JPS6329247A - 分析用組成物，分析要素及び被分析物の測定方法 - Google Patents

分析用組成物，分析要素及び被分析物の測定方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に臨床化学に関する。特に、本発明は、
生物学的流体中の被分析物の測定に有用な分析組成物、
要素及び方法に関する。例えば、本発明は、免疫分析に
使用することができる。
以下余白 〔従来の技術〕 水性液体をその液体中の被分析物の濃度に比例して検出
可能な生成物を生じうる試薬の配合物と接触させること
によって定量的又は定性的分析を実施することは周知で
ある。本明細書において、この試薬配合物とは、化学反
応、触媒活性又は適当な操作及び装置を用いて検出しう
る変化を最終的に生じうる他の化学的又は物理的相互作
用をしうる相互作用組成物をいう。
有用な分析の一つは、被分析物が、適切な試薬と接触し
たときに、適当な酵素の存在下に酸素と反応して被分析
物の濃度に比例して過酸化水素を生成する酵素反応を利
用する。検出可能な生成物は、試験される液体中の被分
析物の濃度に比例して過酸化水素の反応により生産され
る。ペルオキシダーゼは、一般にこのような分析におい
て、過酸化水素による相互作用組成物の酸化を触媒する
ため使用される。
ペルオキシダーゼは、種々の被分析物、例えばグルコー
ス、トリグリセリド、尿酸、コレステロ−ル、タレアチ
ンキナーゼ等の診断的測定に使用され、また、免疫学的
に反応性の種の測定（すなわち、免疫分析）に使用され
るリガンドアナローグにおける標識として使用される。
このような測定は、溶液中で又は乾式分析要素で実施す
ることができる。
種々の基質とペルオキシダーゼとの反応の速度は、多く
の段階にわたって変動する。若干の場合に、反応が緩や
かに進行する場合には、反応速度を高めるため多量のペ
ルオキシダーゼを使用する。
しかし、反応速度を高めるため多量のペルオキシダーゼ
を使用することは、ある分析では使用することができな
い。例えば、ペルオキシダーゼ−標識リガンドアナロー
グを使用する酵素免疫分析は、薬剤、抗原又は他の免疫
学的に反応性の化合物を測定するため重要になってきた
。このような分析においては、酵素反応速度を高めるた
めに多量のペルオキシダーゼを添加することはできない
。トリアリールイミダゾールロイコ染料を利用する有用
な分析法は、米国特許第４，０８９，７４７号明細書に
（Ａ　　） 記載されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかしながら、このような分析において、ペルオキシダ
ーゼによるロイコ染料の酸化は比較的遅いことが観察さ
れた。反応速度を高めるには、多量のペルオキシダーゼ
が必要であるが、ペルオキシダーゼの使用量を増加する
ことは、経済的理由から、又は例えば、ペルオキシダー
ゼが免疫分析における標識として使用される場合に、増
加した量が分析に不利に作用するので、しばしば望まし
くないか又は実用的でない。従って、ペルオキシダーゼ
の量を増加することなくロイコ染料のペルオキシダーゼ
触媒酸化の反応速度を増加しうろことが望ましい。
〔問題点を解決するための手段〕
前記の問題点は、ペルオキシダーゼ又は免疫学的に反応
性のリガンドのペルオキシダーゼ標識アナローグ、ペル
オキシダーゼ及び過酸化水素の存在下に検出可能な色素
を生成しうるロイコ染料、並びにペルオキシダーゼの存
在で過酸化水素と反応してロイコ染料より高い酸化電位
を有する中間化合物を生成しうるフェノール又はアニリ
ン電子移動剤を含む分析用組成物によって克服される。
本発明は、また、前記の分析用組成物を含む分析要素を
提供する。
被分析物の測定方法は、 Ａ、被分析物を含むと思われる液体試料を前記の分析用
組成物と接触させ、そして Ｂ、被分析物の存在の結果として検出可能な色素を測定
する 工程を含む。
実施■様 本発明は、水性液体中の化学的又は生物学的物質（本明
細書では、被分析物という）の測定（定性又は定量測定
）に関する。特に、本発明は、動物又は人間の生物学的
流体を分析するため使用することができる。このような
流体は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、を髄
液、唾液、汗及び排泄物を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。ヒト又は動物の組織、例えば骨格筋
、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄又は皮膚の流体調製物を分
析することもできる。
本発明を用いて過酸化水素を測定することができる。更
に、本発明を使用して、過酸化水素を生成しうる被分析
物、すなわち、適当な相互作用組成物の存在で過酸化水
素を生成する１種以上の反応に関与しうる物質を測定す
ることができる。この方法で測定しうる被分析物は、グ
ルコース、トリグリセリド、尿酸、コレステロール、ガ
ラクトース、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ピルビン
酸塩、及び他の当業者に公知の物質を包含する。
本発明は、グルコース、トリグリセリド、尿酸、コレス
