JPS63291594A - 過酸化水素の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、キサンチンオキシダーゼ（以下、ＸＯＤと略
称する。）の作用を介して生成する過酸［発明の背景］ 核酸代謝にｌ４する酵素であるグアナーゼ、アデノシン
デアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ等、
或はそれらの酵素による代謝産物であるイノシン、ヒボ
キサンチン、キサンチン等、又はプリンヌクレオシドボ
スホリラーゼの基質となる電機リン等は、臨床検査の分
野に於いては、重要な測定項目の−ってあり、これらの
正確で簡便な測定法の確立は近時重要な課題となってき
ている。

これら核酸代謝に藺与する物質の測定法としては、例え
ばグアナーゼの場合には基質プリンの減少を紫外部吸光
度変化で測定する方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
２Ｑ、１２４頁、　１９５０）、生成物であるアンモニ
アを測定する方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、１２，５
２４頁、＋９５２）、生成物であるキサンチンにＸＯＤ
を作用させて生じる尿酸を測定するか（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｌｇ、、１６７．４６１頁。

アデノシンデアミナーゼの測定については、生成物であ
るアンモニアを測定する方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、ｃｈｅ
■、、＋６７．４４５頁、＋９４７）、プリンヌクレオ
シドホスホリラーセ及びＸＯＤを介在させることにより
生成物のイノシンを尿酸と過酸化水素に変換させ、生し
た過酸化水素を測定する方法（Ｃｈｅ＋ｇ、Ｐｈａｒｎ
＋、Ｂｕｌ　１、．２９，４２６頁、＋９８１）等が知
られている。

しかし、アンモニアを測定する方法、基質プリンの減少
を紫外部吸光度変化で測定する方法或は生成物である尿
酸を測定する方法では試料中の内因性アンモニア、紫外
吸光物質或は尿酸の影響を受けるため試料ブランク値の
測定を実施しても、測定結果が不正確となる場合がある
。

一方、ヒボキサンチン（或はキサンチン）を基質として
、ＸＯＤの作用により生成する過酸化水素を測定する方
法に於いては、過酸化水素のほかにもスーパーオキサイ
ドアニオン（０＝２）が同時に生成し、しかも過酸化水
素とスーパーオキサイドアニオンの生成比はｐＨ或は基
質濃度によって変化しくＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、υ
１５，４０５３頁、　＋９７０）、過酸化水素とスーパ
ーオキサイドアニオンが直接反応して過酸化水素が分解
されたり、或は過酸化水素とパーオキシダーゼ（以下、
ＰＯＤと略称する。）の反応を介して生成する色素をス
ーパーオキサイドアニオンが還元したりするために、実
測された過酸化水素生成量は紫外部吸光度測定により求
めたノ、％質減少量から算出した過酸化水素の理論的生
成績よりも低かったり、生成する色素量が過酸化水素の
理論的生成績に比例しないと言う現象が生し、しかもこ
のような現象は測定条件により変化するため、この反応
を利用して物質の定量を行った場合には低濃度域での測
定しか信頼性がない等の問題があった。

その為、ＸＯＤの作用により生成する過酸化水素を測定
する方法に於いてはこれらの問題点を解決すべく種々の
方法、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）
を共存させ、反応後に液性を酸性とする方法（特公昭５
９−６６８９９号公報）、或は反応液の液性を一旦酸性
とした後に発色試薬を加えて比色定量する方法（特公昭
５９−２２８０号公報）等が報告されている。しかしな
がら、これらの方法は測定のステップ数が増加する為操
作が繁雑となるし、酵素活性を測定するための所謂レイ
ト法には適用てきないものであった。また、これら以外
にも微生物由来の特別なＸＯＤを使用することにより上
記問題点を回避している報告（特公昭５５−１０８２９
８号公報）もあるがこれに使用できる酵素（ＸＯＤ）は
限定されており、更なる改良が望まれていた。

