JPS63317772A - ウレミックトキシンの検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血清中に含まれる毒性物質であるウレミックト
キシンを検定する方法に関するものである。このような
ウレミックトキシンが原因となる病気としては例えば尿
毒症、末梢神経傷害、筒、後天性免疫不全症、心臓病等
である。

〔発明の背景〕

尿毒症患者に見られる臨床症状の発生機序に関しての議
論には１５０年以上の歴史があり、その原因の一つとし
て、尿中に排泄されるべき物質が体内に蓄積することが
あげられる。これらの物質の総称がウレミックトキシン
（ＵＴ）である。現在。

ウレミックトキシンとして想定されている物質を第１表
１）にまとめた。　　　。

近年の人工透析療法の進歩により、中低分子を除去する
ことで尿毒症が軽減することがわかり、これらの透析可
能な中低分子が注目され始めた。

特に中分子のＵＴに関して勢力的な研究が進められてい
るが、その正体についてはまだ解明されていない部分が
多い。

１９７２年にパップら２）　によって中分子仮説が提唱
され、中分子物質（ＭＶ、３００−５０００）が原因で
尿毒症性の末梢神経傷害が起っているとされた。これを
皮切りに、チャーマンら３）やネッカーらりにより神経
毒性物質の同定がおこなわれた。また中分子のＵＴは神
経毒性以外にも多彩な毒性を持つことが知られている。

その中でも１９５５年にヒユームら５）　が腎移植患者
において組織拒絶反応が弱くて遅いと報告したことに始
まり、腎不全患者の免疫能の低下に関する数多くの報告
が出された。

特に細胞性免疫能の低下に関する報告は多く、患者血中
の活性Ｔ細胞の減少６）す、サプレッサーＴ細胞の増加
り、Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける機能低下１）−
ｔａ）、さらにＮＫ活性の低下１４）などが示されてい
る。そして中分子物質の中にもたしかに細胞性免疫を抑
制する物質が含まれていることを多くの研究者が報告し
ている。１幻−２１゜このように腎不全患者の細胞性免
疫能の低下に中分子のＵＴが関与している可能性が強く
示唆されている。

〔発明の目的〕

本発明の目的は上記中分子のＵＴに対する抗体を作成し
て該抗体によって血液等の試料中のＵＴを検定すること
にあり、このような検定によれば、例えば慢性腎不全患
者に対する透析の効果等を明確に把握することが出来る
。

〔目的達成のための手段〕

本発明は上記目的達成のための手段として、血清中に含
まれる高分子物質および低分子物質を除去して中分子分
画を得ること、 該中分子分画を分子量差により所定のグループに分別す
ること。

分別されたグループについて細胞におけるマイトゲンに
対する応答の抑制作用もしくは活性化作用を調べろこと
。

抑制作用の強いグループもしくは活性化作用の強いグル
ープを選択してキャリアーに結合させることによって免
疫原を得ること、 該免疫原を動物生体に投与して該中分子のペプチド群に
対する抗体を作成すること、 該抗体により酵素免疫測定法を用いて試料中のウレミッ
クトキシンを検定すること、 以上からなるウレミックトキシンの検定方法および第１
発明によって製造された抗体を産生ずる動物生体から細
胞を摘出し、該細胞とミエローマ細胞とを融合し、得ら
れたハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生
ずること、 該モノクローナル抗体により酵素免疫測定法を用いて試
料中のウレミックトキシンを検定すること。

以上からなるウレミックトキシンの検定方法を提供する
ものである。

〔中分子分画の採取〕

血清中に含まれる高分子物質および中分子物質を除去し
て中分子分画を得るためには血液、血清、血漿、あるい
は血液透析外液（ＥＣＵＭ液）をイオン交換クロマトグ
ラフィー、ペーパークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー等のクロマトグラフィーおよび／または
ゲル濾過、限外濾過等の濾過による方法が適用される。

また上記分画効率を高めるために、血清、血漿、ＥＣＵ
Ｍ液等の試料を減圧濃縮してもよい。減圧濃縮を行なう
場合は上記血清、血漿、ＥＣＵＭ液等の試料を変性させ
ない程度の低温、例えば６０℃以下、望ましくは５６℃
以下に加温する。

上記ゲル濾過によれば上記試料に含まれる分子量５００
０以上の高分子タンパク類の除去と脱塩とが行なわれ、
上記限外濾過によれば更に低分子のアミノ酸や塩類が除
去される。

上記のようにして得られた中分子分画を分子量差によっ
て所定のグループに分別する。上記分別にはイオン交換
クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーや超
遠心分離等の遠心分離による方法が適用される。

〔マイトゲンに対する応答の抑制または活性化作用〕

上記のようにして分別されたグループの各各について、
マイトゲンに対する応答の抑制活性を調べる。この場合
に用いられるマイトゲンとしてはコンカナヴアリンＡ　
（Ｃｏｎ　Ａ　）　、フィトヘマグルチニン、リポポリ
サッカライド等が例示され、また用いられる細胞として
はマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ等のリンパ球が例示
される。そして各グループについて該リンパ球の上記マ
イトゲンに対する幼若化応答の阻害活性を調べる。

上記したように分別されたグループについて細胞におけ
るマイトゲンに対する応答の抑制または活性化作用を調
べた後、目的に応じて該抑制作用の強いグループかもし
くは活性化作用の強いグループを選択する。