テロール及びクレアチンキナーゼの測定に特に有用であ
る。
好ましい実施態様において、本発明は、対応するレセプ
ターと特異的に複合する物質である免疫学的に反応性の
リガンドの測定に有用である。このようなリガンドは、
抗原、ハプテン、抗体、毒素、ホルモン、治療薬、天然
及び合成ステロイド、蛋白質、ウィルス、細菌、ペプチ
ド、ヌクレオチド等を包含するが、これらに限定されな
い。この実施態様において、測定すべきリガンド及び対
応する標識リガンドアナローグは、一定量の共通の反応
体に対して競合する。この反応体は、リガンド及びリガ
ンドアナローグを特異的に認識し、反応してそれらと複
合体を形成するものであり、本明細書においてはレセプ
ターという。
本発明の分析用組成物は、ペルオキシダーゼ又はペルオ
キシダーゼ−標識リガンドアナローグを含む。合成又は
天然産（すなわち、植物、ミルク、細菌及び他の公知資
源から得られる）のペルオキシダーゼを使用することが
できる。これらの物質は、一般に市場で入手しうるか又
は入手可能な資源から容易に抽出される。本発明に有用
なペルオキシダーゼ−標識リガンドアナローグは、当業
者に公知の適当な技法を使用して製造される。一般に、
これらは、結合を達成するため適当な方法で変性されう
るリガンド分子にペルオキシダーゼ標識を共有結合させ
る（結合基を用いるか又は用いないで）ことによって製
造される。
ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在で酸化されたと
きに検出可能な色素を生成しうる限り、任意の適当なロ
イコ染料を本発明の実施に使用することができる。有用
なロイコ染料は、例えば、イミダゾール誘導体、例えば
米国特許第４，０８９，７４７号明細書及び該明細書に
記載されている参考文献、欧州特許出願第１２２，６４
１号明細書及び日本特許出願公報箱５８　（１９８３）
　−０４５，５５７号公報に記載されているもの、並び
に例えば欧州特許出願公告箱１６５．６８５号公報に記
載されているトリアリールメタン類を包含するが、勿論
これらに限定されない。
米国特許第４．０８９，７４７号明細書のトリアリール
イミダゾール類は、本発明の実施に好適である。
これらのロイコ染料は、一般に、次式を有する：〔式中
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に有機基を表し、そ
のうち少なくとも１個は炭素原子数１８以下のオルト−
又はパラ−ヒドロキシ置換アリール基であり、他の２個
の基は、化合物の酸化電位が炭素ベース電極を用いて標
準カロメル電極に対してサイクリック・ボルトメトリー
で測定して一７０ｍＶ〜＋１００ｍＶの範囲であるよう
に選択される〕。これらの好ましいロイコ染料及び酸化
電位の測定の技法について更に詳細には米国特許第４，
０８９，７４７４号明細書に記載されている。
本発明の実施に有用なフェノール類及びアニリン類は、
ロイコ染料を酸化して検出可能な色素を生成する際に電
子移動剤として作用するものである。これらのフェノー
ル類及びアニリン類は、ペルオキシダーゼの存在で過酸
化水素と反応して、分析に使用したロイコ染料より高い
酸化電位を有する中間化合物を生成する。フェノール又
はアニリン、過酸化水素及びペルオキシダーゼの反応は
、ロイコ染料、過酸化水素及びペルオキシダーゼの反応
より速く、これにより生成した中間体は、口ィコ染料又
は他の徐々に酸化される物質と迅速に反応しなければな
らない。第一の反応は、第二の反応より少なくとも２倍
迅速であるのが好ましい。
従って、所定のフェノール又はアニリンが本発明に有用
であるか否かを測定するため、簡単な試験を実施するこ
とができる。ロイコ染料の酸化速度をフェノール又はア
ニリンの存在又は不存在で比較する。フェノール又はア
ニリンの存在での速度が少なくとも２倍速い場合に、そ
のフェノール又はアニリンは本発明の実施に有用である
。本発明に有用なフェノール又はアニリンは、すべての
ロイコ染料と共に有用であるわけではないが、どのロイ
コ染料及びフェノール又はアニリンが本発明の実施に有
用であるかは、当業者は容易に測定することができる。
本発明において有用な代表的フェノール類は、ｐ−ｐ　
’−ビフェノール、４１−ヒドロキシアセトアニリド、
ｐ−メトキシフェノール、クロロフェノールレッド、ｐ
−クレゾール、ｍ−メトキシフェノール、バニリン、４
−クロロ−３，５−ジメチルアミノフェノール、ホモバ
リニン酸、ｐ　−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ
フェニル酢酸、ｎ−メトキシフェノール、フェノール、
レゾルシノール及びｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを包
含する。有用なアニリンは、ｐ−アニシジン、４′−ア
ミノアセトアニリド、ｐ−ヒドロキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアニリド及び０−フェニレンジアミンを包含する。ｐ
−ｐ　’−ビフェノール、４゛−ヒドロキシアセトアニ
リド、ｐ−メトキシフェノール、ｐ−アニシジン及び４
′−アミノアセトアニリドが好ましく、４′〜ヒドロキ
