JPS6336796A - マウス−ヒトキメラ抗体、それをコ−ドする発現型キメラｄｎａ配列、プラスミド及び細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、マウス−ヒトキメラ抗体、それをコードする
キメラＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列が組み込まれたプラ
スミド及びそのプラスミドが導入された細胞に関するも
のである。更に詳しくは、ヒト急性白血病リンパ腫共通
抗原と特異的に反応するマウス−ヒトキメラ抗体及びそ
れに関連する一連の発明に関するものである。

ｂ、従来技術 一般に免疫グロブリン遺伝子は、Ｈ＃Ｉ（Ｈｅａｖｙ　
Ｃｈａｉｎ　）とＬ　蹟（Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　）
とから構成され、それぞれは抗原と特異的に結合する機
能を有するｖｇ４域（可変領域）とイ７エクター機能を
有するＣ領域（定常領域）とを有している。

一方マウスの抗体におけるＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子に関し
てそれらのＶ＠域とＣ領域の両領域に含まれる種々の遺
伝子単位をはじめ、プロモーター、エンハンサ−などの
種々の機能を有する単位の存在が明らかにされ、その一
部はＤＮＡ配列が明らかにされている。

一方、最近になってモノクローナル抗体の技術が進歩し
、病態の診断、制御、予防等の免疫学的診断及び治療へ
の応用が期待され℃いる。

かかるモノクローナル抗体の利用においてはヒト抗体を
用いるのが最適である。しかしヒトの場合にはマウスの
・−イグリドーマ生産技術はどモノクローナル抗体製造
技術は進んでおらず、各糧の特異性をもった抗体を得る
には制限が多（、この免疫学的診断、治療には多（の制
約がある。この困難さを克服する一つの手段とじ℃ヒト
抗体に酷似し℃いてヒト体内で異物とし℃認識される事
の少い抗体を人為的に創製し、この抗体を免疫学的診断
、治療に利用する椹が考えられる。このような抗体とし
て最近マウスの成る植の抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領
域とからなるキメラ抗体が提案すれている（特開昭６０
−１５５１３２号公報参照）。

そこで本発明者の一部は、上記のような観点からヒトの
免疫学的診断及び治療に応用ｉｊＪ能な耕規キメラ抗体
を１１１製することを目的として研究を行ったところ、 （ａｔ　　マウス抗体ｕ＠ｖａ域のアミノ酸配列とｔｂ
ｌ　　ヒト抗体ＨＭＣ領域のアミノ酸配列とからなりヒ
ト急性白血病リンパ腫共通抗原に特異的に反応するマー
クスーヒトキメラ抗体ＩＩ鎖を見出し先に提案した（を
特願昭６１−４１９８３号明細を参照；昭和６１年２月
２８日付出願）。

本発明者は、前記マウス−ヒトキメラ抗体Ｈ鎖のｊｌｊ
製に続いて、マウス−ヒトキメラ抗体り蹟を取得すべ（
、更に研究ｔｔ進めたところ、（Ｈマウス抗体ＬＭＶ領
域のアミノ酸配列と（１１）　　ヒト抗体り鎖Ｃ領域の
アミノ酸配列とからなり、ヒト急性白血病リンパ腫共通
抗原と特異的に反応し得るマウス−ヒトキメラ抗体り鎖
を得ることができ既に提案した。

そこで本発明者は、前述の研究を更に進展させて、抗体
のＨ顕及び［、ｄの双方を含む完全キメラ抗体を得るべ
（研究を亜ねた。

Ｃ６発明の目的 本発明の目的は、ヒト急性白血病リンパ腫共通抗原と特
異的に反応するマウス−ヒト児全キメラ抗体を提供する
ことにある。

本発明の他の目的は、前記キメラ抗体をコードする発現
型のキメラＤＮＡ配列を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、か−る発現型のキメラＤＮＡ
配列を組み込んだプラスミド及びそのプラスミドを導入
した細胞を提供することにある。

本発明の更に他の目的は以下の説明から一層明らかとな
るであろう。

ｄ０発明の構成 本発明によれば、前記本発明の目的は、（ａｌ　　Ｈ＠
及びＬＭにおけるＶ領域がマウス由来のアミノ酸配列で
あり。

ｔｂｌ　　Ｈ鎖及びＬ頌におけるＣ領域がヒト由来のア
ミノ酸配列であって、かつ （ｃｌ　　ヒト急性白血病リンパ腫共通抗原と特異的に
反応する ことによって特徴付けられるマウス−ヒトキメラ抗体を
提供することによって達成される。

ヒト急性白崩病すンパ肺共通抗原は、各種の白血病リン
パ腫患者の血中にみられる抗原であり、前記本発明によ
って提供されるマウス−ヒトキメラ抗体は、この共通抗
原に特異的に反応し且つヒトに対し異物としてｇａｐさ
れることの少ないかされ難い抗体であるから、ヒト急性
白血病リンパ腫患者の免疫学的診断及び治療に極めて寄
与するものである。

以下本発明について更に詳細に説明する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ｃＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａ　　Ｌ−アラニン Ａｒｇ　　Ｌ−フルギニン Ａｓｎ　　Ｌ−アスパラギン Ａｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 ｃｔｙ　　グリシン Ｈｌｓ　　Ｌ−ヒスチジン １１ｅ　　Ｌ−インロイシン ［、ｅｕ　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　Ｌ−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン ＴｒｐＬ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩羞の’ｔｉｉｍで略記するもの
とし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチンルｔａｒｔ示す。）Ｇ　グアニン（
デオキシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシ
チミジル酸な示す。）本発明のマウス−ヒトキメラ抗体
は、■領域がＨ鎖及びＬ鎖共にマウス由来のものであり
、そのアミノ酸配列がヒト急性白血病リンパ腫共通抗原
に対して特異的に反応するマウス抗体に由来するもので
ある。具体的にはＨ鎖のＶ領域におけるアミノ酸配列は
添付第１図に示されたアミノ酸配列であることができる
。さらにＬＭのＶ領域におけろアミノ酸配列は添付第３
図に示されたアミノ酸配列中１番目（Ｇｌｕ　）から９
７７番目Ｌｅｕ）までの配列を少くとも含んでいればよ
（、またｌ番目（Ｇｌｕ）から１０９番目（Ａｒｇ　）
までの配列であってもよい。

また本発明のマウス−ヒトキメラ抗体において、Ｃ領域
のヒト由来のアミノ酸配列が、ＬＭはヒト抗体のに頌に
由来するものであり、且つＨ鎖はヒト抗体のＣｒ、　１
１１に由来するものであることができる。Ｃ領域のＩ（
鎖は具体的には添付第２図のアミノ酸配列であることが
でき、またＬ鎖は具体的には添付第４図のアミノ酸配列
であることができる。

本発明によれば、更に前記マウス−ヒトキメラ抗体のア
ミノ酸配列をコードしたキメラＤＮＡ配列が提供される
。このキメラＤＮＡ配列の具体的な配列としては以下に
示すものであることができる。このＬ）ＮＡ配列は、理
解を谷筋にするためにＨＩＣにおけるマウス−ヒトキメ
ラＤＮＡ配列とＬＭにおけるマウス−ヒトキメラＤＮＡ
配列とのそれぞれについて分けて説明する。

■　抗体Ｈａにおけるマウス−ヒトキメラＤＮＡ配列 このキメラＤＮＡ配列は、本発明者らの一部が先に提案
した特願昭６ｉ−４１９８３’ｊｊ明細書に記載された
キメラＤＮＡ配列と同じものであることができる。

ｊ　１ｇわち、Ｈ鎖のＶ＠域における７９ス由来のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は第６図に示すＤＮＡ
配列及びその相補鎖を具体的配列として示すことができ
る。この第６図に示されたｌ（鎖Ｖ領域のアミノ酸配列
をコードするＬ）ＮＡ配列は、同第６図に示されている
よ５ＫＶ遺伝子、Ｄ遺伝子及びＪ、遺伝子のそれぞれを
コードしているＶ−セグメント。

Ｌ）−セグメント及びＪ、−セグメントより構成されて
いる。

ＩＩ鎖のＣ領域におけろヒト由来の７４／１％ｉ配列を
コードするＩＪＮＡ配列の具体例は、第７図−（１）及
び謁７図−（２）に示すような配列及びその相補鎖であ
う。このＣ領域におけるＤＮＡ配列は、第７図に示され
るように、Ｃ４１−セグメント、ヒンジ　（ｈ）−セグ
メント、　　Ｃ３ｉ２−セグメント及びＣＨ３−セグメ
ントより構成される。

上記した１ｉ鎖における■領域のＤＮＡ配列（マウス白
米）とＣ領域のＤＮＡ配列（ヒト由来）とから抗体ＨＡ
マクスーヒトキメラＤＮＡ配列が形成されるが、このＤ
ＮＡ配列において、ヒトエンハンサ−ＤＮＡ配３’ｌｌ
、ｎにヒト抗体１（ｉＡのエンハンサ−Ｌ）ＮＡ配列な
結合させることにより高効率の発現型のマウス−ヒトキ
メラＤＮＡ配列となる。このヒトエンハンサ−＋）　Ｎ
　Ａ配列は、如イｌｌＪなる位置に結合させてもよいが
、望ましくはＶ領域のＤＮＡ配列とＣ領域のＤＮＡ配列
の間に位置ずろことである。

前αヒトエン・・ンサーｆ）ＮＡ配列は、添付第１５図
に示される配列及びそれに相補的なりＮＡ配列を具体的
に示すことができる。このヒトエンハンサ−ＤＮＡ配列
には更にマウスエンへンナーヤマウス由来もしくはヒト
由来のイントロンが含まれてい又も差支えない。

配列 このＬ頌におけるキメラＤ　Ｎ　Ａ配列は、本発明者が
最近提案した抗体Ｌ＠発現型ＤＮＡ配列と同じものであ
ることができる。

すなわち、このＬ偵発現屋キメラＤＮＡ配列は、 （１１，）　　マウス抗体ＬｆｉｌＣおけるＶ領域のＤ
ＮＡ断片 （ｂｌ　　ヒト抗体り鎖におけるＣ領域のＤＮＡ断片　
及び ｔｅ）　　ヒ）ｔｔ体Ｈａ由来のエン・・フサ−ＤＮＡ
断片 よりなる配列である。

この発現型キメラＤＮＡ配列は、ヒト抗体Ｈｄ由来のエ
ンハンサ−ＤＮＡ配列を含んでいる。このヒトエン八ン
サーＤＮＡ配列は、ヒト抗体の）（鎖中に存在するエン
ハンサ−機能を有する配列であればよく、例えばヨーロ
ッパ特許第１４６７４３号明細書に開示されたエンハン
サ−ＤＮＡ配列を使用することができる。殊に添付第５
図に示されたＤＮＡ配列及びそれに相補的なりＮＡ配列
を使用することができる。しトエンーンサーＤＮＡ配列
は、ポ■紀抗体り鎖発現ｍＤＮｋ配列中に含まれていれ
ばよ（、その位置は問わない。丁なわち、抗体り鎖遺伝
子において、Ｖ領域のＩ）　Ｎ　Ａ配列、Ｃ領域のＤＮ
Ａ配列と並ぶＤＮＡ配列上でＶ領域のＤＮＡ断片とＣ領
域のＤＮＡ断片の間に位置（７ていてもよ（また該Ｖ領
域のＤＮＡ断片の５′−側或いは、Ｃ領域のＤＮＡ断片
の：つ′−側のいずれに位置し工いてもよい。

さらに曲記丁、鎖発現型キノラＤＮＡ配列には、プロモ
ーターや他の機能を有するＤＮＡ配列やイントロンが含
まれ工いても差支えない。

本発明のＡＵ　ｒ＋Ｑマウ７、−ヒト型のキメラ抗体り
開発現型１’）　Ｎ　Ａ配列は、そのＶ領域のＤＮＡ配
列には、本発明者が見出し先に提案した抗ヒト急性白血
病リンパ腫共通抗原抗体を産生ずるマウス・−イズリド
ーマにおけろし鎖のＶ領域のアミノ酸配列を少（ともコ
ードするＤＮＡ配列を含んでいる。このＬ　ｄのＶ領域
のアミノＩ’ｆｆ配列を少くともコードしているＤＮＡ
配列とじ℃は、添付第３図に示したアミノ酸配列罠おい
℃、１番目（Ｇｌｕ）から９７７番目Ｌｅｕ）までのア
ミノ酸配列を少くともコードし又いるものでもよ（、ま
たｌ番目（、Ｇｌｕ）から１０９番目（Ａ、ｒｇ）まで
のアミノ酸配列を少（ともコードしているものであつ℃
もよい。添付第３図のアミノ酸配列におい℃１番目（Ｇ
ｌｕ）から９７７番目Ｌｅｕ）までの配列は前記へイブ
リドーマにおける抗体のＬｆｉのＶ領域のアミノ酸配列
であり、また１番目（Ｇｉｕ）から１０９番ＩＪ　（Ａ
ｒｇ）までの配列は同ＬｆＡのＶ領域とＪ領域のアミノ
酸配列である。

前記Ｖ領域のアミノ酸配列（１番目〜９７番目ンを少く
ともコードしているＩ）ＮＡ配列としては、添付第８図
の５７９番目ＣＧ）から８６９１ｉ目（ｃ）までのＤＮ
Ａ配列であることができ、またＶ領域とＪ領域を少くと
もコードしているＤＮＡ配列とし又は、添付第８図の５
７９番目（Ｇ）から第９０５査目（Ｔ）までのＤＮＡ配
列であることができる。

さらに前記Ｖ領域のアミノ酸配列を少（ともコードして
いるＩＪＮＡ配列としては、同第８図において５６２番
目（Ｔ）から９０５番目（Ｔ）までのＤＮＡ配列であっ
てもよく、また３４０′Ｔｒ目（Ａ）から９０５番目（
Ｔ）までのＤＮＡ配列であることができ、また２３０番
目（′ｆ）から９０５番目（Ｔ）までのＤＮＡ配列であ
ってもよい。

本発明の抗体り開発３Ａ型キメラＤＮＡ配列を構成する
抗体１，６におけるＣ領域のＤＮＡ断片としては、ヒト
抗体に鎖由来のものであるのが好まし〜・。またか又る
Ｃ領域のＤＮＡ断片とし壬、添付第４図のアミノ酸配列
を少くともコードしているＤＮＡ配列であることカ”１
：き、特にそのＤＮＡ配列どＬ　’１：　ｉｊ：、添付
第９図のＤＮＡ配列を一つの具体的例とし℃挙げること
ができる。

以上説明した本発明の抗体Ｈ鎖のマウス−ヒトキメラＤ
ＮＡ配列及び抗体り鎖のマウス−ζトキノラＤＮＡ配列
は、それぞれを別々にベクタープラスミドに組み込み、
組み換えプラスミドを得、久いで得られたプラスミドに
別１１の宿主動物細胞に導入して形質転換細胞と１．こ
れを培養することによつ“て、マウス−ヒト抗体Ｈ鎖及
びマウス−ヒト抗体り絵を別個に得℃、それらを再構渠
して本発明のマウス−ヒトのキメラ完全抗体とすること
ができる。またＨＩ前記抗体１（頗マウスーヒト二■メ
ラＬ）ＮＡ配列と抗体り鎖のマウス−ヒトキメラＤＮＡ
配列をそれぞれ別のプラスミドに組み込み組み換えプラ
スミドを得、久いで得られ１こプラスミドを用い′１：
順次同一の宿主動物細胞に導入し−こ形質転遺を行な−
・、両者で形質転換された細ｊ泡乞得、これを培養する
ことに上って目的とするマウス−ヒトのキメラ完全抗体
を発現させろこともできろ。

しかし前記した抗体ＨＲのマウス−ヒトキメラＤＮＡ配
列と抗体１のマウス−ヒトキメラＤＮＡ配列とをそれ自
体公知の方法で同じベクタープラスミド中へ、組み込み
、組み換えプラスミドとし、これを宿主動物細胞へ導入
して目的とするマウス−ヒトのキメラ完全抗体を発現さ
せることもできる。

いずれの場合であつ℃も、キメラＤＮＡ配列の発現に使
用し得るベクタープラスミドとしては、種々のものが挙
げられるが、例えばＰＳＶ２　ｇｐｔ　、　Ｐ　Ｓ　Ｖ
　２　ｎ、ｅｏ　、　ＰＫＳＶ　−１０などのプラスミ
ドが適当である。

かくして調製された組み換えプラスミドは、それ自体公
用の例えばプロトプラスト法〔免疫実１ｉＩｉ操作法Ｘ
ＩＩＩ　４５３３頁、日本免疫字会鶴。

（１９８４）参照」或いはＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−デキストラ
ン法〔セル（ｃｅｌｌ　）　５１４３３巻７２９頁（１
９８３）参照）などの方法による宿主動物細胞、例えば
マウスミエローマ（例えばＪ５５８Ｌ、Ｎ５−１゜Ｘ６
３Ａｇ　８，６５３など）Ｋ導入し形質転換細胞を得る
。得られた形質転換細胞を培養することにより培養物中
に目的とする抗体を蓄積させることができ、この培ＩＩ
物から抗体を分離９回収することができる。

かくして本発明によつ℃得られたマウス−ヒトキメラ抗
体は、ヒト急性白血病リンパ腫患者の診断９発見に使用
し得るのみならず、そのまま或いは抗癌剤と結合させて
ヒト急性白血病リンパ腫患者に投与することにより、急
性白血病リンパ腫の免疫学的治療に使用することが期待
されろ。

以下実施例を掲げ本発明のＩ）ＮＡ配列、その作成及び
抗体の発現などについて史に詳細に説明する。

実施例１（マウス染色体ＤＮＡの単離）マウスハイプリ
ドーマＮＬ−１１ＸＩＯ”個を１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｓｏ
ｄｉｕｍ　１ａｕｒｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ　）存在下プ
ロテア−七Ｋ（シグマ社Ｍ）で処理した後、水飽和フェ
ノールを加えＤＮＡを抽出した、遠心により水相を分離
し、ｌ　ＯｍＭ　　Ｔｒｉｍ　−ＨＣ７！ｐＨ７，４、
０，１ｍＭ　ＮｈＣｌ　、　０．１　ｍＭ　ｇＤＴＡ（
ＴＮＥ）パン７アーで透析した。リボヌクレアーゼＡ（
シグマ）で処理し、再度フェノール抽出を行なった後、
’ｒ’Ｎｇ、：ソファーで透析しマウス染色体Ｄ　Ｎ　
Ａ　１．２■を得た（　Ｎ、グライン、　　Ｄ、Ｗ。

スグフオード：ヌクレイツクアシッドリサーチ３巻２，
３０３ページ（１９７６）　（Ｎ、　Ｂ１１ｎ、　Ｄ、
Ｗ。

５ｔａｆｆｏｒｄ　；　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、、　３　２３０３（１９７６））参照〕。

実施例２（マウス遺伝子ライブラリーの作成）実施例１
で得られたマウス染色体ＤＮＡ　１５０μｙ　を後述す
る実施例４に示した方法に準じて制限＃素Ｈｉｎｄｌｌ
［（宝泊ａ）で消化した後、蔗糖密度勾配遠心〔蔗糖１
０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）＋２８００Ｏｒ！１ＩＸ１
５時間、２０℃〕を行ない、４Ｋｂ〜９　Ｋｂに相当す
るＤＮＡ断片を得た。

次にこのＤＮＡ断片０．４５．ｉｉ、ｊＶとＣｈａｒｏ
ｎ　２８ベクターＤＮＡ　（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ）の１（ｉｎｄｕ１７−ムとの連節を行ない
。

次いでアマージャム社のキットを用いｉ、ｉｎ。

ｖｌｔｒｏパッケージングを行ない、マウスＮＬ−１遺
伝子ライブラリー４Ｘ　１０’　　ＰＦＵ／μｙを得た
。

連結はＴ４ＤＮＡ　！、１ガーゼ（宝酒造）を用い、反
応６Ｊｘ／’ｌ　６６　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　ＨＣｌ　（ｐ
Ｈ７，６）−６，６ｍＭＭｇＣ１２−１０ｍＭジチオス
レイト−／ｌ／　−１ｍＭＡＴＰ水溶液中で４℃、１６
時間行った。