なお上記抑制または活性化作用を調べるにあた□って分
別された各各のグループが中分子のペプチド群を含むこ
とを確認するために例えば薄層クロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーで上記グループの各各を展開
し、ニンヒドリン陽性スポットを確認同定することが望
ましい。

〔キャリアーとの結合〕

上記選択されたグループ中に含まれる物質は中分子のペ
プチド群であり、それ自体では免疫原となり得ず、また
、たとえなり得たとしてもきわめて弱い。そこでこれら
のペプチド群に免疫原性を持たせるためにキャリアーに
結合させる必要かある。該キャリアーとして用いられる
物質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵
白アルブミン（○ＶＡ）キーホールリンヘットヘモシア
ニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）等がある。

上記ペプチド群をキャリアーに結合させる方法としては
通常カルボジイミド法２？）が用いられる。

即ちタンパク質である上記キャリアーに含まれるカルボ
キシル基にＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　　（式中Ｒ１Ｒ′は
アルキル基である）なる式で表わされるカルボジイミド
を結合させ、ハプテンである上記ペプチド群に含まれる
アミノ基とカップリングさせれば、該ペプチド群をハプ
テンとして結合したキャリアーである免疫原が得られろ
。上記反応の過程を以下にまとめる。

タンパク質−Ｃ−ＯＨ＋　　Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’０Ｎ
−Ｒ タンパク質−Ｃ−０−Ｃ＝Ｎ−Ｒ’ ハプテン　−　ＮＨ２ ↓ ■ タンパク質−〇−Ｎ−ハプテン （免　疫　原） 〔動物生体に対する免疫原の投与〕 このようにして得られた免疫原を動物生体に投与する。

この場合に用いられる生体は通常マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ等である。該免疫原を生体に投与するには通
常皮下注射、眼内点滴、あるいは経口投与が適用される
。この際動物生体の免疫機構を刺激して特異的免疫反応
を強めるためにアジュバントが添加されることが望まし
い。このようなアジュバントとしては鉱物油と界面活性
剤とからなるフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ
）、あるいは該ＩＦＡに更にミコバクテリウムの加熱死
菌を加えたフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）等
が例示される。

上記のようにして免疫原を投与された動物生体は所定期
間を経て血液中に該免疫原に対する抗体を生ずる。

所望なれば該生体から採血を行ない、血液中の該抗体価
を酵素免疫検定法を用いて測定し、抗体価の高い生体を
選別して更に該生体に免疫原を投与して抗体を能率よく
生成させろ方法をとってもよい。

このようにして生体内に該免疫原に対する抗体を生成せ
しめた後、該生体内から採血を行ない、所望なれば採取
された血液から血清もしくは血漿を分離すれば、該血液
、血清、もしくは血漿には上記のようにして生成された
該免疫原に対する抗体が含まれる。

〔モノクローナル抗体の産生〕

所望なれば上記のように生体から血液を採取する代りに
例えば牌臓等から細胞を摘出し、該細胞とミエローマ細
胞とを融合し、得られたハイブリドーマによってモノク
ローナル抗体を産生じてもよい。上記細胞融合において
は通常融合剤としてポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　
Ｇ）を用い、ケーラーとミルスティン２′）の方法およ
びゲラファー２ｇ）等の方法に準じて細胞融合を行なう
ことが望ましい。

〔酵素免疫検定法（ＩＥＡ）） 本発明の抗体およびモノクローナル抗体は下記の酵素免
疫検定法により検定せられる。

該免疫検定法の原理は本発明の抗体またはモノクローナ
ル抗体と、ＵＴとβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）
との結合体（ＵＴ−β−Ｇ　ａｌ）との反応を利用する
ことにある。即ち本発明の抗体またはモノクローナル抗
体をＡｂとすると、試料中に含まれるＡｂとＵＴ−β−
Ｇａｌとは次のように定量的に反応する。

Ａｂ＋ＵＴ−β−Ｇａｌ＝ＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂ上記
反応式によって産生したＵＴ−β−Ｇ　ａ　１−Ａｂを
第２抗体（ラビット抗マウスＩｇＧ。

（ＩｇＧ））を吸着せしめたポリスチレンボールに結合
せしめて未反応のＵＴ−β−Ｇａｌから分離する。該ポ
リスチレンボールを採集して４−ＭＵＧ溶液に投入すれ
ば、該ポリスチレンボールに結合している　ＵＴ−β−
Ｇａｌ−Ａｂと４ＭＵＧとは定量的に反応して４ＭＵが
生成するから、該４ＭＵを蛍光光度計にて定量する。即
ち４ＭＵの生成斌とＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂの址とは比
例するから、４ＭＵの定量によって試料中のＡｂ　ｉが
検定されるのである。

ＣＵＴの酵素免疫測定〕 本発明の抗体およびモノクローナル抗体を用いて試料中
のＵＴを測定する。測定の原理は前章で述べた酵素免疫
測定法（ＩＥＡ）と同様である。

即ちＵＴの酵素免疫測定法においては前章で述べた酵素
免疫測定法において試料が存在すると、試料中のＵＴと
ＵＴ−β−Ｇａｌとが一定量のＡｂと競合的に反応して
ＵＴ−ＡｂとＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂの両者が産生され
る。