シアセトアニリドが最も好ましい。
前記のように、過酸化水素以外の被分析物を測定するた
め、相互作用組成物を本発明の分析用組成物と共に使用
することができる。相互作用組成物は、被分析物と反応
して過酸化水素を生成する試薬を１種以上含む。適当な
相互作用組成物は、当業者に公知である。例えば、尿酸
の測定用の相互作用組成物は、ウリカーゼを含み、グル
コースの測定用の相互作用組成物は、グルコースオキシ
ダーゼを含む。コレステロールの測定用の相互作用組成
物は、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロール
エステルヒドロラーゼを含む。
本発明の分析用組成物は、適当な標識に共有結合したリ
ガンドを含むリガンドアナローグを使用して免疫学的に
反応性のリガンドを測定するため使用することもできる
。前記のように、ある実施態様では、その標識はペルオ
キシダーゼである。
他の実施態様では、標識は、ペルオキシダーゼ以外の酵
素、例えば被分析物の過酸化水素への変換及びロイコ染
料の検出可能な色素への変換に関与するグルコースオキ
シダーゼ又はガラクトースオキシダーゼである。これら
のりガンドアナローグは、自体公知の技法で製造するこ
とができる。リガンドアナローグは、グルコースオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼを含むのが好ましい。
本発明の分析用組成物は、分析に一般に含まれる他の添
加物、例えば緩衝剤又は界面活性剤を従来公知の量で含
むことができる。
本発明の分析用組成物及び方法は、溶液及び乾弐分析に
適用することができる。免疫反応性リガンド以外の被分
析物に関する溶液分析では、適当な容器（例えば、試験
管、シャーレ、ビーカー又はキュベツト）中で分析用組
成物及び相互作用組成物（含まれる場合）を、被分析物
を含まれると思われる液体試料と接触させ、混合する。
得られる溶液を短時間４０℃以下の温度で静置し、被分
析物の存在により生成する検出可能な色素を適当な検出
装置及び操作を用いて測定する。
本発明の免疫分析においては、標識リガンドアナローグ
の結合（複合）又は非結合（非複合）フラクションを測
定することができる。必要に応じて、結合リガンドアナ
ローグと非結合リガンドアナローグとの物理的分離を任
意の適当な技法を用いて達成することができる。溶液免
疫分析においては、リガンドアナローグ、適切なレセプ
ター及びリガンドを含むと思われる液体試料を前記のよ
うな容器中で混合する。複合後、試料を適当な装置及び
操作を用いて結合又は非結合リガンドアナローグを測定
して評価する。
溶液分析においては、使用したロイコ染料の量は、生成
した色素の吸光係数に左右される。適切な量は容易に決
定することができる。一般に、ロイコ染料は、少なくと
も４Ｘ１０−７モル、好ましくは２Ｘ１０−’〜ｌＸｌ
０−’モル濃度で存在する。
同様に、ペルオキシダーゼは、ロイコ染料を酸化して検
出可能なシグナルを生じるのに充分な量で存在する。一
般に、ペルオキシダーゼは、少なくとも１ｏ−１３モル
濃度の量で存在する。本発明の利点は、本明細書に記載
したフェノール又はアニリンが酵素の反応速度を向上さ
せるので、多くの分析においてより少ない量のペルオキ
シダーゼを使用すればすむことである。分析に使用する
フェノール又はアニリンの量は、使用するロイコ染料及
び色素への酸化速度に応じて変動しうる。しかし、一般
に、これは少なくとも１０−６モル濃度、好ましくは１
０−４〜１０−２モル濃度の量で存在する。
溶液免疫分析においては、リガンドアナローグは、一般
に、少なくとも１０−”　モル濃度、好まｔ１ζ） しくは１０−１０〜１０−’モル濃度で存在する。対応
するレセプター（例えば、単クローン性又は多クローン
性抗体）は、−Ｃに、少なくとも１０−８モル濃度、好
ましくは１Ｏ−１ｌ〜１０−３モル濃度の量で存在する
。
本発明方法を乾式分析要素を使用して実施することもで
きる。最も簡単な要素は、本発明の分析用組成物を含む
吸収性担持物質、例えば自立性吸収性又は吸水性物質の
薄いシート、例えば口紙又はストリップから成る。要素
を担持物質の個々の帯域に組成物の異なる成分を組み込
んだ２個以上の別々の帯域に分割することができる。こ
のような要素は、従来、試験ストリップ、診断要素、浸
漬スチック、診断剤等として知られている。
有用な吸収性担持物質は、水又は生物学的液体、例えば
全血又は血清にさらされても不溶性であり、その構造的
一体性を保有するものである。有用な要素は、紙、多孔
性粒状構造体、多孔性ポリマーフィルム、セルロース、
ガラス繊維、織布及び不織布から製造することができる
。このような要素／Ｉ　ＣＳ を製造するために有用な物質及び操作は、文献、例えば
米国特許第３，０９２，４６５号、同第３，８０２，８
４２号、同第３．９１５．６４７号、同第３，９１７，
４５３号、同第３．９３６，３５７号、同第４．２４８
，８２９号、同第４，２５５，３８４号、同第４．２７
０，９２０号及び同第４．３１２，８３４号明細書に良
く知られている。
本発明の乾式分析要素の吸収性担持物質は、多孔性拡散
帯域であるのが好ましい。この帯域は、自立性（すなわ
ち、その一体性を保持するのに充分に硬い物質から成る