実施例３（マウス免疫グロブリンに鎖遺伝子のスクリー
ニング） 前記実施例２で得られたマウスＮＬ−１由来のＤＮＡを
含むＣｈａｒｏｍ　２８フアージを大腸菌ＬＥ３９２株
に感染させ、プラークへイプリダイゼーション法ＣＷ、
Ｄ、ベントン、　　Ｒ，Ｗ、デービス：サイエンス１９
６巻１８０ページ（１９７７）（Ｗ、Ｄ、　Ｂｅｎｔｏ
ｎ　＋　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉａ　：　５ｅｉｅｎｅｅ　
　１９６１８０（１９７７））参照〕を使用して１２ｐ
標識マウス抗体ＫｄＪ遺伝子で選別した。、＋マウス免
疫グロブリンＫＩＡ遺伝子を含むＣｈａｒｏｎ　２８フ
アージからのＤＮＡの調製はトーマスとデービスの方法
により行った。（Ｍ、トーマス、　ＲｏＷ、デービス：
シャーナルオノモンキュラーバイオロジ−９１巻３１５
ページ（１９７４）　（Ｍ、　Ｔｈｏｍａｓ。

Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉ！Ｉ：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、＋　９１３１５（１９７４）　）参照〕 実施例４（マウスに＠ｖ領域遺伝子の制限酵素切断地図
の作成） 実施例３で得られたマウスに鎖遺伝子を含むファージＤ
ＮＡ、及び後述する実施例５に準じてプラスミドにリク
ローニングしたＤＮＡ　１μｙを制限酵素切断地図＠ｇ
　（ＸｂａＩ　、　Ｂｇｌ　ＩＩ　切断では５０ｍＭＴ
ｒｉａＨ（Ｊ（ｐＨ７，４）−１００ｍＭＮａＣＡ！　
−１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，水ｆＲｇを、Ｂａｍ　ｌ（Ｉ　
。

Ｈｉｎｄ　ｌｌｌ　Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｒａａ　Ｉ　、　
Ｈ４ｎｅ■、ＤｒａＩ切断では１０ｍＭＴｒｉｓｌ（ｃ
Ｊ　（ｐ）（７，５）−６０ｍＭＮａＣｌ−７ｍＭ　Ｍ
ｇＣ右水溶水溶液れぞれ用いた。〕２０μｌに溶解させ
、制限酵素（Ｒｓａ　Ｉはニンボンジーン製、その他は
全酒造製を用いた）２ユニントを添加して３７℃、１時
間以上消化を行なった。

制限酵素による切断後、４μｌの０．２５％ブロモフェ
ノールブルー・５０％クリセロール水溶液を加え、０．
８％〜２．５％アガロースゲル電気泳動を行なった。ア
ガａ−スはシグマ社のタイプ■電気泳動用を使用した。

電気泳動バッファーとし℃、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢
ｒＲ８０ｍＭ酢酸ナトリウム−７２ｍＭ塩化ナトリウム
１ｍＭＥＤＴＡを用い、５ｆｌ厚水平ゲルＶこて２Ｖ／
ｃｍの電圧で９〜１６時間電気泳動を行なった。この電
気泳動の際、ＤＮＡ断片の分子菫マーカーとして、λフ
ァージのＤＮＡなＨｉｎｄｌｌｌ　で消化したもの（日
本ジーン製）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲ
ル中のＤＮＡを２μｊｌ／ｍｌエチジウムブロマイド水
溶液で染色し、このゲルに対して長波長紫外線を照射し
℃、切断パターンの観察を行なった。各徨制限酵素単独
による切断、及び二種の制限酵素の組合せによる切断、
これらの切断パターンｉｔ　′ＰｓＪ３？することによ
り、各制限酵素切断点の相対位置関係を決定した。

マウス免疫グロブリンＫＭｋ遺伝子断片の制限酵素切断
地図を第１０図に示した。Ｄｒａ　Ｉ　。

Ｈｉｎｅ　ＩＩ　、　Ｒｓａ　Ｉ　　切断点は図示した
以外にも存在する。

実施例５（マウス免疫グロブリンに頌Ｖ−Ｊ領域遺伝子
のサブクローニング） マウス免疫グロブリンに鎖ｖ−ＪＨ域遺伝子を含むＣｈ
ａｒｏｎ　２８フアージＤＮＡを、実施例４の方法に準
じて、）（Ｉｎｄｌｌｌ　で切断し、アガロースゲル電
気泳動を行なった。Ｖｔ　−Ｊに遺伝子を含ｔｊ　６．
５　ｋｂのＤＮＡ　＃ｉ片を、エレクトロ・エリューシ
ョン法を用いてアガロースゲルより回収した。一方、大
？ＪＩ菌用プラスミドｐＢＲ３２２１μｙ′Ｉｔ実施例
４に準じてＨｉｎｄ　ｌｉｔ　で切断したものに対して
、アルカリ性ホスファターゼ（Ｅ、ｃｏｌｉｃ７５）（
全酒造製）を０．５ユニット加えて、６８℃で１時間反
応させた。反応終了後、反応液中のアルカリ性ホスファ
ターゼを失活・除去するために、フェノール抽出を３回
繰返した。

このようにして得られたｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｎ／
アルカリ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した
６、５　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ断片水浴液と混ぜ、エ
タノール沈澱の後、連結反応用バッファー（実施例２を
参照）１０μｌに浴解させる。２ユニツトのＴ　４−Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、１１℃。

１２時間反応させて、ノヘイグリツドＤＮＡを得る。

大腸菌ＯＨ１株の形質転換は、通常の（：ａＣＡ！を法
ＣＭ、■、メノーード、に、キーン、Ｊ、モナ／ヘム：
ジーン３巻２７９　ページ（１９７８）　（Ｍ、Ｖ。

Ｎｏｒｇ！Ｌｒｄ　、　Ｋ、　Ｋ＠ｅｎ　＋　　ＪｌＭ
ｏｎａｈａｍ　：　Ｇｅｍ５　＊　、Ｌ２７９（１９７
８））参照〕の改良法で行なった。

すなわち、５ｓｔＺのＬ培地（１％トリプトン。

０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１、ｐＨ７，５）
に大腸菌ＤＨ−１株の１８時間Ｊ＠養基を接４し、６０
０ｎｍにおける光学密度０．３まで生育させる。

菌体ｆ！：冷たいマグネシクム・パンファー〔０，１Ｍ
　　ＮａＣｌ　　　５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　　５ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　　　ＨＣＩ（ｐＨ７，６，０℃）〕　中で
２回洗い、２ゴの冷したカルシウム・バッファー（１０
０ｍＭ　　ＣａＣＡ’ｔ−２５０ｍＭ　　ＫＣＡ！　−
５ｍＭ　　ＭｇＣ４−５ｍｆｖｌ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　（ｐＨ７，６，ＯＣ）　）　　中に再懸濁させ、０℃
で２５分間放置する。次に菌体をこの容量のｌ／１０童
のカルシウム・パンファーの中に再Ｍ濁し、へイブリッ
ドＤＮＡ水溶液と２：１（ｖｏｌ、　：　ｖｏｌ、　）
混合する。この混合物を６０分間、０℃で保った侵、ｌ
　ａｌのＬＢＧ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、１％ＮａＣｌ　。

０．０８％グルコース、ｐＨ７，５）　　をふ加し、３
７℃で１時間培養する。培養液を、選択培地（アンピシ
リン３０μｍ！／１を含むＬ培地プレート）に１００μ
ｌ／プレートで接種する。プレートを３７℃で１晩培養
して、形質転換株を生育させる。得られたコロニーより
、公知の方法を用いてＩ）　Ｎ　ＡをａｔＩ製し、アガ
ロースゲル電気泳動により、目的の・−・イグリンドＤ
ＮＡを確認した。

か（してｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　ｉｌｌ　サイトにＶ
ｔ　−Ｊに遺伝子を含む６，５ＫｂのＤＮＡ断片をりｐ
　−二７　りＬ　ｐＹＮ　−Ｍｌ、Ｖｌ　＆びｐＹＮ　
−ＭＬＶ２　’ｔ　作成した。

褐１０図のＶｔ　−Ｊｔ遺伝子を含むＢａｍＨｌ　（Ａ
−１）　　Ｈｉｎｄｌｌｌ（Ａ　　２　）断片の）ｌｉ
ｎｄ　Ｉｌｌ　（Ａ−２）がｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
サイト寄りに連結されたものがｐＹＮ−ＭＬＶＩ　、そ
の逆オリエンテーションのものがｐＹＮ−ＭＬｖ２であ
る。

またｐＹＮ−ＭＬＶＩを実施例４に準じてＢａｍＨＩ、
及びＰａｔ　Ｉ　　で消化し、０．７％アガロース電気
泳動の後エレクトロエリューションを行う事により第１
０図のＢａｍＨＩ　（Ａ　−１）　−Ｐａｔｌ（Ａ−３
）のＤＮＡ１１′ｉ片を得た。一方ＰＵＣ１８ベクｐ−
（ビーエルバイオケミカルス＃　）　ヲＭｂｉ　Ｋ　Ｂ
ａｍ）ｌ　Ｉ及びＰｓｔ　［で切断し、約２，７　Ｋｂ
　　の線状ヘクター断片を取得した。この二つのＤＮＡ
断片を実施例２に準じて連結し、大腸菌Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＪＭ　　１０３株を前記Ｄｌ（１株と同様
に処理する事により形質転換株を生育せしめた。その後
公知の方法により形質転換株よりプラスミドＤＮＡをａ
ｌｌ製し、アガロース電気泳動により目的の組み換えプ
ラスミドを確認した。かくして、実施例３でクローニン
グされた遺伝子の一部、すなわち第ｉｏ図に示すＢａｍ
ｆ（Ｉ　（Ａ−Ｉ　）−ＰｇｔＩ（Ａ　　３）を含むｐ
Ｕｃ　１８組換えプラ、ｃ、　ｊ　）’　ｐＹＮ　−Ｍ
ＬｖＢＰを得た。

