JPS63298051A - 酵素電極の製造方法 - Google Patents
酵素電極の製造方法Info
- Publication number
- JPS63298051A JPS63298051A JP62133212A JP13321287A JPS63298051A JP S63298051 A JPS63298051 A JP S63298051A JP 62133212 A JP62133212 A JP 62133212A JP 13321287 A JP13321287 A JP 13321287A JP S63298051 A JPS63298051 A JP S63298051A
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、固定化酵素電極（以下酵素電極と略す）の製
造方法に関し、特に酵素が強固に固定された酵素電極の
製造方法に関する。
造方法に関し、特に酵素が強固に固定された酵素電極の
製造方法に関する。
（従来の技術）
酵素反応を生体物質や食品等に含まれる目的物質の定量
に用いることは、その反応速度の速さ及び基質特異性を
有する等の利点から広く行われている。特に酵素電極を
用いた目的物質の濃度測定法は、微量の酵素を反覆利用
する可能性を開き、その応用範囲を医療、食品、薬品分
析等に広げつつある。このような応用分野の拡大に伴い
、長期間安定して測定が行える酵素電極への要求が高ま
っている。
に用いることは、その反応速度の速さ及び基質特異性を
有する等の利点から広く行われている。特に酵素電極を
用いた目的物質の濃度測定法は、微量の酵素を反覆利用
する可能性を開き、その応用範囲を医療、食品、薬品分
析等に広げつつある。このような応用分野の拡大に伴い
、長期間安定して測定が行える酵素電極への要求が高ま
っている。
現在実用化されている酵素電極には、酸素選択透過膜も
しくは過酸化水素選択透過膜上に酵素を共有結合固定、
あるいは包括固定等により固定化した酸素電極や過酸化
水素電極がある。これらの酵素電極は円筒状の絶縁体の
中に作用掻と対極を組み込んだもので、構造上小型化し
難い欠点がある。また、酵素自体の変性により酵素電極
の感度が低下した場合は、酵素を固定化した選択透過膜
を取換える必要があり、新しい酵素を固定化した選択透
過膜を傷つけてしまう危険性がある。
しくは過酸化水素選択透過膜上に酵素を共有結合固定、
あるいは包括固定等により固定化した酸素電極や過酸化
水素電極がある。これらの酵素電極は円筒状の絶縁体の
中に作用掻と対極を組み込んだもので、構造上小型化し
難い欠点がある。また、酵素自体の変性により酵素電極
の感度が低下した場合は、酵素を固定化した選択透過膜
を取換える必要があり、新しい酵素を固定化した選択透
過膜を傷つけてしまう危険性がある。
これらの欠点を解決するため、近年白金基体上に直接酵
素を固定化する方法が検討されており、セラミック等の
絶縁体上に白金を蒸着することによりミクロな白金基体
を形成し、これに直接酵素を固定して酵素電極を製造す
る試みも行われている。基体上に直接酵素を固定する製
造方決は、例えば （ｉ）白金基体上にアミノ基を有するシランカップリン
グ剤を結合させ、 （ｉｉ）該アミノ基にグルタルアルデヒド等の多官能基
性アルデヒドを結合させ、 （ｉｉｉ ）更に酵素を固定する、 各段階よりなる（特開昭６１−１８７７９２号、特開昭
６２−５１６９号）。しかし、この方法では基体とシラ
ンカップリング剤の結合点が少な（酵素層の強度が不充
分で、長期間の使用に耐えないものしか得られない。
素を固定化する方法が検討されており、セラミック等の
絶縁体上に白金を蒸着することによりミクロな白金基体
を形成し、これに直接酵素を固定して酵素電極を製造す
る試みも行われている。基体上に直接酵素を固定する製
造方決は、例えば （ｉ）白金基体上にアミノ基を有するシランカップリン
グ剤を結合させ、 （ｉｉ）該アミノ基にグルタルアルデヒド等の多官能基
性アルデヒドを結合させ、 （ｉｉｉ ）更に酵素を固定する、 各段階よりなる（特開昭６１−１８７７９２号、特開昭
６２−５１６９号）。しかし、この方法では基体とシラ
ンカップリング剤の結合点が少な（酵素層の強度が不充
分で、長期間の使用に耐えないものしか得られない。
（発明が解決しようとする問題点）
かかる現状に鑑み本発明者等は、酵素が強固に固定され
、長期間にわたり安定した測定が行える酵素電極の製造
方法に関し、鋭意研究の結果、基体を特定電圧で前電解
処理した後に、シランカップリング剤処理を行うと、こ
のような目的が達成されることを見出し、本発明を完成
するに至った。
、長期間にわたり安定した測定が行える酵素電極の製造
方法に関し、鋭意研究の結果、基体を特定電圧で前電解
処理した後に、シランカップリング剤処理を行うと、こ
のような目的が達成されることを見出し、本発明を完成
するに至った。
（問題を解決するための手段）
本発明は、表面をシランカップリング剤で処理した白金
基体に酵素を固定化する酵素電極の製造方法において、
シランカップリング剤処理前の該基体に、対銀・塩化銀
電極＋１．０〜＋１．５Ｖの電位で３０秒以上前電解処
理を行うことを特徴とする酵素電極の製造方法である。
基体に酵素を固定化する酵素電極の製造方法において、
シランカップリング剤処理前の該基体に、対銀・塩化銀
電極＋１．０〜＋１．５Ｖの電位で３０秒以上前電解処
理を行うことを特徴とする酵素電極の製造方法である。
（作用）
第１図に従って本発明を説明する。先づ白金等の基体（
１）の表面をエメリー紙、アルミナパウダー等で研磨し
、更に超音波洗浄して付着物を除去する。
１）の表面をエメリー紙、アルミナパウダー等で研磨し
、更に超音波洗浄して付着物を除去する。
本発明では、こうして得られた清浄化した基体（１）を
特定の電位で前電解処理することに大きな特徴がある。
特定の電位で前電解処理することに大きな特徴がある。
即ち、０．０５〜０，５Ｍ程度の希硫酸中で、対銀・塩
化銀電極＋１．０〜＋１．５Ｖ、より好ましくは＋１．
２〜＋１．４Ｖで、３０秒以上保つことにより、基体上
に酸化被膜（２） （Ｐ ｔ ｏｘ ）を再現性良く一
定量形成することが出来る（第１ａ図）。
化銀電極＋１．０〜＋１．５Ｖ、より好ましくは＋１．
２〜＋１．４Ｖで、３０秒以上保つことにより、基体上
に酸化被膜（２） （Ｐ ｔ ｏｘ ）を再現性良く一
定量形成することが出来る（第１ａ図）。
処理時間が３０秒未満では充分に酸化被膜が形成されな
いため３０秒以上、より好ましくは５分以上処理を行う
。ただし、２時間以上処理すると感度の低下が認められ
る。
いため３０秒以上、より好ましくは５分以上処理を行う
。ただし、２時間以上処理すると感度の低下が認められ
る。
このような前電解処理を行った基体につき、０゜１Ｍ硫
酸中で＋０．９ｖからスウィーブ速度ｌ■／秒程度で負
電位方向にサイクリックポルタングラムを記録すると、
酸化被膜に由来する還元ピーク（３）が現れることによ
り基体上の被膜形成を確認することができる（第２ａ図
）、本発明の方法による被膜の還元ピークの大きさはほ
ぼ一定であり、再現性に優れている。因みに前電解処理
を行わない場合還元ピークは認められない（第２ｂ図）
。
酸中で＋０．９ｖからスウィーブ速度ｌ■／秒程度で負
電位方向にサイクリックポルタングラムを記録すると、
酸化被膜に由来する還元ピーク（３）が現れることによ
り基体上の被膜形成を確認することができる（第２ａ図
）、本発明の方法による被膜の還元ピークの大きさはほ
ぼ一定であり、再現性に優れている。因みに前電解処理
を行わない場合還元ピークは認められない（第２ｂ図）
。
ただし、前電解処理を対銀・塩化銀電極＋１．５Ｖを越
える領域で行うと、酸化被膜による還元ピークの大きさ
は大きくバラつき、複数の電極を製造する場合に各酵素
電極の出力値が一定にならないことが分かった。かかる
現象が起こる理由については必ずしも明らかではないが
、対銀・塩化銀電極＋１．５ｖを越える領域では、基体
表面で水の電気分解による発泡が起こり、その部分の酸
化を妨害するため有効酸化面積が変動するためと推測さ
れる。
える領域で行うと、酸化被膜による還元ピークの大きさ
は大きくバラつき、複数の電極を製造する場合に各酵素
電極の出力値が一定にならないことが分かった。かかる
現象が起こる理由については必ずしも明らかではないが
、対銀・塩化銀電極＋１．５ｖを越える領域では、基体
表面で水の電気分解による発泡が起こり、その部分の酸
化を妨害するため有効酸化面積が変動するためと推測さ
れる。
逆に＋１．０ Ｖ未満の電位で前電解処理すると基体の
酸化が充分起こらず、結果的に、酵素を強固に固定する
ことが出来ない。
酸化が充分起こらず、結果的に、酵素を強固に固定する
ことが出来ない。
次に、酸化被膜を有する基体をシランカップリング剤溶
液に浸漬してｒＰｔ−０−３ｉｊ結合を形成する（第１
ｂ図）。本発明で用いられるシランカップリング剤には
γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−アミノブ
チルジメチルメトキシシラン、４−アミノブチルトリエ
トギシシラン等がある。通常シランカップリング剤の無
水ベンゼン溶液に、酸化被膜を形成した基体を３０分程
浸漬処理後、洗浄する。
液に浸漬してｒＰｔ−０−３ｉｊ結合を形成する（第１
ｂ図）。本発明で用いられるシランカップリング剤には
γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−アミノブ
チルジメチルメトキシシラン、４−アミノブチルトリエ
トギシシラン等がある。通常シランカップリング剤の無
水ベンゼン溶液に、酸化被膜を形成した基体を３０分程
浸漬処理後、洗浄する。
更にグルタルアルデヒド等の架橋剤で処理しく第１ｃ図
）、水洗した後、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）等
の酵素水溶液に浸漬して固定化酵素電極を製造する（第
１ｄ図）。
）、水洗した後、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）等
の酵素水溶液に浸漬して固定化酵素電極を製造する（第
１ｄ図）。
このようにして得られたＣＯＤを固定化した酵素電極の
場合、酵素反応で発生した過酸化水素の酸化電流を測定
することによりグルコースの定量を行うことができる。
場合、酵素反応で発生した過酸化水素の酸化電流を測定
することによりグルコースの定量を行うことができる。
本発明では、基体を対銀・塩化銀電極＋１．０〜＋ １
．５ Ｖで前電解処理するため、一定量の水酸基を有す
る酸化被膜が再現性良く形成される。従って、一定量の
酵素を強固に固定できるので、長期間の測定が可能であ
り、各酵素電極の出力値のバラツキは極めて小さく、相
対標準偏差は±５％以下である。更に、このような前電
解処理を行わない酵素電極に比べて、本発明では感度に
優れた酵素電極が得られる。これは研磨処理、超音波処
理等では取り除けない基体表面の吸着物が前電解処理に
より電気化学的に除去されるためと考えられる。
．５ Ｖで前電解処理するため、一定量の水酸基を有す
る酸化被膜が再現性良く形成される。従って、一定量の
酵素を強固に固定できるので、長期間の測定が可能であ
り、各酵素電極の出力値のバラツキは極めて小さく、相
対標準偏差は±５％以下である。更に、このような前電
解処理を行わない酵素電極に比べて、本発明では感度に
優れた酵素電極が得られる。これは研磨処理、超音波処
理等では取り除けない基体表面の吸着物が前電解処理に
より電気化学的に除去されるためと考えられる。
本発明は、酵素を白金基体に固定化する場合のみならず
、種々の蛋白質を強固に結合させる場合にも有効である
。さらに本発明者らが先に出願した特願昭６２−１４６
４８号のようにアルブミンを用いた選択透過膜を基体上
に固定する場合にも本発明を応用することが出来る。
、種々の蛋白質を強固に結合させる場合にも有効である
。さらに本発明者らが先に出願した特願昭６２−１４６
４８号のようにアルブミンを用いた選択透過膜を基体上
に固定する場合にも本発明を応用することが出来る。
以下に実施例を示し、より具体的に述べるが、勿論本発
明は、これらに限定されるものではない。
明は、これらに限定されるものではない。
夫夫１迂１
直径２ｍｍの白金線の末端をエメリー紙で研磨し、側面
を熱収縮テフロンで被覆して電極用基体とした。この白
金基体を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、Ａｇ／Ａｇ
’ＣＩ電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋１．４
Ｖで１０分間の前電解処理を行った。基体をよく水洗
した後、４０”Ｃで１０分間乾燥し、１０％γ−アミノ
プロピルトリエトキシシランの無水ベンゼン溶液に１０
分間浸漬後、洗浄した。この基体上に、ウシ血清アルブ
ミンとＣＯＤ （Ｓ ｉ ｇｍａ社製；ＴｙｐｅＩＩ）
を５ｍｇ／ｍｌづつ含む水溶液にグルタルアルデヒドを
０゜２％になるまで加えた水溶液５μｌを展開し、４０
℃で３０分間硬化処理を行った。
を熱収縮テフロンで被覆して電極用基体とした。この白
金基体を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、Ａｇ／Ａｇ
’ＣＩ電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋１．４
Ｖで１０分間の前電解処理を行った。基体をよく水洗
した後、４０”Ｃで１０分間乾燥し、１０％γ−アミノ
プロピルトリエトキシシランの無水ベンゼン溶液に１０
分間浸漬後、洗浄した。この基体上に、ウシ血清アルブ
ミンとＣＯＤ （Ｓ ｉ ｇｍａ社製；ＴｙｐｅＩＩ）
を５ｍｇ／ｍｌづつ含む水溶液にグルタルアルデヒドを
０゜２％になるまで加えた水溶液５μｌを展開し、４０
℃で３０分間硬化処理を行った。
このようにして作成した酵素電極を０．１ Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）で洗浄後、０．１ Ｍリン酸緩衝液
中で白金対極、銀・塩化銀参照極を有する３電極形式の
セルに設置した。酵素電極に＋〇、６ Ｖを印加し、ス
ターラーで緩衝液を攪拌しながら０゜１ ｍＭになるよ
うにグルコースを添加し、その平衡出力を記録した。次
に酵素電極を別のビーカー中の０．１ Ｍリン酸緩衝液
中に移し、６００Ｗの超音波洗浄器で１５分間処理した
後、同様の測定を行った。この一連の操作を別個に作成
した１０本の酵素電極について同様に行い、その出力値
の平均と相対標準偏差（±ＣＶ％）を超音波処理前後に
ついて計算し、第１表に記載した。
衝液（ＰＨ７，０）で洗浄後、０．１ Ｍリン酸緩衝液
中で白金対極、銀・塩化銀参照極を有する３電極形式の
セルに設置した。酵素電極に＋〇、６ Ｖを印加し、ス
ターラーで緩衝液を攪拌しながら０゜１ ｍＭになるよ
うにグルコースを添加し、その平衡出力を記録した。次
に酵素電極を別のビーカー中の０．１ Ｍリン酸緩衝液
中に移し、６００Ｗの超音波洗浄器で１５分間処理した
後、同様の測定を行った。この一連の操作を別個に作成
した１０本の酵素電極について同様に行い、その出力値
の平均と相対標準偏差（±ＣＶ％）を超音波処理前後に
ついて計算し、第１表に記載した。
本発明による酵素電極では超音波処理を行っても処理前
とほぼ同じ２２８ ｎＡの電流が検出され、酵素が強固
に固定されているため活性の低下が起こらないことが分
かった。出力値の相対標準偏差は±５％以下であり、各
酵素電極の品質のバラツキは極めて小さかった。
とほぼ同じ２２８ ｎＡの電流が検出され、酵素が強固
に固定されているため活性の低下が起こらないことが分
かった。出力値の相対標準偏差は±５％以下であり、各
酵素電極の品質のバラツキは極めて小さかった。
比較例１
前電解処理の電位を＋１．９■とした以外は実施例１と
同様に試験を行った。超音波処理による活性低下は認め
られないが、出力値の相対標準偏差は±２１％に達し、
各酵素電極の品質のバラツキが大きかった。
同様に試験を行った。超音波処理による活性低下は認め
られないが、出力値の相対標準偏差は±２１％に達し、
各酵素電極の品質のバラツキが大きかった。
比較例２
前電解処理を行わない以外は実施例１と同様に試験を行
った。実施例１の出力値平均２３０ｎＡに比べて２０％
程度低い１８０ｎＡであった。また超音波処理後の出力
値は２０ｎＡであり、酵素が充分に固定されていないた
め著しい出力値の低下が認められた。
った。実施例１の出力値平均２３０ｎＡに比べて２０％
程度低い１８０ｎＡであった。また超音波処理後の出力
値は２０ｎＡであり、酵素が充分に固定されていないた
め著しい出力値の低下が認められた。
第１表
（効果）
このように、本発明は各酵素電極の出力値のバラツキが
小さく、酵素が強固に固定されているため長期間にわた
り安定して正確な測定値が得られ、しかも高感度な酵素
電極の製造方法であった。
小さく、酵素が強固に固定されているため長期間にわた
り安定して正確な測定値が得られ、しかも高感度な酵素
電極の製造方法であった。
第１図は本発明の各製造工程を例示した説明図である。
第１ａ図は、酸化被膜形成後の基体を表し、第１ｂ図は
シランカップリング剤（γ−アミノプロピルトリエトキ
シシラン）処ＩＩ、第１Ｃ図は架橋剤（グルタルアルデ
ヒド）処理後、第１ｄ図は酵素（ＣＯＤ）固定後の電極
を表す。 第２ａ図は本発明方法で酸化被膜を形成した基体のサイ
クリックポルタングラムを表す。酸化被膜に由来する還
元ピークが認められる。 第２ｂ図は前電解処理を行わない基体のサイクリックポ
ルタングラムを表す。還元ピークは認められない。 （１１・・・基体 （２）・・・酸化被膜 （３）・・・還元ピーク
シランカップリング剤（γ−アミノプロピルトリエトキ
シシラン）処ＩＩ、第１Ｃ図は架橋剤（グルタルアルデ
ヒド）処理後、第１ｄ図は酵素（ＣＯＤ）固定後の電極
を表す。 第２ａ図は本発明方法で酸化被膜を形成した基体のサイ
クリックポルタングラムを表す。酸化被膜に由来する還
元ピークが認められる。 第２ｂ図は前電解処理を行わない基体のサイクリックポ
ルタングラムを表す。還元ピークは認められない。 （１１・・・基体 （２）・・・酸化被膜 （３）・・・還元ピーク
Claims (1)
- 表面をシランカップリング剤で処理した白金基体に酵素
を固定化する酵素電極の製造方法において、シランカッ
プリング剤処理前の該基体に、対銀・塩化銀電極＋１．
０〜＋１．５Ｖの電位で３０秒以上前電解処理を行うこ
とを特徴とする酵素電極の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62133212A JPS63298051A (ja) | 1987-05-28 | 1987-05-28 | 酵素電極の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62133212A JPS63298051A (ja) | 1987-05-28 | 1987-05-28 | 酵素電極の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63298051A true JPS63298051A (ja) | 1988-12-05 |
| JPH0545910B2 JPH0545910B2 (ja) | 1993-07-12 |
Family
ID=15099348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62133212A Granted JPS63298051A (ja) | 1987-05-28 | 1987-05-28 | 酵素電極の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63298051A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0238854A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-02-08 | Kokuritsu Shintai Shiyougaishiya Rihabiriteeshiyon Center Souchiyou | 生体機能物質固定化電極、それを用いた分析装置及び分析方法 |
| JP2015510584A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-04-09 | カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ | ナノ構造の酸化銀膜使用の水性ボルタンメトリー農薬センサおよびそのセンサの製造方法 |
-
1987
- 1987-05-28 JP JP62133212A patent/JPS63298051A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0238854A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-02-08 | Kokuritsu Shintai Shiyougaishiya Rihabiriteeshiyon Center Souchiyou | 生体機能物質固定化電極、それを用いた分析装置及び分析方法 |
| JP2015510584A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-04-09 | カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ | ナノ構造の酸化銀膜使用の水性ボルタンメトリー農薬センサおよびそのセンサの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0545910B2 (ja) | 1993-07-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |