JPS63301829A - 合成ノナペプチドの補助薬としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は１つかそれ以上のアミン基からなり、低免疫原
性の抗原に対する抗体反応を生体内において増強できる
塩に転化された合成ペプチドの薬学上許容できる溶媒溶
液からなる製剤を治療補助薬として使用することに関す
る。

［従来例］ 抗原は、生体の免疫系に接触すると、抗体を排除して、
以前の平衡を回復しようとする細胞相互作用の複雑なメ
カニズムを活性化する、生体に対しては異物である物質
として定義されている。

抗原の特徴は、抗原に選択的に結合して（抗原性）、こ
れを不活性化できる特定抗体（免疫原性）の産生を誘導
できる点にある。

生体の感染に対する最高の防御メカニズムである免疫反
応は、抗原をワクチンにより投与することによって慎重
に刺激することができる。

ところが、一部の抗原は免疫原性が低く、その生体内反
応への刺激は生体に有効な免疫を与えるには不十分であ
る。

よく知られているように、免疫系に与えられる抗原を高
濃度にできる、死菌や免疫上不活性な物質などの補助薬
と併用して投与するならば、抗原の免疫原性を増強でき
る。

最もよく使用されている物質の一つはフロイント補助液
、即ち死菌と混合した鉱油及び水のエマルジョンである
。

エマルジョンに抗原を導入して、沈着物を生成し、これ
から抗原を徐々に放出すると同時に、死菌により特定の
免疫反応機能をもつ細胞を沈着物の方に吸引する。

現在量も効力のある補助薬のひとつが市販されているが
、これには欠点がある。例えば、激しい苦痛を与えたり
、時には被注射部位に膿ようが生じる。

フロイント補助液の代替物として使用されている明ばん
又は水酸化アルミニウムもまた幾つかの点において、特
に合成抗原や非胸腺依存抗原に対して効力かない点から
みて、満足のいくものではない。細菌由来や化学的由来
の補助薬が今まで数多く提案されているか、いずれも効
力が低く、副作用がある。

実例は胸腺依存抗原のみに作用するマイクバクテリア（
Ｅｉｓｅｎ　Ｉｌ、　Ｎ、　１９７３＾ｎｔｉｂｏｄｙ
ＦｏｒｎａＬｉｏｎ、　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ、２ｎｄ　　ｅｄｉｔｉｏｎ。

ｐ、４８１；　　ｋシｄｉｔ、　　１ｌａｒｐｅｒ　　
ａｎｄ　　Ｒｏｗ　　ＩｌａｇｃｒｓＬｏｗｎ）　、及
び単核細胞マクロファーゼラインの細胞から産生ずる物
質であるヒトの１−インターロイシン（ＩＬ−１）であ
る。

事実、ＩＬ−１は各種由来の感染に対する反応における
ホストの防御に参加すると考えられ（Ｄｉｎａｒｅｌｌ
ｏ、　Ｃ０＾、　Ｒｅｖ、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ
。

６、５１．１９８４）、そして細菌由来の誘導剤を使用
することによってその産生に刺激を与えることができる
（Ｍｉｚｅｌ、Ｓ、Ｈ，ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏ
ｇｙ。

９．８２）。

マウスに注射すると、インターロイシン−１は血清レヴ
エルで蛋白質抗原に対する２次反応を増強することもで
きる（Ｓｔａｒｕｃｈ、Ｍ、Ｊ。

及びｆｏｏｄ、　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、　１３０．２
１９１　（１９８３））。

しかし、ＩＬ−１は免疫反応を増強するほかに、鋭敏相
に熱、プロスタグランジンＥ。

や蛋白質を誘導したり、好中球を活性化するなどの非免
疫性活性を併せもち、これがヒトのワクチンの補助薬と
して使用することを制限している。

従って、望ましくない副作用を誘導せずに、免疫原性の
低い、胸腺依存抗原及び非胸腺依存抗原に対する抗体反
応を刺激することができる補助薬が望まれている。

［発明が解決しようとする課題」 今回、本発明のベプチドイこよれば、この必要条件を満
足できることが見いだされた。

即ち、本発明の目的は、１つかそれ以上のアミン基から
なり、低免疫原性の胸腺依存抗原及び非胸腺依存抗原に
対する１次及び２次反応を生体内において増強できる塩
に転化した合成ペプチドの薬学上許容できる溶媒からな
る、殺菌溶液製剤を助薬として使用することにある。

本発明の別な目的は、該製剤を治療に適用することにあ
る。

上記以外の本発明の目的は、以下の説明及び実施例から
明らかになるはずである。

〔課題を解決するための手段及び作用］より詳しくいえ
ば、本発明のペプチドはひとつかそれ以上のアミノ基か
らなり、ヒトのインターロイシン！−βのフラグメント
１６３−１７１に対応する次のアミノ酸配列を有する塩
に転化した合成ナノペプチドである。

