JPS6335501A - ラツト初期胚の凍結保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の不旧亀を顆 本発明は、ラットの２細胞３ｔｌＩ胚を用いて胚を高い
生存率で保存し得るラット初期胚の凍結保存法に関する
。

鴛速４ｕυ損顎逢量 近年、マウスをはじめとする哺乳動物の初１υ１胚を凍
結保存する方法の開発が進められており、既にマウス胚
の保存については一部の実験動物センター等で実用的に
利用されている。

しかし、ラット胚の保存方法について主として８細胞期
乃至胚盤胞まで発達した段階の胚を、マウスと同様の方
法で凍結保存することに成功しているものの実用上下記
のような問題がある。

■８細胞期乃至胚盤胞の発達段階の胚は、成熟雌からの
採取に際し、ホルモン投与による過排卵処置を施しても
多く採取できない。

■多くの研究報告にみられるごとく、凍結保存後のラッ
ト胚の生存率が、マウス胚の生存率に比較して低いため
実用性に乏しい。

日が７ンしようとする課題 本発明は、叙上のラット胚の凍結保存上の問題点に鑑み
なされたものであって、過排卵処置によりラットの成熟
雌から胚が多数採取でき、かつ胚を高い生存性で保持し
得る実用性の高いラット胚の凍結保存法を提供すること
を課題とする。

本発明では、ラット胚として、過排卵誘起処置を施すこ
とによりラットの成熟雌より数多く採取し得る２細胞期
胚を、特定な冷却条件により凍結することにより、上記
課題の解決に成功し、本発明をなすに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

尤ユ■稗底 本発明の構成上の特徴は、過排卵誘起処置により成型！
Ｉ！雌ラットより採取した２細胞期胚を、常温において
、牛胎子血清及び凍害保護剤を添加した凍結保存用培地
に移し、次いで該培地を冷却し、−７°Ｃ前後に達した
時点で植氷処置を行った後、０．５℃〜１．０℃／ｗｉ
ｎの冷却速度で冷却し、−２０℃〜−４０℃に達した時
点で液体窒素中に移して凍結保存することにある。

課　を”ンするための一 本発明で用いるラットの２細胞期胚は、従来用いられて
いた８細胞期乃至胚盤胞の発達段階の胚に比べて、過排
卵誘起処置を施したラットの成熟雌から多数採取し得る
ので、ラット胚として凍結保存に利用すると有利である
。上記２細胞期胚の採取は下記の手順で行い得る。

成熟雌ラットに、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ
Ｇ）とヒト絨毛性性刺激ホルモン（ｈＣＧ）を石橋らの
方法（「家畜繁殖誌」２９巻、１号、ｐ１〜７．１９８
３）に従って投与した後、該ラットを雄ラットと同居さ
せ、翌朝膣栓の有無により交尾を確認し、その日を妊娠
第１日とし、第２日目の午後に卵管を潅流して２細胞朋
胚を採取する。このようにして採取した２細胞期胚は、
牛胎子血清及び凍害保護剤を添加した凍結保存用培地に
常温下に移す。

ここで用いる培地は、細胞の凍結保存に通常使用される
Ｈ　Ｅ　Ｒ液に牛脂子血清を、好ましくは１８％程度添
加し、かつ凍害保護剤として１．５ＭのＤＭＳＯもしく
は１．５ｈのプロピレングリコールを添加したものが適
当である。

次に、上記培地に移した２細胞期胚は５〜１５分間程度
平衡させた後、ストロ−に移し、下記手１）１によりプ
ログラムフリーザーを用いて緩徐に冷却し、−７℃前後
になった時点で１０分間程度静置して、その間に植氷処
置を行う。

この植氷処置は、冷却過程での急激な温度変化を抑止す
るために行うものであって、そのためにごく僅少な過冷
却の生じた上記時点で人為的に水晶化を促す処置である
。

この植氷処置を行うには、公知の各手法を適用でき、例
えば液体窒素あるいは超低温槽内で予め冷却しておいた
ピンセットを用いその両方の刃で上記２細胞期胚を移し
であるストロ−を軽くはさむとよく、この操作によりス
トロ−内の液表層の氷晶化が起る。

次いで、上記植氷処置を行って氷晶形成を確認した後、
上記ストロ−を０．５〜１．０℃／ｍｉｎの冷却速度で
冷却し、−２０℃〜−４０°Ｃ２好ましくは＝３０°Ｃ
に達した時点で液体窒素中に移して保存する。

上述のごとくして保存した２細胞期胚の生存性は次のよ
うにして検定し得る。

液体窒素からストロ−を取り出し常温〜４０°Ｃの温水
中で急速解凍を行い、融解後、スＩ−ローの内容物を常
温下で時計皿上に移し、これに少量の（例えば約０．８
ｍ　（１）のＨＥＲ液を添加して、約５分間静置した後
、ＩＩＥＲ液で胚を洗浄したものを実体顕微鏡下で観察
してその形態を判定する。

次いで、上記観察により形態的に正常と認められた胚を
、偽妊娠第１日目のレシピエンｌ−」１ｌｔ（情管結紮
雄と交配させておいたもの）の卵管内に移植し、正常な
胎児の発生状況を調べることによって胚の凍結保存後の
生存性を評価することができる。

次に、本発明の方法に従って、ウィスター系ラット２細
胞期胚を凍結保存したものを、上述のごとくして融解し
てその形態の判定と、その移植による胎児の発生状況を
調べた結果を表１及び表２に示す。

叙上のごとく、本発明は、ラットの２細胞朋胚を採取し
て特定な冷却条件で凍結保存することにより、高い生存
性を維持したまま保存し得るのでそれを移植してラット
種動物の維持、繁殖を行うことが可能となる実用上の効
果を奏する。

以下に実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例 ■ラット２細胞期胚の採取 ５ＩＩＲ（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎ
ｓｉｖｅ　Ｒａｔ）系ラットの成熟雌に、その発情前期
（交尾を許容する日）の日にｈＣＧ　（ヒト絨毛性性腺
ホルモン）を投与し得るように、ラット外周！ＩＪＩに
合わせてＰｌ’ｌＳＧ　（奸馬血清性性腺刺激ホルモン
）を上記ｈＣＧの投与の約４８時間前に２０１Ｕを腹腔
内投与し、次いでｂＣＧを同単位腹腔内に投与して過排
卵誘起処置を行った。

上記投与後、該ラットを雄ラットと同居させて交配を行
わせ、翌朝その膣栓の有無により交尾を確認し、その日
を妊娠第１日とし、第２日日の午後に卵管を潅流して２
細胞朋胚を採取した。

■ラット２細胞期胚の凍結 上述のごとくして採取した２細胞期胚を下記の凍結保存
用培地に室温下に移した。

培地（ＩＩＥＲ液）の組成： １）ａｍＦ＋ｚ　　　　　　６０　　（ｗｔ％）ＲＰＭ
Ｉ　１６４０　　　　２０ Ｕａｇｌｅ’ｓ？８液　　２０ 上記組成の基本培地に牛脂子皿清１８ｗｔ％及び１．５
Ｍのジメチルスルホキシド（凍害保護剤）を添加し、更
に抗生物質（ペニシリンとストレプトマイシン）の少量
を添加したものを用いた。

上記培地に移した２細胞期胚は、約１０分間平衡させた
後、培地と共に、０．２５＋ｗｆｆ容のプラスチックス
ドローに注入し下記手順により冷却した。

冷却条件： ０℃〜−７°Ｃまではｌ”ｃ／ｍｉｎの冷却速度で冷却
し、−７°Ｃに達した時点で、予め液体窒素中で冷却し
ておいたピンセットを用いて上記ストロ−を軽くはさん
で植氷処置を行った。次いで、ストロ−内の液表層に氷
晶が生成したことを６１認した後、該ストローを０．５
°Ｃ／ｍｉｎの冷却速度で冷却して一３０℃に達せしめ
、その時点でストロ−を液体窒素中へ投入し、６０日間
凍結保存した。

■凍結保存胚の生存性： 上述のごとくして凍結保存した２細胞朋胚を３７°Ｃ温
水中で急速に融解させ、ストロ−の内容物を室温下で時
計皿に移し、これに少量の前記基本培地液を添加して、
５分間静置した後、再び上記培地液を用いて洗浄し、得
られた胚を、偽妊娠１日日のレシピエンド雌の卵間内に
移植した。その結果、２８個の凍結胚のうち２２匹が生
存して分娩され（生存率７５％）、そのうち２０匹は離
乳に至った（離乳率７１％）。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）過排卵誘起処置により成熟雌ラットより採取した
   ２細胞期胚を、常温において、牛胎子血清及び凍害保護
   剤を添加した凍結保存用培地に移し、次いで該培地を冷
   却し、−７℃前後に達した時点で植氷処置を行つた後、
   ０．５℃〜１．０℃／ｍｉの冷却速度で冷却し、−２０
   ℃〜−４０℃に達した時点で液体窒素中に移すことを特
   徴とするラット初期胚の凍結保存法。
2. （２）凍結保存用培地は、１８％牛胎子血清及び凍害保
   護剤として１．５Ｍのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
   ）又は１．５Ｍのプロピレングリコールを添加した培地
   である特許請求の範囲第（１）項記載の凍結保存法。
3. （３）凍結保存用培地はＨａｍＦ＿１＿２６０％、ＲＰ
   ＭＩ１６４０２０％及びＥａｇｌｅ’ｓ溶液２０％の組
   成の基本培地からなる特許請求の範囲第（１）項記載の
   凍結保存法。
4. （４）−３０℃に達した時点で液体窒素中へ移す特許請
   求の範囲第（１）項記載の凍結保存法。