JPS6337640B2 - - Google Patents
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- JPS6337640B2 JPS6337640B2 JP55144063A JP14406380A JPS6337640B2 JP S6337640 B2 JPS6337640 B2 JP S6337640B2 JP 55144063 A JP55144063 A JP 55144063A JP 14406380 A JP14406380 A JP 14406380A JP S6337640 B2 JPS6337640 B2 JP S6337640B2
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- maltose
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
- G01N2400/18—Cyclodextrin
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- Y10S435/837—Bacillus megaterium
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Description
本発明は、血清、唾液や尿などの被検液中のア
ミラーゼ活性測定において、その基質として変性
還元性末端グルコース残基を有するグルコース重
合体または環状グルコース重合体を用い、該アミ
ラーゼの反応によつて生成する基質分解物にマル
トースデヒドロゲナーゼおよびNADまたは
NADPを作用せしめて生成した還元型NADまた
は還元型NADPを測定してなる新規なアミラー
ゼ活性測定法に関する。 一般にアミラーゼ活性測定法としては、基質と
して澱粉などのグルコース重合体を用い、アミラ
ーゼの加水分解作用により、グルコース、マルト
ースや種々のオリゴ糖を生成せしめる方法に基く
ものである。例えば、アミラーゼによる澱粉の加
水分解による粘度の低下を測定してなる測定法、
ヨウ素を用いるヨウ素滴定法、澱粉などにアミラ
ーゼを作用せしめて生成するマルトースを、α―
グルコシダーゼにてグルコースまで分解せしめ、
このグルコースをグルコースオキシダーゼやグル
コースデヒドロゲナーゼ、NAD（Ｐ）などととも
に反応せしめて測定してなる測定法、不溶性色素
結合澱粉にアミラーゼを作用せしめて生成される
可溶化された色素結合成分を測定してなるブルー
スターチ法やマルトースホスホリラーゼ法（特公
昭55−27800号方法）が報告されている。 しかしながらこれらの方法は、用いる試薬や反
応系でのグルコース重合体の加水分解状態の多様
性や、共存するグルコースやマルトースにより正
確な測定は困難であつた。また特にブルースター
チ法において、可溶性色素成分を遠心分離手段に
て分離する必要性があり、そのために測定の自動
化に著しい欠点となるので、さらにマルトースホ
スホリラーゼ法では４種類もの酵素を必要とする
コスト高な方法で、かつ工程数の多い方法であつ
た。 本発明者らは、アミラーゼ活性測定において簡
便かつ自動化し得る正確な測定法について種々研
究した結果、還元性末端グルコース残基を有する
グルコース重合体の還元性末端基を、エステル
化、エーテル化または酸化せしめることによりマ
ルトースデヒドロゲナーゼの基質とならない変性
還元性末端基となし、この変性還元性末端グルコ
ース残基を有するグルコース重合体をアミラーゼ
活性測定用の基質となすことにより、簡便かつ正
確に測定し得ることを見い出した。またこの変性
還元性末端グルコース残基を有するグルコース重
合体の代りに、環状グルコース重合体を用いるこ
とにより、良好に測定し得ることを見い出した。
さらに、反応によつて生成する基質分解物に、マ
ルトースデヒドロゲナーゼおよびNADまたは
NADPを作用せしめ、次いで反応によつて生成
する還元型NADまたは還元型NADPを直接的ま
たは還元型水素伝達系呈色反応試薬にて間接的に
測定することにより、より良好にアミラーゼ活性
を測定し得ることを見い出した。さらに好ましく
は、血清、唾液や尿などのアミラーゼ含有被検液
を、あらかじめ、α―グルコシダーゼまたは
Mg++、ATPの存在下ヘキソキナーゼなどのキナ
ーゼの作用にて前処理することによつて良好に測
定し得ることを知り、本発明を完成した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、その目的は簡便かつ正確で、自動化し得る良
好なアミラーゼ活性測定法を提供するものであ
る。 まず本発明に使用される基質としては、変性還
元性末端グルコース残基を有するグルコース重合
体または環状グルコース重合体であり、一般にこ
れらグルコース重合体としてはグルコース重合度
５以上のものが好ましい。また変性還元性末端グ
ルコース残基を有するグルコース重合体として
は、好ましくはアミロース、アミロペクチン、澱
粉や可溶性澱粉などのデキストリンと称される澱
粉加水分解物などのグルコース重合体の還元性末
端グルコース残基を変性還元性末端グルコース残
基となしたものが用いられる。本発明において変
性還元性末端グルコース残基としては、その還元
化能を失なわせしめたものであればよく、例えば
その還元性末端を常法によりエーテル化せしめる
か、エステル化せしめればよく、またはそのグル
コース残基を酸化せしめてグルコン酸残基または
そのエステル体などの誘導体となしたものが挙ら
れる。エーテル化について詳しく例示すれば、
種々の多糖類、例えば可溶性澱粉の溶液を、４％
メタノール性塩酸に加えて70℃、４時間反応せし
め、中和後、ゲル過剤充填カラムにて分子量約
1000以上の画分を集めて、メチルエーテル化され
た可溶性澱粉を得ればよく、または無水酢酸3.5
ml含有乾燥ピリジン中に可溶性澱粉を加えて０
℃、一夜反応せしめ、アセトンにて沈澱せしめ、
さらにゲル過剤充填カラムにて分子量約1000以
上の画分を集めて、アセチル化された可溶性澱粉
を得ればよく、さらに可溶性澱粉溶液にてフエー
リング試薬を加えて、５分〜20時間煮沸反応後濃
縮、メタノール添加にて不溶物の除去を行ない、
さらにゲル過剤充填カラムにて分子量約1000以
上の画分を集めて、可溶性澱粉の還元性末端グル
コース残基をグルコン酸残基に酸化せしめたもの
を得ればよく、さらにこのグルコン酸残基は、必
要に応じて公知のエステル化手段などにて誘導体
となしてもよい。さらにこれらの変性還元性末端
グルコース残基となす手段は上記の方法に限定さ
れるものでなく、簡便かつ安価な公知の種々の手
段を用いて行なえばよく、例えばメチルエーテル
化の代りに、エチルエーテル化、イソプロピルエ
ーテル化などの種々のエーテル誘導化せしめても
よく、またアセチル化の代りにプロピオニル化な
どの種々のアシル化手段を用いてエステル誘導化
せしめてもよく、さらにグルコン酸残基の代りに
その無水体であるグルコノラクトンタイプとなし
たものでもよいが、通常グルコノラクトンタイプ
自体不安定であつてグルコン酸タイプに容易に変
換するために、グルコン酸残基として使用するこ
とが好ましい。なおこれらの原料として用いられ
るグルコース重合体としてはほぼ単一な重合度を
有するものであつても、また種々の重合度からな
る混合物であつてもよい。また本発明に使用され
る環状グルコース重合体としては、例えば澱粉を
原料として得られるグルコース重合度６以上の環
状に結合したデキストリンで、α―、β―、γ
―、δ―やξ―サイクロデキストリンなどが挙ら
れる。 このような基質を用いて、アミラーゼを含有す
る被検液に加えることにより、通常37℃にて、PH
６〜８の緩衝液中にて、この基質はアミラーゼ作
用により加水分解されて、グルコース、マルトー
スや種々のオリゴなどの基質分解物を生成する。 さらにこの基質分解物を測定することにより、
被検液中のアミラーゼ活性の定量を行なうもので
あるが、好ましくは、この基質分解物にマルトー
スデヒドロゲナーゼおよびNADまたはNADPを
作用せしめ、通常37℃にて、PH６〜８の緩衝液中
にて行なうものである。 使用されるマルトースデヒドロゲナーゼとして
は、例えばバチルス・メガテリウム・Ｂ―0779菌
株（Bacillus megaterium Ｂ−0779）（微生物受
託番号通知書、微生物受託番号「微工研菌寄第
5662号、FERM−ＰNo.5662」）（昭和55年８月29
日特許願、発明の名称「マルトースデヒドロゲナ
ーゼの製造法」参照）などのマルトースデヒドロ
ゲナーゼ生産菌を培養して得られる酵素が用いら
れる。使用されるバチルス・メガテリウム・Ｂ−
0779菌株は静岡県田方群大仁町浮橋のすいか畑の
土壌より分離し、同定したもので、本菌の詳細な
菌学的所見は以下の通りである。 Ａ 生育の特徴 (イ) 普通寒天斜面培地 生育は良好で、線状に生育し、半光沢で、灰白
色〜灰色を呈す。可溶性色素は産生しない。 (ロ) 普通寒天平板培地 円形で、周囲はやや波状で、丘状の集落を形成
する。 (ハ) ペプトン水培地 生育はやや弱いが、一様に混濁後、柔毛状沈澱
を生ずる。 Ｂ 形態的特徴 単独、二連または短連鎖する。まつすぐな大き
な桿菌で、端は丸い。大きさは1.0〜1.5×2.0〜
3.0μで、まれに1.0〜1.5×1.5〜7.0μの細胞もみら
れる。莢膜（カプセル）を形成し、運動性はな
