JPS6334B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、β−ガラクトシダーゼの分離方法、
詳しくはβ−ガラクトシダーゼをより簡単な操作
で効率よく、基質特異性、殊にオリゴ糖生成能の
異なる２つのβ−ガラクトシダーゼに分離する改
良された方法に関する。

従来の技術 β−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）
は、ラクトース等に含まれるβ−ガラクトシド結
合の加水分解及びガラクトサイド転位反応を触媒
する酵素であり、国際生化学連合委員会の酵素番
号E.C.3.2.1.23に分類され、系統名ではβ−Ｄ−
ガラクトシド ガラクトハイドロラーゼ（β−Ｄ
−galactoside galactohydrolase）と呼ばれてい
る酵素である。本酵素としては、従来より各種微
生物例えばバチルス サーキユランス（Bacillus
circulans）、エシエリヒア コリー
（Escherichia coli）、クリベロミセス ラクテイ
ス（Kluyveromyces lactis）、アスペルギルス
オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギル
ス ニガー（Aspergillus niger）等を起源とす
るものの他、植物及び動物起源のものが知られて
いる。

本発明者らは、先にバチルス サーキユランス
起源のβ−ガラクトシダーゼ標品（限外過によ
り精製したもの）につき、更にこれをセフアデツ
クスＧ−150によるゲル過、イオン交換クロマ
トグラフイー、ポリバツフアー交換体によるクロ
マトフオーカシング及びポリアクリルアミドゲル
を用いる電気泳動に従い精製する時には、上記酵
素が酵素形態の異なる２種のβ−ガラクトシダー
ゼ（）及び（）に各々分離精製されることを
見出した〔アグリカルチユラル アンド バイオ
ロジカル ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）、
48(12)、3053−3061（1984）〕。

発明が解決しようとする問題点 上記２種のβ−ガラクトシダーゼ（）及び
（）（以下単に「酵素」及び「酵素」と言う
ことがある）は、殊にそれらのオリゴ糖生成能に
おいて顕著な相違があり、之等の分離により、オ
リゴ糖生成能の非常に弱い酵素は、例えばミル
ク中のラクトースの分解に、またオリゴ糖生成能
の強い酵素は、ガラクトオリゴ糖の生産に、
各々有利に使用できると考えられた。しかしなが
ら上記分離方法は、非常に繁雑な工程と操作を要
し、工業的規模での実施は到底困難であり、上記
方法に代り、より簡単な操作で効率よく、上記酵
素ととを分離する方法の開発が望まれた。

問題点を解決するための手段 上記現状に鑑み、本発明者らは先に開発した分
離精製法に見られる欠点を解消することを目的と
して鋭意研究を重ねた結果、ハイドロキシアパタ
イトゲルを用いるカラムクロマトグラフイーによ
れば、上記目的が達成されることを見出し、ここ
に本発明を完成するに至つた。

即ち、本発明は、バチルス サーキユランス由
来のβ−ガラクトシダーゼをハイドロキシアパタ
イトゲルを用いたクロマトグラフイーによりオリ
ゴ糖生成能の異なるβ−ガラクトシダーゼとβ
ガラクトシダーゼとに分離することを特徴とす
るβ−ガラクトシダーゼの分離方法に係わる。

本発明方法によれば、非常に容易な操作で効率
よく、上記酵素及びを分離することができ、
かくして分離された各酵素は、そのままで精製品
としてそれらの特性を利用した独自の用途に極め
て有効に利用できる。

本発明方法においては、原料としてバチルス
サーキユランス由来のβ−ガラクトシダーゼを用
いる。該酵素は、前記文献にも記載される通り、
粉末形態で、又は限外過により部分精製された
溶液として入手できるが、例えばバチルス サー
キユランス（ATCC No.31382）等のバチルス
サーキユランスに属する公知の該酵素生産菌の培
養により得ることもできる。この培養による方法
及び得られる酵素の理化学的性質等は、例えば米
国特許第4237230号明細書に記載されている。

本発明では、上記β−ガラクトシダーゼを、ハ
イドロキシアパタイトゲルを用いたクロマトグラ
フイーに付すことを必須の要件とする。ここで用
いられるハイドロキシアパタイトとしては、公知
の各種のもの例えば「ヒドロキシアパタイト25％
solids No.HO252」（シグマ社製）の他、太平化
学産業社製造、半井化学社販売、日本ケミカル社
製製造、生化学工業社販売のヒドロキシアパタイ
トゲル等を例示できる。該ゲルを用いたクロマト
グラフイー操作は、通常のこの種クロマトグラフ
イー操作と同様のものとすることができ、一般に
は、適当なカラムに上記ゲルを充填し、これに酵
素液を通液してゲルに酵素を吸着させ、次いで吸
着された酵素を溶離させればよい。上記酵素の溶
離のための溶離液としては、リン酸バツフアを利
用できる。

本発明方法は、特に上記リン酸バツフアによる
酵素の溶離を濃度勾配法に従い行なうのが適当で
ある。即ち、目的酵素の分離は、濃度を約20〜
300ｍＭの範囲で次第に高濃度とした上記リン酸
バツフアを順次カラムに通液させることにより実
施できる。この操作により、まず約20ｍＭリン酸
バツフアで夾雑蛋白が溶離し、110ｍＭリン酸バ
ツフアで目的のβ−ガラクトシダーゼが、また
250〜300ｍＭリン酸バツフアで目的のβ−ガラク
トシダーゼが各々溶離する。

かくして両酵素の分離が行ない得る。分離され
たβ−ガラクトシダーゼ及びは、本発明者ら
が先に報告した文献に記載のそれらと作用、基質
特異性、至適PH、至適温度、分子量、温度安定
性、金属イオン及びその他の薬品の酵素活性に対
する影響等の理化学的性質において各々一致する
ものである。

実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例
を挙げる。

尚、実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
は、以下の方法により測定した。

＜β−ガラクトシダーゼ活性＞ 0.25％２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（ONPG）を含有する0.1M酢酸緩衝
液（PH6.0）４mlに本酵素１mlを加え、40℃で15
分間反応させた後、反応液１mlを10％炭酸ナトリ
ウム１mlに注入して反応を停止させ、生成したｏ
−ニトロフエノール量を測定してONPGの分解
量を求める。１分間に1μMのONPGを加水分解
する酵素量を１−ONPG単位とする。

実施例 １ ラクトース0.3ｇ、ポリペプトン３ｇ、肉エ
キス1.5ｇ及びNaCl0.2ｇを水に加えて全量を
100mlとし、PH7.0に調整後、これを坂口フラス
コに入れ、滅菌した。これにバチルス サーキ
ユランス（ATCC31382）の１白金耳を接種し、
38℃で１日間振盪培養した。

下記各成分 ラクトース 48ｇ 魚 粉 36ｇ フアーマメデイア（トレーダーズオイルミル社
製） 18ｇ コーンデイステイラーズソリユブル 10ｇ 酵母エキス 1.95ｇ CaCO₃ ４ｇ （NH₄）₂SO₄ 1.5ｇ MnCl₂ 0.02ｇ Na₂CO₃ 2.1ｇ 大豆油 ５ml をミニジヤーフアーメンターに入れ、水を加え
て１とした後、殺菌した。これに上記で得
た培養液10mlを接種し、38℃で２日間、通気攪
拌培養した。

上記で得られた培養液の一部を、遠心分離
して菌体を除き、酵素液を得た。この酵素液
を、55％飽和硫安塩析し、遠心分離により酵素
沈澱を得た。これを20ｍＭリン酸バツフア（PH
6.0）に対して透析し、透析酵素液を得た。

この酵素液の総活性は4800 ONPG単位であ
つた。

ヒドロキシアパタイトゲル（半井化学社）60
mlをカラムに充填し、室温で20ｍＭリン酸バツ
フア（PH6.0）250mlを通液させ、次いで上記
で得た酵素液を通液させ、酵素を吸着させた。

次に、上記カラムに20ｍＭリン酸バツフア（PH
6.0）250ml、50ｍＭリン酸バツフア（PH6.0）450
ml、110ｍＭリン酸バツフア（PH6.0）450ml、150
ｍＭリン酸バツフア（PH6.0）350ml、200ｍＭリ
ン酸バツフア（PH6.0）500ml、250ｍＭリン酸バ
ツフア（PH6.0）250mlを順次続けて通液させ、酵
素を溶離させた。

上記による酵素の溶離曲線を第１図に示す。第
１図において縦軸は蛋白の280ｍμにおける吸光
度（UV280、実線で示す）及びβ−ガラクトシ
ダーゼのONPG活性（破線で示す）を表わし、
横軸は溶出量（ml）を示す。また図にはリン酸バ
ツフアの濃度を示した。

上記第１図より明らかなように、β−ガラクト
シダーゼは、250ｍＭリン酸バツフアで溶離さ
れ、β−ガラクトシダーゼは110ｍＭリン酸バ
ツフアで溶離されることが判る。

かくして分離されたβ−ガラクトシダーゼ及
びは、それぞれ前記した文献に記載の理化学的
性質に一致する性質を有するものであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例に従うβ−ガラクトシ
ダーゼの溶離曲線を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス サーキユランス由来のβ−ガラク
   トシダーゼをハイドロキシアパタイトゲルを用い
   たクロマトグラフイーによりオリゴ糖生成能の異
   なるβ−ガラクトシダーゼとβガラクトシダー
   ゼとに分離することを特徴とするβ−ガラクト
   シダーゼの分離方法。