ｔｏｈ−ｃ　。
Ａ、、　Ｔａｄａ　、　Ｓ、およびＯｓｈｉｍａ　、　
Ｙ、　、　Ｊ　。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５１　、１３８０−１３９０
．１９８２　；　Ｔｏｈ−ｅ　、　Ａ、　、　Ａｒａｋ
ｉ、　Ｈ，、Ｕｔａｔｓｕ　。
１、および０ｓｈｉｉａ　、　Ｙ、　、　Ｇｅｎ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ。
１３０．２５２７−２５３４．１９８４）。
３　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
から単離した２μプラスミドは現在まで３　、　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅの形質転換に成功裡に使われた唯一のプ
ラスミドであった。
しかし、２μプラスミド由来のベクターは形質転換効率
が低くあるいはＳ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｃｒｅ
ｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａｅ以外の酵母にて安定して複製する
能力に制限があった。
したがって、他のＭｍの形質転換に適するベクターの構
築用プラスミドが必要であり、特に例えばＫ　１ｕｙｖ
ｅｒｏｎ＋ｙｃｅｓ属に属するものを含めて、工業上車
装な酵母について然りである。
しかし、この必要性を現在まで満足するすべての試みは
有効でなかった。
更に具体的に言えば、２つのベクターがＫ　＋ｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｔａｃｔ＋ｓの形質転換に使われてき
た。１つはに、　Ｉａｃｔｉｓの染色体ＤＮＡ断片を含
有ｔ、、　（［ｌａｓ、　ｓ、およびＨｏｌｌｅｎｂｅ
ｒｇ　、　Ｃ，Ｐ、　。
Ｃｕｒｒａｎｔ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　６．１２３−
１２８．１９８２）および他はに、　Ｉａｃｔｉｓから
単離した直線プラスミドｐＧＫ１から誘導した（１−０
ｄｅＬ　　ｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ、　　　ト１　　、　
　Ｆｕｋｕｈａｒａ　　　、　　　Ｈ，Ｈｅ５ｌｏｔ　
　　。
Ｍ、　Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ　、　、　Ｅ　Ｌ　Ｆ　　
Ｂ　１ｏｒｃｃｈｃｃａｈｃのフランス特許出願第８２
０９５６４号；ｌ、、ｄｅＬＯＩＪＶＱｎＣＯｔｌｒ　
＠、　Ｊ　、　ＢａＣｔＯｒｉＯｌ、　１５４　、７３
７−７４２．１９８２）。
上記両ベクターはこの酵母にて複製を可能とするに、　
１ａｃｔｉ３のヌクレオチド配列を含むが、形質転換ク
ローンを得る効率および／又は安定性は全く低いことを
°指摘するのは重要である。
したがって、本発明の目的は酵母特に Ｋ　１ｕｙｖｅｒｏＢｃｃｓ属用クローニングと発現ベ
クターのｍ！Ｊである。その酵母はすぐれた形質転換効
率を有しかつ形質転換細胞において高い安定性を示す。
本売り１によれば、この目的はＣ９Ｆａｌｃｏｎｅａ　
Ｌ。
ＦｒｏｎｔａｌｉおよびＨ，）”　ｕｋｕｈａｒａ　　
（発明者）により行なわれた新規プラスミドに関する研
究過程において、形質転換ベクターの本質部分としてＫ
　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒ
ｕ＋＋＋株にて発見されたプラスミドを使うことにより
達成できることが分った。
ここで扱うプラスミドは円周１．６ミクロンの環状二重
ＤＮＡ分子から成り、これはＵＣＤ５１−１３　Ｑ　Ｋ
　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｃｓ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒ
ｕｍ株（Ｕ。
Ｃ，Ｄ、コレクション、加州人、Ｄａｖｉｓ、　Ｃ△９
５６１６）にて発見された。
ｐｋＤ　１と呼ぶこのプラスミドは高コピー数（）ロー
１００／細胞）の細胞に存在し、標準法を使って染色体
ＤＮＡから容易に分離できる。
