JPH0225426A - 精子の低温保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 適用される産業分野 本発明は低温生物学及び低温医学に関し、特に精子の低
温保存方法に関する。

本発明は、不妊症治療における臨床的使用のためのヒト
精子の深冷凍結に適用された場合に最も有用性を見出す
ことができる。

これは精子低温バンクの強化に役立ち、ひいては凍結細
胞の質に関してそれらの選択を可能にする。しかも、凍
結精子の使用は卵子の体外受精による様々なタイプの不
妊症の治療において現在極めて有効である。

本発明は、例えば可能な最短期間内で新品種の飼育動物
を繁殖させる畜産業のような他の一部の低温生物学領域
においても応用することができる。

商業上貴重かつ希少な魚の品種の精子の低温保存は、そ
れらの急速な生殖のための一手段でもある。

精子低温保存向は低温技術の応用は、人間の経済活動及
び公衆の健康維持に関する更に一層広い分野にわたる。

精子凍結により現在見出されている広範な応用例におい
てはそれらの保存方法を更に改善すべき必要性を有して
いたが、その理由はこれまでに存在する方法は、一部の
凍結細胞による浸透能の消失を最終的にはもたらす結晶
化プロセスの進行のせいで適切に精子を低温保護しえな
いためである。

したがって、ガラス質化（ｖｉｔｒｉｆｌｃａｔｉｏｎ
　）に基づく精子の低温保存方法の新たな開発が、それ
らの生存能力を高める目的で、明らかに必要となってき
ている。

従来技術 最終濃度１０％まで射精液に無水グリセロールを滴下す
ることによる精子凍結のための一つの従来技術方法が得
られているしファーティル・アンド・ステリル（Ｐｅｒ
ｔｉｌ、　ａｎｄ　５ｔｅｒｊ１．）、第１４巻。

第１号、１．９６３年、アイ・ケー・ジャーマン（１，
に、ｓｈｅｒｍａｎ）“凍結及び凍結乾燥によるヒト精
子の改善された保存方法″参照〕。ガラス又はポリエチ
レン製アンプル中に０．５ｍρずつ凍結防止剤と共に精
子を分与しかつそれらを密閉シーリングした後、精子は
２５℃／分の速度でマイナス７５°Ｃまでしかる後１６
℃の速度でマイナス１８０°Ｃまで冷却される。解凍後
の精子生存率は６０％もの低さである。

前記方法に固有の欠点は、射精液へのグリセロルの直接
添加に起因する細胞への浸透ダメージである。それによ
って細胞膜器官、特にそのミクロゾームキャップに及ぼ
される潜在的障害は冷却中に悪化せしめられ、その結果
関与する細胞の大部分において生物学的構造に不可逆的
ダメージを与えてしまう。

当業界で公知のものとして、ドライアイス表面上に作ら
れた穴の中に精子を入れることによる、粒子の形の凍結
防止剤と一緒の精子低温保存のためのもう一つの従来技
術方法がある〔雄生殖不能症の治療、１９８２年、ベル
リンーノ＼イデルベルグーニューヨーク、アイ・バーケ
イ（１，８ａｒｋａｙ）。

エッチ・ズッカーマン（Ｈ，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ）　、
　　“精子の凍結保存及び貯蔵“、第２６３−２８１頁
参照〕。

試料０．１〜０．１５ｍｇの凍結プロセスはこの場合に
６０秒以内の非常に高い速度で進行する。

粒子使用により精子を凍結することは、温度制御キャビ
ネットを備えた特別装置で行われ、それによって低温凍
結プロセスが制御されている。このようにして処理され
た精子の生存率は７０〜７５％に達している。

この方法の欠点は、精子の凍結が結晶化プロセスを伴い
、その結果精子が球形状で凍結されてしまうという事実
に関係している。したがって、穴の中央及びその壁側に
位置する細胞の異なる冷却速度に基づき凍結せしめられ
た精子試料において温度勾配が生じるため、粒子中での
精子の凍結は無菌的に行うことができないのである。

更にもう一つの精子低温保存方法がこれまで用いうるこ
とか知られているが〔ソビエト特許（ＳＵ、Ａ）第１．
１．０Ｂ、８３７号明細書〕、その場合に凍結防止剤、
即ちグリセロールは徐々に精子に加えられ、その最終濃
度１０％が得られるまで処理され、その際精子は０．５
ｍΩ無菌チューブに入れられて、後者は密封される。凍
結は二段階で行われ、最初は０．５〜１．０℃／分の速
度でプラス４又は５℃に、しかる後精子はその温度で３
０〜６０分間維持され、次いで凍結はマイナス１８０〜
１９０℃の温度が得られるまで２０〜ｂ 凍結精子は液体窒素中で保存され、水浴中プラス３６°
Ｃで解凍される。精子の生存率は６６％である。

前記方法に特有の欠点は、精子の低温保存が、その進行
がガラス質化の原因とはならない凍結条件によって妨げ
られる結晶化プロセスを伴うことである。しかも、上記
プロセスにおける凍結防止剤のプラスの影響は、射精液
への１０％グリセロール直接添加に関係したマイナスの
現象によって相殺される。これにより、精子の細胞質膜
に障害を引き起こし、ひいてはこの膜の耐凍結性を低下
させてしまう。更に、精子への無水グリセロールの直接
添加は、射精液中において著しい浸透シフトを生じさせ
てしまう。この場合に、細胞の強い脱水化現象はタンパ
ク質分子の部分的変性と細胞器官の機能障害（ｄｊｓｏ
ｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）とを引き起こす。

高濃度グリセロール媒体に対する細胞の長時間接触は、
上記凍結防止剤の毒性作用発現と関係している。

解決すべき問題 本発明は、精子の低温保存方法を提供することをその目
的として有しており、その場合においてそれらの冷却は
大部分の細胞内外水のガラス質化の進行のために十分に
高い速度で行われ、解凍中における再結晶化により精子
の生物学的構造上で生じる有害作用が、より低い程度で
しか生じないであろう。

本発明の前記目的は、精子中への凍結防止剤の導入及び
冷媒温度へのそれらの冷却を含む精子の低温保存方法に
おいて、本発明によれば、緩衝塩及び抗ショック成分が
精子中に導入され、それらの双方が凍結防止剤と一緒に
なって凍結保存剤を形成しており、しかも精子が冷媒温
度まで予め冷却された高熱拡散性粉末物質中の凍結保存
剤を媒体として冷却され、上記凍結保存剤の濃度が精子
及び凍結保存剤を凍結させる過程で非結晶相が生成する
のに十分に高い、という事実に基づき達成される。

提案された方法によれば、ガラス質化を進行させること
により精子の形態機能保存に関して更に高い効果を得る
ことが可能となり、それらの８５％もの高い生存率を達
成することができる。これは、精子を冷却させるために
高熱拡散性粉末物質の使用によってなしとげられるか、
その物質は目的物及び冷媒間の直接的接触なしに冷却せ
しめられる目的物周囲において冷媒蒸気による断熱シェ
ルの形成を妨げている。冷却速度に関する結果的に著し
い増加はガラス質化が進行するために十分であることが
判明しており、しかも上記プロセスの実現に寄与する値
にまで凍結防止剤濃度を低下させることを可能にしてい
る。

提案された方法は、凍結される精子において結晶化プロ
セスの進行を妨げ、ひいてはそのプロセスを促進させる
いかなる極端な因子も排除することを可能にしている。

同時に、提案された方法によれば、操作数の減少とそれ
らの実施に要する時間の短縮とによって低温保存プロセ
スを簡略化することができる。それと共に、本発明は低
温保存サイクルを短縮させることによってその方法の更
に高い労働生産性と更に低い主要費用とに寄与している
。

本発明の好ましい態様によれば、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３
）が高熱拡散性粉末物質として用いられる。これは、非
結晶凍結のために十分に高い冷却速度が、提案された凍
結保存剤の媒体中て精子のガラス質化を起こすように生
じるという事実と関係しているが、特に胚のような他の
細胞と比較して上記細胞か比較的小さなサイズであるこ
ととひいては凍結されるべき精子中で自由水が少量であ
ることによって説明される。

凍結防止剤は１，５〜２．５％の濃度で使用されること
が特に好都合であるが、その理由は凍結防止剤の毒性の
みならず浸透性までもがかかる濃度では発現しないから
であるか、但し後者は予め選択された冷却条件下におけ
るガラス質化の進行にとって十分に高いものである。

本発明の一態様によれば、凍結保存剤は生物学的有効物
質を含んでいる。

生物学的有効物質は、精子の凍結保存に際して、氷への
相変換中における温度ショック及び“溶解効果”から細
胞質膜を保護することによって処理されるべき細胞の生
存率を高める目的から使用される。

塩化コリンが生物学的有効物質として用いられることが
好都合である。

３つのメチル基及び１つのヒドロキシル基が存在した窒
素基の高エネルギーポテンシャルに基づき生物学的プロ
セスにおいてメチル化剤として機能する塩化コリンは、
関係物質による水分子の活性水和を引き起こしひいては
凍結保存剤の凍結防止作用の一層となる高塩基性に特徴
を有する。メチル基は生体膜の自然構造を安定化させ、
その結果それらの耐凍結性に寄与している。

塩化コリンは２％の濃度で用いられることが特に好都合
である。

塩化コリン濃度か低くなると凍結保存剤の凍結防止力を
高くしえなくなり、一方丈に高い濃度のその生物学的有
効化合物は生体高分子との疎水的相互作用に関与して、
膜を安定化させるのではなく膜構造を変化させてしまう
のである。

本発明の他の目的及び利点は、下記のその具体的態様に
関する詳細な説明から明らかになるであろう。

態　　様 本方法を実施するために金属製容器が冷媒、即ち液体窒
素中に浸漬されるが、この容器は高熱拡散性粉末物質で
満たされており、その中に希釈された精子を入れた容器
が突っ込められる。

本発明は下記のようにして行われる。希釈されると、精
子はグルコース、クエン酸ナトリウム、即ち緩衝塩、抗
ショック成分としての卵黄、生物学的有効物質、即ち塩
化コリン溶液及び凍結防止剤、即ちグリセロールを含有
した事実上水溶液である凍結保存剤と混合される。希釈
された精子は平衡化され、しかる後食品用ホイルで作ら
れた容器中に入れられ、次いでフレア状に広げられて冷
媒、即ち液体窒素の温度まで冷却された高熱拡散性粉末
物質中に入れられ、しかる後容器はそこで貯蔵させるた
めに液体窒素中に素早く移される。

このようにして冷凍された精子は水浴中で解凍される。

例］ 精子２ｍΩを希釈のためにサーモスタット中３７°Ｃで
２５〜３０分間おき、しかる後グルコース４．０ｇ、ク
エン酸ナトリウム１．．２ｇ、卵黄］　１ ２６．０ｍｇ、２０％塩化コリン溶液２．０ｍｇ、グリ
セロール３．０ｍＭ及び残余の水を含有した処理剤を１
：１比で加える。最終グリセロール濃度は１．５％であ
る。このようにして希釈された精子を４５分間保持し、
しかる後壁厚０．３ｍｍの食品用ホイルで作られた容器
中に０．５ｍｇずつ入れ、容器の自由端をフレア状に広
げる。精子を凍結させるために、粉末アルミナで満たさ
れかつ液体窒素中に浸漬された事実上金属製容器である
凍結室中に上記容器を入れ、次いで容器を粉末アルミナ
中で５〜１０秒間維持し、しかる後液体窒素中にそこで
貯蔵させるべく移す。

解凍は、水浴中４０℃で容器を浸漬することにより、凍
結保存の３週間後に行う。解凍後、精子のｐＨは７．５
、精子総数５２００万／ｍｉｌ、運動率６６％、活動的
運動率５１．８％、正常形態率７２％である。

精子の生存率は下記式に従い計算される：凍結前に運動
能力のある精子率％ 得られた結果によれば、それは８２．２％である。

例２ 精子２ｒＪｌを希釈のためにサーモスタット中３７℃で
２５〜３０分間おき、しかる後グルコース４．０ｇ１ク
エン酸ナトリウム１．２ｇ、卵黄２６．０ｍｇ、２０％
塩化コリン溶液２．０ｍｇ、グリセロール４．０ｍｇ及
び残余の水を含有した処理剤を１・１比で加える。最終
グリセロール濃度は２．０％である。この希釈された精
子を４５分間保持し、しかる後壁厚０．３ｍｍの食品用
ホイルで作られた容器中に０．５ｍｇずつ入れ、容器の
自由端をフレア状に広げる。精子を凍結させるために、
粉末アルミナで満たされかつ液体窒素中に浸漬された事
実上金属製容器である凍結室中に上記容器を入れ、次い
で容器を粉末アルミナ中で５〜１０秒間維持し、しかる
後液体窒素中にそこで貯蔵させるべく移す。

解凍は、水浴中４０℃で容器を浸漬することにより、凍
結保存の３週間後に行う。解凍後、精子はｐＨ値７，５
、精子総数５２００万／ｍＪ？、運動率６６％、活動的
運動率５３，１％、正常形態率７２％である。

精子の生存率は下記式に従い計算される：凍結前に運動
能力のある精子率％ 得られた結果によれば、それは８４．２％である。

例３ 精子２ｒ＋ｄｌを希釈のためにサーモスタット中３７°
Ｃで２５〜３０分間おき、しかる後グルコース４．Ｏｇ
、クエン酸ナトリウム１．２ｇ１卵黄２６．０ｍｆｌ、
２０％塩化コリン溶液２．Ｏｍρ、グリセロール５．　
、　Ｏｒ＋ｄｌ及び残余の水を含有した処理剤を１＝１
比で加える。最終グリセロール濃度は２．５％である。

この希釈された精子を４５分間保持し、しかる後壁厚０
．３＋ｎｍの食品用ホイルで作られた容器中に０，５ｍ
ρずつ入れ、容器の自由端をフレア状に広げる。精子を
凍結させるために、粉末アルミナで満たされかつ液体窒
素中に浸漬された事実上金属製容器である凍結室中に上
記容器を入れ、次いで容器を粉末アルミナ中で５〜１０
秒間維持し、しかる後液体窒素中にそこで貯蔵させるべ
く移す。

解凍は、水浴中４０°Ｃで容器を浸漬することにより、
凍結保存の３週間後に行う。解凍後、精子はｐＨ値７．
５、精子総数５２００万／ｍρ、運動率６６％、活動的
運動率５４．７％、正常形態率７２％である。

精子の生存率は下記式に従い計算される：得られた結果
によれば、それは８６．５％である。

一定の限界内での低グリセロール濃度及び粉末アルミナ
媒体中での高速度凍結の適用により本発明の目的を達成
しつるという事実を立証するために、実施された実験の
結果を表にしたものが以下で示されており、そこには前
記例の結果も含まれている。

］　６ 第１表 低温保存された精子の生存率対凍結媒体の組成第２表 精子の運動性対凍結媒体 １凍結保存剤及びグリセロール を用いない天然精子 ２凍結保存剤を用いるが但し少 量のグリセロールしか用いな い精子 ３１．０ ４１．５ ５２．０ ６２．５ ７３．０ ８５．０ ８７．５±１．４６ ４９．１±２．１８ ６７．２±３．１８ ８２．２±２，２２ ８４．２±１．８１ ８６．８±１，１６ ７８．２±１．１７ ７１．０±３．１８ １凍結保存剤及びグリセロール を用いない天然精子 ２凍結保存剤を用いるが但し少 量のグリセロールしか用いな い精子 ３１．０ ４１５ ５２．０ ６２．５ ７３．０ ８５．０ ２２．５±１．３８ ２８．０±２．１６ ４２．０±２．８６ ５１．８±１．１２ ５３．１±２．１６ ５４．７±１．６１ ５０．２±１．５６ ４４．０±２．７４ 第３表 精子の運動性対精子の低温保存方法 本発明方法　　　　６４．１±３．１８　５４．６８±
１．１２従来公知の方法　Ｂ５．ｌｌ±３．６４　４３
．６７±２．４７ｐ　＜　０．０５ ｐ−スチューデントーフィッシャー（Ｓｔｕｄｅｎｔ　
−Ｆｊｓｈｅｒ）による統計処理での差の信頼性指標上
記表のデータは、双方のケースにおける解凍精子の運動
性はそれらの凍結前の運動性と比較して低下していると
いうことを立証している。しかしながら、提案された方
法によれば公知の方法よりも高い活動性を有する精子を
得ることを可能にすることができる。

前記の例は、最も低い結果は天然精子が凍結保存された
場合に得られることを示している。グリセロールなしの
凍結保存剤添加は、細胞の保存の程度をやや高める。更
に優れているのはグリセロールを含めた凍結保存剤によ
る凍結防止であり、最大度の凍結防止は凍結媒体中のグ
リセロール濃度が１．５〜２．５％である場合に得られ
る。本凍結方法における２、５％濃度でのグリセロール
の使用により、１９．８％まで生存率を高めることがで
きるが、これは非常に優れた精子保存率である。

以上のように、凍結保存剤中における低濃度グリセロー
ル及び塩化コリンの存在は、いずれの否定的現象も生じ
ない最大に顕著な凍結防止能の発現のためにとって好ま
しい条件を作出することができる。

このことは、適用される凍結保存剤中の細胞が天然物質
よりも高い生命力を有しているという事実によって特に
立証される。

発明の効果 本発明は、不妊症治療における臨床的使用のためのヒト
精子の深冷凍結に関して用途を見出すことができる。か
かる精子ストック（又はバンク）１つ の使用は、実験−臨床及び実務の医学、並びに飼育動物
の精子の凍結保存に関する進歩とかかわっているのであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精子中への凍結防止剤の導入及び冷媒温度へのそれ
   らの冷却を含む精子の低温保存方法であって、 緩衝塩及び抗ショック成分が精子中に導入され、双方が
   凍結防止剤と一緒になって凍結保存剤を構成しており、
   しかも精子が冷媒温度まで予め冷却された高熱拡散性粉
   末物質中の凍結保存剤を媒体として冷却され、上記凍結
   保存剤が精子及び凍結保存剤が凍結せしめられていると
   きに非結晶相が生成するうえで十分に高い濃度を有して
   いることを特徴とする方法。 ２、アルミナ（Ａｌ＿２Ｏ＿３）が高熱拡散性粉末物質
   として用いられる、請求項１に記載の方法。 ３、凍結防止剤が１．５〜２．５％の濃度を有する、請
   求項１に記載の方法。 ４、凍結保存剤が生物学的有効物質を含んでいる、請求
   項１に記載の方法。 ５、塩化コリンが生物学的有効物質として用いられる、
   請求項４に記載の方法。 ６、塩化コリンが２％の濃度で用いられる、請求項５に
   記載の方法。