実施例６（塩基配列の決定） 実施例５紀載のｐＹＮ−ＭＥ、Ｖｌ　　を実施例４に準
じてＢａｍＨＩとｐａｔ　Ｉで切断し、第１０図のＢａ
ｍＨＩ　（Ａ　−１）とＰａｔｌ（Ａ　　３）切断部位
で挾まれたＤＮＡ断片を得た。また同様にＢｇ／ＵとＰ
ｓｔ　［で切断し、第６図のＰｓｔｌ（Ａ−３）とＢｇ
ｌ　ＩＩで挟まれた約１．５ＫｂのＬ）ＮＡ断片を得た
。これらのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ　　及びＰａｔ　１
で切断したＭ１３ｍｐ１８（ビーエルバイオケミカルズ
製ンにクローニングした。塩基配列決定はＭ１３シーク
エンシングキット（宝酒造）と〔α−”Ｐ　）　ｄｃＴ
Ｐ　（アマ−ジャム社製）を用いジデオキシチェーンタ
ーミネーション法で行つた〔高浪満、大井龍夫１！　ｒ
ＤＮ人シーケンス解析マニュアルＪ　（１９８３）＃談
社参照〕。

ＢａｍＨＩ　（Ａ−１）　−Ｐｓｔ　Ｉ　（Ａ−３）断
片についてはＰ＋＋ｔ　Ｉ側から５′方向に、Ｐｓｔ　
Ｉ　（Ａ−３）−ＢｇｌｌＩ断片についてはＰｓｔ　ｌ
側から３′方向に塩基配列決定を行った。更にプラスミ
ドｐＹＮ−ＭＬｖＢＰ　　を実施例４に準じてＲａａ　
ＩとＰａｔ　Ｉで切断し℃約０，６５　ＫｂのＤＮＡ断
片を得、Ｍｌ３　ｍｐ　１９　（ピーエルバイオケミカ
ルズ製）７アーンをＳｍａ　Ｉ及びＰｓｔ　Ｉで切断し
たものにクローニングし、Ｒｓａ　ｌから３′方向にｊ
ｉＭ配列を決定した。Ｓｍａ　Ｉ消化は１０　ｍＭ　　
Ｔｒｉｍ　−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）、　　７　ｍＭ　　
ＭｇＣ１１，２０ｍＭＫｃ６゜７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール水ｆｅ４ｇ、中で３７℃、２時間行い、その後
ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭ　にした上Ｐｓｔ　ｌで消化を
行った。

またプラスミドｐＹＮ−１ｖｌＬＶＢＰ　　を実施例４
に準じてＲｓａ　Ｉと１）ｒａ　Ｉ　、及びＤｒａ　Ｉ
とｐｓｔ　■で切断し、生成したＤＮＡ断片を分画した
。分画には２　ｗｓＪ４．　５９　Ｑアクリル７ミド垂
直ゲルを用いた〔高木東学ｍ［遺伝子操作実験マニュア
ルｊ（１９８２）講談社参照〕。Ｒｓａ　ＩとＤｒａ　
Ｉ切断では約０．３　Ｋｂ　、　Ｄｒａ　ＩとＰｓｔ　
Ｉ切断では約０．４ＫｂのＤＮＡ断片を得、前者はＭ１
３ｒｎｐ　］　８をＳｍａ　Ｉ消化し実施例５に準じて
脱燐酸処理を行ったもの、後者はＭ１３ｍｐ１９をＳｍ
ａ　ＩとＰａｔ　Ｉで消化したものに連結反応を行い、
第１Ｏ図のＲｓａ　Ｉ　−Ｄｒａ　Ｉ及びＤｒａ　Ｉ　
−Ｐｓｔ　１．　（Ａ−３）切１］！Ｉ【部位で囲まれ
るＤＮＡ＠片の挿入された組換えファージな得、前述の
如く塩基配列の決定を行った。Ｒａｔｓ　ｌ　−Ｄｒａ
　ｌ譚Ｔ片についてはＤｒａ　Ｉから５′方向、Ｄｒａ
　Ｉ　−ＰｓｔＩＩＥｆｆ片についてはＤｒａ　Ｉかも
３′方向にそれぞれ行った。

各々の結果を連結し℃まとめたものを第８図に示す。

実施例７（ヒト染色体ＤＮＡの単離） ヒト培養細胞Ａ１１（７７株３Ｘ１０″個をガラス捧で
つぶし、２％ＳＯ８存在下、プ「ＪテアーゼＫ（シグマ
社製）で処理した後、１０　ｍＭＴｒｉａ−ＨＣＩ　（
ｐＨ８，０）　　１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ水溶液で飽和し
たフェノールを加えた。遠心分離により水相と７工ノー
ル層を分離（フェノール抽出）、水相を２０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｍ　　ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）１００　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１５ｍＭ　　ＥＤＴＡ水溶故に対して透析した。リボ
ヌクレアーゼ人（シグマ社Ｍ）処理をし、フェノール抽
出を行なった後、水相をｌ　ＯｍＭ　　Ｔｒｉａ−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ８，０）　−１ｍＭＩ；ＤＴＡ水溶液に対し
て透析し、ヒト染色体ＤＮＡ約１．２１９を取得した〔
実施例１記載のプラインとスタフオードの報告参照〕。

実施例８（ヒト遺伝子ライブラリーの作成）実施例７で
得られたヒト染色体ＤＮＡを後述の実施例１０に示した
方法に準じ℃制限酵素ＥｃｏＲＩ（全酒造）で切断した
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、２　Ｋｂ〜３　
Ｋｂに相当す６ＤＮＡ断片をエレクトロ・エリューショ
ン法を用いて回収した。次にこのＤＮＡ断片の１ｇｔＷ
Ｅ　Ｓ　Ｉ　Ｂベクター（アマーシャ五社ｆｆ）との連
結を、実施例２に準じて行ない、λｇｔＷＥｓλＢベク
ターの右のアームと左のアームとの間にヒト由来のＤＮ
Ａが挿入されたハイブリッドＤＮＡを得た。得られたハ
イブリッドＤＮＡＫついて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　パッ
ケージングを行ない、ヒト遺伝子ライブラリー（アマー
ジャム社キットを使用）とした。

実施例９（ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子のスクリーニ
ング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むλｇｔ
ＷＥ　ＳλＢファージの集合（遺伝子ライブラリー）を
大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成させた
。ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子を含むクローンは実施
例３に準じてＳａｐミル標識マウス　遺伝子をクロスへ
イプリダイゼーションプローグとして用い選択した。ヒ
ト免疫グロブリンに＠遺伝子を含むλＧＴｗｅλＢファ
ージからのＤＮＡの調製は、実施例３に準じて行なった
。

実施例１０（ヒトＫ　鎖Ｃ領域遺伝子の制限酵素地図の
作成） 実施例９で得られたヒトに鎖遺伝子を含むファージＤＮ
Ａ及び後述する実施例１１に準じてプラスミドにリフｏ
　−ニングしたＤＮＡＩμｙを制限酵素切断用パン７ア
ー（ＥｃｏＲＩ切断ではＴｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ　（ｐｉ（
７，５）　５０ｍＭ、　ＭｇＣ１！７ｍＭ、　　ＮａＣ
６１００ｍＭ、　　２−メルカプトエタノール７　ｍＭ
　＋　Ａｃｅ　Ｉ　　切断ではＴｒｉｍ　−Ｈｃｌ　（
ｐＨ７，５）　１０ｍＭ、　ＭｇＣ１ｔ７　ｍＭ、　Ｎ
ａ（Ｊ　６０　ｍＭ、　２−メルカプトエタノール２　
ｍＭ　、　　Ｓａｃ　Ｉ切断ではＴｒｉｍ　−ＭＣＩ　
（ｐＨＬＯ）　１０ｎΔＩ＊　　ＭｇＣ１１７ｍＭｅ２
−メルカプトエタノール７　ｍＭ　水溶夜をそれぞれ用
いた〕２０μ／ＫＦ＋解させ、制限酵素（全話ｍｆｉ）
２ユニツトを添加して３７’Ｃ，１時間以上消化を行っ
た。その後実施例４に準じて電気泳動を行い制限酵素切
断地図を作成した〔Ｐ。

Ａ＋ヒーター、　　Ｅ、Ｅ、マックス、　　Ｊ、Ｇ、シ
ードマン。

Ｊ、ｖ、マイゼルＪｒ、Ｐ、レーダー：セル２２巻。

１９７ページ（１９８０）　（Ｐ、Ａ、　Ｈｌｅｔｅｒ
　、　Ｅ、Ｅ。

Ｍａｘ　＊　Ｊ、Ｇ、　Ｓｅｉｄｍａｎ　、　　Ｊ、Ｖ
ｏＭａｉｚｅｌ　＋　　Ｊｒ、＋Ｐ、Ｌｅｄｅｒ　：　
Ｃｅ１ｌ　２２　１９７（１９８０）　）参照〕。

ヒト免疫グロブリンに鎖のＣ％域を含む遺伝子の制限＃
素切断地図を第１１図に示した。

実施例１１（ヒト免疫グロブリンに鎖Ｃ領域遺伝子のサ
ブクローニングン ヒト免疫グクグリンＸ＠Ｃ＝域を含むλｇｔＷＥＳλＢ
ファージＤＮＡ　３μｇを実施例１ｏの方法に準じてＥ
ｃｏＲＩ　　で切断し、７カロース寛気泳動を行った。

Ｃ＆遺伝子を含む２．６　ＫｂのＤＮＡ断片をエレクト
ロエリューション法を用いてアガロースゲルより回収し
た。−万人ｎｉＩＪｍ用プラスミドｐＨＲ３２２１μ９
２実施例１ｏに準じてＥｃｏＫ　Ｋ　で切断したものに
対し、実施例５に準じてアルカリ性７オスフ７ターゼ処
理を行った。

このようにして得られたｐＢＲ３２２の１２ｃｏＲＩ切
断／アルカリ性７オスフアターゼ処ｆＩｊＡＤＮＡをゲ
ルより回収した２、６　Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片
と混合し、エフノール沈澱の後連結反応用バッファー（
実施例２参照）１０μｌに溶解させ、実施例５に準じて
Ｔ４ＤＮＡ！ｊガーゼでＭ結した。