ｐｋＤ　１の完全ヌクレオチド配列を測定し、プラスミ
ドの正確な大きさく４７５７塩基対）が知られている。
更に、この配列の分析により、このプラスミドと２μお
よびｐＧ’Ｋ　１プラスミド間の第１構造上の実質的差
異についてＤＮＡ−ＤＮＡバイブリド法により前に得た
データを確認した。
このプラスミドは、等ω存在しかつ２．１５キロベース
の中心断片の方向により互いに異なるΔと８と呼ぶ２つ
の相互変換１■能な分子形の同一細胞内に存在し、第１
図では２つの垂直の点線間から成る。第１図は多くの制
限酵素の部位の位置を示しくこのような位置は直線分子
として描く場合はｐｋＤ　１のＡ形とＢ形と呼ぶ）、こ
れらの酵素は図の左欄に示す。平行方向に示すスケール
はプラスミドに対するこれらの部位間の距ｆｆ１（ｋｂ
）を示す。；ト印はその位ＰＩ関係かはつぎすしない断
片を示す。
この配列の分析の結果、２１３６ヌクレオチドの距離で
、配列上同一であるが逆方向をもつことが再度分った３
４６塩基対のＤＮＡ断片の存在をこのプラスミドにみた
。
この逆方向塩基配列（ＴＲ）は、Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミドで観察されたも
のと類似して、Ａ形と８形間の相互転換の灘構上基本的
なもののようである。
プラスミド１）ｋＤ　１のヌクレオチド配列から、Ａｌ
ＢおよびＣと呼ぶ３つの可能な遺伝子の存在を推定した
（１　３４１．１２４５および６３６ヌクレオチドに関
し）。配列ホモロジイおよびその機能に関する予茹研究
に基づくこれらの遺伝子は２μプラスミドに存在するＦ
ＬＰ、ＲｅｐｌおよびＲｅｐ２遺伝子に夫々類似する様
である（　３　ｒｏａｃｋ　。
Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　２８．２０３−２０４．１９８２
）。
ｐｋＤ　１プラスミドは酵母のクローニングおよび発現
ベクターの構築に有利に使うことができる。
主にその環状形が命中な操作を可能とするからである。
更に、このプラスミドはＥｃｏＲ１、Ｃ１ａ（Ｊ３よび
ｐｓｔ（の如き制限酵素に対して多くのユニークな部位
を含み、この特長は異種遺伝子の挿入および組換えベク
ターの構築に対し特に右利である。
ｐｌ＋０１プラスミドの存在および高コピー数の細胞中
同じものから誘導したベクターの存在は更に有利である
。挿入した異種遺伝子の増幅を可能にするからである。
更に、ｐｋＤ　１プラスミドの配列の完全性と連続性は
本発明に係るベクターの構築に必要としないことも有利
である。実際、このようにｐｋＤ　１配列を中断するユ
ニークな制限部位の１つにクローンすべき遺伝子を挿入
することあるいは本発明の目的に対しこのプラスミドの
複製オリジンを含有する断片を使用することが可能であ
る。
本発明の特定の目的は酵母において異種遺伝子のクロー
ニングおよび発現ベクターを構築するこであり、このベ
クターには少なくともｐｋＤ　１プラスミド（Ｋ　ｌｕ
ｙｖａｒｏｍｙｃｃｓ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍか
ら単離）のＤＮＡの全部又は一部およびこの遺伝子を発
現させる配列を含めて、任意の異種遺伝子を有するＤＮ
Ａ断片を含有する。
ｐｋＤ　１プラスミドの全ＤＮＡを使う場合、クローン
すべき遺伝子をコニーク制限部位の一つ、特にｐｓｔ１
部位に挿入することが望ましい。
クローニングに最も望ましい遺伝子の内、Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　のＵＲ△３遺伝子は大腸菌の
ｐＢＲ３２２プラスミドの配列および更にこのＵ　ＲＡ
　３遺伝子の配列から成るＹＩＰ５プラスミドの一部と
して特に省處する価幀がある。
本発明の別の望ましい態様において、ベクターはＹＩＰ
５プラスミドのユニーク１３ａｍｌ−１１部位に挿入さ
れる酵素Ｂａｍ１−１ｆにより得たｐｋＤ　１プラスミ
ドのＤＮＡの１．７ｋｂ１ｇｉ片を含有する。
本発明はまた上記ベクターにより形質転換された酵母に
関し、特に限定Ｊるものではないが、Ｋ　Ｉｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ属の株、更に言えばＫ　ｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓに関する。