Ｖａ　１−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−（１＋Ｉｕ−Ｇｌｕ−３ｅ
ｒ−Ａｓｎ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｘ（式中、Ｖａ　１＝Ｌ
−バリン、 Ｇ１ｎ＝Ｌ−グルタミン、 Ｇｌｖ＝グルプシン、 ＧＩｕ＝Ｌ−グルタミン酸、 ５ｅｒ−Ｌ−セリン、 Ａｓｎ＝Ｌ−アスパラギン、 Ａｓｐ＝Ｌ−アスパラギン酸、 Ｌｙｓ＝Ｌ−リシン、そして Ｘ＝ＯＨである。） より特定すれば、本発明のペプチドは配列（１）を有す
るナノペプチドのハイドロクロライド又はトリフルオロ
アセテートである。

以下ペプチド１６３−１７１．８ＣＮ及びベビーｙ−ト
ｘ　６３−１７１．　′ｒＦＡと呼フコれらベピチドは
一般に知られている方法の一つによって合成できる。

特に、ペプチドｌ　６３−１７１．ＴＦＡはイタリア特
許出願第１９３３８　　Ａ／８６号明細書に記載されて
いる方法によって調製する。本発明によれば、ペプチド
１６３−１７１のハイドロクロライドはトリフルオロア
セ−テートペプチドを水に溶解し、次に生成した溶液を
ＣＱ−の形でアンバーライトのカラムに接種することに
よって調製する。次に、このカラムを水で溶離し、／８
＃Ｉ液を凍結乾燥する。この方法によると、９０％の収
率でペプチド１６３−１７１．ＨＣ＆が得られ、ｃｉｘ
−イオン感受性電極を使用して測定したところ、ペプチ
ド１モルに対する塩素含量は約２モルである。

生体内で検定したところ、これらペプチドは塩の形で、
インターロイシン１に特徴的な望ましくない副作用を誘
導せずに、低免疫原性の胸腺依存抗原及び非胸腺依存抗
原に対する１次及び２次抗体反応を増強できる。抗体−
蛋白質又は多糖質の物質−はＴヘルパー細胞が抗体反応
に参加するかどうかに応じて、胸腺依存抗原又は非胸腺
依存抗原に分類される。

この点において、多くの多糖質抗原は非胸腺依存抗原と
同じように挙動する。

特に、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａａ＾、Ｊ、及びＳｚｅｎｂｅ
ｒｇによる溶血プラークの方法（Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｙ
、　１４．５９９、１９６８）を使用して、羊の赤血球
、胸腺依存抗原に対する抗体反応、及びストレプト・ニ
ューモニエ・七ロタイブ（Ｓｔ　ｒｅｐＬｏｃｏｃｃｕ
ｓｐｎｅｕｓｏｎｉｅ　５ｅｒｏｔｙｐｅ）３　（Ｓ　
Ｉ　Ｉ　Ｉ　）の多糖、低免疫原性の非胸腺依存抗原に
対する反応においてペプチドｌ　６３−１７１．ＴＦＡ
及びペプチド１６３−１７１．ＨＣＱの免疫刺激活性を
検定した。

この方法では、ある抗原に特異的な抗体を分泌する細胞
の数を決定する。また、検定すべき抗原でマウスに免疫
性を与え、該マウスのひ臓から得たリンパ球を同じ抗原
に接触させ、そして最後に補体を添加することによって
溶血プラークを検出する。

抗原−抗体反応が生じる部位、即ち特定抗体を産生ずる
各細胞で溶菌域（プラーク生成細胞、ＰＦＣ）が認めら
れる。直接法と呼ばれる、この方法は免疫化抗原に対す
る１次反応に特異的なりラスＩｇＭの抗体分泌細胞を示
す。

補体を添加する前に、マウスの免疫グロブリンにラビッ
トから直接得た抗血清を添加することによって２次反応
に特有なりラス１ピＧ抗体分泌細胞の数を求める。

従って、本発明によれば、５ＲＢＣ及び５ＩＩＩで免疫
化し、各投与量のペプチド１６３−１７１．ＴＦＡ及び
ペプチド１６３−１７１、８Ｃｉ２を用いて各種方法で
処理したマウスのひ臓からリンパ球を分離することによ
ってクラスＩｇＭ及びＩｇＧの抗体分泌細胞を決定する
。この目的から、体重が約２５ｇの、インブリードした
雄のＣ３Ｈ／　Ｈｅ　Ｎｃ　ＲＩ　Ｂ　ｒマウス及び雄
・雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを使用したが、結果は同じ
であった。本発明によれば、ｆ’　Ｂ　Ｓ　０　、２　
ｍ　ｌに対してｌ〜２×１ＯａＳＲＢＣ及びＰＢＳＯ６
５ｍ　ｌに対して０．５μｇの濃度でマウスの静脈及び
腹腔に、リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｃ）に予め溶解したＳ
　ＲＢ　Ｃ及び５ｌｌｌ抗原を接種した。

