JPS6336784A - 酵素の固定化法 - Google Patents
酵素の固定化法Info
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- JPS6336784A JPS6336784A JP61172938A JP17293886A JPS6336784A JP S6336784 A JPS6336784 A JP S6336784A JP 61172938 A JP61172938 A JP 61172938A JP 17293886 A JP17293886 A JP 17293886A JP S6336784 A JPS6336784 A JP S6336784A
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- enzyme
- epoxide
- gel
- water
- enzymes
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- Pending
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
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- Biochemistry (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の新規な固定方法に関する。
固定化した酵素及びその利用は既知である（メソツズ・
イン・エンサイモロジー４４巻インモピライズド・エン
ザイムス・アカデミツク出版社１９７６年及びインモビ
ライズド・エンザイムス・ハルステッド出版社１９７８
年参照）。
イン・エンサイモロジー４４巻インモピライズド・エン
ザイムス・アカデミツク出版社１９７６年及びインモビ
ライズド・エンザイムス・ハルステッド出版社１９７８
年参照）。
酵素をなるべく簡単にかつ大きい費用を要しないで固定
化するため、これをゲル中に埋めこむことは既に試みら
れている。その１例は、酵素含有水性ゲルを、アクリル
アミド及びメチレン−Ｎ、ｂｆ−ビスアクリルアミドを
使用して製造することである（ Ａｃｔａ ％Ｃｈｅｍ
、 ５ｃａｎ 、 ２０巻２８０７頁１９６６年）。
化するため、これをゲル中に埋めこむことは既に試みら
れている。その１例は、酵素含有水性ゲルを、アクリル
アミド及びメチレン−Ｎ、ｂｆ−ビスアクリルアミドを
使用して製造することである（ Ａｃｔａ ％Ｃｈｅｍ
、 ５ｃａｎ 、 ２０巻２８０７頁１９６６年）。
しかしこのゲル中には固定化された酵素が、共有結合な
しで機械的に封入されているにすぎない。そのためゲル
を使用する場合に、酵素が多量に抽出されることになる
。これを避けるため、酵素のアミン基又は水酸基と反応
しうるビニル基含有単量体を酵素と反応しうるビニル基
含有単量体わ酵素と反応させることができる（前記のメ
ンツズ・イン・エンザイモロジー参照）。この処理によ
ると酵素はビニル基含有単量体と同様に挙動し、そして
重合に際して生成したゲル中に共有結合により構成含有
される。しかしこの方法は、不溶性酵素製品を製造する
ために追加の操作工程が必要であり、そして適当な単量
体が多くは入手困難で、かつ酵素活性に対し有害である
ことが欠点である。すべての考えうる欠点をできるだけ
完全に避けようとする方法が、西独特許出願公開２８３
５８７４号明細書に記載されている。この方法では酵素
活性生物物質を多機能エポキシプレポリマーと、次いで
多機能アミンと混合し、最後に数段階を経てポリ電解質
の助けによって、大孔質の球状製品にする。しかしこの
方法は煩雑であり、そして工業的規模で実施する場合に
著しく大きい装置上の費用を必要とする。
しで機械的に封入されているにすぎない。そのためゲル
を使用する場合に、酵素が多量に抽出されることになる
。これを避けるため、酵素のアミン基又は水酸基と反応
しうるビニル基含有単量体を酵素と反応しうるビニル基
含有単量体わ酵素と反応させることができる（前記のメ
ンツズ・イン・エンザイモロジー参照）。この処理によ
ると酵素はビニル基含有単量体と同様に挙動し、そして
重合に際して生成したゲル中に共有結合により構成含有
される。しかしこの方法は、不溶性酵素製品を製造する
ために追加の操作工程が必要であり、そして適当な単量
体が多くは入手困難で、かつ酵素活性に対し有害である
ことが欠点である。すべての考えうる欠点をできるだけ
完全に避けようとする方法が、西独特許出願公開２８３
５８７４号明細書に記載されている。この方法では酵素
活性生物物質を多機能エポキシプレポリマーと、次いで
多機能アミンと混合し、最後に数段階を経てポリ電解質
の助けによって、大孔質の球状製品にする。しかしこの
方法は煩雑であり、そして工業的規模で実施する場合に
著しく大きい装置上の費用を必要とする。
本発明の課題は前記方法の欠点を避けて、できるだけ簡
