JPS6337633B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、オレフインを酸化して相応するエポ
キシドに転化し得る能力を有する菌を用いてオレ
フインを酸化してエポキシド類を製造する方法に
関する。 従来の技術 コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
及びノカルデイア属に属する微生物を用いてオレ
フインを酸化して相応するエポキシドを製造する
方法は既に提案されており（特公昭56−40号公
報）、また、かかる方法において特に、炭素数３
個乃至４個を有する直鎖状α―オレフインを炭素
源の存在する培地で酸化させることにより、高収
率でエポキシドを製造する方法が提案されている
（特開昭57−2692号公報）。 しかしこの方法においては、培地に添加する炭
素源の量が多過ぎると培地にコンタミが生じ易
く、また、粘度の上昇によりオレフインの過剰消
費が起り易く、エポキシドの生産活性が急激に低
下する。一方、逆に添加量が少な過ぎるとエポキ
シドの生産活性は十分に高くならず、又その失活
も早くなり、エポキシドの生産効率が低下して好
ましくない。そこでエポキシ化反応期間中、反応
系に炭素源、窒素源、更には、他の成分を適宜添
加することが提案されている（特開昭58−141790
号公報、特開昭58−141791号公報）。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、上記方法においては、炭素源等
の適正な添加量或いは添加速度が、炭素源の種
類、菌種、その他の醗酵条件の違い、さらには醗
酵過程の各時点においてそれぞれ異なるため、最
適の添加量又は添加速度に保持することは極めて
困難である。 本発明は、上記問題点を解決したもので、極め
て簡便な方法により炭素源等の増殖原料の添加量
を適正に調節し、エポキシドの生産活性を高活性
に長期間維持することにより、効率よくオレフイ
ンを酸化してエポキシドを製造する方法を提案す
ることを目的とするものである。 問題点を解決するための手段 本発明は、コリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属及びノカルデイア属に属する微生物群
から選定されたオレフインを酸化して相応するエ
ポキシドに転化し得る能力を有する菌を含む醗酵
槽でオレフインを酸化してエポキシド類を製造す
る方法において、前記醗酵槽から排出される炭酸
ガス量を25〜35ｍmol／ｇ―cell・dayに保持す
るように当該醗酵槽に増殖原料を添加することに
より成る微生物によりエポキシド類を製造する方
法である。 作 用 本発明で使用するコリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム及びノカルデイア属に属する微生
物群から選定されるオレフインを酸化して相応す
るエポキシドに転化し得る能力を有する菌（以下
「エポキシド生産菌」という）は、コリネバクテ
リウム・アルカナムATCC21194（工業技術院微生
物工業技術研究所寄託番号FERM−Ｐ−4598）、
コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス
ATCC15108（同、FERM―Ｐ―4599）、ブレビバ
クテリウム・ブタニカムATCC21196（同、
FERM―Ｐ―4600）、ブレビバクテリウム・ケト
グルタミカムATCC15587（同、FERM―Ｐ―
4601）、ノカルデイア・コラリーナＢ―276（同、
FERM―Ｐ―4094）、ノカルデイア・ブタニカ
ATCC21197（同、FERM―Ｐ―4602）、並びにノ
カルデイア・パラフイニカATCC21198（同、
FERM―Ｐ―4603）を例示し得る。 これらの菌のうち、ノカルデイア・コラリーナ
Ｂ―276の菌学的性状は、特公昭56−40号公報に、
コリネバクテリウム・アルカナムATCC21194、
ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196、
ノカルデイア・ブタニカATCC21197及びノカル
デイア・パラフイニカATCC21198の菌学的性状
は、特公昭47−48673号公報に、コリネバクテリ
ウム・ハイドロカーボクラスタスATCC15108の
菌学的性状は、特公昭46−41588号公報に、また、
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム
ATCC15587の菌学的性状は、米国特許第3591456
公報にそれぞれ詳記されている。 本発明では、上掲したエポキシド生産菌をまず
培養して菌体を増殖させ、次いで得られた菌の懸
濁液を調製する。当該菌体の増殖及び菌懸濁液の
調製は次の方法によると、高活性なエポキシド生
産性の菌を得ることができて好ましい。まず、グ
ルコース10〜60ｇ／、硫安１〜６ｇ／、
K₂HPO₄1〜２ｇ／、MgSO₄・7H₂O0.5〜２
ｇ／、KCl0.1〜１ｇ／、FeSO₄・7H₂O0.01
〜0.1ｇ／、カラリン102（三洋化成工業(株)製）
１〜５mlから成る培地でPHを6.8〜7.2に調節しな
がら30℃の温度で通気撹拌して回分式培養を行
う。この培養において、菌の増殖が静止期に達し
たら炭素源を加えながら半回分培養を行う。次い
で得られた菌体を無機塩を溶解した水溶液に乾燥
菌体濃度として３〜30ｇ／程度に懸濁させるこ
とにより菌懸濁液を調製することができる。この
菌懸濁液を醗酵槽に収容して、これにオレフイン
及び空気、酸素、酸素富化ガスのような酸素含有
ガスを供給して酸化させる。このとき、オレフイ
ンがプロピレンやブテンのようにガス状で供給で
きる場合は、酸素含有ガスと共に連続的に導入す
ることが好ましい。一方、オレフインがスチレン
等のように液状物の場合は、あらかじめ全量を醗
酵槽に収容しておくか、又は連続的或いは間歇的
にポンプ等により供給することが好ましい。尚、
オレフインは前述のプロピレンやブテンのように
α―，β―，γ―位に二重結合を有する直鎖状、
又は分岐鎖状のオレフイン或いはスチレン等芳香
環を有するオレフイン等エポキシド生産菌が酸化
し得るオレフインであれば、いずれでも本発明に
適用し得る。 醗酵槽から排出される炭酸ガスの量は醗酵槽排
出ガス中の炭酸ガス濃度及び排出ガスの流量を測
定することにより算出できるが、一般には、排出
ガスの流量は、当該醗酵槽に導入される空気の量
によりほぼ決定され、この量を変化させない限り
排出ガス量も変化しないため、一般には排ガス中
の炭酸ガス濃度で増殖原料の供給量をフイードバ
ツク制御することで十分である。 増殖原料としては、もつぱら炭素源を用いるこ
とができる。炭素源としては、グルコース、シユ
クロース、フラクトース、廃糖蜜のような糖類、
酢酸、エチレングリコール、プロピレングリコー
ル、ｎ―パラフイン、α―オレフイン等を用いる
ことができる。尚、炭素源の存在が資化の律速条
件となつていないような醗酵下においては、資化
の律速条件となる基質、例えば窒素源や、無機栄
養源等を増殖原料として用いることができる。 尚、排出される炭酸ガスの量は25ｍmol／ｇ―
cell・day（ｇ―cellとは、乾燥菌体１ｇと意味す
る）以下とすると菌のエポキシド生産活性が急激
に低下する傾向にあり、また35ｍmol／ｇ―
cell・day以上とすると菌の増殖が活発となり、
培養液の粘度上昇によりエポキシドの原料である
オレフインの過剰消費が起りエポキシドの生産活
性が急激に低下する傾向にある。従つて、醗酵槽
から排出される炭酸ガスの量が25〜35ｍmol／ｇ
―cell・dayとなるように増殖原料の添加量を調
節する。 次に本発明をプロピレンオキサイドの製造に適
用した場合の例について、図に基き説明する。 図中１は、醗酵槽で前述したエポキシド生産菌
が無機塩を脱イオン水に溶解した溶液に懸濁して
収容されている。無機塩溶液としては、リン酸水
素二カリウム１〜２ｇ／、硫酸マグネシウム・
７水塩0.5〜２ｇ／、塩化カリウム0.1〜１ｇ／
、硫酸第一鉄、７水塩0.01〜0.1ｇ／、カラ
リン102（三洋化成工業(株)製）１〜５ml／のもの
が好適である。菌体は乾燥菌体濃度として３〜30
ｇ／とすることが反応効率上好ましい。 醗酵槽１においては、その下部から殺菌された
酸素含有ガス及びプロピレンが散気管２を介して
供給される。プロピレンは１〜10ｇ／・minで
供給することが好ましい。１ｇ／・min以下の
供給速度では反応効率が悪く、又10ｇ／・min
以上とすると醗酵槽から排出されるガス中に未反
応のオレフインが多量に含まれることになりあま
り好ましくない。醗酵槽１中の醗酵液はPHセンサ
ー３によりPHが検知され、当該PHが6.5〜7.5を保
つようにPH制御装置４の指示信号により希硫酸５
又は水酸化ナトリウム水溶液６が添加できるよう
になつている。 また、醗酵槽１には、増殖原料としてのグルコ
ースを溶解した溶液１２がコントロールバルブ１
１を介して供給されるようになつている。 醗酵槽１内においてプロピレンは、エポキシド
生産菌の作用によりプロピレンオキサイドに変換
され、代謝物である炭酸ガス等とともに排出ガス
として系外に排出される。この排水ガス中のプロ
ピレンオキサイドは、排出ガス中の極く少量をサ
ンプリングしガスクロマトグラフイー７を用いる
ことにより分析しプロピレンオキサイドの製造量
を算出できる。また当該排出ガスは、硫酸を収容
した吸収塔８に導入され、プロピレンオキサイド
はプロピレングリコールとして相分離により回収
される。 一方、排ガス中の炭酸ガス濃度ガスセンサー９
により測定され、醗酵槽１内で発生する炭酸ガス
の量が25〜35ｍmol／ｇ―cell・dayとなるよう
に制御装置１０によりグルコース水溶液１２の供
給をコントロールバルブ１１でフイードバツク制
御される。 実施例 実施例１〜２，比較例１〜３ （菌体の調製） ノカルデイア・コラリートＢ―276（工業技術院