い。芽胞の確認は困難であるが、中央または端に
近い位置に形成する。 Ｃ 生化学的、生理的特徴 グラム染色 ＋ 抗酸性染色 − OFテスト ０（酸化） 嫌気での生育 − ゼラチンの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 − カゼインの加水分解 （＋） エスクリンの加水分解 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ （＋） レシチナーゼ − ウレアーゼ SSR培地 − クリステンゼン培地 − H2Sの産生 − VP、MRテスト − フオスフアターゼの産生 − リゾチーム耐性 − インドールの産生 − 硝酸塩の還元 ＋ クエン酸の利用（シモンズ培地） ＋ 炭水化物より酸の産生性（ガス非産生） 酸産生 Ｌ（＋）アラビノース、セロビオース、フラク
トース、グルコース、グリセリン、イヌリン、マ
ルトース、ラフイノース、シユクロース、トレハ
ロース、キシロース、 酸非産生 アドニトール、ヅルシトール、メソーエリスリ
トール、フコース、ガラクトース、イノシトー
ル、ラクトース、マンノース、メレジトース、メ
リビオース、Ｌ（＋）ラムノース、サリシン、Ｌ
−ソルボース、ソルビトール、デンプン、 DNAのGC含量 40.1ｇ 以上の通り、本菌Ｂ−0779菌株は、グラム染色
陽性、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性、芽胞を形
成する好気性の大きな桿菌、アセトイン非産生、
リゾチーム非耐性、レシチナーゼ非産生、アラビ
ノース、マンニトール、キシロースより酸を産生
するとの主たる性状を有することから、バチルス
属に属する菌と認められる〔Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology 第７版
（1957）、同第８版（1974）、医学細菌同定の手引
き（1974、坂崎利一訳）およびAgriculture
Handbook427、The genus Bacillus〕。さらに
後述第１表に示す詳しい対比により、本菌Ｂ−
0779菌株は、バチルス・メガテリウムに属すると
固定され、よつて本菌をバチルス・メガテリウ
ム・Ｂ−0779（Bacillus megaterium Ｂ−0779）
と命名したものである。
ミラーゼ活性測定において、その基質として変性
還元性末端グルコース残基を有するグルコース重
合体または環状グルコース重合体を用い、該アミ
ラーゼの反応によつて生成する基質分解物にマル
トースデヒドロゲナーゼおよびNADまたは
NADPを作用せしめて生成した還元型NADまた
は還元型NADPを測定してなる新規なアミラー
ゼ活性測定法に関する。 一般にアミラーゼ活性測定法としては、基質と
して澱粉などのグルコース重合体を用い、アミラ
ーゼの加水分解作用により、グルコース、マルト
ースや種々のオリゴ糖を生成せしめる方法に基く
ものである。例えば、アミラーゼによる澱粉の加
水分解による粘度の低下を測定してなる測定法、
ヨウ素を用いるヨウ素滴定法、澱粉などにアミラ
ーゼを作用せしめて生成するマルトースを、α―
グルコシダーゼにてグルコースまで分解せしめ、
このグルコースをグルコースオキシダーゼやグル
コースデヒドロゲナーゼ、NAD（Ｐ）などととも
に反応せしめて測定してなる測定法、不溶性色素
結合澱粉にアミラーゼを作用せしめて生成される
可溶化された色素結合成分を測定してなるブルー
スターチ法やマルトースホスホリラーゼ法（特公
昭55−27800号方法）が報告されている。 しかしながらこれらの方法は、用いる試薬や反
応系でのグルコース重合体の加水分解状態の多様
性や、共存するグルコースやマルトースにより正
確な測定は困難であつた。また特にブルースター
チ法において、可溶性色素成分を遠心分離手段に
て分離する必要性があり、そのために測定の自動
化に著しい欠点となるので、さらにマルトースホ
スホリラーゼ法では４種類もの酵素を必要とする
コスト高な方法で、かつ工程数の多い方法であつ
た。 本発明者らは、アミラーゼ活性測定において簡
便かつ自動化し得る正確な測定法について種々研
究した結果、還元性末端グルコース残基を有する
グルコース重合体の還元性末端基を、エステル
化、エーテル化または酸化せしめることによりマ
ルトースデヒドロゲナーゼの基質とならない変性
還元性末端基となし、この変性還元性末端グルコ
ース残基を有するグルコース重合体をアミラーゼ
活性測定用の基質となすことにより、簡便かつ正
確に測定し得ることを見い出した。またこの変性
還元性末端グルコース残基を有するグルコース重
合体の代りに、環状グルコース重合体を用いるこ
とにより、良好に測定し得ることを見い出した。