実施例５に準じて大Ｍ菌Ｅ、ｃｏｌｔ　ＤＨＩを形質変
換し、プラスミドＤＮＡを調製して目的の／Ｓイブリッ
ドＤＮＡを１４認した。

’ｌｌ’１１２（マウス・ヒト・キメラ抗体遺伝子の作
製） 実施例５で得られた、マウス免疫グロブリンＫ　４ｕ　
Ｖ　−Ｊ領域遺伝子を含むｐＹＮ−ＭＬＶｌを、実施例
４及び１０の方法に準じてＢａｍｆ（Ｉ　及びＥｅｏＲ
Ｉ　　で切断し、アガロースゲル電気泳動を行なった。

得られたＶに−Ｊに遺伝子を含む４．２ＫｂのｇｃｏＲ
Ｉ　−Ｂａｍ１（Ｉ　断片を、実施例５と同様な手法に
より、ｐｓＶ２ｎａｏベクターＣＰ、Ｊ。

サザン、Ｐ、バーグニジャーナルオブモレキュラ−アン
ドアプライドジエネデイツクス１巻。

３２７ページ（１９８２）　（Ｐ、、１．５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ　、　Ｐ。

Ｂｅｒｇ　　：　　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｏｎｅｔ
、１　３　２７（１９８２））参照〕のｇｃｏＲＩ　　
ＢａｍＨＩ間に挿入し、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ−Ｍ
ＬＶを作成した。

これを第８図に示す。

次に、実施例１１で得られた、ヒト免疫グロブリンに鎖
Ｃ領域遺伝子を含むｐＹＮ−ｆ（ＬＣを、実施例１０の
方法に準じてＥｃｏＲＩで切断し、７ガロースゲル電気
泳動を行なった。得られたＣに遺伝子を含む２．６　Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を、実施例１１と同様な手法を用いて、
上記プラスミドｐＳ’Ｖ２ｎｅｏ−ＭＬＶのＥｃｏＲＩ
サイトに押入した。

得られたクローンのうち、ヒトＣに　遺伝子を含むＥｃ
ｏＲＩ　（Ｂ−１）　　ＥｃｏＲＩ　（Ｂ−２）の断片
のＥｃｏＲＩ　（Ｂ−１）がマウスＶｃ　−Ｊｔ遺伝子
側に連結されたもの（マウス■に−Ｊに遺伝子とヒ）Ｏ
ｘ遺伝子の読み取り方向が一致しているものンを選択し
、このプラスミドｇｐｓＶ２ｎｅｏ−Ｍｌ（Ｌと名付け
た。これを第１３図に示す。

一方、特開昭６０−１２０９９１号公報に１己載のヒト
免疫グロブリンｒＩ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＴＪ３
を、実施例ｉｏ記載の方法に準じてＭ　ｌ　ｕ　Ｉ及び
ＨｐａＩで切断した。但し切断用バッファーとし℃はＴ
ｒｉａＨＣ／　（ｐＨ７，５）　１０　ｍＭ。

Ｍｇｃｚ、　　７　ｍＭ、　　ＮａＣ１１５０ｍＭ、　
　２−メルカプトニゲメール７　ｍＭ　水溶液を用いた
。ＭｌｕＩで切断後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
した後、切断用バッファーＴｒｉｓ　−ＨＣｌ（ｐＨ７
，５）１０ｍＭ、　ＫＣＩ　１００ｍＭ、　ｌＡｇＣ１
，７ｍＭ、　　２−メルカプトエタノール７　ｍＭ　水
溶液を用いてｆ（ｐａＩ切断を行った。アガロースゲル
電気泳動により、約０．９ＫｂのヒトｒＩ＠遺伝子エン
ハン　リサー領域を含むＭｌｕ　Ｉ　　Ｈｐａ　Ｉ　＃
片を得た。このＤＮＡ断片をポリメラーゼ用バッファー
（３７ｍＭリン酸カリウム、　　６．７　ｍＭ　ＭｇＣ
１！、　　１ｍＭ　　２−１　ルカプトエタ７−　ル、
　　ｐＨ７，４）　　に醪解し、ｄＮＴ　Ｐ存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼ・フレノウ（ｋｌｅｎｏｗ　）・フラ
グメント（二ニー・イングランド　バイオラプズンを加
えることにより、末端の平滑化を行なった。さらに、Ｔ
４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いてこの両端にＢａｎ）ＩＩ
リンカ−（全酒造）を連結した後、ＢａｍＨＩで切断し
、アガロースゲル電気泳動により約０．９Ｋｂのヒトｒ
、鎖遺伝子エンＩ−ンサー領域を含む両端がＢ　ａｍＨ
Ｉ断片を得た。このＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ！Ｉｒ片を上用２プ
ラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−ＭＨＬのＢａｍＨ
Ｉサイトに押入し、押入オリエンテーションのそれぞれ
異なるプラスミドｐｓｖ２ｎｅｏ−ＭＨＬＥＩ及びｐｓ
Ｖ２　ｎｅｏ　−ＭＩＬＥ−２を作製した。これを第１
３図に示す。

（流側１３（マウス遺伝子ライブラリーの作成）実施例
１で得られたマウス染色体ＤＮＡ１５０μｇを実施例１
０に示した方法に準じて制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ（全話潰裂）で元金消化しアガロース電気泳動を行
ない、７に〜９　Ｋｂに相当するＬ）ＮＡ的１片５μノ
な１ガロースゲル中から電気的に抽出した。

次にこのＤＮＡ　０．４μνとシャロン４Ａベクター　
ＥｃｏＲＩ　ａｒｍ　（アマージャム社裂）との連結を
実施例２に準じて行いアマージャム社のキントを用いて
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　／’ンケージングを行ない、マ
ウスＮＬ−１遺伝子ライブラリー８×１０’ＰＦ’Ｕ／
μｇを得た。

実施例１４（マウス抗体■ｔＩ遺伝子のスクリーニング
） ｍ１記実施例１３で得られたマウスＮＬ−１由来のＤＮ
Ａを含むシャロン４Ａフアージを大腸菌ＬＥ３９２株に
感染させ、プラークを形成させた。マウス抗体ＨｚＡ遺
伝子を含むクローンは実施例３に準じてＵｐ標識マウス
抗体Ｈ鎖Ｊ遺伝子で選別した。

この方法によって、７，９　ＫｂのマウスＮＬ−１の全
Ｖ領域（５’　ｆｌａｎｋｉｎｇ領域、ＶＤＪ及びエン
・ヘンサー領域）を含む遺伝子を単離した。

実施例１５（マウス抗体Ｈ鎖遺伝子の制限＃索切断地図
の作成） 実施例１４のマウスＮＬ−ＩＨ＠ＤＮＡ遺伝子（７，９
Ｋｂ　、　　ＥｃｏＲＩ断片）　な実施例５に準じ℃プ
ラスミドｐＢＲ３２２にす７゛りａ　−ニングし、該Ｈ
＠遺伝子がＥｃｏＲＩサイトに挿入されたｍ換えプラス
ミドＤＮＡを公卸の方法によってル４製した（　ｐＢＲ
−ＮＬ−１−Ｈ）。このｐＢＲ−Ｎｌ、−１−１（をＩ
１１限酵素で切断し、実施例４に準じ″Ｃ電気泳動を行
ない制限酵素切断地図を作成した。ＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄｌｌ１９Ｊ断は実施例４に、ＥｃｏＲＩ切断は実施
例１０に準じ１行なった。

Ｐ　ｖｕ　ＩＩ切断にはＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）　１０　ｍＭＭｇＣｌ、　　７　ｍＭ　、　　Ｎａ
ＣＡ！　６０　ｍＭ　、　　２−メルカプトニゲ７−　
ルア　ｍＭ水溶液を、ｇｃｏＲＶ、５ｐｈｌ切断にはＴ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐｆ（７，５）　、　ＮａＣ１１
５０ｍＭ、　　ＭｇＣ４７ｍＭ、　　２−メルカプトエ
タノール７　ｍＭ　水溶液をそれぞれ切断用緩衝液とし
く用い、プラスミドＤＮＡ　］μｙに２ユニントの簡］
限ｃｌ＃１を加え、３７℃で２時間以上反応を行った。

第１２図に制限酵素地図を示した。

実施例１６（マウス抗体Ｈ鎖ＶＤＪ領域のＤＮＡ　　！
塩基配列決定〕 前記ＰＢＲ−ＮＬ−１−）１　を制限エンドヌクンアー
ゼｓ　ｐｈ　ｉ及びＰｖｕｌＩで切断し、挿入遺伝子の
与える５ｐｈｌ−ＰｖｕｌＩ切断部位ではさまれる２種
類の断片を得た。これらをｓ　ｐｈ　ｉ及びＨｉｎｃｌ
ｌで切断したＭ１３ファージベクターｍｐ　１８及びｍ
ｐ１９（ピーエルバイオケミカルズ製）にクローニング
した。シーケンシングはＭ１３シークエンスキント（全
話造社製）を用いて、ジデオキンチェーンターミネーシ
ョン法テ行った〔実施例６記載の高浪満・大井龍夫編の
文献参照〕。

Ｓ　ｐｈ　Ｉ　／　ＰｖｕｉＩ　Ｌ片の５’Ｈ断片につ
いてはＳ　ｐｈ　Ｉサイトから３′方向、Ｐ　ｖｕ　Ｉ
Ｉサイトから５′方向に、３′側隣接断片についてはＰ
ｖｕｎサイトから３′方向に塩基配列を決定した。可変
領域のＤＮｋ塩基配列を添付第５図に示した。

邸流側１７（ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子定常領域のＤＮＡ塩基
配列決定） ヒト抗体Ｈ＠遺伝子定常領域のＤＮＡ塩基配列決定はマ
キサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ　−Ｇｉｌｂｅｒｔ
法）（、Ａ、−ｙキサム、Ｗ、ギルバート：メソッド　
イン　エンサイモロジー６５巻。

４９９ページ（１９８０）　（ＡｏＭａｘａｍ、　Ｗ、
Ｇ１１−ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ　６５４９９（１９８０））参照〕により行った。

特開昭６０−１４５０８９号公＠記載のプラスミドｐＴ
Ｊ５をＰａｔＩで消化し、３′　端標識キット（７マ一
シヤム社製）によって〔α−３２ｐ〕ｄｄＡＴＰを用い
て標識した。３２ｐで標識したＤＮＡはＳｍａｌで消化
した後ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％
）により目的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルからの抽出を
行なった。得られた３　２　ｐ−標ａＰｓｔＩ／Ｓｍａ
Ｉ断片について、各塩基特異的な部分分解反応を行い、
７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度８％〜２３％）で分離した。２〜７日間−８０℃で
オートラジオグラフィーを行った後、分解パターンの解
析を行った。同様に他のＬ）ＮＡ断片についても〔α−
”Ｐ　）　ｄｄＡＴＰを用いた３′端ｇａあるいは（ｒ
−”Ｐ）ＡＴＰを用いた５′端標識を行い、化学分解法
により同様に塩基配列を決定した。各結果を連結して得
た結果を第２図に示した。

実施例１８（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭＨ１
の作成） 実施例１５で得られたｐＢＲＮＬ−１−Ｈを実施例４及
び１５に準じ”ＣＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで切断し、
）ＩｆｉＶ領域全域を含むｇｃｏＲ’Ｖ　−ＢａｍＨＩ
ｌ＃■片（約２．７　Ｋｂ　）を実施例４に準じて分画
しエレクトロエリューションで回収した。

一方、プラスミドベクターｐ　Ｓ　Ｕ　２　ｇｐｔ　Ｃ
Ｒ，Ｃ。

ムリガン、Ｐ、バーグ；プロシーディング　オグナショ
ナルアカデミー　オブサイエンス　オプザ　ユナイテイ
ツド　ステーク　オプ　アメリカ７８巻２０７２ページ
（１９８１）（ＬＣ。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ　＋　　Ｐ、Ｂｅｒｇ　：　　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７８　２０７２（１９８１））参照
〕を実施例４及び１５に準じＣＢａｍＨ１及びｆ（ｐａ
Ｉで切断し、Ｅｃｏ　ｇｐｔ遺伝子を含む約５．．３に
１）の線状ベクター遺伝子を分離した（この遺伝子を１
フラグメント１′と略称する）。

元に得たｐＢＲ−ＮＬ−１−）（ＥｃｏＲＶ−Ｂａｒｎ
）ＩＩの゛７ラグメント（約２．７　Ｋｂ　）と前％　
ｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｇｐｔのＢ　ａｍＨＩ　　ｆＩｐａ　
Ｉ　　の７ラグメントー１（約５，３Ｋｂ）とン実流側
５に準じてＴ　４−　ＤＮＡリガーゼで連結し、次いで
ＢａｍＨＩで切断し、ＮＬ−１−ＨのＶ領域約２，７Ｋ
ｂを含む線状ベクター遺伝子（約８．ＯＫｂ　）を得、
分階し梢裂した（このベクター遺伝子を′フラグメント
−２′と略称する）。

一方、時開ｔ１６ｏ−１４５０８９号公報Ｍｒ２　ａの
ヒト免疫グロブリンｒ、ｆＡ遺伝子全域（約２１に、ｂ
）を含むプラスミドｐＳＶ２−ＨＩＧＩを実施例１２に
準じてＭｌｕｌで切断し、ヒトエン・・ンサー及びＣｒ
、を含む約３．７　Ｋｂの断片を得た。この断片に実施
例１２に準じてＢａｍＨＩ！Ｊンカー（全酒造製）を連
結し、両端にＢａｍＨ１サイトを付与し、た（これを１
７ラグメントー４′と略称する）。

このフラグメント−４と先に得たフラグメント−２とを
’ｒ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて連結し、更に
大腸菌ＭＣＩＵＯＯを形質転換してヒトエン八ンサー（
Ｅｈ）を介してＶ領域がマウス由来のものでＣ領域がヒ
ト由来のものであるキメ　１う抗体遺伝子を得た（この
遺伝子を’ｐＭＨ−１と略称する）。上記遺伝子ｐＭＨ
１ｆｔ得る系統図を添付第１４図に示した。

実施例１９（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ、Ｈ
−２の作成） 特開昭６０−１４５０８９号記載のヒト抗体Ｈ鎖遺伝子
約２１　Ｋｌ）を含むプラスミドｐｓｖｚ−）ＩＩＧ［
を制限酵素ＢａｍＨ１で切断し、ヒトエンハンサ−（、
Ｅｂ　）及びｃｒ、を含む約１．４Ｋｂ　　のフラグメ
ントを常法により得た。このフラグメントを先のフラグ
メント−２とＴ　４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結した
後、大腸菌ＭＣＪＯＯＯに形質転換して、Ｖ領域がマウ
ス由来であり、Ｃ領域及び工：／へンサーがヒト由来の
キメラ抗体遺伝子を得たくこの遺伝子を’ｐＭＨ−２’
と略称する）。この遺伝子ｐＭＨ−２欠得る系統図を第
１４図に示した。

超流側２０（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭＨ−
３の作成） 実施例工５のｐ　Ｂ　Ｒ−Ｎ　Ｌ−１−Ｈな制限酵素Ｅ
ｅｏＲＶ、ＥｃｏＲＩで切断し、マウスＨＱＶ領域の全
域とマウスエン／−ンサー（Ｅｍ）を含む約４．７　Ｋ
ｂ　　のフラグメントな実施例５に準じて得た。

次に前記ベクターｐ　ＳＶ２−ｇｐｔ　’ａ：　ＢＣａ
　Ｒｌ　。

ＨｐａＩで切断し、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子を含む約４．５
Ｋｂ　　の７ラグメントを得、分離しｆ＃具した。かく
して得られたフラグメントと先のマウスＶ遺伝子の７ラ
グメント（約４．７　Ｋｂ　）とをＴ４−ＤＮＡリガー
ゼを用いてＷ１結し、久いでＥ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断し
、ＮＬ−１−ＨのＶ領域約４，７　Ｋｂ　ヲ含ｔｒ線状
ベクター遺伝子約９，２　Ｋｂ　　を得、これを分離し
精製した（これを１フラグメント−３′と略称する）。

また実施例１８記載のようにして得たヒトエンハンサ−
（Ｅｈ）及びｃｒ、を含む約１７Ｋｂの断片ＫＮ施流側
２に準じて、Ｅ２ｃｏＲＩＩＪンカー（全酒造社製）を
連結し両端にＫｃｏＲＩサイトを付与した（かくし℃得
たフラグメントなフラグメント−５と略称する）。

このフラグメント−５と前３己フラグメント−３とをＴ
４−ＤＮＡ’Ｊガーゼを用いて連結し、ヒト及びマウス
のエンハンサ−、マウス由来のＶ領域、ヒト由来のＣ領
域を有するキメラ抗体遺伝子を得た（この遺伝子を’ｐ
ＭＨ−３’と略称する）。この遺伝子ｐＭＨ−３を得る
系統図を第１４図に示した。

実施例２１（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐ　Ｍ　
Ｈ−４の作成） 実施例１５のｐ　Ｂ　ＲＮＬ　　１−Ｈ’ｔ　Ｅ　ｃｏ
　ＲＶで切断した後実施例１２に準じてＥｃｏＲＩ！ｊ
ンヵー（全酒造製）を連結し、史ＫＥｃｏＲＩ及びＢａ
ｍＨＩで切断する事によりＥｃｏＲＶ端にＥｅｏＲｉ！
Ｉンカーの付層したＶ領域全域を含むＩＪ　２，７　Ｋ
ｂの７ラグメントを得り。

一方、前記ベクターｐｓＶ２　　ｇｐｔをＥｃｏＲＩ及
びＢａｍＨＩで切断し、ＦＪｃｏｇｐｔ遺伝子を含む線
状ベクター４．６　Ｋｂ　　を得、分離して精製した。

のベクターと前記ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ約２．７Ｋｂ
の７ラグメントとをＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、次いでＢａｍＨＩで切断し、ＮＬ−１−Ｈのｖ領域
遺伝子な含むベクター遺伝予約７，３　Ｋｂ　　を得た
（これを１フラグメント−６′と略称する）。

このフラグメント−６と前記実施例１８で得たヒトエン
ハンサ−（Ｅｈ）及びＣｒ、を含むフラグメント−４と
をＴ４−ＤＮＡリガーゼを用い℃連結し、次いで大腸菌
ＭＣ１００Ｏに形質転換し、ヒトエンハンサ−（Ｅｈ）
を介して、マウス由来のＶ領域、ヒト由来のＣ領域を有
するキメラ抗体遺伝子を得たくこの遺伝子を’ｐＭＨ−
４’と略称する）。この遺伝子ｐＭＨ−４を得る系統図
を第１４図に示した。

実施例２２（キメラ抗体遺伝子発現プラスミドｐＭ）（
−５の作成） 実施例１５のｐＢＲ−ＮＬ−１−Ｈ’ｔ　ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＩで切断し、マウスエンハンサ−（Ｅｍ）を
含む約２　Ｋｂ　　のフラグメントを得、分離して精製
した。この約２　Ｋｂ　　の７ラグメントを前記実施例
２０で得たフラグメント−５とをＴ４リガーゼを用いて
連結し、次いでＢａｍ１（Ｉで切断して、マウスとヒト
のエンハンサ−及びヒトｃｒ、を有する約１３ＫｂのＢ
ａｍＩ（ｉ７ラグメントを得た。このＢａｍ１−１ｆフ
ラグメントを前記実施例２１で得たフラグメント−６と
Ｔ　４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、次いでこれを
大腸菌ＭＣ１００Ｏに形質転換し、マウスとヒトのエン
へンサーを介して、マウス由来のＶ領域、ヒト由来のＣ
領域を有するキメラ抗体遺伝子を得た（この遺伝子を’
ｐＭＨ−５’　と略称す７１）。この遺伝子ｐＭ）１５
’Ｙ得る系統図を第１４図に示した。

実施例２３（キメラ抗体Ｈ頭遺伝子の発現）前記実施例
１８〜２２で得られたキメラ抗体遺伝子発現プラスミド
ｐＭＨ−１〜ｐ　Ｍ　Ｈ−５を、実施例５の方法に準じ
−〔大腸菌ＭＣＩＵＩＪＬＩに形質転換し得られた形質
転換体をアンピシリンを含む培地で培養したのら、クロ
ラムフェニコールによってプラスミドを増巾した。次に
リゾチーム（シグマ）処理によってプロトプラスト化を
行なった。得られたプロトプラストを、２×１０６個の
マウスミエローマＪ５５８Ｌ　（λ生産株）及びＸ６３
Ａｇ　８．６５３　　（抗体非生産株）と０．５ｍｔ５
０％ＰＥＧ　４０Ｌ）０中２〜７　分Ｍｌｌ胞融合シ、
ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎａ
　＋　Ｎ　Ｙ　）で希釈後、遠心によりＰＥＧ　４１）
００を除去した。