本発明により形質転換した酵母はベクターにＪ、り挿入
された異種遺伝子によりコードされるクン白の製造に有
利に利用できることは興味ある。このような酵母は例え
ば食品分野（アミラーゼ、レンニン、ペクチナーゼ等の
ＷＡ造）又は医薬分野（インスリン、インターフェロン
等）に特に重要なものとなりうる。
更に、このような形質転換前出は動物又は家畜飼料の成
分足りつる。
ｖ１限するものではなく説明上、 Ｋ　Ｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓのｕｒａ
　　Ａ株にてＳ　ａｃｃｈａｒｏＩｌｙｃｃｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子をクローニングおよび
発現させるために本発明の使用が考えられる。１Ｊｒａ
　Ａ株は通常ウラシルを合まない培地には生育できない
。ｐｋＤ　１プラスミドから誘導したベクターに存在す
るＵＲＡ３ｍ伝子は宿主細胞に発現されることが分りま
たその細胞はウラシルを含まない培地に生育しうろこと
も分った。このことは、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
　のＵＲＡ３遺伝子によりコードされるＡロチジン−モ
ノリン酸塩脱カルボキシレートタン白はに、１ａｃｔｉ
ｓにより有効に合成されることを示す。
ＵＲＡ３遺伝子を含むｐｋＤ　１プラスミドから誘プラ
スミドＤ　Ｎ　Ａ　Ｇ、ｔＫ　、ｄｒｏｓｏｐｈｉ　Ｉ
ａｒｕａ＋　（７）　培ａ物２１から得たプロトプラス
トより調整した。このプロトプラストの溶解後に得た核
酸を５Ｏｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ！、５＋ｅＭ　　ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８含有溶液４０ｄに再懸濁させた。Ｃ３Ｃｊ
１４０ｇおよび臭化エチジウム４Ｉｄ（５０ｍ　Ｍ　　
Ｔｒｓｉ　−ＨＣｌ中１０＃ｔ９／ｄ、ｐＨ８，５）を
ＤＮＡ含有溶液に加え、ついでベックマン５０Ｔ１０−
タにて１５℃、４０時間３８．ＯＯＯｒｐｍで遠心した
。
ＤＮＡはＵ、Ｖ、光線で観察し、プラスミドＤＮＡに相
当する低バントグライエントより回収しそして上記操作
により２度精製した。
ｐｋＤ　１誘導ベクター ｐｋＤ　１が互いに逆方向反復塩１　（ＴＲ）配列対を
もつ閉環形で示しである第２図に言及する。黒く示した
ゾーンはプラスミドに存在する主遺伝子の位置を示す。
更に、プラスミドのクローニングおよび操作にとって最
も重要な制限部位の位置が示しである。
この図では、ブラストミドのＢ形が示されている。記述
した様に、遺伝子Ｂが位置されている環の方向によって
、形はＢ形と異なっている。
組換えプラスミドの構築に対し、ｐｋＤ　１を先ずユニ
ークｐｓｔ１部位で直線化した。同時に、Ｓ。
ｃｃｒｃｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子配列およびバク
テリアのプラスミドｐＢＲ３２２の配列を含む組換えプ
ラスミドであるＹＩＰ５もＰ　Ｓｔ　１部位で直線化し
た。ＹＩＰ５の構造は第２ｂ図に示す。Ｓ。
ｃｏｒｅｖｉｓｉａｅのｔＪＲＡ３遺伝子配列は黒で示
してあり、バクテリアのプラスミドＩ）ＢＲ３２２の配
列は白で示してあり、その遺伝子はアンピシリン（Ａｎ
）ｉｆ性とテトラサイクリン（Ｔｅ！ｔ）耐性である。
更に、クローニングに使うあるユニーク制限部位の位置
が示されている。
２つの直線化分子は公知標準法のＤＮＡリガーゼにより
共通のｐ　ｓｔ　１部位で結合した。
したがって、この連結により得たプラスミドは全体のｐ
ｋＤ　１配列、ＬＩＲＡ３遺伝子およびｐＢＲ３２２配
列を有する。後者の配列は大腸菌にて溝築ベクターを増
幅するために導入した。
連結反応混合物は塩化カルシウムで処理した後形質転換
に適合させたＲＲ１株の大腸菌ｍ胞のサスペンションに
直接加えた。
この細（ナスペンションはテトラサイクリン含有完全固
形培地に平板培養させた。得られた多くのコロニー（テ
トラサイクリン耐性）の内、アンピシリン含有培地で生
育できない多くのコロニーを選択した。約１０％のフラ
クションを示すこれらのコロニー（テトラサイクリン耐
性、アンピシリン感受性）をそれらが含むプラスミドの
性質について別々に試験した。
ＰＩベクターで示す、第２Ｃ図ように、このようなコロ
ニーの約半分は目的の構造を有する組換えプラスミドを
含有した。使用した記号は第２ａ図と２ｂ図で使ったも
のと同一である。
この操作により、Ｐ３と呼ぶ別のベクターも構築したが
、ｐｋ［）　１のＡ形を含む点でＰｌと異なる。
Ａ１５プラスミドはｐｋＤ　１から誘導されたその他の
組換え分子である。後者はＢａ１ＨＩによる制限酵素で
消化し、１７００塩基対の断片を単離した。ついでこの
断片をそのユニークＢａ５８１部位で切断したＹＩＰ５
の直線化分子と混合した。連結しかつ大腸菌にて増幅後
（上記したように）、アンピシリン耐性およびテトラサ
イクリン感受性を示すりＯ−ンを選択した。組換えプラ
スミドをこのクローンから甲離し、予期したように、こ
のプラスミドはｐｋＤｌのＢａｍ１−１１断片、ＵＲＡ
３遺伝子およびｐＢＲ３２２の配列を含有した。
Ａ１５ベクターの構築に関する第３図では、ＹＩＰ５プ
ラスミドにおけるｐｋＤ　１の１．７ＫｂＢａｌｌＨＩ
断片（黒色）の挿入点が示しである。使用した記号は上
記図面と同じである。
上記したｐｋＤ　１を使って構築したベクター、ＵＲＡ
３遺伝子および大腸菌にて複製できるｐＢＲ３２２の配
列は上記した大腸菌のクローンから精製しついでＫ　Ｉ
ｕｙｖｃｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓのｕｒａ　Ａ株
の形質転換に使った。
Ｋ　１ｕｙｖｅｒｏＩ！１ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓの形
質転換に、１ａｃｔｉｓめｕｒａ　Ａ変異はＳ　、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３ｍ伝子により補完されう
ろことを上記研究は証明した（Ｌ、　ｄｅ　　Ｌｏｕｖ
ｅｎｃｏｕｒｔ等Ｊ。
Ｂａｃｔｅｈｉｏｌ、１５４，７３７−７４２．１９８
２）したがって、この変異を含むに、　ＩａＣｔｉＳ株
は、ｐｋＤ　１配列とＵＲＡ３′ｉｉ伝子から成るハイ
ブリッドプラスミドによる形質転換を確証するのに使っ
た。
Ｋ、　１ａｃｔｉｓのＣＢ５２３５９株からＱ　ｒｓａ
ｙ研究所にて甲離した株ＭＷ９８−８Ｃ（ａ、ｕｒａ　
Ａ。
＋　　　　　＋ ａｒａ、ｌｙｓ、Ｋ　　、Ｒ）を２％グルコース、１％
ＭＩＩＩ）エキスおよび１％バクトベブトン含有液体培
地にし振盪浴中２８℃、１８時間生育させた。
対数生育段階の細胞は標準法によりプロトプラストに転
換した。
このプロトプラストは約１０９／−の濃度でＳＴＣバッ
ファー（１Ｍソルビトール、１０ＩＩＭＣａ　ｃｌ２．
１０＋　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐｌ−１７，５）に
再懸濁させた。通常０．１ｍのこのサスペンション試料
は本発明にて記述したｐｌ、ｐ３およびＡ１５と対照プ
ラスミド０．２−０．５μりと混合した。
１０分後、サスペンションを４２℃、２分間加熱し、１
容のポリエチレングリコール４０００と混合した。更に
室温で１０分後、サスペンションを遠心分離し、スフェ
ロプラストを洗いそしてＳＯＳバッファー（この１００
ｄは５０ｍの２Ｍソルビトール、３３．５＃ｌｉ！のＹ
ＥＰ培地、０．６５＃Ｉｉ！のＩＭＣａ　　ｃｌ　　、
１３５μｆの１％ウラシルおよび１５ｉａｉ！の水を含
有する）に再懸濁させた。
スフェロプラストサスペンション試ＦＩＯ，Ｉｍを４ｄ
のＷ培地（これは４５℃で液体に保ら、ウラシル以外の
栄養要求性を補完した補給物を含有）４−に加え、固形
Ｗに培地含有ベトリ皿に注いだ。
］コロニの生育は２８℃で３−４Ｈ１８養後に観察した
。
第１表はｐｋＤ　１プラスミドから誘導したベクターに
よりＫ　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　Ｍ
　Ｗ　９８−８０株の形質転換実験の数および安定性を
示す。
第１表 ベクター　ｕｒａ形質転換体の数ａ）形質転換体の安定
性ｂ） Ｐｉ　　　　　　　　　９８００　　　　　　　　１　
８Ｐ３　　　　　　　　６３００　　　　　　　　３０
Ａ１５　　　　　　６７００　　　　　　　　　３．６
ＹＩＰ５　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　−
ａ）形質転換体の数は、プラスミド０．２−０゜５μ９