）であってよいが、別の支持体上に担持されているのが
好ましい。このような支持体は、任意の適当な寸法安定
性で、好ましくは、２００〜９００ｎｍの波長の電磁線
を透過する非多孔性で透明な物質である。特定の要素に
対して選択される支持体は、所定の検出方法（透過又は
反射分光分析）と矛盾しないものであるべきである。有
用な支持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエステ
ル、ポリカーボネート又はセルロースエステルから製造
することができる。
多孔性拡散帯域は、米国特許第４．２９２．２７２号、
同第３，９９２．１５８号、同第４，２５８，００１号
及び同第４．４３０，４３６号明細書並びに特開間第５
７−１０１７６０号公報に記載されているような任意の
適当な繊維状若しくは非繊維状物質又はその一方若しく
は両方の混合物から製造することができる。拡散帯域は
等方性に多孔性である（すなわち、孔度が粒子、繊維又
はポリマーストランドの間の連続空間又は孔によって生
じるように、帯域のどの方向でも同一であることを意味
する）のが望ましい。
要素は、２個以上の別々の帯域を同じ層内に又は重ねら
れた層として有することができる。その帯域の少なくと
も１個は多孔性拡散帯域であるのが好ましい。他方の帯
域は、試薬帯域又は記録帯域（これらの帯域は従来公知
である）、付加的拡散帯域、輻射線遮断若しくはフィル
ター帯域、下塗帯域又はバリヤ帯域等であってよい。帯
域は一般に、相互に液体接触〔すなわち、一般に液体、
試薬及び反応生成物（例えば着色色素）が隣接帯域の重
なった領域の間をｉｌ過又は移動しうろことを意味する
〕している。帯域は、別々に塗布された層であるのが好
ましい。
本発明の要素において、分析用組成物の成分は溶液分析
に関連して上記したのと同じファクターに応じて変動し
うる量で存在する。一般に、ロイコ染料は少なくとも２
０ｍｇ／ｒｒｒの量で存在する。
ペルオキシダーゼは少なくとも１０１．１．７ｍの量で
存在し、フェノール又はアニリンは少なくとも２．５１
．１．７ｍの量で存在する。最適のレベルは当業者には
容易に決定することができる。本発明の要素は、種々の
製造又は操作上の利点のため要素に一般に求められる他
の添加剤を１種以上含むことができる。このような添加
剤は、界面活性剤、緩衝剤、溶剤又は硬化剤を含む。こ
れらの物質は、前記の要素の１個以上の帯域中に独立し
て存在することができる。若干の実施態様では、フェノ
ール及びロイコ染料は、同じ帯域で存在する他の実施態
様では、フェノール又はアニリン及びベルトキシダーゼ
が同じ帯域に存在する。
本発明の要素を免疫分析に使用する際には、標識リガン
ドアナローグ及び対応するレセプターを使用前に要素に
混入するか、又は分析の時点で添加することができる。
いずれの場合にも、これらは一般に溶液免疫分析につい
て上記した量で存在する。両者を使用前に要素中に混入
するのが好ましい。標識リガンドアナローグを別個の水
溶性帯域又は層中に混入してレセプターから単離してお
くことができる。
レセプターは、使用前、例えば製造の間、要素内に固定
するのが好ましい。例えば、レセプターを要素の吸収性
担持物質内に固定することができる。更に詳述すれば、
レセプターを担持物質、例えばガラス若しくはポリマー
のビーズ又は他の粒子、樹脂又は繊維上の多孔性拡散帯
域内に固定する。有用な担持物質の一つは、微生物、例
えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｕｒｅｕｓ）である。
また、多孔性吸収性担持物質は、固定用の担持物質とし
て作用することができる。
本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を構
成することができる。
本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、被分析物
を含むと思われる液体の試料（例えば１〜２００μりと
、試料と試薬が要素内で混合されるように物理的に接触
させることによって被分析物を測定する。このような接
触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中に浸漬
するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて一滴の
試料を手で又は機械で要素に落とすことによって達成さ
れる。
試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。
本発明の免疫分析は、要素中でリガンド及びリガンドア
ナローグ及びレセプターの間で複合体が形成されるよう
な方法で実施する。複合体形成が起こったら、適当な分
離技法を使用して、複合しく２０） たりガンドアナローグと未複合すガンドアナローグとを
垂直方向又は水平方向に分離することができる。
一つの実施態様においては、試料の接触は、レセプター
及びリガンドの複合並びに未複合及び複合リガンドの実
質的に水平の分離が試料の導入の間に起こるような方法
で達成することができる。
この接触は、手で又はピペット若しくは試験試料を分配
するのに適当な他の分配装置を用いて機械により実施す