微生物工業技術研究所寄託番号FERM―Ｐ―
4094）の３白金耳をNBG培地（オキソイド社製
“ラブレンコ”パウダー10ｇ、中性バクテリオロ
ジカルペプトン10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グル
コース10ｇに水道水を加えて１とし、オートク
レーブ中で120℃、15分加熱殺菌した液体培地）
50mlを入れた500mlの坂口フラスコに接種し、30
℃の温度で24時間振盪（148回／分）培養した。
次にこの培養液を培地（リン酸水素二カリウム
1.7ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩1.5ｇ、塩化カ
リウム0.5ｇ、硫酸第一鉄・７水塩50mg、デイフ
コ社製イーストエキストラクト５ｇ、硫酸アンモ
ニウム１ｇ、グルコース10ｇに水道水を加えて１
とし、殺菌した液体培地）１に対し50ml添加
し、30℃温度で、PHを6.8〜7.2に維持しながら、
撹拌下に培養した。培養期間中は排ガス中のCO₂
濃度を測定し、CO₂の生成速度が50ｍmol／―
dayに下がつた時点で増殖原料溶液（50ｇ／―
グルコース及び５ｇ／―硫安溶液）を添加し、
CO₂生成速度が50〜90ｍmol／―dayとなるよ
うに増殖原料溶液の添加量をコントロールして64
時間半回分培養を行い菌体を活性化した。 エポキシドの生産 上記増殖後の培養液を15000Gで10分間遠心分
離して上澄液を除去し、次いで0.1モル濃度のリ
ン酸緩衝液（PH7.5）で、さらに下記に示す培地
で１回洗浄した後乾燥菌体濃度として５ｇ／と
なるように下記培地に再懸濁し、図に示したよう
な装置の300の醗酵槽に200収容した。 〔（培地）0.1モル濃度のリン酸緩衝液（PH7.5）
１に対し、リン酸水素二カリウム1.75ｇ、硫酸
マグネシウム・７水塩３ｇ、硫酸第一鉄・７水塩
50mgを溶解したもの。〕 次に下部ノズルから殺菌された５容量％のプロ
ピレンを含む空気を200／minの速度で供給し、
醗酵液のPHを７に保つように、10Nの水酸化ナト
リウム又は10Nの希硫酸を添加しながらプロピレ
ンの酸化を行つた。この際、炭酸ガスの生成量を
各々27，34，20，41ｍmol／ｇ―cell・dayに維
持するように炭酸ガスセンサーで炭酸ガス濃度を
測定して炭素源である５重量％のグルコース水溶
液を供給した。このときのプロピレオキサイドの
生産量の経時変化を第１表に示した。尚、グルコ
ース水溶液を添加しなかつたものについても同様
に行い、比較例３として第１表に併記した。この
結果から明らかなように炭酸ガスの生成量を25〜
35ｍmol／ｇ―dayにすることによりエポキシド
の生産活性を高く維持することができることが分
る。

【表】 実施例３〜４，比較例４〜５ ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196
（工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号
FERM―Ｐ―4598）、コリネバクテリウム・アル
カナムATCC21194（同、FERM―Ｐ―4598）を
用い、オレフインとして１―オクテンを原料とし
て、前記実施例１〜２、又は比較例３と全く同じ
操作を行つた。尚、排出される炭酸ガスの保持量
は30ｍmol／ｇ―cell・dayに維持するようにし
た。また、原料オレフインの１―オクテンは１
を有機溶剤として用いた１―ヘキサデカン20と
ともにあらかじめ醗酵槽に入れて24時間酸化させ
た。醗酵終了後１―ヘキサデカン層を相分離した
後、ガスクロマトグラフイーにより生成したエポ
キシオクタンの量を測定した。この結果を第２表
に示した。

【表】 発明の効果 以上のような本発明は、醗酵槽から排出される
炭酸ガスを測定し、該排出量を25〜35ｍmol／ｇ
―cell・dayに保持するように増殖原料の添加量
を調節するため、極めて簡便な方法により増殖原
料の添加量を適正に調節でき、エポキシド生産活
性を長期に亘り高活性に維持でき、効率よくエポ
キシドを製造することができる効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

図は本発明に適用される例示のフロー図であ
る。 １……醗酵槽、２……散気管、９……炭酸ガス
センサー、１０……制御装置、１１……コントロ
ールバルブ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
   属及びノカルデイア属に属する微生物群から選定
   されたオレフインを酸化して相応するエポキシド
   に転化し得る能力を有する菌を含む醗酵槽でオレ
   フインを酸化してエポキシド類を製造する方法に
   おいて、前記醗酵槽から排出される炭酸ガスの量
   を25〜35ｍmol／ｇ―cell・dayに保持するよう
   に当該醗酵槽に増殖原料を添加することを特徴と
   する微生物によりエポキシド類を製造する方法。