次に、抗原と一緒に、あるいは別に、体重１ｋｇにつき
ｌｐｇ〜１００ｍｇの濃度で、薬学上許容できる溶媒の
殺菌溶液の形で、験体動物の静脈及び腹腔内にペプチド
塩の各投与量を投与する。

溶媒は例えば水、生理学的溶液又は塩化ナトリウムリン
酸緩衝液であればよい。

特に、塩化ナトリウムリン酸液を使用した。マウスに接
種するｒｆ′Ｊｊこ、ＮａＯＨ及びＫＯＨから選択した
無機塩基で生成した溶液を中和した。

免疫化後時間を変えてＰＦＣ／ひ臓として測定したとこ
ろ、クラスＩｇＭの抗体分泌細胞の数は、ペプチドがす
べての時間において有効な免疫刺激活性を示し、かつ免
疫反応速度にバラツキがないことを示した。

また、活性はペプチドの投与濃度に依存し、そしてペプ
チド１６３−３７１．ＴＦＡの場合、免疫性抗原と併用
して腹腔内に接種した時に投与量をｌｏＯｍｇ／ｋｇに
すると、その効力が最大になることも認められた。

さらに、免疫化の２日前及び２日後に、１００　ｍ　ｇ
　／、　ｋ　ｇの最大投与量でペプチドｌ６３−１７１
を腹腔的投与した場合には、Ｐ　ＦＣ／ひ臓がかなり増
加したことも認められた。

最後に、免疫化前３日間連続して、最適投与量の１０〜
１００倍少ない量を腹腔的投与した場合、トリフルオロ
アセテートペプチドは、抗原と併用して最適量を投与し
た場合に得られる位に、Ｉ）　Ｆ　Ｃ／ひ臓を増加させ
ることも認められた。

投与方法の免疫刺激活性に及ぼす効果を調べる目的から
、本発明に従って、免疫化抗原と共に２種類のペプチド
を静脈投与した。

この結果、低免疫原性の抗原に対する１次及び２次反応
Ｊこ対する免疫刺激活性を得るのに必要な最適投与量の
点において、ペプチドは活性を示し、この活性が腹腔的
投与法によって得られる活性よりもすぐれていることが
認められた。

また、驚くべきことに、ペプチド１６３−１７１のハイ
ドロクロライドはそのトリフルオロアセテートよりもは
るかに高い活性を示すことも認められた。

５ＲＢＣに対する１次反応の増加は、ペプチド１６３−
１７１．１１Ｃ＆の場合１０ｐｇ〜ｌ　ｎ　ｇ　／　ｋ
　（ｒ；の投与量で、ペプチド１６３−１７１．ＴＩ？
’Ａの場合１０〜１００μｇ／ｋｇの投与量で最大にな
る。

同じように、Ｓ　ＲＢ　Ｃに対する２次反応の増加は、
ペプチド＋　６３−１７１．　ＨＣｆｆの場合１０βｇ
〜１μｇ　／　ｋ　ｇの投与量で、ペプチドＩ　６３−
１７１．ＴＦＡの場合１００μｇ　／　ｋ　ｇの投与量
で最大になる。

ヒトのインターロイシンＩ　Ｌ−１βの最適静脈投与量
は１１００ｐ／ｋｇである。

従って、本ペプチドはワクチン製剤の補助薬として好適
である。

本発明の目的には、特にペプチド１６３−１７１のハイ
ドロクロライドが好適である。

本発明によるペプチド１６３−１７１は、低免疫原性ワ
クチンの補助薬としてそのままの形で、又は製剤の形で
使用できる。

本発明による製剤は、免疫原性の低い胸腺依存抗原及び
非胸腺依存抗原に対する１次及び２次抗体反応を増強す
るような濃度で、好ましくは水又は緩衝塩化ナトリウム
溶液から選択される薬学上許容できる殺菌溶媒にペプチ
ド１６３−１７１を塩の形で溶解すると、調製できる。

投与方法に応じて、ペプチドの使用量を１ｐ　ｇ　／　
ｋ　ｇ　〜ｌ　００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇにするのが好
ましい。

本発明によれば、製剤は免疫化抗原と共に、静脈、腹腔
内又は筋肉内に投与できる。

別な態様では、本発明による製剤を適量の免疫原性の低
い、天然又は合成の胸腺依存抗原又は非胸腺依存抗原混
合して得られて組成物をヒトを始めとする動物の治療ワ
クチンとして使用する。