単に固定を可能にする方法を見出すことであった。
単に固定を可能にする方法を見出すことであった。
本発明は、水溶液中で下記成分
ａ）酵素又は分散された微生物、
ｂ）次式
（式中のＲ１、Ｒ２及びＲ３は水素原子、メチル基又は
エチル基である）のエポキシドの１〜３０当量を、２〜
６個の炭素原子を有する多機能アルコール又はモノもし
くはジサッカライドの１当量（ＯＨ基に関する）に付加
反応させ、得られた付加生成物をエピクロルヒドリンと
反応させ、そして必要に応じエポキシドに環化させるこ
とにより製造された水溶性グリシジルエーテル及び Ｃ）少なくとも２個のＮＨ基を有し、そして一部中和さ
れていてもよい水溶性アミンを混合し、得られた混合物
をゲル状に凝固させることを特徴とする、酵素又は微生
物の固定法である。
エチル基である）のエポキシドの１〜３０当量を、２〜
６個の炭素原子を有する多機能アルコール又はモノもし
くはジサッカライドの１当量（ＯＨ基に関する）に付加
反応させ、得られた付加生成物をエピクロルヒドリンと
反応させ、そして必要に応じエポキシドに環化させるこ
とにより製造された水溶性グリシジルエーテル及び Ｃ）少なくとも２個のＮＨ基を有し、そして一部中和さ
れていてもよい水溶性アミンを混合し、得られた混合物
をゲル状に凝固させることを特徴とする、酵素又は微生
物の固定法である。
固定化に用いられる酵素は純粋な形であることを必要と
しない。細胞の破片を含有する溶液を使用することもで
きる。ただしゲル化のｐＨ条件（ｐＨ７，５〜１１）下
で安定な酵素だけが使用される。適当な酵素（又は酵素
含有物）の例は次のものである。グルコースインメラｉ
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、エラスターゼ、Ｄ−ヒダントイナーゼ、ロイシ
ンアミノペプチダーゼ、ホスホジェステラーゼ、グロテ
アーゼ、アスパラギナーゼ、エステラーゼ、β−ガラク
トースデヒドロゲナーゼ、グリセロキナーゼ、リパーゼ
、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ、アルギナーゼ、ヌクレア
ーゼ及びウリカーゼ。
しない。細胞の破片を含有する溶液を使用することもで
きる。ただしゲル化のｐＨ条件（ｐＨ７，５〜１１）下
で安定な酵素だけが使用される。適当な酵素（又は酵素
含有物）の例は次のものである。グルコースインメラｉ
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、エラスターゼ、Ｄ−ヒダントイナーゼ、ロイシ
ンアミノペプチダーゼ、ホスホジェステラーゼ、グロテ
アーゼ、アスパラギナーゼ、エステラーゼ、β−ガラク
トースデヒドロゲナーゼ、グリセロキナーゼ、リパーゼ
、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ、アルギナーゼ、ヌクレア
ーゼ及びウリカーゼ。
エポキシド、多機能アルコール又はモノ−もしくはジサ
ッカライドとエピクロルヒドリンから得られる水溶性グ
リシジルエーテルは、次式％式％ この式中、ｍは１〜３０の数、ｎは２〜１０の数、Ｘは
多機能アルコール又はモノ−もしくはジ もサツカライドの残基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前
記の意味を有する。ｎは普通は多機能アシ ルコール中又はモノもしくは≠もサツカライド中のＯＨ
基の数に相当する。
ッカライドとエピクロルヒドリンから得られる水溶性グ
リシジルエーテルは、次式％式％ この式中、ｍは１〜３０の数、ｎは２〜１０の数、Ｘは
多機能アルコール又はモノ−もしくはジ もサツカライドの残基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前
記の意味を有する。ｎは普通は多機能アシ ルコール中又はモノもしくは≠もサツカライド中のＯＨ
基の数に相当する。
Ｒ１ないしＲ３は好ましくは水素である。式「において
置換基Ｒ１ないしＲ３は、すべての単位−Ｒ’ ＣＨ−
ＣＲ２Ｒ３−０−において同一ではない。種々の連鎖因
子を有する化合物は、例えば種々のエポキシドの縮合に
より得られる。
置換基Ｒ１ないしＲ３は、すべての単位−Ｒ’ ＣＨ−
ＣＲ２Ｒ３−０−において同一ではない。種々の連鎖因
子を有する化合物は、例えば種々のエポキシドの縮合に
より得られる。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の総数のうちの半分、好ましくは６
分の２は水素であり、これによって生成物は水溶性とな
る。好ましいエポキシドはプロピレンオキシド、ブチレ
ンオキシドそして特にエチレンオキシドである。
分の２は水素であり、これによって生成物は水溶性とな
る。好ましいエポキシドはプロピレンオキシド、ブチレ
ンオキシドそして特にエチレンオキシドである。
化合物■の代わりに、対応するクロルヒドリンも使用で
き、これからアミンの影響により中間的にエポキシドが