Ａｂ＋　Ｕ　Ｔ　＝　Ｕ　Ｔ　−Ａｂ Ａｂ＋　Ｕ　Ｔ−β−Ｇａｌ＝ＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂ
上記反応においては試料中のＵＴの斌に比例してＵＴ−
β−Ｇａｌ−Ａｂの産生量が減少する。上記反応式によ
って産生したＵＴ−ＡｂとＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂとを
第２抗体吸若ポリスチレンボールに結合せしめて未反応
のＵＴ−β−Ｇａｌから分離する。該ポリスチレンボー
ルを採集して４−ＭＵＧ溶液に投入すれば、該ポリスチ
レンボールに結合しているＵＴ−β−Ｇａｌ−Ａｂと４
ＭＵＧとは定量的に反応して４ＭｔＪが生成するから、
該４ＭＵを蛍光光度計にて定量する。即ち試料中のＵＴ
の量が多い程ＵＴ−Ａｂの産生量が多くなり、逆にＵＴ
−β−Ｇａｌ−Ａｂの産生量が少なくなり、したがって
４ＭＵの量が少なくなる。このように４ＭＵを定量する
ことによって試料中のＵＴが定量されるのである。

〔実験材料及び実験方法〕

１）実験材料 患者血清サンプル類 透析患者の血清、血漿およびＥＣＵＭ液（ｅｘｔｒａ−
ｃｏｒｐａｒｅａｌ　　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ　　ｍｅｔｈｏｄ液）は全て西本中京厚生クリニック
（名古屋市喘穂区）で採集されたものを用いた。

凱立 感作及びリンパ球幼若化応答に用いたＢＡＬＢ／Ｃ雌性
マウス（８〜１２′ＪＦｉ齢）は日本チャールズリパー
社から購入した。

試薬類 牛血清アルブミン（ＢＳＡ：結晶化され凍結真空乾燥さ
れる）、アミノプテリン、４−メチルウンベリフェリル
−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵＧ）、β−Ｄ−ガラ
クトシド（β−Ｇａｌ：大腸菌よりグレード■）はジク
マケミカル（株）より購入した。ドウルベッコス変性イ
ーグル（ＤＭＥ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地は日永
製薬より購入した。ウシ胎児血清（Ｆｅ２）。

ＸｌｏｏＭＥＭに対する非必須アミノ酸、ピルビン酸ソ
ーダはフロウラボラトリーより、またマイトゲンのコン
カナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびフィトヘマグルチニン
（ＰＨＡ）はＥ、Ｙ、ラボラトリ−より、リポポリサッ
カライド（ＬＰＳ）ならびにＣＦＡ及びＩＦＡはＤＩＦ
ＣＯより購入した。

ヒボキサンチン及びチミジンはヤマサ醤油（株）より購
入し、’Ｈ−ＴｄＲはアマ−ジャムより購入し、ラビッ
ト抗−マウスＩｇＧ、　（ＩｇＧ）　　は岡山大学薬学
部にて調製したものを用いた。また、セファデックスＧ
−２５はファルマシア社から、２次抗体吸着用のポリス
チレンボールはイチコ（株）（名古屋）より購入した。

その他の試薬、溶媒類はすべて市販の特級品を用いた。

骨髄腫細胞株 細胞融合に用いたＳｐ２１０−Ａｇ１４　（Ｓｐ２／○
）はＩｇ非分泌型の８−アザグアニン耐性株であり、大
阪大学医学部・微生物研究所細菌学教室より提供された
。

２）実験方法 ＥＣＵＭ液からの中分子址物質の　離 中京厚生クリニックにて採集した患者透析外液（ＥＣＵ
Ｍ液）を５６℃以下で減圧下にて濃縮し、ファルマシア
社のセファデック”スＧ−２５，（ファイングレード）
カラム（２，０φ×８０Ｇ）によりゲル濾過を行なった
。この操作により高分子のタンパク質（ＭＷ、　５００
０以上）の除去と脱塩ができ、分子量３００〜５０００
の患者中分子分画（ＵＭＭ）を得た。

限外濾過による低分子の除去 セファデックスＧ−２５カラムを用いたゲル濾過では脱
塩が完全であるといいがたい、そこで今回は、東洋濾紙
のＵＨＰ−４３限外濾過器にＵＨ−０５のフィルターを
装着し、Ｎｚガスの加圧下にてＵＭＭの限外濾過を行い
、低分子のアミノ酸や塩類を除いた。ＵＨ−０５のフィ
ルターは分子量が５００以下の物質を濾過することがで
き、フィルター内に残った物質をＵＭＭ　５００＜とじ
、フィルター外に出た物質をＵＭＭ　５００）とした。

ＵＭＭ　５００＜を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により分析し、大きく９つのピークに分かれるこ
とを確認した。そこでこれらの９つのピークを各各分取
することを試みた。溶出液として、Ｈ２Ｏをリン酸でｐ
Ｈ２，５とした溶液とアセトニトリルを混合比４：１と
したものを用い、シマズＬＣ−３Ａ、５ＰＤ−２Ａ、Ｒ
−１１１にゾルパックスＯＤＳ　（０，４６φＸ２５ａ
＋＋）逆相カラムを装着して、試料溶液を１０μＱずつ
注入し、注入２分１０秒後より５滴ずつ１本の試験管に
分取し、合計６０本の試験管に溶出液を集めた。この操
作を１００回繰り返して行い、合計１＋ｍＱ　　の試料
溶液を分画した０分取した６０本の試験管を１本毎に再
度ＨＰＬＣにより同定分析し、同一のピークを有する試
験管を集めて１つのグループとし、その結果これまでに
合計５つのグループを得ることができ、６各Ｇｒ−１＊
　Ｇｒ−２＋　Ｇｒ−３＊　Ｇｒ、４　ｖ　Ｇ　ｒ、　
５とした。またプールした各グループをＨＰＬＣにより
再同定した後、さらに薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ
）によっても同定した。展開溶媒は、ブタノール／酢酸
／ピリジン／水＝　３０　：　２３　：　３　：　２４
（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）を用い、約１時間展開、乾燥後にニ
ンヒドリン溶液を噴霧し、ニンヒドリン陽性スポットを
比較検討した。

Ｏｒ、１〜Ｏｒ、５の各グループのマウスリンパ球のマ
イトゲンに対する幼若化応答の阻害活性を調べた。マイ
トゲンとしてはＣａｎ　　Ａ　：　２．５μｇ／ｍＱ、
ＰＨＡ：２５μｇ／ｍ１２．ＬＰＳ　：１０μｇ／ｍＱ
を用い、２Ｘ１０’個のマウスＩｌ！細胞を、各グルー
プのサンプル５０μｇ　／　ｍ　Ｑとこれらのマイトゲ
ンを含む０．２ｍＱのＲＰＭＩ−１６４０，１０％ＦＣ
５培地中、５％Ｃｏ、、３７℃にて９６孔のマイクロカ
ルチャープレート（Ｎｕｎｃ）で４８時間培養後。

各ウェル当たり０．５μＣｉの”Ｈ−ＴｄＲを加え。

さらに１８時間培養後、リンパ球内に取り込まれた放射
活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。

ウレミックトキシンー蛋白質複合体の作成今回は幼若化
応答を阻害する活性の強い二つのグループ（Ｏｒ、２．
Ｇｒ、３）について抗体を作成することに決定した。キ
ャリアーとしてＢＳＡを用い、前記したグツドフレンド
、Ｔ、Ｌら２７）の方法に準じてＵＴ−ＢＳＡ複合体を
作成した。概略は、Ｇｒ、２とＯｒ、３中のペプチドを
ハプテンと。

して、ＢＳＡと共にＥＤＣ溶液存在下、２４時間反応さ
せ、７２時間精製水で透析後、凍結乾燥して免疫原を得
るわけである。（図１）。また、ＥＩＡに用いるハプテ
ン−酵素複合体もこの方法に準じて作成したものを用い
た。

マウスモノクローナル　ＵＴ　　　の。

ａ）免疫及び採血 ＵＴ−ＢＳＡ複合体を生理食塩水に再溶解し、等量のフ
ロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）と混和してＷ１
０型エマルジョンとし、ＢＡＬＢ／Ｃマウス３匹に蛋白
量として３０μｇずつ背部皮下に注射した。更に、２週
間毎に２回〜３回、フロイントの不完全アジュバント（
ＩＦＡ）とのエマルジョン３０μｇ蛋白址を追加免疫し
た。抗体価の上昇が見られる各免疫後の７日目にマウス
眼底よりキャピラリー（５０μＱ）を用いて採血を行い
、マウス血中の抗ＵＴ抗体価をＥＩＡを用いて測定し、
抗体価の高いマウスについてさらに３０μｇ蛋白量の抗
原を生理食塩水に溶解し、腹腔内に注射。

３日後のマウス牌細胞を細胞融合に供した。

ｂ）細胞融合法 細胞融合法はケーラーとミルスティン　　及びゲラファ
ーら２ｇ）の方法に準じ、当教室で開発した方法により
実施した。

抗体価が上昇したＯｒ、３マウス１匹の腫細胞を最終免
疫後３日目に摘出し、ＤＭＥ培地に浮遊させ、１／１０
ｆｉ度のＤＭＥ培地で赤血球を溶解除去して月中リンパ
球浮遊液を得た。次に３０　Ｘ　１００＋ｎｍのプラチ
ックチューブ（ファルコン）を用いて２×１０’個（７
）　Ｓ　ｐ　２　／　Ｏミエローマ細胞とＩＸＩＱ’個
の調製したリンパ球を混和し、８００ｒｐｍで５分間遠
心した。遠心後に上清を捨て、ペレットに３７℃であら
かじめ保温しておいたＩＩｏＱ　　のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）　−１０００５０％溶液をチューブを
強く振盪させながら滴下し、さらに５ＩＩＩＱ　　のＤ
ＭＥ培地を加え、ＰＥＧを希釈した後、８００ｒｐｍで
５分間遠心して上清を捨た。ペレットを洗浄した後、１
５ｍｆｌ　　の１５％ＦＣ８，１０％ＮＣＴＣ−１０９
　。

非必須アミノ酸溶液、　０．５ｍＭピルビン酸ソーダ含
有ＤＭＥ培地に再浮遊し、９６穴のマイクロカルチャー
プレート（平底、　Ｎｕｎｃ、）に１００μｆｉずつ入
れ、３７℃、５％ＣＯ７下で培養した。培養後１２時間
目にＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン、１０ｍＭ
アミノプテリン、３０μＭチミジン含有ＤＭＥ培地）を
１００μαずつ加えた。更に、３日後、６日後にＨＡＴ
培地を加え、９日後からＨＴ培地（ＨＡＴ培地よりアミ
ノプテリンを除いたもの）と交換し、１２２日目コロニ
ー形成陽性ウェル（ハイブリドーマ陽性）についてＥＩ
Ａによる抗体価スクリーニングを行なった。更に、１４
４日目もスクリーニングを行い、抗体価陽性ウェルを決
定した。