以下、本発明を実験例（実施例）によって説明するが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。

実施例１ ペプチド１６３−１７１．ＴＦＡの胸腺依存ＵＬＳＲＢ
Ｃへの免疫刺激活性の収 羊の赤血球（ＳＣＬＡＶＯ）１〜２Ｘ　Ｉ　Ｏ’を含む
塩化ナトリウムリン酸緩衝妓（ＰＢＳ）０．２ｍｌを用
いて、１０〜１２週令で体重が約２５ｇの、インブリー
ドした雌のＣ３Ｈ／１１ｅＮＣｒｌＢｒマウス（ＣＡＬ
ＣＯ−ＩＴＡＬＩＡ）２４匹を静脈処理した。２時間後
、以下のようにしてマウスを腹腔自処理した。０．２ｍ
ｌのＩ’ＢＳで３匹のマウスを、ヒトのインターロイシ
ン−１β（Ｇｅｎｚｙｓｅ　Ｃｏ−ｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、　Ｂｏｓｔｏｎ）５００．１０００．２０００及び４
０００Ｕ／ｋｇを含むＰＢＳｏ。

２　ｍ　ｌで３匹ずつの４群のマウスを、そしてそれぞ
れペプチド１６３−１７１を１２．３６及び１００ｍｇ
／ｋｇを含むＰＢＳｏ、２ｍ１で３匹ずつの３群のマウ
スを処理した。

接種前に、ペプチド含有溶液を０．ＩＮのＮ　ａ　ＯＩ
−１で中和した。

４日後、マウスを層殺し、ひ臓を取り出し、機械的に解
離して、リンパ球を分離した。

分離後、それぞれアーレ塩含有最小培地（Ｍ、　Ｅ、　
Ａ、　）　（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｖａ
ｌｋ−ｅｒｓｗｉｌｌｅ）　１５　ｍ　ｌで３回リンパ
球を洗浄してから、１５０，０００細胞の最終濃度で同
じ培地１　ｍ　ｌに再懸濁させた。

ＭＥＭ培地で各細胞懸濁液０．１ｍｌを連続希釈（１：
１０及びｔ：１ｏｏＯ）ｔ、、ＭＥＡ培地２５μｍ、Ｓ
　ＲＢ　Ｃの１０％溶液２５μｌ及びテンジクネズミ補
体２５μｌを含有するミクロプレートの窪みに、最終希
釈率１：６４で各希釈液１００μｌを２回加えた。

毛細管作用により、全！！濁液を各窪みから重ねたスラ
イドに直ちに移した。

次に、３７℃で１時間、パラフィンで縁部をシールした
スライドをサーモスタットでインキュベーションした。

インキュベージジンの最後において、光対照バイザーを
使用して、リンパ球分泌抗体の数を示す、直接溶血のプ
ラークを計数した。このようにした検出した抗体は、１
次抗体反応に対して特異的なりラスＩｇＭであった。

第１Ａ図及び第１Ｈ図の結果は、ペプチド１６１１７１
、ＴＦＡ及びヒトのＩＬ−１βの存在下、！００ｍｇ／
ｋｇの最大投与量で、投与量に依存するプラーク／ひ臓
数の増加を示している。

ｇ遣」Ｌζ ５ＲＢＣ投与２時間後、１００ｍｇ／ｋ　ｇのペプチド
１６３−１７１及び２０００Ｕ／ｋｇのヒトＩＬ−１β
を腹腔内接種することにより、実施例１と同様にマウス
を処理した。

接種２．４．７．９及び１５日後に、処理ラットのひ臓
からリンパ球を分離し、ＰＦＣ／ひ臓の数を計数するこ
とによって、ペプチド＋６３−１７１及びＩＬ−１βの
免疫刺激活性を評価した。

第２図の結果は、すべての時間（最大４日後）において
ペプチド１６３−１７１．　ＴＦＡがかなりの免疫活性
を示し、そして１次抗体反応速度にバラツキがないこと
を示している。

実施例３ 麿２ ９匹ずつの３群のマウスを下記のようにして処理した。

Ａ）ＳＲＢＣで免疫化する２日前に、３匹ずつの小群に
分けた第１群に１００ｍｇ／ｋｇのペプチド１６３−１
７１．’！’ＦＡ、２０００　Ｕ／ｋ　ｇのヒトＩＬ−
１β及び０．２ｍｌのＰＢｓを投与した。

Ｂ）ＳＲＢＣで免疫化した２時間後に、３匹ずつの小群
に分けた第２群に１００　ｍ　ｇ　／　ｋｇのペプチド
１６３−１７１．ＴＦＡ、２０００　Ｕ／ｋ　ｇのヒト
ＩＩ、−Ｊβ及び０．２ｍ１のＰＢＳを投与した。

Ｃ）ＳＲＢＣで免疫化した２日後に、３匹ずつの小群に
分けた第３群に１００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇのペプチド
１６３−１７１．’Ｉ’ＦＡ、２０００　Ｕ／ｋ　ｇの
ヒトＩＬ−１β及び０．２ｍｌのＰＩ（Ｓを投与した。