を使用した２−３実験にて得た平均値である。
ｂ）安定性は非選択培地にて６世代後に（ｑたｕｒａ＋
コロニーの％で表わす。
ｐｋＤ１配列含有プラスミドを添加したプロトプラスト
のみがｕｒａ＋であるコロニーを生成した。
どのｐｋＤ　１配列を含有しないＹＩＰ５の場合に、生
育培地にウラシルを添加した時だけコロニーを　４、観
察した。
ＤＮＡはｐｋＤ　１−誘導ベクターで形質転換したいく
つかのコロニーから抽出したａｉｌ＋限地図が形質転換
に使ったプラスミドの地図に同じであるプラスミドが存
在することが分った。
表に示すように、Ａ１５に含まれるｏｋＤ　１ＤＮＡ断
片は組換えベクターの複製を促進するのにそれ自身十分
である。このｐｋＤ１領戚を含まない他のベクターはＫ
　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｃｓ　Ｉａｃｔｉｓを形質転換
できない。しかし、Ａ１５ベクターの形質転換効率およ
び生成形質転換体の安定性は他のベクターでみられたよ
り低い。このことは、Ａ１５ベクターがプラスミド保持
に重要な役割をもつあるｐｋＤ　１配列を欠いている口
とを示唆している。
仝ｐｋＤ　１プラスミドを含むＰｌとＰ３で１！Ｉだ形
質転換体の安定性はＫ　＋ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｃｓの形
質転換でこれまで観察されたものの最高である。
口れらのベクターにより形質転換された＾撃母を含めて
これは工業利用上非常に右利である。
【図面の簡単な説明】
第１図は多くの制限酵素の部位の位置を示す。 第２ａ図はｐｋＤ　１プラスミドのＢ形の構造を示ず。 第２ｂ図はＹＩＰ５プラスミドを示す。 第２Ｃ図は本発明によるＰ１ベクターを示す。 第３図は本発明の別の態様によるＡ１５ベクターを示す
。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）酵母中にて異種遺伝子のクローニングおよび発現
    用ベクターであつて、このビークルは少なくともｐｋＤ
    １プラスミド（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｏｓｄｒｏｓｏ
    ｐｈｉｌａｒｕｍから単離）の全ＤＮＡ又はその一部、
    およびこの遺伝子の発現を確立する配列を含めて、任意
    の異種遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とす
    る、上記ベクター。
  2. （２）異種遺伝子をｐｋＤ１プラスミドのユニーク制限
    部位の一つに挿入する、特許請求の範囲第１項記載のベ
    クター。
  3. （３）ユニーク制限部位はＰｓｔＩ部位である、特許請
    求の範囲第２項記載のベクター。
  4. （４）異種遺伝子はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｓ　ｃｅ
    ｒｅｖｉｓａｉａのＵＲＡ３遺伝子である、特許請求の
    範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載のベクター
    。
  5. （５）ＵＲＡ３遺伝子を有するＤＮＡ断片片はＹＩＰ５
    プラスミドのＤＮＡである、特許請求の範囲第４項記載
    のベクター。
  6. （６）ｐｋＤ１プラスミドの１．７キロベース長のＤＮ
    Ａ断片を含有し、この断片は酵素ＢａｍＨＩにより得ら
    れ、ＹＩＰ５プラスミドのユニークＢａｍＨＩ部位に挿
    入する、特許請求の範囲第５項記載のベクター。
  7. （７）特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項
    に記載のベクターにより形質転換された酵母。
  8. （８）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する、特許請
    求の範囲第７項記載の酵母。
  9. （９）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓに属
    する、特許請求の範囲第８項記載の酵母。
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