Ｃ）スクリーニング法 抗体価を高感度に検出できるＥＩＡを用いてスクリーニ
ングを行なった。まずプレート中の各ウェルの上清１０
μＱを抗体サンプルとして試験管に入れ、下記に示した
方法によりサンプル中のＵＴに特異的な抗体価を測定し
た。また、先に免疫したマウスの血中抗体価を測定した
方法も、この方法に準じて行なったものである。

試料または標準液　　　　１０　　μＱＵＴ−β−Ｇａ
ｌ　　　　　　１００　　ｐＱバッファー（緩衝液）２
００　　μＱ ↓ ４℃、８時間放置 ↓ 第２次抗体吸着ポリスチレンボール投入↓ 室温４時間の振盪 ↓ バッファーによる洗浄 ↓ ポリスチレンボール バッファー　　　　　　　　Ｚｏｏ　　μＱ３Ｘ１０’
Ｍ　４−ＭＵＧ　　　２００　　μＱ↓ ３７℃、２時間の前置 ↓ １．６ｍＱの０．ＩＭ　Ｎａ、Ｃｏ、を添加蛍光光度計
にて測定 （励起波長３６０　ｎｗ、測定波長４５０　ｎｍ）ここ
にバッファーはＯ，Ｌ　ｎ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２０．１％ＢＳＡを含む０．ＯＩＮ　　リン酸ソーダ
溶液（ｐｈ６．５）である。

ｄ）クローニング法 抗体価の高いウェルを検出できたが、そのウェル中には
、ＵＴに対する特異抗体を産生ずるハイブリドーマ以外
のハイブリドーマも存在する可能性がある。したがって
このまま放置すると特異抗体産生ハイブリドーマが希釈
されて徐々に抗体価の低下が起る。そこで特異的な抗体
産生ハイブリドーマのみを得る目的で、限界希釈法を用
いてクローニングを行なった。方法は、ハイブリドーマ
陽性ウェル中の細胞を新鮮なりＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細
胞５ＸＩＯ’浮遊液に懸濁させ、別の新しいプレートに
０．５／ウエルのハイブリドーマ細胞数となるようにま
き込んだ。この操作により、各ウェル中に存在するハイ
ブリドーマはＯもしくは１個となり、この状態で培養を
続けると、７〜１０日後に各ウェル１個のコロニーを持
つウェルが出現してくる。これら１個のコロニーをもつ
ウェルについて再スクリーニングを行い、抗体価の高い
ウェルを再びクローニングを行って、特異抗体産生ハイ
ブリドーマを得た。このハイブリドーマを増殖させた後
、−８０℃で貯蔵した。

〔実験結果〕

ゲル濾過のパターンを第１図に示した。サンプルの量は
Ｌｏｗ　Ｑ　　である。今回は流速を遅くしてより確実
に高分子と低分子を中分子から除けるように試みたが、
ピークが明確に分離されず、第１図のようにブロードな
ものとなった。カラ１１にのせるサンプル量が多すぎる
ために分離が悪くなっている可能性が考えられるため、
サンプル量を２００μＱ　　（Ｘ　１１５０−Ｉｔ）に
して同様に行なったが、サンプル基が１０ｍＱ　　の場
合と比較してもそれほどの分離能の改善は見られなかっ
た（データには示していない）。このことからＥ　ＣＴ
Ｊ　Ｍ液中の分子量２００００以下の物質の分子量が極
めて近接しているためか、あるいは多基に混在する低分
子の塩が影響して分離を劣下させているためのどちらか
に原因があると考えられる。ゲル濾過によって得た患者
中分子分画（ｔｒ　Ｍ　Ｍ　）と正常人の血清から調製
した中分子分画（ＮＭＭ）をＨＰＬＣによって比較した
のが第２図である。黒く塗りつぶした位置のピークがＵ
ＭＭに特異的である。今回用いたＥＣＵＭ液は一人の患
者からのもので、この患者にのみこれらが特異的である
可能性がある。そこで他の２人から別々に得たＥＣＵＭ
液と５人の患者のＥＣＵＭ液をプールした液とから同様
な方法でｔＪ　Ｍ　Ｍを集めてＨＰＬＣで分析した（第
３図）。

多少の違いはみられるが、はぼ第２図に示した患者のＵ
ＭＭ特異的なピークがすべてのＵＭＭから検出されるこ
とが判明した。

次に第１図に示されるように分子量マーカーとして用い
たビタミンＢ１．　（Ｖ、　Ｂｔｔ　：　ＭＷ、　１３
５５）とグルタミン（ＭＷ、　１４６　）の溶出位置が
近接していることより、このＵＭＭ中には低分子の物質
の混在が予想される。そこでこのＵＭＭから低分子を除
く目的で限外濾過を行い、分子量５００以下の物質を除
去した。ＵＭＭの限外濾過前後のＨＰＬＣ溶出パターン
を第４図に示し、ＮＭＭの限外濾過前後のものを第５図
に示した。図７で。

分子量５００以上の中分子の分画（ＵＭＭ　５００＜）
は、限外濾過前のＵＭＭの各ピーク（ｐ　ｓ〜Ｐ６）の
内のＰ２．　Ｐ３−　ＰＳ、Ｐ−を多く含むことがわか
った。一方、分子量５００以下の分画　（ＵＭＭ　５０
０〉）は、Ｐ、、Ｐ、のピークを多く含むことがわかる
。つまりＰ□、Ｐ４のピークは低分子の物質のピークで
あるらしい。またＮＭＭについても同様に限外濾過で分
画したが、ＵＭＭと同様に、最初に出現するピークと遅
く出現してくるピークがＮＭＭ　５００＞に集中し、中
間に出現するピークはＮＭＭ　５００＜に存在すること
がわかった。ところが、ＵＭＭ　５０Ｑ＜のもつピーク
とＮＭＭ　５００＜のもつピークは、その出現位置が多
少異なり、つまり患者血中に出現してくる中分子は、正
常な人の血中に存在する中分子とは少し異なった分子で
あるらしいことが示唆された。

次に、このＵＭＭ５００＜　を再度セファデックスＧ−
２５カラムによって同定した（第６図−八）。

分子１５０００から　１３００付近までの間におよそ５
つのピークが見られた。第６図−ＢのＵＭＭ５００＞の
ゲル濾過のパターンと比較すると、低分子はほとんど除
かれていることがわかる。また、データには示していな
いが、第６図−Ａに見られるＵＭＭ　５００＜の５つの
ピークを分離して、各々を第４図と同様に　　　ＨＰＬ
Ｃで同定してみたところ、どの分画とも同じようなＨＰ
ＬＣ溶出パターンしか得られず、　ＨＰＬＣにより出現
する各ピークと分子量との相関を決定することはできな
かった。

以後、ＵＭＭ　５００＜を用いてさらに分離精製を進め
た。

ＵＭＭ　５００＜のＨＰ　Ｔ−Ｃによろ分随杵笠ＵＭＭ
　５００＜をＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて再分画した。

第４図に示したようにこの分画は９個のピークを持つ。

各ピークをＰａ、　Ｐｂ、　Ｐｃ、　Ｐｄ、　Ｐｅ、　
Ｐｆ＋Ｐｇ、Ｐｈ、Ｐｉとし、各々のピークを分取する
ことを試みた。しかし今回は、五つのグループを分取す
ることが出来た。各々、Ｇｒ、　１　、　Ｇｒ、　２　
。

Ｇｒ、３．Ｇｒ、４．Ｇｒ、５とした。各グループのＨ
ＰＬＣによる同定の結果を第７図に示した。

Ｇｒ、１は主にＰａ、Ｐｂのピークを含み、Ｏｒ、２は
Ｐｂ、Ｐｃ　を、Ｇｒ、３はＰｂ、Ｐｃ、Ｐｄ、Ｐｅ　
を含み、特にＰｃを多く含むグループである。また、Ｇ
ｒ、４　はＰｆ、Ｐｇ、Ｐｈを含み、特にｐｈが主であ
る。Ｇｒ、５はＰｉをその主なピークに持つ。

次にこれらの五つのグループを薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）で同定した。分画前の０ＭＭ５００＜、ＮＭ
Ｍ５００＜、そして各グループを２５μＱのキャピラリ
ーで薄層にスポットし、約１時問屋間した後、ニンヒド
リン陽性スポットを比較してみた。その結果ＮＭＭ　５
００＜とＵＭＭ　５００＜を比較すると、−見それほど
の違いが見られないことが判明した。ところが、各スポ
ットの位置が微妙に異なっていて、特にＰｆ値の大きい
上部に、ＵＭＭ　５００＜特異的な二つのスポットが見
られる。

したがって、このことからもＮＭＭ　５００（とＵＭＭ
　５００＜に含まれる物質が本質的に異なる物質である
可能性が示され、ＨＰＬＣによる同定の結果とよく合う
。Ｐｆ値の大きい二つのスポットの内、下部のスポット
は主にＧｒ、３に多く含まれ、上部のスポットは主にＧ
ｒ、４に多く含まれることがわかる。

分離してきた各グループのマイトゲンに対する幼若化応
答への抑制活性を調べた。Ｔ細胞一般のマイトゲンであ
るＣｏｎ　Ａ　、ヘルパーＴ細胞特異的マイトゲンであ
るＰＨＡ、Ｂ細胞のマイトゲンであるＬＰＳを用いて各
グループのサンプル斌を５０μｇ／ｍＱに統一して測定
した。その結果を第８図に示す。第８図−Ａはマイトゲ
ンを含まない培養系であり、Ｇｒ、５　　は強い抑制作
用を示し、Ｏｒ、４は強い活性作用を示した。またこの
系の生細胞数の算定により、Ｏｒ、５はコントロールに
比較して、約２０％に生細胞数が減少していることがわ
かり、Ｏｒ、５は細胞障害性に働くようである。

これに比べＧ　ｒ、　３の生細胞数は約８０％で、特に
細胞障害性が強いわけではない。他のグループの生細胞
数はＧｒ、１．Ｏｒ、２は約１００％でＯｒ、４につい
ては約１１０％であった。以下第８図−ＢのＣａｎ　Ａ
応答ではＯｒ、　２　、　Ｇｒ、　３　、　Ｇｒ、　５
に阻害が見られ、ＣのＰＨＡについては特にＧｒ、３の
阻害が強かった。ＤのＬＰＳの応答にもＰＨＡ応答と同
様な傾向が見られた。また、ＰＨＡとＬＰＳに対する応
答に、Ｏｒ、４は促進的に作用することが発見された。

このことは中分子分画中には免疫抑制物質と免疫増強物
質が共存していることを示している。尚、分離前のＵＭ
Ｍ　５００＜とＮＭＭ　　５００＜　のマイトゲンに対
する免疫応答への影響を調べたが、いずれのマイトゲン
に対しても１５−１０％の弱い阻害作用が見られろこと
を確認しているがデータには示してない。

このように明らかにＧｒ、３は免疫抑制作用をもつ物質
を含むことがわかった。そこで今回はＣｏｎＡ応答に対
して抑制活性を有するＧｒ、３と若干であるが抑制活性
が見られたＯｒ、２を用いて各々に対して特異的な抗体
、できればモノクローナル抗体の作成を試みることにし
た。またＧｒ、４についても抗体作成を試みた。

マウス抗ＵＴ抗体の作 Ｇｒ、２とＯｒ、３をハプテンとしてＢＳＡと結合させ
、各々について３匹のマウスに感作した。感作７日日か
ら抗体価を測定し、１回目、２回目および３回目の追加
免疫後の夫々７日日に血中抗体価をＥＩＡを用いて測定
した。Ｏｒ、２感作マウスの血中抗体価の変動を第９図
に示し、Ｇｒ、３感作マウスのそれを第１０図に示した
。Ｇｒ、２とＧｒ、３の感作マウス共に、血中抗ＵＴ抗
体価が、追加免疫を重ねるごとに上昇しているのがわか
る。今回は免疫抑制活性のより強ｕ’Ｇｒ、３を免疫し
たマウスの胛細胞を細胞融合に供することにしたが、上
昇した抗体価が真にＧｒ、３中の免疫抑制物質に対する
ものかどうかを確認する必要がある。そこで第１１図に
示す実験を行なった。つまり、マイトゲン応答に対して
Ｏｒ、３が抑制活性を示すわけであるが、この実験系に
あらかじめＧｒ、３に対する抗血清を加えてやれば抗血
清中の抗ＵＴ抗体とＵＴが反応し、ＵＴの持つ抑制活性
が失われろはずである。この実験の結果で、コントロー
ルマウス血清に比べ抗ＵＴ抗血清がより効果的に抑制活
性を回復させることがわかった。

モノクローナル抗ＵＴ抗体の作成 Ｇｒ、３ｖ１３作マウス（■）の紳細胞を第１２図に示
した。ハイブリドーマ確立スケジュールに従って、５Ｐ
２１０　と細胞融合を行なった。ＨＡＴ培地で選択後、
生き残ったハイブリドーマがコロニーを形成し始めたの
が融合後１０日目くらいであった。

そこで融合後１２日目と１４日目にハイブリドーマ陽性
ウェルのスクリーニングを行なった。（第１３図−Ａ、
Ｂ）。ハイブリドーマ陽性ウェルは１２６ウエル中の２
９ウエル（２３％）でその内払ＵＴ抗体陽性ウェルは６
ウエルであった。これらの６ウエルの中から、比較的抗
体価の高いＲ９，Ｒ８の２つのウェルについてクローニ
ングを行なった結果。

Ｒ９より比較的抗体価の高いクローンを得ることができ
た。また、これより先に、抗体価陽性ウエルー上清（Ｒ
７，Ｒ９，Ｒ８）がＵＴにより減少させられたＣｏｎＡ
　に対するリンパ球幼若化応答を回復する能力を有する
かどうかを、第１１図で示した実験系に準じて検討した
。各々の抗ＵＴ活性を持つウェルの上清１００μＱを用
いて、その回復能力を調べた結果、Ｒ９の上清は部分的
にではあるが、抑制されていた幼若化応答を回復させる
能力を有することが示唆された。（第１４図）ＵＴの酵
素免疫測定法（Ｅ、ＩＡ）の開発凍結保存しておいた、
細胞融合に供したマウス抗ＵＴ血清を用いて、ＥＩＡを
確立し、透析患者血中のＵＴの定量を試みた。その結果
、第１５図に示されるように、１６０　ｐｇ／チューブ
〜５００　ｎｇ／チューブの間で検量線が書けた。患者
血漿サンプルはタンパクの非特異的な酵素阻害を避ける
ため、アミコン社のＣＦ−２５を用いて除タンパクした
ものを用いた。５人の患者の透析前後の血漿サンプルに
ついて定量を試みた結果、５人の患者中の４人の患者が
、透析後より透析前め血漿中に多くのＵＴを含むことが
確かめられた。そして、そのＵＴ血中濃度は２０〜１０
０　ｎｇ／　ｍ　Ｑ　　であった、尚。

正常人血中にＵＴは検出されなかった。これらの結果は
、これらのＵＴ、ＥＩＡを用いるようだ。

腎透析予備群の検出あるいは、ＵＴ菩積による諸種疾患
発見の診断等に応用することが可能である。

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Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　８７．７０３　（１
９８４）

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＣＵＭ！縮液のゲル濾過パターンを示すグラ
フであり、縦軸に吸光度、横軸に溶出液量をとった。溶
出液は再留水を用い流速は１．２５ｍＱ１分である。 第２図は患者血液と正常血液における中分子のＨＰＬＣ
プロフィールであり、縦軸に吸光度、横軸に時間（分）
をとった。ＨＰＬＣの条件はカラム：ゾルパックスＯＤ
Ｓ　（０，４６φｘ２５ａａ）、溶出液ニリン酸で再留
水をｐＨ２，５とした液とアセトニトリルとを混合比４
：１で混合した混合液、流速１ｍΩ／分、チャートスピ
ード：５ｎｙｎ／分である。 第３図は患者Ａと患者Ｂの各々のＥＣＵＭ液から分画し
たＵＭＭおよび５人の患者のＥ　ＣｔＪ　Ｍ液をプール
したものから分画したＵＭＭのＨＰＬＣプロフィールで
あり、縦軸に吸光度、横軸に時間（分）をとった。ＨＰ
ＬＣの条件は第２図と同様である。 第４図は限外濾過前と限外濾過後（ＵＭＭ　５００くお
よび５００＞）のＨＰＬＣのプロフィールであす、縦軸
に吸光度、横軸に時間（分）をとった。 ＨＰＬＣの条件は第２図と同様である。 第５図は限外濾過前と限外濾過後（ＮＭＭ　５００〈お
よび５００＞）のＨＰＬＣのプロフィールであり、縦軸
に吸光度、横軸に時間（分）をとった。 ＨＰＬＣの条件は第２図と同様である。 第６図は限外濾過後のＵＭＭのセファデックスＧ−２５
カラムによる溶出プロフィール（パネルＡ　：　Ｕ　Ｍ
　Ｍ　５００＜　、パネルＢ　：　ＵＭＭ　５００＞）
である。 第７図はＨＰＬＣによって分画したＵＭＭ５００くの５
つのグループの同定のグラフであり、ＵＭＭ　５００＜
をＨＰＬＣによって５つのグループ（Ｇｒ、１〜Ｇｒ、
５）に分け、その各々のグループを再びＨＰ　Ｌ　Ｃに
よって同定した。ＨＰＬＣの条件は第２図と同様である
。 第８図は上記５つのグループのマイトゲンに対する幼若
化応答への抑制および活性作用を示すグラフである。パ
ネルＡ：マイトゲン非存在、パネルＢ　：　Ｃｏｎ　Ａ
　（２，５ｕ　ｇ／ｍ　Ｑ）　、パネルＣ：ＰＨＡ　（
２５ｕｇ／ｍＱ）　、パネルＤ：ＬＰＳ（１０μｇ／ｍ
Ｑ）　、培養時間は６６時間、培養期間の最後の１８時
間に３Ｈ−ＴｄＲを加え取り込まれた３Ｈ−ＴｄＲを測
定した。 第９図はＧｒ、２の感作マウス血中抗体価の変動を示す
グラフである。 第１０図はＯｒ、３の感作マウス血中抗体価の変動を示
すグラフである。 第１１図はＵＴにより抑制されたＣｏｎ　Ａ　に対する
リンパ球幼若化応答への抗ＵＴ血清の回復効果を示すグ
ラフである。即ち第８図Ｂに示されるＣｏｎＡ応答の系
に正常血清あるいは抗ＵＴ血清を加えてＵＴにより抑制
された応答が回復されるかどうかを調べた。なお加えた
血清蛋白量は１００μｇ　／　ｍ　Ｑとした。 第１２図はハイブリドーマ確立スケジュールの説明図で
ある。 第１３図は２９のハイブリドーマ陽性ウェルからスクリ
ーニングされた抗ＵＴ力価のグラフであり、パネルＡは
細胞融合後１２日日日パネルＢは細胞融合後１４日口の
スクリーニングの結果を夫々示す。 第１４図はＵＴにより抑制されたＣｏｎＡ　に対するリ
ンパ球幼若化応答へのハイブリドーマ上清の回復効果を
示すグラフである。第１１図の系に準じハイブリドーマ
上清ｌＯＯμＱを用いてＵＴにより抑制されている応答
を回復出来るかどうかを調べた。 第１５図は標＊　Ｕ　Ｔ　（０〜５００ｎｇ／チューブ
）を用いたＥＩＡによるＵＴ検検線線示す。標準ＵＴ液
５０μＱ、マウス抗ＵＴ血清希釈液１００μＱ、ＵＴ−
β−Ｇａｌ希釈液１００μＱを用いた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清中に含まれる高分子物質および低分子物質を除
   去して中分子分画を得ること、 該中分子分画を分子量差により所定のグループに分別す
   ること、 分別されたグループについて細胞におけるマイトゲンに
   対する応答の抑制作用もしくは活性化作用を調べること
   、 抑制作用の強いグループもしくは活性化作用の強いグル
   ープを選択してキャリアーに結合させることによって免
   疫原を得ること、 該免疫原を動物生体に投与して該中分子のペプチド群に
   対する抗体を作成すること、 該抗体により酵素免疫測定法を用いて試料中のウレミッ
   クトキシンを検定すること、 以上からなるウレミックトキシンの検定方法２、血清中
   に含まれる高分子物質および低分子物質を除去して中分
   子分画を得ること、 該中分子分画を分子量差により所定のグループに分別す
   ること、 分別されたグループについて細胞におけるマイトゲンに
   対する応答の抑制作用もしくは活性化作用を調べること
   、 抑制作用の強いグループもしくは活性化作用の強いグル
   ープを選択してキャリアーに結合させることによって免
   疫原を得ること、 該免疫原を動物生体に投与して該中分子のペプチド群に
   対する抗体を作成すること、 該動物生体から細胞を摘出し、該細胞とミエローマ細胞
   とを融合し、得られたハイブリドーマによってモノクロ
   ーナル抗体を産生すること、 該モノクローナル抗体により酵素免疫測定法を用いて試
   料中のウレミックトキシンを検定すること、 以上からなるウレミックトキシンの検定方法