JPS6329248A - 固相分離による診断免疫試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は生化学的液体中の大小蛋白質およびアナラ−ｆ
　トの固相分離測定用診断免疫試験法に関する。本発明
方法は特に自動化されたシステムで用いるに適する。

背景技術 多くの診断免疫試験はアナライト又は蛋白質とある追跡
できる置換基をもつ％定抗体との間にある特異的結合特
性を一般に使用する。この方法に伴なう従来からの問題
はアナライト濃度が正確に測定できる方法でアナライト
濃度が試験される生化学的液体からどの様な方法で過剰
の抗体を除去するかである。

過剰抗体除去の種々の試みがあるが、米国特許第４，２
９８．６８２号は特定抗体に対し増感されたポリアクリ
ルアミドゲルより成る固相上への未反応抗体の吸収を発
表してぃ米国特許第４．５５１，４２６号はジゴキシン
の免疫試験で過剰抗体を除去する他の方法を発表してい
る。この場合過剰の標識された抗体はそれを固相クロマ
トグラフマトリックス上に固定化されたジゴキシン同涙
体であるウーアバイン（ｏｕａｂａｉ％）をもつアフィ
ニティカラムにとおして除去される。過剰の抗体はウー
アバインに吸収される。次いでクロマトグラフ浴離液の
標識きれた抗体−アナライト錯体につ（・て検べる。

上記方法は効果あるが、それらはすべて操作、取扱い法
ｉ、ｉよひｈＶ度について改良を要する。不発ゆ］の方
法は上記方法よりも改良さ１１ておりまた搗に促米法に
ない様な自動分析に適している。

発明の概要 本発明は診断免疫試験実施方法に関する。この方法はｔ
ｃＬｌ試験試料中にあるアナライトの錯体をつくるため
モル過剰の標識された抗体と試験試料の反応混合物をつ
くり、（ｂ１反応混合物を工程＋ａ＋において使用した
過剰のＷされた抗体と錯体をつくるに十分な量の化合物
を固定化している固相物質と接触させ、（ｃ）固相物質
および固相物質錯体を沈降させて固相および液相としか
つ（ｗ液相中にある錯体量を測定する工程より成るので
ある。

一般に固相物質は重力によって急速に沈澱するに十分な
密度をもつものである。固相物質は水中個当り約５秒乃
至約２分の沈降速ををもち直径約５乃至約３００ミクロ
ンであるものが好ましい。固相物質は褌々の物質、好１
しくはアガローズ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド
、それらの誘導体又は混合物から生成できる。

固相物質はそれに対応する抗原又は化学的同族体の様な
過剰な標識された抗体を結合できる化合物を固定化して
も５一 つている。一般に標識された抗体は酵素標識された抗体
である。

本発明は特に遠心濾過又はカラム濾過が不可能な又は実
用的でない自動診断装置に用いるに適している。

本発明は特定アナライトの同定に使われた過剰な標識さ
れた化合物をアナライト測定のため容易に除去できる方
法を提供するものである。下記する方法は古くからの精
製又は除去方法、例えば濾過、遠心分離又は濾過カラム
が適合しなｌ−鳴動方式に使用するに特に適している。

更に本発明の方法は螢九偏光免役試験法に基づく血清又
は血漿中の治療楽濃度足量用の７ポツトラボラトリ一ズ
製診断免疫試験Ｍ 装置ＴＤｚ　　　と共に使用するとよ（・。

一般にこの方法は知られたアノライト又は蛋白質を含む
と思われる生化学的液体と定量しようとする特定のアナ
ライト、蛋白質又は物質と錯体をつくりうる標識された
物質、抗体との反応混合物の製造より成る。標識された
物質は定量しようとする物質の推定量よりもモル過剰量
を反応混合物に加えて完全錯体を確実にする。

適当時間培養後、即ち標識はれた物質を定量しようとす
る物質すべてと錯化させるに十分な時間後錯体を測定す
る。

しかしモル過剰の標識された物質を使用するので、生成
錯体量測定前にこの過剰分を除去する必要がある。

本発明の方法は標識された物質と錯化しうる化合物を表
面に固定してもっている固相物質の添加による過剰の標
識された物質除去に特徴がある。固相物質は反応混合物
中に容易に分散し沈澱する様な物理特性をもつものであ
る。したかって固相物質の密度と大きさは撹拌によって
迅速に分散し重力によって沈澱する様な程度である。