ることができる。液体試料を水平分離を行う多数の方法
で要素に適用することができる。例えば、比較的に多量
の液体試料（例えば、２００μｌ）を適当な分配装置を
使用して連続的方法で徐々に（例えば少なくとも５秒か
けて）適用することができる。また、試料を少量ずつ、
例えば、２滴以上ずつ（例えば０．１〜１μｌ）一定時
間かけて（例えば少なくとも５秒かけて）適用する。
別の実施態様では、液体試料を要素に適用した後、洗浄
液を徐々に添加することによって分離を達成することが
できる。この洗浄は、未複合物質を複合物質から移動さ
せて引き離す。
試験試料中のリガンドの量は、ペルオキシダーゼ及び基
質の反応の結果としてロイコ染料の酸化により生成した
色素（例えば反射又は透過濃度の変化）を検出すること
によって測定する。この方法で、複合又は未複合リガン
ドを測定することができる。
水平分離に関する前記の実施態様においては、複合リガ
ンドアナローグを接触した領域の中心における一定部分
内で測定する。試験試料中のリガンドの量は、その−足
部分内で測定したりガンドアナローグの量に反比例する
。一般に、リガンドアナローグの測定は、試験試料を要
素に適用してから５〜５００秒の後に実施する。
本明細書において、１．　Ｕ、は酵素活性に関する国際
単位であって、その酵素の標準ｐＨ及び温度条件下に１
分光たりに１マイクロモルの基質の変換を触媒するのに
必要な酵素活性の量を１単位と定義される。
〔実施例〕
Ｋ２ＨＰＯ，（４，３６ｇ／　５００−水）及びＫｌｌ
□ｐｏ。
（３，４１ｇ１５００−水）から燐酸カリウム緩衝液（
５０マイクロモル、ｐＨ６，５）を製造した。界面活性
剤溶液は、５０ミリモル緩衝液中のトリトン（ＴＲＩＴ
ＯＮ）　Ｘ−１６５（１０重量％）から製造した。
２−　（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル
）−４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミ
ダゾールロイコ染料の溶液を下記のようにして製造した
。前記のトリトンＸ−１６５溶液（２８，６Ｗり及び前
記の５０ミリモル緩衝液（１７１，４ｄ）を窒素でパー
ジし、ロイコ染料０．２ｇを添加した。生成した混合物
を、溶液が得られるまで（約２時間）、２５℃で攪拌し
た。この溶液を２００ミリモルの緩衝液で１；１９に希
釈した。
キュベントに試薬を下記の順序で加えることによって試
験溶液を製造した：ロイコ染料溶液３ｉ、２００ミリモ
ルの緩衝液中の１０ミリモル過酸化水素１０μｌ、ｐ−
メトキシフェノール（下記の第１表に示した種々の濃度
）及びペルオキシダーゼ溶液１０μＩ！　（２００ミリ
モルの緩衝液２５ｉ中の１６５プルプロガリン単位／ｍ
ｇの活性を有する酵素７．５８ｍｇ）。
３０℃で標準分光光度計を使用して６７０ｎｍで吸光度
を測定した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）　　−とじ
て下記の第１表に示す、得られたデータは、ｐ−メトキ
シフェノール（ＰＭＰ）の存在でペルオキシダーゼによ
って触媒されてロイコ染料の酸化速度が向上したことを
示す。
（以下余白） ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０、．３４
４３．３Ｘ１０−８　　　　　　　　　　　　　０．３
６９８．３ｘｌＯ−’　　　　　　　　　　　　　　　
０．３６８１．７ｘｌＯ−’　　　　　　　　　　　　
　　　０．４００３．３Ｘ１０−’　　　　　　　　　
　　　　　　０．３９８８．３Ｘ１０−７　、　　　　
　　　　　　　　０．４６７１．７Ｘ１０Ｔ６　　　　
　　　　　　　　　０．５６０３．３ｘｌＯ−；　　　
　　　　　　　　　　　　０．６５２８．３ｘ　１　０
−’　　　　　　　　　　　　　　　１．００４１．７
Ｘ１０−’　　　　　　　　　　　　　　１．２４０３
、ａｘ　１　ｏ”　　　　　　　　　　　　　　　１．
６７５６．６ｘｌ　　Ｏ−’　　　　　　　　　　　　
　　　２．３　１　４９．９ｘｌＯ−５２，５１６ ■ 前記の例１に使用したロイコ染料溶液をこの例にも使用
した。キュベツトに試薬を下記の順序で加えることによ
って試験溶液を製造した二ロイコ染料溶液（３，０ｍｆ
ｆ１）　、２００ミリモルＫＰ緩衝液中の１０ミリモル
過酸化水素１０μ１１４′−ヒドロキシアセトアニリド
（下記の第■表に示した種々の濃度）及びペルオキシダ
ーゼ溶液１〇−（２００ミリモルの燐酸カリウム緩衝液
５〇−中の１６５プルプロガリン単位／ｍｇの活性を有
する酵素３．０３ｍｇ）。
３０℃で標準分光光度計を使用して６７０ｎｍで吸光度
を測定した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）として下記
の第■表に示す、得られたデータは、４′−ヒドロキシ
アセトアニリド（４−ＨＡ）の存在でペルオキシダーゼ
によって触媒されてロイコ色素の酸化速度が向上したこ
とを示す。
以下余白 ｆ９７） 算」し表 ０　　　　　　　　　　　　　　　０、１６７Ｂ、３ｘ
ｌＯ−８０，１７８ １，７Ｘ１０−’　　　　　　　　　　　　０．２００
３．３Ｘ　１０−７０．２２６ ８．３Ｘ１０−７　　　　　　　　　０・２６５１．７