生成する。
き、これからアミンの影響により中間的にエポキシドが
生成する。
多機能アルコールとしては、例えばグリセリン、ペンタ
エリトリット、トリメチロールグロバン及びソルビット
が適する。モノ−又はジサッカライドとしては、特にグ
ルコース及び蔗糖が用いられる。
エリトリット、トリメチロールグロバン及びソルビット
が適する。モノ−又はジサッカライドとしては、特にグ
ルコース及び蔗糖が用いられる。
好適な水溶性アミンは、アンモニア、−級脂肪族アミン
例えばメチル−、エチル−、プロピル−又はブチルアミ
ン、−級もしくは二級の脂肪族ジアミン例えばＨ２Ｎ
（ＣＨ２） ｎ−ＮＨ２（ｎは２ないしろ）及び脂肪
族ポリイミンである。特に好ましいアミンはポリエチレ
ンイミンである。
例えばメチル−、エチル−、プロピル−又はブチルアミ
ン、−級もしくは二級の脂肪族ジアミン例えばＨ２Ｎ
（ＣＨ２） ｎ−ＮＨ２（ｎは２ないしろ）及び脂肪
族ポリイミンである。特に好ましいアミンはポリエチレ
ンイミンである。
アミンの量は、エポキシ基対アミン基の比が１＝１．４
ないし１：２０、好ましくは１：１．７ないし１：６と
なるように選ばれる。固定化される酵素が過度のアルカ
リ性条件によって損われることを避けるため、アミンを
混合する前に酸れるｐＨ価は特に８ないし？である。
ないし１：２０、好ましくは１：１．７ないし１：６と
なるように選ばれる。固定化される酵素が過度のアルカ
リ性条件によって損われることを避けるため、アミンを
混合する前に酸れるｐＨ価は特に８ないし？である。
酵素活性の溶液又は懸濁液の量に対するエポキシド及び
アミンの比率は、一方では両反応成分の溶解性が保証さ
れ、他方では系の過度の希釈によって軟かいゲルが生成
することのないように選ばれる。両成分の正しい比率は
、予備実験により最良に定めることができる。
アミンの比率は、一方では両反応成分の溶解性が保証さ
れ、他方では系の過度の希釈によって軟かいゲルが生成
することのないように選ばれる。両成分の正しい比率は
、予備実験により最良に定めることができる。
混合の順序としては、まずエポキシドを、次いでアミン
を添加することが優れている。混合時の温度は、０℃と
固定化される酵素の著しい変質がまだ起こらない温度と
の間にある。混合は室温で行うことが好ましい。ゲル生
成中の温度も、同じように規制される。
を添加することが優れている。混合時の温度は、０℃と
固定化される酵素の著しい変質がまだ起こらない温度と
の間にある。混合は室温で行うことが好ましい。ゲル生
成中の温度も、同じように規制される。
酵素又は酵素含有物（細胞又は細胞成分）は、ゲルの機
械的強度が耐えうる程度、又は酵素の活性が拡散限度に
よってもはや完全に保護されなくなるまでの濃度までゲ
ルに混合できる。純粋な酵素では、上限は３０〜５０ｍ
９／Ｅｌゲルの程度にある。
械的強度が耐えうる程度、又は酵素の活性が拡散限度に
よってもはや完全に保護されなくなるまでの濃度までゲ
ルに混合できる。純粋な酵素では、上限は３０〜５０ｍ
９／Ｅｌゲルの程度にある。
酵素活性ゲルの弾性及び密度は、生成した混合物が、微
粒の不活性材料例えば活性炭、珪藻土又は合成樹脂強化
用の材料、あるいは合成樹脂粉末を、生成１〜だ混合物
に対し１００重量％までの量で添加される場合に、適宜
に変更しうる。不活性材料の酵素に対する調和性は、少
量の試料について試験することにより定めることが好ま
しい。
粒の不活性材料例えば活性炭、珪藻土又は合成樹脂強化
用の材料、あるいは合成樹脂粉末を、生成１〜だ混合物
に対し１００重量％までの量で添加される場合に、適宜
に変更しうる。不活性材料の酵素に対する調和性は、少
量の試料について試験することにより定めることが好ま
しい。
特に強度の高い酵素活性製品を得るだめの他の方法は、
生成した混合物を、不活性の多孔質材料例えば珪藻土、
ガラス繊維フリース、多孔質イオン交換体、開放気泡発
泡体、合成吸着体、多孔質鉱物体例えば陶土又は軽石の
小孔中に加入加工することである。その逆（（、例えば
密度又は圧縮性を変えるため、不活性物質例えば前記の
もの又は砂その他の微粒材料を、ゲルに混合加工するこ
ともできる。最後に酵素活性ゲルを、その使用前に乾燥
することによって、さらに強化することもできる。
生成した混合物を、不活性の多孔質材料例えば珪藻土、
ガラス繊維フリース、多孔質イオン交換体、開放気泡発
泡体、合成吸着体、多孔質鉱物体例えば陶土又は軽石の
小孔中に加入加工することである。その逆（（、例えば
密度又は圧縮性を変えるため、不活性物質例えば前記の
もの又は砂その他の微粒材料を、ゲルに混合加工するこ
ともできる。最後に酵素活性ゲルを、その使用前に乾燥
することによって、さらに強化することもできる。
このゲルは、行われる反応のために適当で、そして固定
化酵素がこの環境で活性であるならば、無水ないしほと
んど無水の溶剤中で使用することもできる。
化酵素がこの環境で活性であるならば、無水ないしほと
んど無水の溶剤中で使用することもできる。