固相物質は水よりも大きい密度をもつ粒子又はマドＩＪ
ツクスとして人っている。固相物質は水中σ当り約５秒
から約２分、好１しくは約２０秒から約１．５分の沈降
速さをもつ。固相物質の粒子大ぎさは直径約５乃至約３
００ミクロン、好１しくは約４０乃至約１２０ミクロン
でよい。この沈降速さと粒子大ぎさは固相物質が本発明
の反応混合物の反応容器に何のエネルギー又は運動も外
から与えずに分散し沈澱させるに重要である。これは自
動診断装置使用の際特に重要である。

固相物質は多くの天然材料又は合成材料から製造できる
。

好ましい固相物質はアカローズ、ポリスチレン、ポリア
クリルアミド、それらの誘導体又は混合物から製造され
る。

一般に同相は粒状構造としである。固相物質は反応容器
に乾燥粉末、湿潤スラリ、錠剤又はカプセルとして入れ
られる。

標識された物質を錯化できる化合物が固相物質上に固定
される。一般にこれは同定される物質に対する補充物質
である。例にはアナライト又はその同族体がある。生成
した錯体は固相物質に不可逆的に結合しその物理的特性
のため重力によって沈澱する。したがつズ全反応混合物
は過剰の標識された物質と錯化した固相物質を含む固相
と定量しようとする標識された物質に錯化した物質を含
む液相に分離される。

次いで液相は定量しようとする物質、即ちアナライト又
は蛋白質の量について測定される。一般にこれは液相を
注射器、吸出器などでとり出して行なわれる。次いで用
いた特定の標識と一致する標識された物質の量の測定に
適当な免疫試験方式が使われる。

代表的な標識化手段には酵素、放射同位元素、発色団、
螢光団又は検出可能洒号発生物質の単独又は他試薬との
混合物がある。標識化手段と標識された錯体の同市方法
は一般にり、？づルズとＣ，ハルスのＬａｂａｌａｄ　
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ２１’Ｊ、１８７−１８９（１９
６８）と米国特許第３，６５４．０９　ｏ号に記載のと
おり診断免疫試験分野でよく知られて（・る。

本発明の方法は測定される錯体の比較的自動的な精製の
ため自動診断免疫試験装置に特に便利である。特にこの
免疫試験法は分析される生化学的液体を十分な標識され
た物質と混合した後この反応混合物を本発明の内相物質
を含む容器に入れ又は初めの反応混合物に上記固相物質
を加えることにより追加の物理的又は化学的処理工程の
必要なく上記固相物質が過剰な標識された物質をもつ反
応混合物を精λすることができるのである。かくて本発
明の方法により遠心分離、カラムからの溶離液製造又は
最終測定用標識きれた物質をえるための他の複雑な工程
が不要となるのであ実施例Ｉ 試料液体中の大小両方のアナライトの測定法である。試
験方式は試料な定鎗的に迅速に結合してアナライト−酵
素−標識された抗体錯体を生成する様に過剰の酵素標識
された抗体を試料と共に予培養することより成る。この
混合物の一部を溶液中に容易に懸濁ししかも重力によっ
て、急速沈澱するに十分な密度特性をもつ重合休校に共
有結合的に結合したアナライトより成る面相物質の人っ
ている容器に移した。固相物質は直ちに過剰の非共役結
合酵素標識された抗体と結合し沈澱した。反応し沈＃後
アナライトー酵累標識された抗体を宮む試料を螢光発生
基質を使う酵素装置用キュベツトに移した。試料のアナ
ライト濃度に比例した偏分かえられた。

実施例■ ａ）　ｒｇ素標鐵された抗体調製法 兎の抗−ジゴキシンＦ（ａｂ′）、に共役したβ−ガラ
クトシダーゼの酵素標識された抗体をつくった。兎のジ
ゴキシンに対する抗血清をアガローズー牛血清アルブミ
ンーウーアパイン上に（Ａ’Ｈａ　）２　Ｓ　Ｏ４とア
フィニティクロマトグラフ法によって分別した。えられ
たジゴキシン特異性抗体はペプシンと反応はせてＦ（ａ
ｂ’　）ｔ（抗体フラグメント）とした。

これをキタガワとアイカワのＪ、Ｅｉｏｏｈｍｍ、７９
　：　２３３（１９７６）に発表の方法によりＥ−コリ
ーβ−ｊラクトシダーゼとカップルはせた。Ｆ（ａｂ）
２−β−ガラクトシダーゼはカラムクロマトグラフ法に
よシ分離した。

ｂ）固相物質の調製法 ＰＮＡＳ５７：　７１（１９６７）に発表のとおり牛血
清アルブミン−ジゴキシンを製造した。生成物をｏＩＭ
へペス緩衝ｇ（ＰＨ７，５）Ｋ対し透析し′ｍ縮して５
ダ／ゴ溶液をえた。この液の８１部分を平均直径３ｏｏ
ミクロン（Ｂ４°０−Ｒａｄ　　ラボラトリーズ社から
ＢｉＯ−Ｒａｄ　Ａｆｆｉ−Ｇａ１１５として市販）を
もつアガローズ小粒１５ｍ／を加えた。えたアガローズ
ー牛血清アルブミンージゴキシン粒を４モルグアニジン
−塩酸とりん酸塩緩衝塩溶液で洗った。

ジゴキシンｄ当、ｅ）１．０．２．０．３．（ｌよ？Ｊ
５．０す、／！クラム含む血清溶液を下記試験書にした
がって各々試験した。

ジゴキシンと固相物質を加えない対照試験も行なった。

上記（８１調製法とおシ酵素標識された抗体１μｔを血
清試料０．０５１１１に混合した。反応混合物を３４℃
で１ｏ分間培養した後２０μを試料を上記（ｃ）で製造
した固相？２１質（２ｏ：１比）と０．１　Ｍりん酸塩
緩衝Ｅｌ（ｐＨ７，４）＋７）溶液１００μｔに加えた
。混合物を撹拌しながら３４℃で３０分培養した。

混合物をしばらくお（・た後液相と固相に分離した。生
成フルオレセインの足置により上澄液のβ−カラクトシ
ダーゼ活性を６１１１足した。測定は基質として１０ミ
クロモル　ジー（β−Ｄ−カラクトシル）フルオレセイ
ン溶液およびＱ、　Ｉ　Ｍりん酸ナトリウム、牛ガンマ
グロブリンおよび０１チアジ化ナトリウムを含む試験緩
衝液を用いｐＨ７−４にお（・て行なった。

測定は次のとおりであった： 対照（固相物質なし）　　　　　　０．０　　　　　１
３７０１　　　　　　　　　　０、　Ｏ９５ ２１，０１１０ ３２，０１２５ ４３，０１７０ ５５，０２４５ えた結果は本発明方法使用によってジゴキシン濃度の未
知な血清溶液を分析する標準曲線が作成でさることを示
している。１だ対照と比較したとぎゼロ濃度測定値はこ
の方法により過剰の抗体錯体が有効に除去できたことを
示して（・る。

実施例■ α）　ＦＣαｂｌ）−ガラクトシダーゼコンジュゲート
の調製特異的ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈａｒｐ　）抗
体なｈｃｇ−免疫吸着剤を用い抗−ｈｃｇ兎血清の連続
鎖酸アンモニウム沈澱法によって製造された兎抗体（Ｉ
ｇＧ）から免疫精製した。

Ｂ１０−Ｒａｄ文献に記載の普通の方法でＡｆｆｉ−Ｇ
ａ　Ｊ　＠１５上にｈｅσを固定してｈｃｇ−免疫吸着
剤をつくった。

免疫精製のため予め４．０ＭグアニジンＨＣ１，１，（
ＬＭ酢酸およびトリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）で洗ってお
いたｈｅｇ−Ａｆｆｉ−Ｇａｌ　　１５カラムにＩｇＧ
をつめた。このカラムを広（ＴＢＳで洗い０．１Ａｆ昨
酸で溶離した。溶離液かもえられた精製ｈａｇ特殊抗体
を０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム（ｐＨ４，５）に対して
透析した。

ｈｃｇ特異性抗体のフラグメン）　ＣＦＣＧｂ’　）２
３は上記抗体をペプシンで消化した後その混合物からカ
ラムクロマトグラフ法によりＦ（ａｂ′）、フラグメン
トを分離して製造した。

Ｆ（ａｂ′）、−ガラクトシダーゼ錯体製造のためＦ（
ａｂ′）。

片をｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル（ＭＢＦ：）と反応させた。えたＭＢＳ誘
導誘導金片ラムクロマトグラフ法で精製した後予めカラ
ムクロマトグラフ法で精製しておいたＥ、コリβ−カラ
クトシダーゼと反応させた。えたＦ　（ａ　ｂ’　）！
−ガラクトシダーゼ錯体を未反応のガラクトシダーゼと
未反応のＦ（ａｈ’）２かもサイズ除外クロマトグラフ
法によって分離した。

ｂ）　　ｈｃｇ固相固相試合成法 ｈ・、をトリスアクリ〜＠ＧＦ−２０００ＬＳに力・ブ
ー畑せてんｃｇ−固相試薬をつくった。

トリスアクリルはメリーランド州ゲイタースブルグＬＫ
Ｅ社発売の多孔質球状ポリアクリルアミド固相マトリッ
クスである。んｃｇとカップルさせる前トリスアクリル
を水、エタノール、アセトンおよびジメチルホルマミド
（ＤＭＦ）と洗って活性化した後トリスアクリルをカル
ボニルジイミジゾール（ＣＤＩ）とＤＭＦ中で反応はせ
た。活性化トリスアクリルをｐＨＩ　Ｑ、　２緩衝水液
中でｈａｇと結合反応させた。カップリング後１．０Ｍ
醋酸と中性ｐｌｉ緩衝液で洗って未反応ｈａｇをトリス
アクリルから除去した。

Ｃ）血清ｈＣｇ量分仇法 既知量のｈＣｇを含む血清溶液を用いて次の方法で標準
曲線を作成した：上記（ａ）により合成したＦ（ａｈ’
）、−ガラクトシダーゼで２５　ｐｔを試料１００　ｐ
Ｌと’Ｉ’Ｄｚ緩衝液５Ｏ−１７＝ ｐｔに加えた。反応混合物を２分２０秒間３４℃で培養
した恢反応混合物５０μｔをＴＤｚ緩衝液６０μｔと共
に上記ｔｂｌで合成したｈｃｇ　−トリスアクリル５０
μｔおよびＴＤ　ｚ緩衝液１０μｔより成るスラリに加
えた。混合物を撹拌しつつ３４℃で１０分間培養した。

混合物をしばらく放宜した後液相と固相に分離した。生
成フルオレセインを足置（−て上澄液のガラクトシダー
ゼ活性を測定した。基質としてシ（β−Ｄ−ガラクトシ
ル）フルオレジインの１０ミクロモル溶液および０．１
　Ｍりん酸ナトリウム牛ガンマグロブリンおよび０１％
アジ化す）　ＩＪウムを含む試験緩衝液を便ってｐＨ７
，４で測定した。

表１は檀々のんｃｇ−）リスアクリル試料からえた感度
を示している。結果はえた感度が４５４−５０１Ｕ／ｒ
ｎｌ範囲のトリスアクリル化カップルしたｈＣｇ量に精
密には依らないことを示している。

図１は標準法（アボットβ−ＨＣＧ　１５／１５　）と
本発明の方法を用いｈｃｇ含量を測定した５０臨床試料
（Ｎ−５０）の結果を示している。図１に示した結果の
分析から相関係数Ｒ−０，９２と傾斜０．８６かえられ
た。この結果は本発明の方法がｈｃｇの血清量の正確測
足法であることを示している。

表　　１ Ａ　　　４５４　　１０．０ Ｂ１５１　　　１０．Ｏ Ｃ５０１２，５ Ｄ　　　１７　　２５．０

【図面の簡単な説明】

図１は本発明方法によってえたデータと標準法（アボッ
トβ−ｈＣＧ　１５／１５　）の相関曲線である。 特許出願人　　アボット　ラボラトリーズ゛）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）試験試料および上記試験試料中に存在するア
   ナライトと錯体をつくりうる標識された抗体のモル過剰
   量との反応混合物をつくり、 （ｂ）上記反応混合物を上記過剰の標識された抗体と錯
   化しうる量の化合物を固定化してなる固相物質と接触さ
   せ、（ｃ）上記固相物質とその錯体を沈澱させて固相と
   液相を生成し、かつ （ｄ）上記液相中に存在する錯体の量を測定する工程よ
   り成ることを特徴とする診断免疫試験方法。 ２、上記固相物質が重力によつて急速に沈降するに十分
   な密度をもつ特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、上記固相物質が水中においてセンチメートル当り約
   ５秒から約２分までの沈降速さをもつ特許請求の範囲第
   ２項に記載の方法。 ４、上記固相物質が約５乃至約３００ミクロンの直径を
   もつ特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、上記固相物質が重合体ビーズ又は重合体マトリック
   スより成る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、上記固相物質がアガローズ、ポリスチレン、ポリア
   クリルアミド、それらの誘導体又は混合物より成る特許
   請求の範囲第６項に記載の方法。 ７、上記標識された抗体が酵素で標識された抗体である
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、上記固相上に固定され過剰の標識された抗体と錯化
   しうる上記化合物が対応する抗原又はその化学的同族体
   である特許請求の範囲第１項に記載の方法。