また、簀機リンの測定方法としては、Ｆｉｓｋｅ−５ｕ
ｂｂａＲｏｗ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｊ６，３
７５頁、１９２５）が一般に用いられているが、強酸を
使用している為に、自動分析装置の使用材料への影響が
懸念され、新規な自動分析！ａ置への応用が可能な測定
法の確立が望まれていた。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、Ｘ
ＯＤの作用を介して生成する過酸化水素の定量方法に於
いて、従来より改善が求められていた種々の問題点をす
べて解決した、正確で簡便な定量方法を提供することを
目的とする。

［発明の構成］ 本発明の目的を達成する為に、本発明は次の構成よりな
る。

ｒＸＯＤの作用を介して生成する過酸化水素の測定方法
に於いて、過酸化水素生成系にマンガン及び／叉はコバ
ルトの水溶性化合物を加えて、これを行うことを特徴と
する過酸化水素の定量方法。」即ち、本発明者らは、例
えばヒボキサンチン、或はキサンチンにＸＯＤが作用し
て生ずる過酸化水素を測定夕るに当り、過酸化水素と同
時に生成するスーパーオキサイドアニオンに起因して生
ずる種々の問題点を解決すべく、スーパーオキサイドア
ニオンを過酸化水素に定量的に変化させる物質について
鋭意研究を行ったところ、マンガン及びコバルトの水溶
性化合物が、その目的を達成し得るものであることを見
い出し本発明を完成するに至った。

本発明に用いられるマンガン若しくはコバルトの水溶性
化合物としては、例えば酢酸マンガン。

アセチルアセトンマンガンＪＣ＃アンモニウムマンガン
、安息香酸マンガン、ｐ−アミノ安息香酸マンガン、ホ
ウ酸マンガン、ｎ−酪酸マンガン、炭酸マンガン、塩化
マンガン、４−シクロヘキシル酪酸マンガン、２−エチ
ルヘキサンマンガン、ギ酸マンガン、硝酸マンガン、リ
ン酸マンガン（塩基性）。

硫酸マンガン、　Ｍ　ｒｒ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、ヘキサ
フルオロアセチルアセトンマンガン、トリフルオロアセ
チルアセトンマンガン、臭化マンガン、グルコン酸マン
ガン等や、例えば塩化コバルト、臭化コバルト。

硫酸コバルト、硝酸コバルト、酢酸コバル）、Ｍ酸アン
モニウムコバルト、ヘキサアンミンコバルト塩化物等の
、マンガン或はコバルトの、水溶性塩類（錯塩を含む）
や水溶性キレート化合物が挙げられるが、特に２価のマ
ンガンイオン（Ｍｎ２＋）、２価のコバルトイオン（Ｃ
ｏ２”）のそれがより好ましく用いられる。これらマン
ガン又はコバルトの水溶性化合物は夫々単独で用いても
よいし、適宜２種以上組み合わせて用いてもよく、その
使用量としては、系内に合計で少なくとも０．Ｏ１■門
以上存在させることが最低必要条件であるが、通常０．
１〜３０ｍ門の範囲が好ましく用いられる。

本発明の好ましい実施態様の１つは、マンガン又は／及
びコバルトの水溶性化合物と金属キレート剤とを併用す
る方法である。即ち、金属キレート剤をマンガン又は／
及びコバルトの水溶性化合物と併用させることにより、
ＸＯＤの作用を受けて生成する過酸化水素をより高感度
に測定することができ、核酸代謝に関する物質のより高
感度な測定が可能となる。

このような目的で用いられる金属キレート剤としては、
例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘ
キサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリ
アミン五酢ｆｉ（ＤＴＰＡ）等が挙げられるが、特にこ
れらに限定されるものではなく、マンガン或はコバルト
とキレートを形成し得るものであればいずれにてもよい
。これら金属キレート剤は単独で用いても２種以上組み
合わせて用いてもよく、その使用濃度としては用いる水
溶性金属化合物のモル濃度と同等乃至それ以上の濃度で
あればよい。

本発明の方法により測定可能な物質としては、例えばＸ
ＯＤの基質となるキサンチン、ヒボキサンチン等、或は
適当な酵素反応によりこれらの物質に変換されるアデノ
シン、イノシン、グアニン等、又は上記した如き物質を
産生ずるアデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ、グアナーゼ等の酵素、無機リン等が挙
げられるが、最終的にＸＯＤの作用により過酸化水素を
発生させる反応系に導けるものであれば特に限定されな
い。

本発明に用いられるＸＯＤは牛乳由来及び微生物由来の
いずれのものでもよい。

本発明の定量方法は、過酸化水素生成系内にマンガン又
は／及びコバルトの水溶性化合物を加えるか、或はこれ
に更に金属キレート剤を加えること以外は、ＸＯＤの作
用を介して生成する過酸化水素をＰＯＤと被酸化性呈色
試薬を用いて比色定置する自体公知の方法に従ってこれ
を行えばよく、用いられる測定試薬も、自体公知の測定
法に於いて用いられる試薬を用いることで足りる。即ち
、ＰＯＤは植物由来、動物由来、微生物由来のいずれに
てもよいが、通常は西洋ワサビ由来のものが好ましく用
いられ、被酸化性呈色試薬としては通常過酸化水素−Ｐ
ＯＤ系で用いられている、例えば４−アミノアンチピリ
ンと、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換アニリン
系化合物とを組み合わせた被酸化性呈色試薬、３−メチ
ルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリ
ン系化合物との組み合わせ試薬、トリフェニルメタン系
ロイコ色素、ベンジジン誘導体、０−トリジン誘導体、
ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール読導
体、ロイコメチレンブルー誘導体、０−フェニレンジア
ミン、２．２′−アミノビス（３−エチルヘンジチアゾ
リン−６−スルホン酸）又はその塩などが挙げられるが
、これらに限定されるものではない。

また、測定試薬の液性の調整に用いられる緩衝剤も通常
使用されるものであれば特に限定されないが、例えばリ
ン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤、グツド緩衝剤等が挙げら
れる。但し、無機リンの測定には、リン酸塩緩衝剤以外
の緩衝剤を使用しなくてはならないことは言うまでもな
い。測定試薬の液性（ｐＨ）は、測定対象物質、ＸＯＤ
と共役して用いられる酵素等の至適１）Ｈ等の考慮が必
要であるが、通常はｐＨ６〜１０の範囲が好ましく用い
られる。測定時の温度としては、目的とする反応が進行
する温度であれば特に限定されないが、通常２５〜４０
℃の範囲が好ましく用いられる。尚、本発明に用いられ
る測定試薬中には、測定対象物質に応して必要な基質や
共役酵素が必要濃度添加されることは言うまでもない。

本発明の方法に於いて、アスコルビン酸、ビリルビン等
の測定妨害物質を含むものを試料とする場合には、アス
コルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等の
酵素を用いる方法や、沃素酸塩、過沃素酸塩を用いる方
法など従来から良く知られた方法で処理してもよいし、
また、特開昭６０−２６２５９９号公報に記載の方法、
即ち、銅イオン及びＰＯＤとアニリン系化合物、フェノ
ール系化合物、４−アミノアンチピリン等を併用するこ
とによって処理してもよく、これらのうちの適当な方法
に従って処理することによりこれらの影響を軽減するこ
とができる。

本発明の方法は、通常ｌステップの操作で測定可能であ
るが、妨害物質の除去を行う前処理操作等を加えて２ス
テツプの操作としてもよいし、また、測定対象物質を酵
素とした場合には、反応停止液を用いた２ステツプの操
作、或は前述の如き前処理操作を加えて３ステツプの操
作として行ってもよい。

以下に実施例により、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない
。

［実施例］ 実施例１．ヒボキサンチンの定量 （測定試薬） ０．１Ｍ　Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタン
スルホン酸（ＡＣＥＳ）・ＮａＯＨ緩衝液に下記物質を
下記濃度となるように溶解して測定試薬とした。

Ｘ　　ＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．０４Ｕ／ｓ＋ＩＰ　ＯＤ　　　　　
　　　　　　　　　　４Ｕ／ｍ１Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｓ−トルイジン
（ＴＯＯ５）　　　　　２６０曙ｇ／１４−アミノアン
チピリン　　　　　　９０■ｇ／ＩＭｎＣ１２１１４Ｈ
２０１ｍＭ （試料） ヒボキサンチンを夫々３．２．６．４．９．６．１２．
８■−含む水溶液を調製し試料とした。

（操作法） 試料を１０μｍとり、測定試薬２．５１を加えてよく混
合し、３７℃で５公園反応させた後、５５５ｎ−に於け
る吸光度Ｅｑを測定した。

試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブラ
ンクＦＢＩを測定した。

（結果） 横軸のヒボキサンチン濃度に対して得られた吸光度（Ｅ
ｓ　　Ｅｅｌ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んで
得られる検量線を第１図に示す（−Δ−）。

実施例２゜ 実施例Ｉの測定試薬のＭｎＣ１２・４Ｈ２０の代りにＣ
ｏＣｌ２・６Ｈ２０を１ｍＭ溶解したものを測定試薬と
した以外は実施例１と同様の測定試薬を用い、実施例１
と同様の操作により実施例１と同し試料について測定を
行った。

（結果） 横軸のヒボキサンチン濃度にたいして得られた吸光度（
Ｅｓ−Ｅｅｌ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んで
得られる検量線を第１図に併せて示す（−０−）。

第１図から明らかな如く、実施例１及び２により得られ
た本発明に係わる検量線は、何れも原点を通る直線とな
り、良好な定量性を示した。

実施例３．′ （測定試薬） 実施例１の測定試薬にＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ−２Ｎａ　１ｍＭ
を加えたものを測定試薬とした。

（試料） 実施例１と同じ。

（操作法） 実施例Ｉと同し。

（結果） 横軸の一ヒボキサンチン濃度に対して得られた喚光度（
Ｅｓ−ＥＢｔ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んで
得られる検量線を第２図に示す（−〇−）。

比較例１゜ 実施例３の測定試薬からＭｎＣｌ２・４Ｈ２０及びＥＤ
ＴＡ−２Ｎａを除いたものを測定試薬とした以外は実施
例３と同様の測定試薬を用い、実施例３と同様の操作に
より実施例３と同じ試料について測定を行った。

結果を第２図に併せて示す（−へ一）。

比較例２゜ 比較例１の測定試薬にスーパーオキシドジスムターゼ（
ＳＯＤ）を５０Ｕｌ園１となるように添加したものを測
定試薬とした以外は実施例３と同様の測定試薬を用い、
実施例３と同様の操作により実施例３と同じ試料につい
て測定を行った。

結果を第２図に併せて示す＜−Ｘ−＞　。

第２図から明らかな如く、本発明の方法による実施例３
に於いて得られた検量線は、比較例１又は２に於いて得
られたそれと比べ、測定感度及び直線性において優れて
おり、また、マンガンの水溶性化合物と金属キレート剤
（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−２Ｎａ）を併用したことにより金属
キレート剤を併用しない実施例１及び２て得られた検量
線よりも測定感度が一段と高いことがわかる。

参考例１゜ （測定試薬） 実施例３と同じ。

（試料） 過酸化水素を夫々６．４．Ｉ２．８．＋９．２，２５．
６ｍＭ含むＩ８液を調製し、試料とした。

＜Ｐｋ作法） 実施例３と同じ。

（結果） 得られた吸光度（Ｅｓ−Ｅａｔ）を実施例３て得られた
結果と併せて表−１に示す。

以下余白 表−１ ヒボキサンチンｌ当量はＸＯＤとの反応により理論上は
２当量の過酸化水素を生成する。即ち、表−１から明ら
かな如く、本発明の方法によればヒボキサンチンから理
論遣の過酸化水素が生成していることが判る。

実Ａｉ！ｆＩＪ４ａ、ｊ！！機’）ンノ定ｍ（測定試薬
） ０．１Ｍ　Ｎ−（２−７セタミド）−２−アミノエタン
スルホン酸（ＡＣＥＳ）・Ｎａ０ｌｌ緩衝液に下記物質
を下記濃度となるように溶解して測定試薬とした。

Ｘ　ＯＤ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０４Ｕ／ａ＋
１ＰＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　４υ１ＩＮ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
１−トルイジン（ＴＯＯＳ　）　　　　　２６０ｍｇ／
　ｌドアミノアンチピリン　　　　　　９抛ｇ／ＩＭｎ
Ｃ１２・４Ｈ２０１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　　　　　　　　　　Ｉｍ門プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ０．４Ｕ／ｍｌイノシン　
　　　　　　　　　　　　２ｓＭ（試料） 無機リンを夫々１０．２０．３０．４０園ｇｌ旧含む水
溶液を：ＡＳ１し試料とした。