Ｘ１０−６　　’　　　　　　　　　０．３５６３．３
Ｘ１０−’　　　　　　　　　　　０．５３５８．３Ｘ
１０−ｂ　　　　　　　　　　Ｏ，８３１１，７ｘｌＯ
−ｓ　　　　　　　　　　１．１０８３．３Ｘ１０−’
　　　　　　　　　　　　１．５４４８．３Ｘ１０−５
　　　　　　　　　　１．９００１．７Ｘ１０−４　　
　　　　　　　　２．０７８３．３Ｘ１０−’　　　　
　　　　　　　　２・１０４６．６Ｘ１０−’　　　　
　　　　　　　１．７４３１．７ｘｌＯ−３１，４６１ 貫主 イノオキシダーゼ　、パ束　の１　のための２＝径とし
ての　、　　′−ビフェノールの ロイコ染料の溶液を下記の物質、すなわち、２００ミリ
モル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）、１００ミリ
モルグルコース溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（緩衝液
５〇−中５ｇ）、燐酸カリウム緩衝液５０ｍ１中のロイ
コ染料０．０５ｇ、０．０５モルジメドン及び１．２５
ミリモル過酸化水素から製造した。
キュベツトに試薬を下記の順序で加えることにより試験
溶液を製造した二ロイコ染料溶液７９０μ１１ペルオキ
シダーゼ（１０プルプロガリン単位／ｄ）２００μ！及
びｐ、ｐ’−ビフェノール（第■表に示した種々の量）
。
３０℃で標準分光光度計を使用して６７０ｎｍで吸光度
を測定した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）として下記
の第■表に示す、得られたデータは、４回の測定値の平
均であり、ｐ、ｐ“−ビフェノールの存在でペルオキシ
ダーゼによって触媒されてロイコ染料の酸化速度が向上
したことを示す。
以下余白 ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０、００４１
０−’　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３Ｂ２
２Ｘ１０−’　　　　　　　　　　　　　　　０．６７
０３Ｘ１０−５　　　　　　　　　　　　０．８８６５
Ｘ１０−’　　　　　　　　　　　　　　１．１４５１
０−’　　　　　　　　　　　　　　　１．４０にの例
は、ジゴキシンの測定のための本発明の詳細な説明する
ものである。
下記の構造及び成分を有する本発明の要素を製造した： ポリ　（ビニルトルエンーコー ｐ−ｔ−プチルスチレンーコー メタクリル酸）ビーズ　　　１３１ｇ／ｍポリ　（アク
リル酸メチル−コー２ −アクリルアミド−２−メチル 拡散　　プロパンスルホン酸−ツー２−層　　　アセト
アセトキシエチルメタクリレート）接着剤　　　　　　
　４ｇ／ｒｒ？ジゴキシン抗体で被覆された 黄色ブドウ球菌　　　　　　　１．６８／ｍ２−　（３
，５−ジメトキシ−４− ヒドロキシフェニル）−４，５− ビス（４−ジメチルアミノフェニ ル）イミダゾールロイコ染料０．１６ｇ／ｍサーファク
タント（ＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴ）１００界面活性剤　　
　　　　１．１ｇ／ｍジメドン　ヒ方止　　　　　　　
０．０５７ｄポリ　（ビニルアルコール）　　　０．５
５ｇ／ｍ水溶　ゾニル（ＺＯＮＹＬ）　ＦＳＮ界面活性
剤０．１１ｇ／ｎｆ性層　燐酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７
）　　０．１１ｇ／ｍジゴキシンーペルオキシダーゼ 人　　　　　　　　　　　　　３Ｘ１０−５／ｍｒゼラ
チン（硬化）　　　　　　　　ｆｉｇ／ｍサーファクタ
ント１０Ｇ 界面活性剤　　　　　　　　０．２２ｇ／ボ／’）１１ 試薬　燐酸カリウム緩衝液　　　　　０．６５ｇ／ｒＪ
層　　α−グリセロールホスフェート オキシダーゼ　　　　　２．１８０１，１．／ｒｒｒ４
′−ヒドロキシアセト アニリド　　　　　　　　　０．１６　Ｍポリ　（エチ
レンテレフタレート） この要素を使用して下記の方法でジゴキシンを測定した
。緩衝液（ｐ＋Ｉ　７　）中で種々の量のリガンドであ
るジゴキシンを含む一連の試験試料を製造した。各試験
試料の１０μｌの試料を要素に施して３７℃で約５分間
静置した。この時点で、α−グリセロールホスフェート
１００ミリモルを含む洗浄液１０μｌの試料を要素に、
試験試料と接触した拡散層部分上に施して未複合すガン
ドアナローグを複合リガンドアナローグから水平方向に
洗浄除去し、検出可能な色素を生成する酵素反応を開始
させる。次に、複合リガンドアナローグを標準反射計を
用いてスポット部分の中心で６７０ｎｍで反射濃度を監
視することによって測定した。色素濃度の変化率を静置
中に６０秒と１２０秒の間で行った測定から計算した。
ウィリアムス−クラッパ−（Ｗｉ　ｌｌｉａｍｓ−Ｃ１
ａｐｐｅｒ）変換（Ｊ、　０ｐｔｉｃａｌＳｏｃ、　Ａ
ｍ、、４３巻５９５頁、１９５３）を使用して反射濃度
値から透過濃度値を測定した。試験液中のジゴキシンの
濃度は、色素形成の速度に反比例することが観察された
。
肛 ＼　　、を　　したフェニトインの渭 下記の構造及び成分を有する、フェニトイン測定用の分
析要素を製造した。フェニトインは、ジフェニルヒダン
トインとしても知られている。
正常なウサギの血清で被覆された ポリスチレンビーズ（５〜 ２０μｍ）　　　　　　　　　　　６５ｇ／ボポリ　（
アクリル酸ｎ−ブチル− コースチレンーコー２−アク 拡散　　ジルアミド−２−メチルプ０ 層　　　パンスルホン酸ナトリウム塩）（ｌｊｔ） （７５：２０：５重量比） 接着剤　　　　　　　　　　　２．６ｇ／ｒｒｆゾニル
ＦＳＮ界面活性剤　　　　　０．５ｇ／ｒ＋（フェニト
イン抗血清で被覆された 色ブドウｂ’　　　　　　　　　　２．２／叶中間　ゼ
ラチン（硬化）　　　　　　　　　２ｇ／ｍゾニルＦＳ
Ｎ　　　’　　　　　　　　　０．２Ｊムｍｌゼラチン
（硬化）　　　　　　　　　１１ｇ＃＋（ロイコ染料＊
　　　　　　　　　０．１６ｇ／ＩＴ？５．５−ジメチ
ル−１，３− 試薬　　シクロヘキサンジオン　　　０．０５ｇ／ｍ層
　　グルコース　　　　　　　　　　　２ｇ＃ｒｆ４′
−ヒドロキシアセト アニリド　　　　　　　　　０．０２ｇ／ｒｒ？ドデシ
ル硫酸ナトリウム　　　　　１ｇ／１１（ペルオキシ゛
−ゼ　　　　１１００１．石賀ポリ　（エチレンテレフ
タレート） 〜 ＊４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミ
ダゾール ０．０１モルの３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスル
ホン！緩衝ｆｉ　＜ｐＨ７）　、０．１５モルの塩化ナ
トリウム及び０．０５％のウサギＴ−グロブリンを含む
緩衝液中で種々の量のフェニトインを含む一連の試験試
料を製造した。試験試料中のフェニトインの濃度を下記
の第■表に示す。
試験には、下記の標識接合体を使用した：５−エチル、
５−フェニルヒダントイン−バレレート−グルコースオ
キシダーゼ。
標識を各試験試料と混合し、得られた混合物の８μｌの
試料を要素上に落とし、要素を３７℃で７分静置するこ
とによって試験した。静置の間、反射率計を用いて６７
０ｎｍで反射濃度を監視した。
色素濃度の変化率を静置中に６０秒と１２０秒の間で行
った測定から計算した。ウィリアムス−クラッパ−（Ｗ
ｉｌ　ｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換（Ｊ、０ｐｔ
ｉｃａｌＳｏｃ、　Ａｍ、、４３巻５９５頁、１９５３
）を使用して反射濃度値から透過濃度値を測定した。
結果を下記の第■表に示す。これらのデータは、（’４
ζ１ 観察された変化率（時間と共に透過濃度における変化と
して示した）が試験試料中のフェニトインの濃度に反比
例することを示す。これらのデータを使用してプロット
した用量応答曲線から、０、１５５の動的範囲が得られ
た。
策丘表 フェニトイン濃度　　　　　　　ＤＴ／分（モノ１Ｆ）
　　　　　　　　　　（Ｂ）０　　　　　　　　　　　
　０．３０７１０−８　　　　　　　　　０．２８９１
０−’　　　　　　　　　　　０．２６７１０−’　　
　　　　　　　　　０．２２５１０７５　　　　　　　
　　０．１８８１０−’　　　　　　　　　　　０．１
５４２Ｘ１０−４　　　　　　　　　０．１５２コレス
テロールの渭 この例は、本発明の分析要素を使用してコレステロール
を測定するための本発明の詳細な説明するものである。
下記の成分及び構造を有する要素ＩＱｃ箋 を製造した： 硫酸バリウム　　　　　　　１１０ｇ／ｒ＋？酢酸セル
ロース　　　　　　　　９ｇ／ｍポリウレタン樹脂　　
　　　　　１ｇ／ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，５〜 拡散／　　　６．５）　　　　　　　　　　　１．５ｇ
＃ｒ？試薬　　トリトンＸ−１００界面活性剤　　８ｇ
／ｌｒｉ’層　　　ペルオキシダーゼ　　　２０，００
０１．１．／ｍ４′−ヒドロキシアセト アニリド　　　　　　　　０．０９ｇ／ｍコレステロー
ルオキシダーゼ ２．７００１．ｌ］、／ｎ？ コレステロールエステル ヒドロラーゼ　　　　７，３００１．Ｕ、／ｍ２−　（
３，５−ジメトキシ−４− ヒドロキシフェニル）−４，５ −ビス（４−ジメチルアミノ フェニル）イミダゾール　　１．６ｇ／ｍ５．５−ジメ
チル＝１．３− シクロヘキサンジオン　　　０，４／Ｍ下塗　　ポリ　
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド＞　　　　　　　　
　　　ｏ、１メーゼラチン（硬化）　　　　　　　１８
ｇ／耐結合　　燐酸カリウム緩衝液　　　　　０．３ｇ
／ｎｆ層　　　トリトンＸ−２００Ｂ界面活性剤０．０
１ｇ／ｍサーファクタントＩＯＣ ニー　　＋　　　　　　　０．００６／ｒｒｒポリ　（
エチレンテレフタレート） この要素を評価するため、ウシ及びヒト血清から、４１
ｍｇ／ｄ１〜８７６ＩＩＩｇ／ｄ１のコレステロール濃
度のコレステロール標準列を製造した。
要素にこれらの標準品のｌθμ！の小滴スボ・ントを落
とし、エクタヘム（ＥＫＴＡＣＩＩＥＭ）　ｂ＝床化学
分析装置を使用して標準操作を用いて５４０ｎｍで、３
７℃で反射濃度を読み取った。種々の濃度で得た反射濃
度（ＤＲ）を下記の第７表に示す。
以下余白 第Ｖ表 コレステロール濃度　　　　　Ｄ。
（ｍ　／ＣＩり　　　　　　　　５４０ｎｍ、　３７℃
４１．０　　　　　　　　０．５２２ ９３、　Ｏ０，７５６ １４４、００，９２６ １９８，０１，０６０ ２６８、０１，２０５ ３０８，３１，２８８ ３９２、０１，３８７ ４３８、０１，４５６ ４４１，８１，５２６ ５３３、０１，５８９ ６４９，０１，６９１ ８７６，０１，７７０ ■１ テオフィリンの渭 下記の構造及び成分を有する、テオフィリン測定用の分
析要素を製造した。
以下余白 ポリスチレンビーズ　　　　　　６５ｇ／＋ｄポリ　（
アクリル酸ｎ−ブチル− コースチレンーコー２−アク 拡散　　ジルアミド−２−メチルモ 層　　　パンスルホン酸ナトリウム塩）（７５：２０：
５重量比） 接着剤　　　　　　　　　　　　２ｇ／ｎ（ソ゛ニルＦ
ＳＮＳ　　主　　　　　　０．５／、ｄ中間　ゼラチン
（硬化）２ｇ／イ ゾニルＦＳＮ　　　’　　　　　　　　　０．２／ｒｒ
ｆゼラチン（硬化）　　　　　　　　　ｌ１ｇ／ｍグル
コース　　　　　　　　　　　２ｇ／ＩＴ？４′−ヒド
ロキシアセト 試薬　　アニリド　　　　　　　　　０．０２ｇ／ｒｒ
ｉ層　　ペルオキシダーゼ　　　　１．１００１．Ｕ、
／ｍドデシル硫酸ナトリウム　　　　　Ｉｇ／ｒ４４．
５−ビス（４−ジメチルアミノ フェニル）−２−（４−ヒドロ キシ−３，５−ジメトキシ フェニル）イミダゾール　　０．０２ｇ／ｍ−ｍ−りス
上ノーーーーーーーーーー立工ｍメボリ　（エチレンテ
レフタレート） テオフィリン−グルコースオキシダーゼ接合体を０．５
Ｘ１０−８モル−８Ｘ１０−８モルの範囲で変動する濃
度で含み、テオフィリンを含む（１０−３モル）溶液及
びテオフィリンを含まない溶液を製造した。これらの溶
液の試料（１０μβ）を前記要素の拡散層の一定領域上
に落とした。３７℃で２〜３分間静置した後、反射濃度
を変形標準反射計を用いて６７０ｎｍで各要素の一定領
域の中心で測定した。ウィリアムス−クラッパ−（Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換（Ｊ、０ｐｔｉｃ
ａｌ　Ｓｏｃ、Ａｍ、、４３巻、５９５頁、１９５３）
を使用して透過濃度値（ＤＴ　）を測定した。
下記の第■表に示す、得られた結果は、テオフィリンを
含む溶液と含まない溶液との間の変化率（Ｄ１／分）の
差を示す。これらのデータから、この溶液がテオフィリ
ンの測定に有用であることが判る。
ン農度　　　　　　　　テオフィリン （−４１」ニジＵ囚１度）　なし　　１ｏ−３ユ妃速度
−〇、５　　　　　　０．０２５　０．０１２　０．０
１３１．０　　　　　　０．０４５　０．０２０　０．
０２５２．０　　　　　　０．０８２　０．０４５　０
．０３７４．０　　　　　　０．１６２　０．０８０　
０．０８２８．０　　　　　　０．２２０　０．１５５
　０．０６５〔発明の効果〕 本発明は、ロイコ染料と組み合わせて使用する場合にペ
ルオキシダーゼ触媒によるロイコ染料の酸化反応の速度
を向上させる手段を提供する。この利点は、溶液分析又
は乾式分析においてペルオキシダーゼ及びロイコ染料と
共に一定のフェノール類又はアリエン類を使用すること
によって達成される。これらのフェノール類又はアリエ
ン類は、電子移動剤として作用しうる、すなわち、ベル
オキシダーゼの存在で過酸化水素と反応してロイコ色素
より酸化電位の高い中間化合物を生成しうるものでなけ
ればならない。本発明は、反応速度が極めて高いという
利点と共に、高い吸光度の色素を生成するロイコ染料の
使用により得られる利点を結合して有する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ペルオキシダーゼ又は免疫学的に反応性のリガンド
    のペルオキシダーゼ標識アナローグ、ペルオキシダーゼ
    及び過酸化水素の存在下に検出可能な色素を生成しうる
    ロイコ染料、並びにペルオキシダーゼの存在下に過酸化
    水素と反応してロイコ染料より高い酸化電位を有する中
    間化合物を生成しうるフェノール又はアニリン電子移動
    剤を含む分析用組成物。 ２、ペルオキシダーゼ又は免疫学的に反応性のリガンド
    のペルオキシダーゼ標識アナローグ、ペルオキシダーゼ
    及び過酸化水素の存在下に検出可能な色素を生成しうる
    ロイコ染料、並びにペルオキシダーゼの存在下に過酸化
    水素と反応してロイコ染料より高い酸化電位を有する中
    間化合物を生成しうるフェノール又はアニリン電子移動
    剤を含む分析要素。 ３、Ａ、被分析物を含むと思われる液体試料をペルオキ
    シダーゼ又は免疫学的に反応性のリガンドのペルオキシ
    ダーゼ標識アナローグ、ペルオキシダーゼ及び過酸化水
    素の存在下に検出可能な色素を生成しうるロイコ染料、
    並びにペルオキシダーゼの存在で過酸化水素と反応して
    ロイコ染料より高い酸化電位を有する中間化合物を生成
    しうるフェノール又はアニリン電子移動剤を含む分析用
    組成物と接触させ、そして Ｂ、被分析物の存在の結果として検出可能な色素を測定
    する 工程を含む被分析物の測定方法。
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