第３図に示した結果は、処理群Ａ）及び処理群Ｂ）、Ｃ
）のいずれの場合も、免疫４日後に測定したところ、ペ
プチド１６３−１７１、ＴＦＡの存在下ＰＦＣ／ひ臓が
かなり増加したことを示している。

実施例４ 最初に接種した４日後に、同じ投与量の５ＲＢＣ抗原を
実施例１と同様にして５ＲＢＣで免疫化したマウスの腹
腔に再接種すると同時に、１２．３６．１００ｍｇ／ｋ
ｇのペプチドｌ　６３−１７１．ＴＦＡ及び５００．１
０００．２０００Ｕ／ｋｇのヒトＩＩ、−１βを接種し
た。

１度の接種で同じ量のペプチド及びヒトＩＬ−１βを投
与することによって、５ＲＢＣに対する２次反応へのペ
プチドの免疫刺激活性も求めた。

２回目の投与４日後に、マウスを層殺し、補体とラビッ
ト血清を合わせた後、ｌ：２００の最終希釈率で免疫グ
ロブリンに対して、実施例１と同様にしてＰＦＣ／ひ臓
の数を求めた。

表１及び第４図に示した結果は、１００ｍｇ　／　ｋ　
ｇの最大投与量で適用濃度に依存して、各時間において
投与したペプチド１６３−１７１．ＴＦＡの存在下にお
いて、合計１）ＦＣ／ひ臓数が増加することを示してい
る。

ｌえｊ− ３ＲＢＣに対する２次反応に及ぼすペプチド１６３−１
７１．Ｔｒ”Ａ及びヒトｒｌＬ−１βの冑なる投与量の
効果 処理　（ａ）　　　　　　　　　　合計抗５ＲＢＣＰＦ
Ｃ／ひ臓の平均　　　（ｂ）（９５％信＃１限界）　　
　　　　　　　　ｐＰ［３８２１，５２８（１９，７２
４−２３，４９６１−ペプチド＋６３−１７＋　１２　
ｍａ／ｋａ　　　　　　３８．０１９　（３１，９８９
−４５，１８５）　　　　　≦０．０＋３６　　ｍｇ／
ｋｇ　　　　　　　　　　４０．４４＋７　　（２２，
６４６−７２，＋１０１　　　　　　　　　≦　０．０
５１０８　ｍＱ／ｋｏ　　　　　　４４．９８７　（２
６，４４２−７６，５６０１≦０．０１円３３　　　　
　　　　　　　　２９．９９２　（１８，３６５−５１
，０５０１−ベプチＦ　　１６３−１７１　ＴＯＯｉｇ
／ｋｇ　　　　　９３．３２５　（６９，０２３−１２
６，１８２）　　　　≦０．０＋ヒトｒ１１−１β　５
００　ｋｌ／ｋｏ　　　　　　５９．８４１　（４５，
６０４−７８，３４３１≦０．０１１０００１１／ｋａ
　　　　　　７Ｆ、６２４　（６１，５０２−９７，４
９９１≦０．０１２００００／ｋａ　　　　　１０Ｇ、
００Ｇ　（８４，１３９−１１８，８５０１≦０．０１
４０００　Ｕ／ｋｖ　　　　　　４２．３６４　＋２９
．８５３−５９．９７９１　　　　　ｎ、　ｓ。

ａ＞　−ｉｏ日に１〜２ｘ１０８の５ＲＢＧをマウスに
静脈接神し、モして０日にｊ１州を役りすると同時にＰ
ＢＳ　（対照）又は異なる投与量のペプチド１６３−１
７１゜ＴＦＡ又はヒトｒｌＬ−１βで１１２腔内処理し
た。

ｂ）統計的有意差　ＶＳ　　対照 衷情」（１ 実施例１に準じた。即ち、ストレプトコッカス・ニュー
モニエ・セロタイプ（５ｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ　
ｐｎｅｕｓｏｎｉａｅ　５ｅｒｏＬｙｐｅ）３　　Ｓ　
Ｉ　Ｉ　Ｉ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｊ、　ｆｌａｋｅｒ　
ＮＩＡＩＤ、　Ｎ１１ｌ、Ｂｅｔｂｅｓｄａから人手）
０．５ｍｌを腹腔内接種し、２時間後、ペプチド１６３
−１７１．ＴＦＡ及びヒトインターロイシン！βを接種
した。