さらに、反応によつて生成する基質分解物に、マ
ルトースデヒドロゲナーゼおよびNADまたは
NADPを作用せしめ、次いで反応によつて生成
する還元型NADまたは還元型NADPを直接的ま
たは還元型水素伝達系呈色反応試薬にて間接的に
測定することにより、より良好にアミラーゼ活性
を測定し得ることを見い出した。さらに好ましく
は、血清、唾液や尿などのアミラーゼ含有被検液
を、あらかじめ、α―グルコシダーゼまたは
Mg++、ATPの存在下ヘキソキナーゼなどのキナ
ーゼの作用にて前処理することによつて良好に測
定し得ることを知り、本発明を完成した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、その目的は簡便かつ正確で、自動化し得る良
好なアミラーゼ活性測定法を提供するものであ
る。 まず本発明に使用される基質としては、変性還
元性末端グルコース残基を有するグルコース重合
体または環状グルコース重合体であり、一般にこ
れらグルコース重合体としてはグルコース重合度
５以上のものが好ましい。また変性還元性末端グ
ルコース残基を有するグルコース重合体として
は、好ましくはアミロース、アミロペクチン、澱
粉や可溶性澱粉などのデキストリンと称される澱
粉加水分解物などのグルコース重合体の還元性末
端グルコース残基を変性還元性末端グルコース残
基となしたものが用いられる。本発明において変
性還元性末端グルコース残基としては、その還元
化能を失なわせしめたものであればよく、例えば
その還元性末端を常法によりエーテル化せしめる
か、エステル化せしめればよく、またはそのグル
コース残基を酸化せしめてグルコン酸残基または
そのエステル体などの誘導体となしたものが挙ら
れる。エーテル化について詳しく例示すれば、
種々の多糖類、例えば可溶性澱粉の溶液を、４％
メタノール性塩酸に加えて70℃、４時間反応せし
め、中和後、ゲル過剤充填カラムにて分子量約
1000以上の画分を集めて、メチルエーテル化され
た可溶性澱粉を得ればよく、または無水酢酸3.5
ml含有乾燥ピリジン中に可溶性澱粉を加えて０
℃、一夜反応せしめ、アセトンにて沈澱せしめ、
さらにゲル過剤充填カラムにて分子量約1000以
上の画分を集めて、アセチル化された可溶性澱粉
を得ればよく、さらに可溶性澱粉溶液にてフエー
リング試薬を加えて、５分〜20時間煮沸反応後濃
縮、メタノール添加にて不溶物の除去を行ない、
さらにゲル過剤充填カラムにて分子量約1000以
上の画分を集めて、可溶性澱粉の還元性末端グル
コース残基をグルコン酸残基に酸化せしめたもの
を得ればよく、さらにこのグルコン酸残基は、必
要に応じて公知のエステル化手段などにて誘導体
となしてもよい。さらにこれらの変性還元性末端
グルコース残基となす手段は上記の方法に限定さ
れるものでなく、簡便かつ安価な公知の種々の手
段を用いて行なえばよく、例えばメチルエーテル
化の代りに、エチルエーテル化、イソプロピルエ
ーテル化などの種々のエーテル誘導化せしめても
よく、またアセチル化の代りにプロピオニル化な
どの種々のアシル化手段を用いてエステル誘導化
せしめてもよく、さらにグルコン酸残基の代りに
その無水体であるグルコノラクトンタイプとなし
たものでもよいが、通常グルコノラクトンタイプ
自体不安定であつてグルコン酸タイプに容易に変
換するために、グルコン酸残基として使用するこ
とが好ましい。なおこれらの原料として用いられ
るグルコース重合体としてはほぼ単一な重合度を
有するものであつても、また種々の重合度からな
る混合物であつてもよい。また本発明に使用され
る環状グルコース重合体としては、例えば澱粉を
原料として得られるグルコース重合度６以上の環
状に結合したデキストリンで、α―、β―、γ
―、δ―やξ―サイクロデキストリンなどが挙ら
れる。 このような基質を用いて、アミラーゼを含有す
る被検液に加えることにより、通常37℃にて、PH
６〜８の緩衝液中にて、この基質はアミラーゼ作
用により加水分解されて、グルコース、マルトー
スや種々のオリゴなどの基質分解物を生成する。 さらにこの基質分解物を測定することにより、
被検液中のアミラーゼ活性の定量を行なうもので
あるが、好ましくは、この基質分解物にマルトー
スデヒドロゲナーゼおよびNADまたはNADPを
作用せしめ、通常37℃にて、PH６〜８の緩衝液中
にて行なうものである。 使用されるマルトースデヒドロゲナーゼとして
は、例えばバチルス・メガテリウム・Ｂ―0779菌
株（Bacillus megaterium Ｂ−0779）（微生物受
託番号通知書、微生物受託番号「微工研菌寄第
5662号、FERM−ＰNo.5662」）（昭和55年８月29
日特許願、発明の名称「マルトースデヒドロゲナ
ーