JPS6336146A - 核酸塩基の配列決定方法 - Google Patents
核酸塩基の配列決定方法Info
- Publication number
- JPS6336146A JPS6336146A JP61177543A JP17754386A JPS6336146A JP S6336146 A JPS6336146 A JP S6336146A JP 61177543 A JP61177543 A JP 61177543A JP 17754386 A JP17754386 A JP 17754386A JP S6336146 A JPS6336146 A JP S6336146A
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- Japan
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- nucleic acid
- electrophoresis
- gel
- array
- acid group
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明に核酸塩基の配列決定方法に係り、特に自動化に
好適な配列決定方法に関する。
好適な配列決定方法に関する。
従来、核酸塩基の配列決定は、例えばマキサム・ギルバ
ード法、あるいはダイデオキシ法により行なわれきた（
化学総説４６，１）ｐ２〜９，１９８５）。
ード法、あるいはダイデオキシ法により行なわれきた（
化学総説４６，１）ｐ２〜９，１９８５）。
この方法では、まず放射性同位体で標識された核酸を化
学的に断片化した後、電気泳動法にて、長さの異なる核
酸断片をガラス板で挾まれたゲル支持体中で分子着順に
整列させる。そして、ゲル支持体をガラス板よシはがし
、このオートラジオグラムを撮ることで放射性核酸断片
を含む泳動帯の検出を行ない、核酸の塩基配列を決定す
る。ここで、従来技術による核酸断片の塩基配列決定法
について、図面に基づいて説明する。第７図は従来の核
酸断片の電気泳動装置の講造を示す斜視図である。同図
に示すごとく、２枚のガラス板３に挾まれた核酸断片の
泳動分雌用ゲル２、その泳動分離用ゲル２の両端を浸す
電極液槽１、および直流電源６で構成される。そして、
放射性同位体（例えば３２Ｐ）で標識さｎた核酸断片試
料を、泳動分離用ゲル２の負億側スロット５に供給し、
ゲル長めたり４０ Ｖ／ｃｍ程度の電圧Ｅｖで泳動させ
ると、同一分子量を持つ核酸断片に、それぞれ泳動帯４
を形成しつつ負極より正極に向い、分子量の対数にほぼ
反比例した移動度で泳動する。この核酸断片の泳動帯４
の泳動パターンから、核酸塩基の分子１屓の配列を決定
する。
学的に断片化した後、電気泳動法にて、長さの異なる核
酸断片をガラス板で挾まれたゲル支持体中で分子着順に
整列させる。そして、ゲル支持体をガラス板よシはがし
、このオートラジオグラムを撮ることで放射性核酸断片
を含む泳動帯の検出を行ない、核酸の塩基配列を決定す
る。ここで、従来技術による核酸断片の塩基配列決定法
について、図面に基づいて説明する。第７図は従来の核
酸断片の電気泳動装置の講造を示す斜視図である。同図
に示すごとく、２枚のガラス板３に挾まれた核酸断片の
泳動分雌用ゲル２、その泳動分離用ゲル２の両端を浸す
電極液槽１、および直流電源６で構成される。そして、
放射性同位体（例えば３２Ｐ）で標識さｎた核酸断片試
料を、泳動分離用ゲル２の負億側スロット５に供給し、
ゲル長めたり４０ Ｖ／ｃｍ程度の電圧Ｅｖで泳動させ
ると、同一分子量を持つ核酸断片に、それぞれ泳動帯４
を形成しつつ負極より正極に向い、分子量の対数にほぼ
反比例した移動度で泳動する。この核酸断片の泳動帯４
の泳動パターンから、核酸塩基の分子１屓の配列を決定
する。
この時、パターンを読みとるために、既にのべたように
オートラジオグラムを撮る方法が一般的に行なわれてい
る。
オートラジオグラムを撮る方法が一般的に行なわれてい
る。
さらに核酸断片からのβ線を直接検出し、高速化を計る
方法が考えられている。すなわち、電気泳動装置の断面
図を第８図に示すが、泳動されてくる尿酸断片４が検出
器３０を通過した時のβ線を検出することにより、オー
トラジオグラムラ不要とし、高速化を図ろうとするもの
である。
方法が考えられている。すなわち、電気泳動装置の断面
図を第８図に示すが、泳動されてくる尿酸断片４が検出
器３０を通過した時のβ線を検出することにより、オー
トラジオグラムラ不要とし、高速化を図ろうとするもの
である。
上記従来技術は、塩基配列を決定するために。
４種の反応系ごとに電気泳動のレーンを使用していた。
これによシ、多種類の核酸試料を処理する場合について
配慮がされておらず、処理能力の問題があった。
配慮がされておらず、処理能力の問題があった。
本発明の目的は、塩基配列決定技術において、その処理
能力が向上した方法を提供することにある。
能力が向上した方法を提供することにある。
上記目的は、核酸断片の４種の反応生成物を。
適当な２種の混合物とし、電気泳動の２ケのレーンに供
給することによシ達成さｎる。
給することによシ達成さｎる。
まず、核酸試料は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の特異的反応系ｌこよっ
て断片生成される。各断片は、その１種を他の２種とそ
れぞれ組ヰ合せ２種類の混合物とし、電気泳動ケルに供
給する。それによって。
グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の特異的反応系ｌこよっ
て断片生成される。各断片は、その１種を他の２種とそ
れぞれ組ヰ合せ２種類の混合物とし、電気泳動ケルに供
給する。それによって。
電気泳動すると、谷祈片は分子量分離するので、電気泳
動上のパターンを読み取ることによって、核酸試料の塩
基配列を決定することができる。
動上のパターンを読み取ることによって、核酸試料の塩
基配列を決定することができる。
第８図の直接検出方式においては、２ケの検出器出力を
パルスカウンタと論理回路を組合わせることによって、
核酸試料の塩基配列を決定することができる。
パルスカウンタと論理回路を組合わせることによって、
核酸試料の塩基配列を決定することができる。
以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。まず
、塩基配列を決定したい核酸試料１０は、クローニング
、増殖などの前処理プロセスｌｌを経て反応系１２に移
行する。この場合、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、
チミン（Ｔ）で特異的に切断される反応系１２を使用す
る。そして、反応系１２で生成された断片は、ＣとＴの
混合物、およびＧとｒの混合物の２種類に分けて、電気
泳動ゲル２のレーンＸ、Ｙに供給する。ゲル上の分離パ
ターンが本図のように得られた場せ、パターンの有るも
のが”１″、無いものを“０“とすれば、表の真理値表
に示すように、塩基配列は上から順ｆｃＡ、Ｃ，Ｇ、Ｔ
となる、このように５本実施例によれば、従来と比較し
て次の効果がある。
、塩基配列を決定したい核酸試料１０は、クローニング
、増殖などの前処理プロセスｌｌを経て反応系１２に移
行する。この場合、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、
チミン（Ｔ）で特異的に切断される反応系１２を使用す
る。そして、反応系１２で生成された断片は、ＣとＴの
混合物、およびＧとｒの混合物の２種類に分けて、電気
泳動ゲル２のレーンＸ、Ｙに供給する。ゲル上の分離パ
ターンが本図のように得られた場せ、パターンの有るも
のが”１″、無いものを“０“とすれば、表の真理値表
に示すように、塩基配列は上から順ｆｃＡ、Ｃ，Ｇ、Ｔ
となる、このように５本実施例によれば、従来と比較し
て次の効果がある。
（１） レーン数２ヶで塩基配列が決まるので、泳動
分離ゲルに２倍の情報量を持たせることができる。
分離ゲルに２倍の情報量を持たせることができる。
（２）核酸断片の生成反応系のいずれか−っを省略する
ことができる。
ことができる。
また第１図では２種の混合物１３，１４をＣ＋・ｒおよ
びＧ＋Ｔとしたが、たとえばＡ＋ＣとＡ十Ｇの組合せで
も同様に４種の塩基配列を決定することが可能である。
びＧ＋Ｔとしたが、たとえばＡ＋ＣとＡ十Ｇの組合せで
も同様に４種の塩基配列を決定することが可能である。
すなわち、２種の混合物は、４種の反応系のいずれか一
つを共通とした組合せであれば、レーン数が２ケで塩基
配列を決めることができる。
つを共通とした組合せであれば、レーン数が２ケで塩基
配列を決めることができる。
ところで第１図は反応プロセス１２の生成物を混合した
場合を説明したが、２種の混合物は、第２図に示すよう
に、反応プロセス１２′で直接、生成することも可能で
ある。この場合も、第１図と同様に、１種を共通とした
２穐、２組のものでめれば、実施例以外の組合せでも同
様の効果が得られることは明らかである。
場合を説明したが、２種の混合物は、第２図に示すよう
に、反応プロセス１２′で直接、生成することも可能で
ある。この場合も、第１図と同様に、１種を共通とした
２穐、２組のものでめれば、実施例以外の組合せでも同
様の効果が得られることは明らかである。
さらに本発明による一実施例を第３図で説明する。図の
２は電気泳動ゲル、３０．３０’は検出器で第８図を正
面から見たものでめる。レーンＸとＹに２種の混合物１
３．１４を供給し電気泳動すると、核酸断片は分子量の
順に分離されて、検出器３０および３０′を通過する。
２は電気泳動ゲル、３０．３０’は検出器で第８図を正
面から見たものでめる。レーンＸとＹに２種の混合物１
３．１４を供給し電気泳動すると、核酸断片は分子量の
順に分離されて、検出器３０および３０′を通過する。
核酸断片ＶＣは放射性同位体（たとえば４２Ｐ）が標識
されているので、そこから放射されるβ線を検出する。
されているので、そこから放射されるβ線を検出する。
そしてパルスカウンタ３１および３１′で信号処理し、
β線のカウント数を論理回路３２で参照する。回路３２
の内容は真理値表の論理とし、その結果はプリンタ３３
に出力する。
β線のカウント数を論理回路３２で参照する。回路３２
の内容は真理値表の論理とし、その結果はプリンタ３３
に出力する。
ここで、論理回路３２の一実施例を第４図に示す。パル
スカウンタ３１および３１′の計数値Ｙ。
スカウンタ３１および３１′の計数値Ｙ。
Ｘを計数値比較器４０．４０’で定数にと比較する。比
較器４０．４０’の結果はＹ＜Ｋ、Ｙ≧Ｋ。
較器４０．４０’の結果はＹ＜Ｋ、Ｙ≧Ｋ。
Ｘ＜Ｋ、Ｘ≧にの４種類であり、その組合せは真理値表
に対応する。そこで、これらの組合せで、図のような論
理和をとれば、検出結果がＡ、Ｃ。
に対応する。そこで、これらの組合せで、図のような論
理和をとれば、検出結果がＡ、Ｃ。
Ｇ、Ｔのいずれかを決定することができる。ここで結果
のＡは、カウンタ３１および３１′の計数値が定数によ
りも小さい場合であるが、これは核酸断片が検出器を通
過していない場合と区別する必要がある。でこて、バン
ド間隔が、ある塩基数の範囲で一定であることを仮定し
て、判定タイミングの信号によって、結果がＡであるこ
とを判定する。
のＡは、カウンタ３１および３１′の計数値が定数によ
りも小さい場合であるが、これは核酸断片が検出器を通
過していない場合と区別する必要がある。でこて、バン
ド間隔が、ある塩基数の範囲で一定であることを仮定し
て、判定タイミングの信号によって、結果がＡであるこ
とを判定する。
オートラジオグラフィー法によってＸ線フィルムに感光
させることができる。このＸ線フィルム５０を照明装置
５１に置いて、光源５３と検出器５２をフィルム面に沿
って走査する。これによシＸ線フィルム上の核酸断片の
泳動パターンが画像として画像処理装置５４に出力され
て、核酸塩基の配列が決定できる。この場合、核酸試料
は同時に５ヶ程度の電気泳動を行なうのが一般的である
が、従来の方法によれば電気泳動のレーン数は２０ケ、
必要とする。しかし１本発明による方法でに、レーン数
は１０ケで良＜、２０Ｖ−ンまで同時に解析する場合は
、核酸試料が１０ケまで可能となる。
させることができる。このＸ線フィルム５０を照明装置
５１に置いて、光源５３と検出器５２をフィルム面に沿
って走査する。これによシＸ線フィルム上の核酸断片の
泳動パターンが画像として画像処理装置５４に出力され
て、核酸塩基の配列が決定できる。この場合、核酸試料
は同時に５ヶ程度の電気泳動を行なうのが一般的である
が、従来の方法によれば電気泳動のレーン数は２０ケ、
必要とする。しかし１本発明による方法でに、レーン数
は１０ケで良＜、２０Ｖ−ンまで同時に解析する場合は
、核酸試料が１０ケまで可能となる。
さらに本発明による一実施例を第６図で説明する。第６
図はオートラジオグラフによるＸ線フィルム５０の電気
泳動パターンをライトベン６０で読み取り、処理装置ｆ
、６１で核酸塩基の配列を決定する装置である。この場
合も従来の方法に比較して、本発明による方法では、１
つの泳動パターンに２倍の核酸試料が解析可能になる。
図はオートラジオグラフによるＸ線フィルム５０の電気
泳動パターンをライトベン６０で読み取り、処理装置ｆ
、６１で核酸塩基の配列を決定する装置である。この場
合も従来の方法に比較して、本発明による方法では、１
つの泳動パターンに２倍の核酸試料が解析可能になる。
本発明によれば、電気泳動ゲルのンーχ数が２ケで１ケ
の核酸試料の塩基配列を決定できるので従来の方法と比
較して２倍の核酸試料を解析できる効果がある。また、
核酸断片の生成反応系が、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか一
つを省略できるので。
の核酸試料の塩基配列を決定できるので従来の方法と比
較して２倍の核酸試料を解析できる効果がある。また、
核酸断片の生成反応系が、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか一
つを省略できるので。
反応プロセスを従来よシ大巾に簡単化できる。
第１図に本発明の一実施例の論理を示すフローチャート
図、第２図は第１図の反応生成系の変法の説明図、第３
図は本発明の一実施例で、直接検出装置のブロック図、
第４図は第３図における論理回路の説明図、第５図は本
発明の一実施例で。 フィルム読取装置の説明図、第６図は本発明の一実施例
で、ライトペンによる解析装置の説明図、第７図は従来
の核酸塩基の配列決定装置の説明図。 第８図は従来の直接検出装置の説明図である５２・・・
電気泳動ゲル、１２−Ａ・・・アデニンに特異的断片化
させる反応系、１２−Ｃ，１２−Ｇ、１２−Ｔ・・・谷
、シトシン、グアニン、チミンに特異的断片化させる反
応系、１２′・・・２種の断片生成反応系、３０・・・
直妥検出器、３２・・・塩基配列決定の論理回路、５０
・・・Ｘ線フィルム。 ７．−１代理人 弁
理士 小用勝１．゛男 冨 １ 口 ００Ω・〜″ ↓ ７３、／４ シ昆１３゛・耕ノ（テ 第５図 卯 猶 ６ 図 １ρ ヲヂにヤン
図、第２図は第１図の反応生成系の変法の説明図、第３
図は本発明の一実施例で、直接検出装置のブロック図、
第４図は第３図における論理回路の説明図、第５図は本
発明の一実施例で。 フィルム読取装置の説明図、第６図は本発明の一実施例
で、ライトペンによる解析装置の説明図、第７図は従来
の核酸塩基の配列決定装置の説明図。 第８図は従来の直接検出装置の説明図である５２・・・
電気泳動ゲル、１２−Ａ・・・アデニンに特異的断片化
させる反応系、１２−Ｃ，１２−Ｇ、１２−Ｔ・・・谷
、シトシン、グアニン、チミンに特異的断片化させる反
応系、１２′・・・２種の断片生成反応系、３０・・・
直妥検出器、３２・・・塩基配列決定の論理回路、５０
・・・Ｘ線フィルム。 ７．−１代理人 弁
理士 小用勝１．゛男 冨 １ 口 ００Ω・〜″ ↓ ７３、／４ シ昆１３゛・耕ノ（テ 第５図 卯 猶 ６ 図 １ρ ヲヂにヤン
Claims (1)
- １、核酸塩基の配列決定方法において、４種の塩基特異
的断片生成反応物の１種を他の２種のそれぞれと組み合
わせて２組の試料とする工程及び該２組の試料をそれぞ
れ分子量分離する工程よりなることを特徴とする核酸塩
基の配列決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61177543A JPS6336146A (ja) | 1986-07-30 | 1986-07-30 | 核酸塩基の配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61177543A JPS6336146A (ja) | 1986-07-30 | 1986-07-30 | 核酸塩基の配列決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6336146A true JPS6336146A (ja) | 1988-02-16 |
Family
ID=16032785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61177543A Pending JPS6336146A (ja) | 1986-07-30 | 1986-07-30 | 核酸塩基の配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6336146A (ja) |
-
1986
- 1986-07-30 JP JP61177543A patent/JPS6336146A/ja active Pending
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