５日後、マウスを層殺し、ひ臓からひ臓細胞を分離し、
反復洗浄し、ＭＥＭ培地に再懸濁させた。

塩化クロムによって５ＲＢＣ共にに共役化した５ｌｌｌ
をＰＢＳに懸濁させた１０％懸濁液［Ｂａｋｅｒ　Ｐ、
Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　ＡｐｐＨ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１７．４２２（１９６９）］　２５　ｍ　ｌ使用して、
実施例１と同様にしてペプチド１６３−１７１．ＴＦＡ
及びヒトＩＬ−１βの補助薬活性を求めた。この方法に
よって、ＩｍｇのＳＩ［Ｉを含有する塩化ナトリウム溶
液１　ｍ　ｌに沈降５ＲＢＧ０．５ｍｌを再懸濁させ、
そして塩化クロムの０．１％溶液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ）０　、　１　ｍ　ｌをこの第！の溶
液に加えた。周囲温度（２０〜２５℃）で５分間、生成
した混合物を穏やかに撹はんしながら維持した。

第４図に示した結果は、１００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの
最大投与量で投与量に依存して、ペプチド１６３−１７
１．ＴＦＡの存在下においてＰＦＣ／ひ臓の数が増加し
たことを示している。

実施例６− 実施例１に準じた。即ち、（Ｉｐｇ／ｋｇ〜１００μｇ
　／　ｋ　ｇの）ペプチド凰６３−１７１、ＴＦＡを含
有するＰＢＳ０．２ｍｌを一部のマウスに静脈接種し、
そして（Ｉｐｇ／　ｋ　ｇ　＝　Ｉ　００βｇ　／　ｋ
　ｇの）ペプチド■６３−１７１．　ｔｌｃＩ２を含有
するＰＩ３５Ｏ，２ｍｌを残りのマウスに接種した。

表２に示した結果は、静脈接種した場合、ペプチド１６
３−１７１．ＴＦＡ製剤の方が活性が高く、そして最適
な免疫刺−活性を得るのに必要な投与量に関して、ペプ
チド！６３−１７１．　ＨＣ（１（１）方がペプチド！
６３−１７１、’ｌ’ＦＡよりも活性がかなり高いこと
を示している。

Ｓ　ＲＢ　Ｇに対する１次反応における増加は、ペプチ
ド１６３−１７１．ＨＣｌ２の場合にはｔｏｐｇ〜１μ
ｇ　／　ｋ　ｇの投与量で、ペプチド＋６３−１７１．
ＴＦＡの場合には１０〜１００βｇ　／　ｋ　ｇで最大
になる。

ｌｉｊミ ５ＲＦ３Ｃに対する１次反応に及ぼすペプチド１６３−
１７１．ＴＦＡ及びペプチド１６３−１７１．１１ｃＬ
の効果の比較＋１１１３−１７１　ＴＦＡ　　　　　　
　　１（ｉ３−１７１１１ＣＬ対象　　　　　　　　４
２，３６４　＋１００．０り＋ＤＱ／ｋＱ４１，４００
（９７，７Ｘ）＋７７．６２５＋＋８３．２Ｋ）＄６１
０８、、　　　　　　　　　４１，４００　（９７，７
駕）＋　　　　　　　　ｔ３１．８２６１３＋Ｌ２駕）
　＊５１００　〃−４４，６１０（＋０５．３Ｋ）＋　
　　　　　　　８９，１２５　＋２１０．４Ｘｌ　”＋
　ｒ＋ａ／ｋｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　９０．５７３　（２１３，８＄ｌ　ａｍ
＋ｏ＃＃４１，９７１３（９９，１り＋８０，４５６（
１８９，Ｈ）＊傘ＴＯＯ’Ｎ６１，６５９（１４Ｓ、５
Ｋｌ傘６１　μｇ／ｋｇ　　　　　　　　７７．０９０
（１ｇ２．０驚）＊傘６Ｇ、２５６　（１４２，２Ｘｌ
　傘）６　＃　　＃　　　　　　　　　１０４，０７１
　（２４５，７１ｍ５　　　　　　　−　　　−１００
　　＃　　　　＃　　　　　　　　　　　　　　　　１
Ｇ８，２３２　　（２５５，５算）傘傘　　　　　　　
　　　　　４６，０２６　　＋１０８．６駕）　＋＋ｎ
、ｓ。

椅＋ｐ＜ｏ、ｏｓ ＊＊　　ｐ＜０．０１ Ｂ、ＳＲ［ｌＣに対する２次反応 実施例４に準じた。ただし、ペプチド１６３−１７１．
’Ｉ’ＦＡ及びペプチド＋６３−１７１．１ｌｃＱ（Ｐ
ＩＪＳ中１１００ｐ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ）の製剤
と共に抗原を静脈接種した。

表３に示した結果は、Ｓ　Ｒ［Ｉ　Ｇに対する２次反応
における増加はペプチド１６３−１７１．８ｃ１２の投
与量１μｇ　／　ｋ　ｇで最大になることを、換言すれ
ばペプチド１６３−１７１、ＴＦＡ（１００μｇ　／　
ｋ　ｇ　）の場合に認められた反応より約１０．１００
倍低いことを示している。

さらに、静脈接種するトリフルオロアセテートペプチド
の最適投与量は腹腔内投与に必要な投与量（１００ｍｇ
／ｋｇ）よりも少ない。

１！よ■ Ｓ］セＢＧに対する２次反応に及ぼすペプチド１６３−
１７１．ＴＦＡ及び１６３−１７１、）−１ｃＬの効果
の比較 １８３−１７１１Ｆ＾　　　　　　　　１６３Ｊ７１１
１ｃＬ対象　　　　　　　２Ｇ、０９１　（１Ｇ０．０
％１１００　Ｄ（１／ｋＱ　　　　　　　１７，２５８
　（８５，９駕）＋　　　　　　３１．１７７　（１５
４，９×）＋＋ｎｇ／ｋｇ　　　　　　　　　　−−−
−１０＃　＃　　　　　　　　　　２６，９１５　（１
３４，Ｏｘｌ　＋　　　　　　　５１．２８６　（２５
５，３ｇ３　＊＊１００＃Ｉｌ−−−−番串 １μ＋１／ｋｇ３１．４０５＋ＩＳ６．３％ｌ＊６１，
２３５（３０４，８Ｘｌ＊”ＩＱ　ｎ　ｓ　　　　　　
　　　　　−−−−１００＃　　　＃　　　　　　　　
　　　　　　　　６１．６５９　　（３０６，９り６６
　　　　　　　　　　　　３７．７５７　　（１８７，
９Ｘｌ＊傘＋ｎ、ｓ。

＊　　ｐ＜０．０５ ＊＊　　ｐ＜０．０１ Ｃ，５ＩＩＩに対する１次反応 実施例５に準じた。即ち、Ｉｐｇ／ｋｇ〜１１００ｐ／
ｋｇの濃度で２！１類のペプチドを静脈接種した。

表４の結果は、Ｉ〜＋００ｐｇ／ｋｇのペプチド投与量
で抗原５ｌｌｌに対する反応がかなり増加することを示
している。

同じ投与量では、トリフルオロアセテートペプチドの方
が不活性である。

Ｊ生【− ８１１１に対する１次反応に及ぼすベプブ下１６３−１
７１．ＴＥＡ及び１６３−１７１．８ＣＬの効果の比較 １６３−１７１　ＴＦＡ　　　　　　　　１６３−１７
１　ＨＣＩ対象　　　　　　　　８５１　（＋ＧＯ，Ｏ
駕）＋　　ｐｏ／ｈｏ　　　　　　　　　　　　　１３
４　　（８Ｇ、３％）　　−ト　　　　　　　　　　１
、＋８３　（１３９，０Ｘ）＊ＴＯ＃ｓ　　　　　　　
　　　７７６　（９Ｌ２Ｘ）　＋　　　　　　　　Ｌ４
５５　（１７＋、ＯＫ１’１００　＃　〃７８２　（９
１，９Ｘｌ　＋　　　　　　　　１．６７８　（１９？
、２％）ＩＩ−＋ｎ、ｓ。

＊ｐ＜ｏ、ｏｓ ＊＊　　Ｉ）＜０．０１

【図面の簡単な説明】

第１図：　Ｉ）　Ｆ　Ｃ／ひ臓として測定した、Ｓｒｔ
　１３　Ｃに対する１次反応に及ぼすペプチド１６３−
１７１（１）、１２．３６．１００　ｍ　ｇ／ｋｇ）（
第１Ａ図）及びヒトインターロイシンｌ−β（５００，
１０００，２０００゜４０００Ｕ／ｋｇ）（第１Ｂ図）
の免疫刺激効果。 １次反応における直接抗Ｓ　Ｉｔ　Ｂ　ＣＰ　Ｆ　Ｃは
、Ｓ　ＲＢ　Ｇの塩化ナトリウムリン酸緩衝液（Ｃ：ｌ
、５ＩｔＢＣ／ヒトインターロインン１−β（１）及び
５１ｔｕｃ／ペプチド１６３−１７１（Ｐ）の投与４日
後に求めた。 縦線は９５％信頼限界を示す。 統計的有意差 領域Ａ：全群ｖｓ、対照：ｐ≦０．０１領域Ｂ：ベプチ
ド１６３−１７１ｖｓ、対照：ｐ≦０．０１；ヒトＩｔ
、−１β４０００１／ｋｇｖｓ、対照：無視できる；ほ
かのすべての群ｖｓ、対照：ｐ＝ｏ、ｏｓ。 第２図：５ＲＨＣに対する１次反応の生体内速度。抗原
Ｓ　ＩＲＢ　Ｇ接種から各時間において！次抗体反応へ
の及ぼすペプチド１６３−１７１（１００ｍｇ／ｋｇ　
：　（・・・・・）、ＩＬ−１β（２００００／ｋｇ　
；　（０・・・○）及び）’ＢＳ　（ム・・・ム）の効
果の評価。 統計的有意差：ベプチドｖｓ、対照：ｐ≦０．０５（Ｂ
数＋２及び＋４）及びｐ≦０゜０１（上記以外の１」数
）、ＩＬ−１β　ｖｓ。 対照：ｐ≦０．０５（日数＋２及び＋４）及びｐ≦０．
０１（上記以外の日数）。 第３図：５ＲＢＣに対する１次抗体反応に及ぼすペプチ
ド１６３−１７１．ＴＦＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＩ
Ｌ−１β（２０００Ｕ　／　ｋ　ｇ　）の効果の反応速
度。ペプチド１６３−１７１．ＴＦＡ及びＩＬ−１βは
５ＲＩ３Ｃによる免疫化の２日前、免疫化と同時に、そ
して免疫化の２日後に接種し、免疫化４日後にＰＦＣ／
ひ臓を求めた。 縦線は９５％信頼限界を示す。統計的有意差：全群ｖｓ
、対照：ｐ≦０．０５゜ 第４図、５ＲＨＣに対する生体内２次反応に及ばずペプ
チド１６３−１７１．ＴＦＡ及びヒトのインターロイシ
ンＩ　Ｌ　−１βに対する異なる２種類の投与時間の効
果の比較。 ペプチド１６３−１７１．ＴＦＡ（１００ｍ　ｇ　／　
ｋ　ｇロコ　）、ｚ、−１β（２０００ｕ／ｋｇｒＷ口
）　＆ＣＦＰ　Ｂ　Ｓ　Ｃ２ｘ）　ハｍ１（日−１０）
及び第２（０日）接種材料と共に投与した。 縦線は９５％信頼限界を示す。統計的有意差：全群ｖｓ
、対照：ｐ≦０．０１゜ 第５図：ＰＩＪＳ（対照ロコ）に比較した場合の、ＳＺ
ｔに対４°る１次反応に及ぼすペプチド１６３−１７１
．　’Ｉ’Ｆ’Ａ　（０）　（１２，３６，１００ｍｇ
／ｋｇ）及びヒトのインターロイシン１−β（・）（５
００，１０００，２０００ＬＪ／ｋｇ）の効果。統計的
有意差：１Ｌ−Ｉβ（’５００Ｕ／ｋｇ）ｖｓ。 対照：無視できる：上記以外の全群ｖｓ、対照、ｐ≦０
．０１゜ 図面一つ浄書′内容に変更なし） 鵡　１図 薬２図 第３図

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）１つかそれ以上のアミン基からなり、低免疫原性
   の抗原に対する１次及び２次抗体反応をヒトを含む生体
   内において増強できる塩に転化した合成ペプチドを１ｐ
   ｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの量で含有する、薬学上許容でき
   る溶媒の殺菌溶液からなる、補助薬として使用する製剤
   。
2. （２）合成ペプチドが下記のアミノ酸配列を有するノナ
   ペプチドのハイドロクロライド又はトリフルオロアセテ
   ートである請求項第１項記載の製剤。 【アミノ酸配列があります】（ I ） （式中、Ｖａｌ＝Ｌ−バリン、 Ｇｌｎ＝Ｌ−グルタミン、 Ｇｌｖ＝グルブシン、 Ｇｌｕ＝Ｌ−グルタミン酸、 Ｓｅｒ＝Ｌ−セリン、 Ａｓｎ＝Ｌ−アスパラギン、 Ａｓｐ＝Ｌ−アスパラギン酸、 Ｌｙｓ＝Ｌ−リシン、そして Ｘ＝ＯＨである。）
3. （３）抗原が胸腺依存抗原である、請求項第１項記載の
   製剤。
4. （４）抗原が非胸腺依存抗原である、請求項第１項記載
   の製材。
5. （５）溶媒が水又は塩化ナトリウムリン酸緩衝液である
   、請求項第１項記載の製剤。
6. （６）免疫原性の低い、天然及び／又は合成胸腺依存抗
   原及び非胸腺依存抗原に対する１次及び２次抗体反応を
   ヒトを含む生体内で増強するために、請求項第１〜５項
   のいずれか１項に記載した製剤の使用。
7. （７）免疫原性の低い、胸腺依存抗原及び非胸腺依存抗
   原を含有するワクチンの補助薬としての、請求項第１〜
   ５項のいずれか１項に記載した製剤の使用。
8. （８）抗原と併用して、あるいは別にヒトを含む生体に
   、請求項第１〜５項のいずれか１項に記載した製剤を投
   与することからなる、免疫原性の低い、胸腺依存抗原及
   び非胸腺依存抗原に対する免疫反応を増強かつ持続させ
   る方法。
9. （９）抗原が合成抗原である、請求項第８項記載の方法
   。
10. （１０）抗原が天然抗原である、請求項第８項記載の方
    法。
11. （１１）静脈投与、腹腔内投与あるいは筋肉内投与を行
    う、請求項第８項記載の方法。