（操作法） 試料を１０μｍとり、測定試薬２．５１を加えてよく混
合し、３７℃で５分ｍ反応させた後、５５５ｎｍに於け
る吸光度Ｅｓを測定した。

試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブラ
ンクＥ８１を測定した。

（結果） 横軸の無機リン濃度（ｌ１ｇ／旧）に対して得られた吸
光度（Ｅｓ　　ＥＢＩ）を縦軸に沿ってプロットした点
を結んで得られる検量線を第３図に示す。

第３図から明らかな如く、得られた検量線は、原点を通
る直線となり良好な定量性を示した。

実施例５．血清中の無機リンの定量 （測定試薬） 実施例４と同じ。

（試Ｉ′４） 人血清１０検体を試料とした。

（操作法〉 試料を１０８ｍとり、測定試薬２．５ｍｌを加えてよく
混合し、３７℃で５公園反応させた後、５５５ｎ■に於
ける吸光度ＥＳを測定した。

試料の代りに精製水及び農機リン標準液（電機リンＩＯ
＋＋８／旧含有）を用いて同様の操作を行い試薬ブラン
クＥａ＋及び標準液吸光度Ｅ　ｓ＋、ｌを測定した。

得られた吸光度を用いて次式により試料中の農機リン濃
度Ｐ（＋ｓ３／ｄｌ）を算出した。

Ｐ　（ｍｇ／ｄｌ）”（（Ｅｓ−Ｅｓ＋）÷（Ｅｓ＋ｄ
−ＥＢＩ））ＸＩＯ（結果） 測定結果を表−２に示す。

比較例３．従来法による血清中のＷｔ機リンの定量市販
の無機リン測定試薬［無機リンＣ−テストフコ−（和光
純薬工業（株）製）］を用い、実施例５と同じ試料につ
いて無機リンの定量を行った。

尚、操作法は、同瀾定試薬の現品説明書に従って行った
。

（結果） 測定結果を表−２に併せて示す。

表−２ 相関係数：γ：０．９９９ 回帰直線式：　Ｙ　＝　１．００３　Ｘ　−０，０３表
−２から明らかな如〈実施例５で得られた値と比較例３
で得られた値とは良く一致しておりその間に有意差は認
められなかった。

［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明はＸＯＤを介して生成する過酸
化水素の、正確、且つ簡便で、しかも自動分析機に応用
可能な測定方法を提供するものであり、これにより例え
ば核酸代謝に関与する物質等を容易に且つより正確に測
定することが可能となった点に顕著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び実施例２により得られた検量線
を示し、横軸のヒボキサンチン濃度（ｍＭ）に対して得
られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだも
のである。ここで、−へ一は実施例１で得られた結果を
、−〇−は実施例２て得られた結果を各々示す。 第２図は、実施例３、比較例１及び比較例２により得ら
れた検量線を示し、横軸のヒボキサンチン濃度（ｍＭ）
に対して得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。ここて、−０−は実施例３て得ら
れた結果を、−Δ−は比較例１て得られた結果を、−×
−は比較例２で得られた結果を各々示す。 第３図は、実施例４により得られた検量線を示し、横軸
の麺機リン濃度（ｓｇ／ｄｌ）に対して得られた吸光度
を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人　相光純薬工業株式会社 第１図 ヒポ°キブンナシ濃度（ｒｒ、Ｍ） 第２図 ヒポキサ〉チシ壇度（ｒｎＭ） Ｍ３図 無機り／１度（ｒｎｇん１）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）キサンチンオキシダーゼの作用を介して生成する
   過酸化水素の定量方法に於いて、過酸化水素生成系にマ
   ンガン又は／及びコバルトの水溶性化合物を加えて、こ
   れを行うことを特徴とする過酸化水素の定量方法。
2. （２）マンガン又は／及びコバルトの水溶性化合物と金
   属キレート剤とを併用する特許請求の範囲第１項に記載
   の定量方法。