その活性を発揮させるために金属イオンが必要な酵素の
固定化の場合は、生成された混合物に、対応する金属の
難溶性酸化物又は塩（なるべく微粉状で）を添加するこ
とが推奨される。
固定化の場合は、生成された混合物に、対応する金属の
難溶性酸化物又は塩（なるべく微粉状で）を添加するこ
とが推奨される。
本発明の固定化方法により得られるゲルは、拡散条件下
の活性損失を避けるため、薄膜の形で製造し又は粉砕す
ることができる。このため４えばふるいを通すか、ある
いは押出し機により調整する。この場合は混合物の工業
的要求に応じて、粒径を約０．１〜５１ｍ１Ｃすべきで
ある。微粒状ゲルを得るための他の方法は、生成した混
合物を有機の水と混合しない溶剤中に′懸濁させること
である。この場合は懸濁液を、ゲル生成が終了するまで
攪拌する。こうして粒径が約０．２〜２朋の微粒状のゲ
ルが得られ、これをふるいにより溶剤と分離することが
できる。
の活性損失を避けるため、薄膜の形で製造し又は粉砕す
ることができる。このため４えばふるいを通すか、ある
いは押出し機により調整する。この場合は混合物の工業
的要求に応じて、粒径を約０．１〜５１ｍ１Ｃすべきで
ある。微粒状ゲルを得るための他の方法は、生成した混
合物を有機の水と混合しない溶剤中に′懸濁させること
である。この場合は懸濁液を、ゲル生成が終了するまで
攪拌する。こうして粒径が約０．２〜２朋の微粒状のゲ
ルが得られ、これをふるいにより溶剤と分離することが
できる。
本発明の固定化方法は、混合、固化及び粉砕の工程だけ
から成るので、特に簡単である点で浸れている。水溶性
エポキシドを使用することによって、エポキシドと酵素
の緊密な混合が得られ、これはエポキシド基による生成
ゲルへの酵素の共有結合を容易にする。本発明の固定化
方法によってＤ−ヒダントイナーゼの寿命が著しく向上
されることは、特に予想外のことである。
から成るので、特に簡単である点で浸れている。水溶性
エポキシドを使用することによって、エポキシドと酵素
の緊密な混合が得られ、これはエポキシド基による生成
ゲルへの酵素の共有結合を容易にする。本発明の固定化
方法によってＤ−ヒダントイナーゼの寿命が著しく向上
されることは、特に予想外のことである。
例１
グリシジルエーテルの製造
ソルビット−ＥＯ８ｏ（ソルビット１モルとエチレンオ
キシド８０モルからの反応生成物、ホウベン−ワイル著
、メトーデン・デル・オルガニツシエン・ヘミ−１４／
２巻１９６６年４５０頁参照）３７０５ｇに、ＢＦ３二
水和水和物１４ｇを添加し、７０℃で攪拌しながらエピ
クロルヒドリン５５５ｇを滴加する。さらに７０’Ｃで
２時間攪拌したのち、２０〜６５℃で５０％苛性ソーダ
液５２８ｇを１〜２時間かけて滴加し、苛性ソーダの約
９０％が消費されるまで攪拌する。
キシド８０モルからの反応生成物、ホウベン−ワイル著
、メトーデン・デル・オルガニツシエン・ヘミ−１４／
２巻１９６６年４５０頁参照）３７０５ｇに、ＢＦ３二
水和水和物１４ｇを添加し、７０℃で攪拌しながらエピ
クロルヒドリン５５５ｇを滴加する。さらに７０’Ｃで
２時間攪拌したのち、２０〜６５℃で５０％苛性ソーダ
液５２８ｇを１〜２時間かけて滴加し、苛性ソーダの約
９０％が消費されるまで攪拌する。
苛性ソーダの消費は滴定により追跡される。
次いで水の土量を７０℃で水流ポンプの真空で留去し、
残留・物を熱時（７０’Ｃ）吸引ｆ過する。エピクロル
ヒドリンとソルビット−ＥＯ８ｏの反応生成物が３４３
９ｇ（８５％）得られ、そのエポキシド滴定値は１．２
〜ｔ ３ ｍｎａｌ ／ 、！ｉ’である。
残留・物を熱時（７０’Ｃ）吸引ｆ過する。エピクロル
ヒドリンとソルビット−ＥＯ８ｏの反応生成物が３４３
９ｇ（８５％）得られ、そのエポキシド滴定値は１．２
〜ｔ ３ ｍｎａｌ ／ 、！ｉ’である。
この生成物は式■において、Ｘがソルビット残基、Ｒ１
、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが１．６４そしてｎが６
である化合物である。
、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが１．６４そしてｎが６
である化合物である。
同様にして次の化合物が製造される。
ｂ）エピクロルヒドリンとペンタエリトリット−ＥＯ，
の反応生成物。収率８６％、エポキシド滴定値： １．
６ ｍＶａｌ／、ｊ；。この生成物は式■において、Ｘ
がペンタエリドツトＡ残基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素
原子、ｍが１０そしてｎが４である化合物である。
の反応生成物。収率８６％、エポキシド滴定値： １．
６ ｍＶａｌ／、ｊ；。この生成物は式■において、Ｘ
がペンタエリドツトＡ残基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素
原子、ｍが１０そしてｎが４である化合物である。
ｃ）ｂと同様に操作し、ただしペンタエリトリツ）−Ｅ
ｏ、７を使用する。収率８６％、エポキシド滴定値：
０．９ ｍＶａｌ ／ ｇ、ｍ＝１４．３、ｎ ＝ ４
゜ｄ）エピクロルヒドリンとグリセリン−Ｅ０６０の反
応生成物。収率７８％、エポキシド滴定値二〇、 ９
ｍＶａ、１ ／ ｇ。この生成物は式Ｈにおいて、Ｘが
グリセリン残基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが
２０そしてｎが６である化合物である。
ｏ、７を使用する。収率８６％、エポキシド滴定値：
０．９ ｍＶａｌ ／ ｇ、ｍ＝１４．３、ｎ ＝ ４
゜ｄ）エピクロルヒドリンとグリセリン−Ｅ０６０の反
応生成物。収率７８％、エポキシド滴定値二〇、 ９
ｍＶａ、１ ／ ｇ。この生成物は式Ｈにおいて、Ｘが
グリセリン残基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが
２０そしてｎが６である化合物である。
ｅ）エピクロルヒドリンとソルビット−ＥＯ３ｏの反応
生成物。収率８４％、エポキシド滴定値：１、９ ｍＶ
ａｌ ／ ｊｊ。この生成物は式Ｈにおいて、Ｘがソル
ビット残基、Ｒ’、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが５そ
してｎが６である化合物である。
生成物。収率８４％、エポキシド滴定値：１、９ ｍＶ
ａｌ ／ ｊｊ。この生成物は式Ｈにおいて、Ｘがソル
ビット残基、Ｒ’、Ｒ２及びＲ３が水素原子、ｍが５そ
してｎが６である化合物である。
ｆ）エピクロルヒドリンとトリメチロールプロパン−Ｅ
ｏ４ｏの反応生成物。収率８１％、エポキシド滴定値：
１．２ ｍＶａｌ ／ ｊｊ ０この生成物は式■に
おいて、ＸがトリメチロールプロパンＲ１、Ｒ２及びＲ
３が水素原子、ｍが１６．４モしてｎが６である化合物
である。
ｏ４ｏの反応生成物。収率８１％、エポキシド滴定値：
１．２ ｍＶａｌ ／ ｊｊ ０この生成物は式■に
おいて、ＸがトリメチロールプロパンＲ１、Ｒ２及びＲ
３が水素原子、ｍが１６．４モしてｎが６である化合物
である。
例２
リパーゼの固定
ガラスフラスコ中で室温で下記の順序で混合を行い、−
夜装置してゲルを製造し、これを目幅２朋のふるいを圧
力をかけて押し通して細砕する。
夜装置してゲルを製造し、これを目幅２朋のふるいを圧
力をかけて押し通して細砕する。
ａ）０．０５Ｍトリス（トリス−ヒドロキシメチルアミ
ン塩酸塩）−緩衝液（１）Ｈ８，５） ７．７ 、！ｉ
’中のパンクレアスーリパーゼ（Ｆｌｕｋａ Ａ ６２
０００）２．３ｇの溶液１０ｇ、 例１ａ）により製造されたグリシジルエーテル６、５．
９ 。
ン塩酸塩）−緩衝液（１）Ｈ８，５） ７．７ 、！ｉ
’中のパンクレアスーリパーゼ（Ｆｌｕｋａ Ａ ６２
０００）２．３ｇの溶液１０ｇ、 例１ａ）により製造されたグリシジルエーテル６、５．
９ 。
塩酸でｐＨ９，０にされたポリエチレンイミン溶液４夕
。ポリエチレンイミンの分子量は約４００００、ポリエ
チレンイミンの量は２５重量％。
。ポリエチレンイミンの分子量は約４００００、ポリエ
チレンイミンの量は２５重量％。
ｂ）パンクレアスーリパーゼ（ａ参照）の溶液５ｇ、０
．０５ Ｍ ）リス−緩衝液５ｍｌ （ｐＨ８，５）、
例１ａのグリシジルエーテル６．５ｇ、ポリエチレンイ
ミン溶液（ａ参照）４ｇ。
．０５ Ｍ ）リス−緩衝液５ｍｌ （ｐＨ８，５）、
例１ａのグリシジルエーテル６．５ｇ、ポリエチレンイ
ミン溶液（ａ参照）４ｇ。
リパーゼ活性の測定は、６０℃でｐＨ一定で操作する装
置内で行われる。トリブチリン（グリセリントリブチラ
ード）１ｇを０．０２ Ｍはう砂／ＨＣｌ−緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ５０ ｒｎｌに乳化する。
置内で行われる。トリブチリン（グリセリントリブチラ
ード）１ｇを０．０２ Ｍはう砂／ＨＣｌ−緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ５０ ｒｎｌに乳化する。
比較のため強く攪拌しながら固定化しないパンクレアス
ーリパーゼ２５ｒｖを使用する。ｐＨ価を一定に保持す
るため、０．５Ｎ苛性ソーダ液を添加する。３．３ μ
ｍｏｌ ＮａＯＨ／ ｍ９リパーゼ・分が消費される。
ーリパーゼ２５ｒｖを使用する。ｐＨ価を一定に保持す
るため、０．５Ｎ苛性ソーダ液を添加する。３．３ μ
ｍｏｌ ＮａＯＨ／ ｍ９リパーゼ・分が消費される。
この実験を固定化された当量のリパーゼを用いて繰り返
すと、次の値が得られる。
すと、次の値が得られる。
ゲルａ） ： ０．２９ ／！７ ｍｏｌ ＮａＯＨ／
Ｉｎ＜）リパーゼ・分ゲルｂ） ： ０．２６ ＩＩ
ｍｏｌ ＮａＯＨ／ ｍ９リパーゼ・分これによって一
般に固定化困難なリパーゼが、本方法により固定化され
ることが証明される。
Ｉｎ＜）リパーゼ・分ゲルｂ） ： ０．２６ ＩＩ
ｍｏｌ ＮａＯＨ／ ｍ９リパーゼ・分これによって一
般に固定化困難なリパーゼが、本方法により固定化され
ることが証明される。
例６
サブチリシンの固定
同時に硫酸亜鉛の０． ＯＯ２Ｍ溶液であり、そして１
４ｍ１中にサブチリシン（シグマ社のプロテアーゼ■型
）６０ｍ９を含有する０、 ０２ Ｍはう砂−緩衝液１
４ｍ１を、ガラスフラスコ中で室温で例１ｂのグリシジ
ルエーテル９７５ｇ及びポリエチレンイミン／ＨＣＩ溶
液（ポリエチレンイミンの分子量約４００００． ｐＨ
８，５、ポリエチレンイミン：２５重量％）６ｇと混合
した。
４ｍ１中にサブチリシン（シグマ社のプロテアーゼ■型
）６０ｍ９を含有する０、 ０２ Ｍはう砂−緩衝液１
４ｍ１を、ガラスフラスコ中で室温で例１ｂのグリシジ
ルエーテル９７５ｇ及びポリエチレンイミン／ＨＣＩ溶
液（ポリエチレンイミンの分子量約４００００． ｐＨ
８，５、ポリエチレンイミン：２５重量％）６ｇと混合
した。
−夜放置して固化した混合物を、目幅０．８ ｍＮのふ
るいを圧力をかけて押し通して細砕した。
るいを圧力をかけて押し通して細砕した。
酵素活性の測定は、Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−口イシル−Ｌ
−リシン−ｐ−ニトロアニリドニ塩・２ＨＣ１）の分解
により行われ、その場合遊離されるｐ−ニトロアニリン
の量（ε＝ ９．６２７／ ｍ ｍｏｌ ”Ｃｒｎ）は
、４０５ ｎｍでの光吸収の定量により測定された。
−リシン−ｐ−ニトロアニリドニ塩・２ＨＣ１）の分解
により行われ、その場合遊離されるｐ−ニトロアニリン
の量（ε＝ ９．６２７／ ｍ ｍｏｌ ”Ｃｒｎ）は
、４０５ ｎｍでの光吸収の定量により測定された。
使用溶液：緩衝液：はう砂、０．０２ Ｍ 、 ｐＨ７
，５゜基質： Ｓ ２２５１ （Ｈ−Ｄ −Ｖａｌ −
Ｌ −Ｌｅｕ−ＬＹＳ −ＮＨ＋Ｎｏ□＠２ ＨＣ１、
ストックホルムのカセイ・デ ィアグノステイカ社製）。こ の基質を前記はう砂−緩衝液 中で、５ ｍｙ ／ ｍｌの濃度で使用した。
，５゜基質： Ｓ ２２５１ （Ｈ−Ｄ −Ｖａｌ −
Ｌ −Ｌｅｕ−ＬＹＳ −ＮＨ＋Ｎｏ□＠２ ＨＣ１、
ストックホルムのカセイ・デ ィアグノステイカ社製）。こ の基質を前記はう砂−緩衝液 中で、５ ｍｙ ／ ｍｌの濃度で使用した。
酵素ニブロチアーゼ■型、シグマ社
製。比軟定量のため、酵素を
前記はう砂−緩衝液中で、１゜
５ ｍｅ） ／ ｍｌの濃度で使用した。
活性測定のため、基質溶液１ｍｌ、緩衝液１．６ｍｌ及
び酵素溶液４００μｌならびに当量の固定化酵素を、開
放容器中に１ｃｍの厚さに加入し、この容器を手でゆっ
くりかつ一定に１０分間振とうした。次いで吸光を測定
した。固定化酵素離酵素では、０．０２４μｍｏｌ ｐ
−ニトロアニリン／ｍ９酵素・分の活性が与えられた。
び酵素溶液４００μｌならびに当量の固定化酵素を、開
放容器中に１ｃｍの厚さに加入し、この容器を手でゆっ
くりかつ一定に１０分間振とうした。次いで吸光を測定
した。固定化酵素離酵素では、０．０２４μｍｏｌ ｐ
−ニトロアニリン／ｍ９酵素・分の活性が与えられた。
固定化酵素における対応する値は、０．０１９μｍｏｌ
ｐ−ニトロアニリン／ｍｑ酵素・分であった。
ｐ−ニトロアニリン／ｍｑ酵素・分であった。
例４
Ｄ−ヒダントイナーゼの固定
凍結乾燥したＤ−ヒダントイナーゼ活性を有する微生物
ＣＢＳ ３０３．８０の超音波により破砕された１０％
水性懸濁液（西独特許出願公開６０３１１５１号参照）
を使用した。これを固定化するため、ガラスフラスコ中
で室温で、下記の成分とそこに示される順序で混合し、
−夜放置して固化させ、生成したゲルを圧力をかげて目
幅１ｍｍのふるいを押し通すことにより細砕した。
ＣＢＳ ３０３．８０の超音波により破砕された１０％
水性懸濁液（西独特許出願公開６０３１１５１号参照）
を使用した。これを固定化するため、ガラスフラスコ中
で室温で、下記の成分とそこに示される順序で混合し、
−夜放置して固化させ、生成したゲルを圧力をかげて目
幅１ｍｍのふるいを押し通すことにより細砕した。
ｍｌ。
例１ｅ）のグリシジルエーテル１ｇ、
１００％メーＩＦ−、Ｑｚ７ミン０．９ ｍｌ ０実験
４ｂ）前記微生物３０３．８０の）゛め濁液２．５ｍｌ
。
４ｂ）前記微生物３０３．８０の）゛め濁液２．５ｍｌ
。
前記グリシジルエーテル１９．
６−（２−アミノエチル）−アミノ
プロピルアミン１．２ ｍｔ！。
実験４ｃ）前記微生物３０３．８０の懸濁液２．５ｍｌ
、 前記グリシジルエーテル１ｇ、 微粉温石０．０５ ｇ、 ポリエチレン溶１１．９（塩酸でｐＨ ９にした）。ポリエチレンの分子量 は約４００００、ポリエチレンイミ ンの量は２５重量％。
、 前記グリシジルエーテル１ｇ、 微粉温石０．０５ ｇ、 ポリエチレン溶１１．９（塩酸でｐＨ ９にした）。ポリエチレンの分子量 は約４００００、ポリエチレンイミ ンの量は２５重量％。
酵素活性の測定は、６０°ＣでｐＨ一定で操作する装置
内、で行われた。基質としては５−メチルチオエチルヒ
ダントインな、０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ
８，５）中の１０ ｍｙ ／ｍｌの濃度で使用した。活
性は１Ｎ苛性ソーダ液の消費により測定された。比較試
験において遊離の超音波により破砕された微生物ＣＢＳ
６０３．８０は、毎分４０２ μｍＯＩ ＮａＯＨ／
ｊｊ微生物（乾燥）の消費を示した。固定化物におい
ては次の値が得られた。
内、で行われた。基質としては５−メチルチオエチルヒ
ダントインな、０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ
８，５）中の１０ ｍｙ ／ｍｌの濃度で使用した。活
性は１Ｎ苛性ソーダ液の消費により測定された。比較試
験において遊離の超音波により破砕された微生物ＣＢＳ
６０３．８０は、毎分４０２ μｍＯＩ ＮａＯＨ／
ｊｊ微生物（乾燥）の消費を示した。固定化物におい
ては次の値が得られた。
実、験４ ａ） ： １ μｍｏｌ ＮａＯＨ／ ｉ固
定化物・分実験４ ｂ） ： ２ μｍｏｌ ＮａＯＨ
／ ｇ固定化物・分実験４ Ｃ） ： １１μｍｏｌ
ＮａＯＨ／ 、！ｉ’固定化物書分１週間後にも固定化
物は最初の活性の５０％以上を保有したが、遊離微生物
の活性は約４時間後にほとんど消失した。
定化物・分実験４ ｂ） ： ２ μｍｏｌ ＮａＯＨ
／ ｇ固定化物・分実験４ Ｃ） ： １１μｍｏｌ
ＮａＯＨ／ 、！ｉ’固定化物書分１週間後にも固定化
物は最初の活性の５０％以上を保有したが、遊離微生物
の活性は約４時間後にほとんど消失した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、水溶液中で下記成分 ａ）酵素又は分散された微生物、 ｂ）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＾１、Ｒ＾２及びＲ＾３は水素原子、メチル
基又はエチル基である）のエポキシドの１〜３０当量を
、２〜６個の炭素原子を有する多機能アルコール又はモ
ノもしくはジサッカライドの１当量（ＯＨ基に関する）
に付加反応させ、得られた付加生成物をエピクロルヒド
リンと反応させ、そして必要に応じエポキシドに環化さ
せることにより製造された水溶性グリシジルエーテル及
び ｃ）少なくとも２個のＮＨ基を有し、そして一部中和さ
れていてもよい水溶性アミンを混合し、得られた混合物
をゲル状に凝固させることを特徴とする、酵素又は微生
物の固定法。 ２、酵素としてリパーゼ、アルカリ性プロテアーゼ又は
Ｄ−ヒダントイナーゼを使用することを特徴とする、特
許請求の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853527014 DE3527014A1 (de) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Verfahren zur immobilisierung von enzymen |
| DE3527014.4 | 1985-07-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6336784A true JPS6336784A (ja) | 1988-02-17 |
Family
ID=6276999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61172938A Pending JPS6336784A (ja) | 1985-07-27 | 1986-07-24 | 酵素の固定化法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4767707A (ja) |
| EP (1) | EP0210499B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6336784A (ja) |
| AT (1) | ATE68202T1 (ja) |
| CA (1) | CA1277267C (ja) |
| DE (2) | DE3527014A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008509226A (ja) * | 2004-05-24 | 2008-03-27 | ジェンボールト コーポレイション | 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1197070B (it) * | 1986-08-06 | 1988-11-25 | Foscama Biomed Chim Farma | Procedimento ed impianto per la produzione in continuo di fruttosio-1,6-difosfato mediante utilizzazione di lievito di birra immobilizzato |
| DE3737335A1 (de) * | 1987-11-04 | 1989-05-18 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung eines biokatalysators und dessen verwendung zur razematspaltung |
| DE3819467A1 (de) * | 1988-06-08 | 1989-12-14 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung eines biokatalysators und dessen verwendung zur razematspaltung |
| CN1034023C (zh) * | 1995-04-08 | 1997-02-12 | 安徽省蚌埠柠檬酸厂 | 一种柠檬酸或柠檬酸钠的制备方法 |
| CN105002256B (zh) * | 2015-08-05 | 2018-02-23 | 杭州人可生物制品有限公司 | 复合酶法拆分制备旋光纯r－（－）坦索洛新的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2835874C3 (de) * | 1978-08-16 | 1981-02-26 | 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen Biokatalysatoren mit hoher enzymatischer Aktivität und perlförmiger Biokatalysator |
| US4334027A (en) * | 1980-02-25 | 1982-06-08 | Joachim Klein | Preparation of immobilized enzymatically-active substance |
| US4347320A (en) * | 1980-11-24 | 1982-08-31 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of microorganisms in gelled carrageenan |
-
1985
- 1985-07-27 DE DE19853527014 patent/DE3527014A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-11 AT AT86109483T patent/ATE68202T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-11 EP EP86109483A patent/EP0210499B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-11 DE DE8686109483T patent/DE3681845D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-23 CA CA000514508A patent/CA1277267C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-24 JP JP61172938A patent/JPS6336784A/ja active Pending
- 1986-07-25 US US06/889,392 patent/US4767707A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008509226A (ja) * | 2004-05-24 | 2008-03-27 | ジェンボールト コーポレイション | 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管 |
| JP2011236237A (ja) * | 2004-05-24 | 2011-11-24 | Genvault Corp | 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1277267C (en) | 1990-12-04 |
| DE3527014A1 (de) | 1987-02-05 |
| EP0210499A2 (de) | 1987-02-04 |
| ATE68202T1 (de) | 1991-10-15 |
| US4767707A (en) | 1988-08-30 |
| DE3681845D1 (de) | 1991-11-14 |
| EP0210499A3 (en) | 1989-03-29 |
| EP0210499B1 (de) | 1991-10-09 |
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