それぞれの細胞をＲＰＭ１１６４０完全培地（Ｇｉｂｃ
ｏ　、　Ｇｒａｎｄ　Ｉａｌａｎｄ　、　Ｎ　Ｙ　）中
で４８〜７２時間成介させた。Ｊ５５８Ｌを形質転換し
たものについてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ（ｃａｐ
ｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）を用い
て細胞表面を蛍光染色し、キメラ抗体遺伝子の発現を調
べたん果、発現プラスミドｐＭＨ−１、ｐＭＨ−２及び
ｐＭ）［−４を組込んだ細胞には強い発現が認められ、
一方、発現プラスミドｐＭＨ−３及びｐＭＨ−５を組込
んだ細胞には比較的弱い発現が観察された。

また前記発現プラスミドｐ　Ｍ　Ｈ−４をマウスミエロ
ーマＪ５５８Ｌ及びＸ６３Ａｇ　８．６５３　にプロト
プラスト融合により導入し、選択培地に移した。選択培
地には２　ｓ　ｏ　ｒ／’キサンチン、１５ｒ／ａｔの
ハイポキサンチン＋６ｒ／’のｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉ
ｃ　ａｅｉｄを含む。２日間連続してメディウム又換の
後、１０〜２５日後ｎ７ｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ
　　抵抗性の形質転換体が得られた（各々Ｊ５５８Ｌ−
Ｈ，Ｘ６３Ａｇ　８，６５３−）１　と称する）。

得られた形質転換体からＲＮＡを抽出し、得られたＩζ
ＮＡそれぞれ２０μンを用い、マウスＶＤＪ遺伝子を含
むプラスミドｐＢルーＮＬ−１−ＨのＢａｍ）ＩＩ　　
ＰｖｕｆＩＭ片、及びヒトＣｒ、遺伝子の一部を含むプ
ラスミドｐｓＶ２−ＨＩＧＩのＰａｔｌ　　ｆ２）　　
ＰｓｔＩ−（３）の断片なｕｐで［ｆｉし、ノーザン・
・イブリダイゼーション〔Ｔ、マニ７テイス他著、ｒモ
レキュラークローニンク」コールトスプリングツ）−パ
ーラボラトリー（１９８２）（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉａ
ｅｔ　ａｌ、　’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ’Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、
　（１９８２）　）参照〕を行なったところ１，７Ｋｂ
　　の位置に完全な分泌型Ｈ鎖のｍ　ＲＮＡ　　に対応
するバンドが観察された。

オートラジオダラムを第１５図に示す。

実施例２４（キメラ抗体Ｈ鎖遺伝子翻訳産物の分析） 実施例２３のキメラ抗体Ｈ競遺伝子で形質変換したＪ５
５８Ｌ−）Ｉ細胞（Ｊ５５８Ｌ細胞はλ生産株）１０７
個を燐酸、緩ｍ敵で洗滌後メチオニン不含ＲＰＭ　Ｉ　
　１６４０　ｆ４地（牛胎児血清１０％含有）にＭＡＬ
、３００　、ｚｃｉ　ノｃ　　”Ｓ　）−メチオニンを
加え８時間培養した。か（して生成した蛋白質な　ａｓ
３で内部標識し、培養上清を回収した。上済より生成抗
体を抗ヒｌ−ＩｇＧ抗体による免疫沈降法で回収し、担
体より遊離させた後、２−メルカプトエタノールで還元
し、■鎖とＬ鎖の分離をはかった。その後試料を５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルを乾
燥後オートラジオグラフィーをとった〔電気隊動学会編
「電気泳ｇ！ＪＪ実験法」文光覚（１９７６）参照〕。

導入した千メラＨ＠遺伝子の翻訳産物はＪ５５８Ｌ内在
性λ鎖遺伝子産物と結合し細胞外に分泌される事が示さ
れた。オートラジオダラムを第１６１に示す。

実施例２５（キメラ抗体り鎖の発現） 実施例２３のＪ　５５８　Ｌ　−Ｈ及びＸ６３Ａｇ８．
６５３−）Ｉに実施例１２記載のキメラ抗体り鎖遺伝子
を言むプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　−ＭＨＬＥＩ及びｐ
　ＳＶ２　ｎｅｏ　−Ｍ）ｔＬＥ２をＤＥＡＥ−デキス
トラン法で導入した（　Ｊ、ベナルジ、ム、オルンン。

Ｗ、シャフナー二セル３３巻　２７９ページ（１９８３
）（Ｊ、Ｂｅｎａｒｊｉ　＋　Ｌ、０１ｓｏｎ　、　Ｗ
、５ｃｈａｆｆｎｅｒ　：Ｃｅ１ｌ　３３　７２９（１
９８３））’３照〕。叩ち１０７個の細胞に８０μｇの
プラスミドＤＮＡとＤＥＡＥ２−デキストラン（ファル
マシア社製）混合物を加え、併置の後、ＲＰＭＩ　１６
４０完全培地（７０一ラボラトリー社！Ｉ！１）（１０
％牛脂児血清含有）に移した。薬剤耐性株はジエネシチ
ン （Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ　＋　６４１８　、ギプコ社’ｊ
Ｊ）１〜１．ｓ〜／ｄを言むＲＰＭ１１６４（ｌ完全培
地の半量交換によって行った。１０〜２０日後、生育し
てくる細胞を安定形質変換法とした（　Ｊ　５５８１．
−ＨＬ、。

Ｘ６３Ａｇ　８．６５３−）１Ｌ　　と称する）。

実施例２６（キメラ抗体り鎖遺伝子形買転換細胞のｍＲ
ＮＡ分針ン 分針側２５のＪ５５８Ｌ−ＨＬ及びＸ６３Ａｇ８．６５
３−）ＬＬについて各々の細胞よりＲＮＡを抽出し、実
施例２３に準じて導入した千メラＬ？Ａ遺伝子の転写産
物についてノーザン・・イプリダイゼーションにより分
析した。キメラし鎖のハイブリダイゼーションプローグ
としてはＶ領域プローグとしてｐＹＮ−ＭＬＶ−１のプ
ラスミド上の図１０　Ｐｓｔｌ（Ａ−３）　　Ｈｉｎｃ
Ｉ［に相当するＤＮＡ断片、Ｃ領域プローグとしてｐＹ
Ｎ−ＨＬＣの５ｅａｌ（Ｂ−１）−８ｃａｌ（Ｂ　　２
）＠片を、それぞれ３！Ｐにて標識して用いた。ｔＡ１
７図に示す如（いずれのプローブを用いた場合にも同じ
位置にバンドが出現した。

実施例２７（キメラ抗体Ｌｍ翻訳生成物の５Ｏ８−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に よる分析） 実施例２５のＸ６３Ａｇ　８，６５３　　ｋＬＬ　　１
０’個を燐酸緩衝族で洗滌後メチオニン不含ＲＰＭＩ−
１６４０培地（＋胎児血清ｌＯ％含有）に１＠濁し、３
００　μｃｉ　Ｏ）　（”Ｓ　）　　）　ｆオニ７ヲＤ
Ｏｔ８時間培誉した。か（して生成した蛋白質をＳＢＳ
で内部標識し、培養上清を回収した。上７により生成抗
体を抗ヒト１ｇＧ抗体による免疫沈降法で回収し、担体
より遊離させた後２−メルカプトエタノールで還元し、
ＨｄとＬ鎖の分離をはかった。その後試料を５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルを乾燥後
オートラジオグラフィーをとった〔電気泳動実験法「電
気泳動実験法」文光堂（１９７６）参照〕。

■鎖とともにに鎖の蛋白の生成が認められた（第１８図
）。この結果は導入したキメラ抗体に鎖が予め導入した
キメラ抗体Ｉ（蹟（ｒ＋　）と結合して分泌されている
事を示している。

実施例２８（キメラ抗体分子の抗原結合特異性検定） キメラ抗体遺伝子Ｈｔｄ及びＬＭで形質転換を行った実
施例２４に記載したＸ６３Ａｇ８，６５３−ＨＬ（親細
胞Ｘ６３Ａｇ８，６５３は抗体非生産株）をＲＰＭＩ　
　１６４０完全培地にて培養し、培養上清を用いて生成
したキメラ抗体の抗原結合特異性を検定した。標的細胞
とし又はヒト急性リンパ球性白血病共通抗原を発現して
いるモン力細胞を用いた。モン力細胞をＲＰＭＩ１６４
０完全培地で培賞し、そのｌＸｌ０’個を集め、燐酸緩
衝族で況滌後、Ａ’ｔｌ述の如く培養したＸ６３Ａｇ８
．６５３−ｆ（Ｌの培養上清１ｄを加え、氷上で３０分
間反応させた。未ｆｋＮの抗体を洗滌除去後、キメラ抗
体の結合したモンカ細胞をＦＩＴＣ標識ヤキ抗ヒトＩｇ
Ｇ、抗体で蛍光染色した。しかる後蛍光顕微鏡に℃検鏡
したところ、Ｘ６３Ａｇ８．６５３−ＨＬ　Ｊ：＠養上
清で処理したモン力細胞は蛍光を発し、Ｘ６３Ａｇ　８
．６５３−ＨＬ　培養上清中に含まれるキメラ抗体がモ
ン力細胞に結合するφ、即ち所期のヒト急性リッツ球性
６皿病共通抗原に対し、特異性をもつことが明らかとな
った。Ｊ５５８Ｌ−ＨＬ培養上渭でも同様の結果が得ら
れた。Ｘ６３Ａｇ　８．６５３．Ｊ５５８Ｌ、もしくは
キメラ抗体Ｈ＠のみで形質転換した実施例２２記載のＪ
５５８Ｌ−ｆ（及び、Ｘ６３Ａｇ８，６５３−Ｈでは反
応は陰性であった。

また蛍光顕微鏡観察と同様に処理したモンカ細胞をＦＩ
ＴＣの蛍光を指標としてフローサイトメトリー　（＝＋
　−ルｙ−社ＭＥＰＩＣ８−ＶＫよる）で分析したとこ
ろ、Ｊ５５８Ｌ−ＫＬやＸ６３１ｇ８．６５３−ＨＬの
培養上清をつかった時には陽性の反応が、Ｊ５５８Ｌ、
Ｘ６３Ａｇ　８．６５３．Ｊ５５８−Ｈ、Ｘ６３Ａｇ　
８．６５３−１−１の培養上清を使った時反応は陰性で
あった。Ｘ６３Ａｇ　８，６５３　　ｔ（Ｌの結果￥第
１９図に示す。

実施例２９（補体依存細胞障害試験） 抗体のＩＫＧは袖Ｓ４−活性化を通じて標的細胞の障害
をひきおこすことが知られて〜・る（　ＩＣ０Ｊ。

ブラウン、　　Ｋ、Ａ、ンヨイナー、　　ＭｏＭ、フラ
ンク１補体Ｊ：Ｖｖ、Ｅ、ボール、偏［“７アンタメン
タ・レイムノロジー」ラハンブンス（１９８４ン、６４
５ページ（Ｅ、Ｊ、Ｂｒｏｗｎ　＋　　Ｋ、Ａ、Ｊｏｉ
ｎｅｒ　、Ｍ、Ｍ、Ｆｒａｎｋ　＋ゝＣｏｒｎｐｌｅｍ
ａｎｔ　’　　：　　ｉｎ　Ｗ、Ｅ、Ｐａｕｌ　　Ｅｄ
＋’　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　＊　　Ｒａｖｅｎ　　Ｐｒｅａｓ（１９８４）ｐ６
４５）　参照〕。該キメラ抗体についてもｆｉｔＣ，で
標識した七ンカ細胞を用い本活性を検討した。

キメラ抗体は実施例２５記載の形質転換細胞Ｘ６３Ａｇ
　８．６５３　　ｋｌＬをＲＰＭＩ　　１６４　ｔ１児
全培地で培養し、その培養土清約７０扉ｔよりプロティ
ンＡセファロースを用いて回収し実験に供した。

一方、１０７個のモン力細胞をＩＩ　Ｃｒ−クロム酸（
日本原子力研究所１）１００μＣｉを含むＲＰＭＩ　１
６４０完全培地と３７℃に１時間保ち！ＩＣ，で標識し
た〔日沼州司、多田正人、熊谷勝男「１ｌ（Ｈ，標識細
胞を用いた抗体依存性細胞中介性細胞障害の測ボ」免疫
来談操作法）鳳巻２４３３ページ（１９７９）日本免疫
学金利参照〕。

残余の”Ｃ，−りｐム酸を洗滌流去の後、キメラ抗体と
補体（ウサギより調製）と混合し、３０〜６０分間お（
ことにより上清中に遊離してくるｔｉｌｅ、の鷺で細胞
Ｉｓ害活性とした。該キメラ抗体と補体な加える事によ
り”Ｃｒ１１ｍ率（細胞ｌｓ害率）は８４％であった。

一方該千メラ抗体のみでは９．０％、補体のみでは２２
％であり、キメラ抗体の補体依存細胞障害活性が認めら
れた。

実施例３０（抗体依存細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ。

Ａｎｔｉｂｏｄｙ　−ｄｓｐｅｎｄｓｎｔ　ｃｅｌｌ　
−ｍｅｄｉａｔｅｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　）活性
試験）抗体依存細胞媒介細胞障害活性試験（以下ＡＤＣ
Ｃ試験と略称する）はヒトエフェクター細胞及び抗体の
存在下に於けるＭａｎｃａ細胞に対する障害活性によつ
″Ｃ測定した［　１．ヘルス）Ｏム。

Ｖ、プラン］パン、　Ｋ、ＦＪ、ヘルストロム、プロシ
ーゲイングオプザナショナルアカデミーオプサイエンス
オプザユナイテインドステーツオプアメリカ８２巻１４
９９ページ（１９８５）（Ｉ。

Ｈｓｌｌｓｔｒ５ｍ　＋　　Ｖ、　Ｂｒａｎｋｏｖａｎ
　、　　Ｋ、Ｅ、　Ｈａｌｌ＋ｔｒｏｍ＋Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、’Ａｃａｄ＋　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　　８２　
　１４９９（１９８５））参照〕。

２Ｘ１０’個のモン力細胞を実施例２９に準じて１００
　ｐＣｌ［”ｅｒＪ−クロム酸で標識し、１回のＡＤＣ
Ｃ試験にその２ＸｌＯ’個を用いた。

エフェクター細胞は健求人末梢血よりリンパ球分離液（
ビオネテイツクスラボラトリープロダクソ（Ｂｉｏｎｅ
ｔｉｃａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｃｓ　
）製）を用いて分離した。

実施例２５記載のＸ６３Ａｇ　８．６５３−ＨＬ形質転
換細胞及び陽性対称試験用としてはマウスハイグリドー
マＮＬ−１をＲＰＭ１１６４０児全培地で培養し、１回
の実験には上消約５００μｊに含有される抗体を用い℃
行った。

２Ｘ１０’個のｊ：：Ａ識ＭａｌＣＢ細胞とｌｔｌ’ｌ
ｌ！のヒトエフェクター細胞及び抗体浴液５０μｌを混
合し、５％ＣＯｔ雰囲気ｒ３７℃６時間Ｉ＃置し、上清
中への５１　Ｃｒの遊離をもって活性とした。別にＭａ
ｎｃａ細胞のみを並行して装置し、５１　Ｃｒ遊離値を
空試験値と１−て夾験槓果より控除した。この空試験値
は９〜１２％であった。３回の測定値の平均をもって結
果とした。

Ｘ６３Ａｇ　８．６５３−ＨＬの生産する該ヒトマウス
キメラ抗体を使った場合の活性は２４．５％。

陽性対称ｖ：、験用のＮｌ、−１マウス抗体を使った場
合には１３．８％であった。一方、抗体を加えない場合
の値ｔユ２．３％、ヒトエフェクター細胞を加えない（
該ハイブリッド抗体のみ）場合は０．９％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗体Ｈ鎖のＶ領域のアミノ酸配列を示したも
のであり、第２図は抗体ＨｆｉのＣ領域のアミノ酸配列
を示したものであり、第３図は抗体り鎖（Ｋ鎖）のＶ領
域のアミノ酸配列を示したものであり、第４図は抗体Ｌ
ｄ（、に＠）のＣ領域のアミノ酸配列を示したものであ
り、第５図はヒト抗体Ｈａのエン・・ンサー塩基配列を
示したものであり、第６図は抗体Ｈ鎖の■領域遺伝子の
塩基配列を示したものであり、第７図は抗体Ｈ鎖のＣ領
域遺伝子の塩基配列を示したものであり、第８図は抗体
り鎖のＶ領域遺伝子の塩基配列を示したものであり、第
９図は抗体り鰭のＣ領域遺伝子の塩基配列を示したもの
であり、第１Ｏ図は抗体り鎖Ｖ領域の制限酵素切断地図
を示したものであり、ｍ１１ｍは抗体Ｌ＠Ｃ領域遺伝子
の制限＃素切防地図を示したものであり、ｔｐＪ１２図
はマウス抗体ＨｒａＶ領域を含む遺伝子の制限酵素ＬＪ
Ｊ断地園地図したものであり、第１３図はキメラ抗体Ｌ
Ｍ遺伝子の作成図を示したものであり、第１４図はキメ
ラ抗体Ｈ鎖の作成図を示したものであり、第１５図ハキ
メラ抗体Ｈ鎖転写産物のノーザンプロソト分ダ［の結果
を示したものであり、第１６図はキメラ抗体Ｈ鎖遺伝子
翻訳生成物の５ｔ）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の精米を示したものであり、第１７因はキメラ抗体り
鎖転写産物のノーザンプロット分析の結果を示したもの
であり、第１８図はＸ６３Ａｇ　８，６５３−ＨＬ細胞
の生産するキメラ抗体（）ｌ＋Ｌ鎖）の５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動のＭ米を示したものであり、
第１９図はキメラ抗体の様的細胞結合能をフローサイト
メトリーによる分り「によって調べた結果を示したもの
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＶ領域がマウス由来の
   アミノ酸配列であり、 （ｂ）Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＣ領域がヒト由来のアミノ
   酸配列であつて、かつ （ｃ）ヒト急性白血病リンパ腫共通抗原と特異的に反応
   する ことによつて特徴付けられるマウス−ヒトキメラ抗体。 ２、該Ｖ領域のマウス由来のアミノ酸配列が、ヒト急性
   白血病リンパ腫共通抗原に対して特異的に反応するマウ
   ス抗体に由来するものである第１項の抗体。 ３、該Ｃ領域のヒト由来のアミノ酸配列が、Ｌ鎖はヒト
   抗体のＫ鎖に由来するものであり且つＨ鎖はヒト抗体の
   Ｃｒ＿１鎖に由来するものである第１項の抗体。 ４、該Ｈ鎖のＶ領域におけるアミノ酸配列が添付第１図
   のアミノ酸配列を有するものである第１項の抗体。 ５、該Ｈ鎖のＣ領域におけるアミノ酸配列が添付第２図
   のアミノ酸配列を有するものである第１項記載の抗体。 ６、該Ｌ鎖のＶ領域におけるアミノ酸配列が添付第３図
   の１番目（Ｇｌｕ）から９７番目（Ｌｅｕ）のアミノ酸
   配列を少くとも有するものである第１項記載の抗体。 ７、該Ｌ鎖のＣ領域におけるアミノ酸配列が添付第４図
   のアミノ酸配列を有するものである第１項記載の抗体。 ８、（ｉ）Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＶ領域がマウス由来で
   あるアミノ酸配列を少くともコードす るＤＮＡ配列 （ｉｉ）Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＣ領域がヒト由来である
   アミノ酸配列を少くともコードする ＤＮＡ配列及び （ｉｉｉ）ヒト抗体Ｈ鎖由来のエンハンサーＤＮＡ配列 よりなる発現型キメラＤＮＡ配列。 ９、前記第８項の発現型キメラＤＮＡ配列が組み込まれ
   た組み換えプラスミド。 １０、前記第９項のプラスミドが導入されたマウスミエ
   ローマ細胞。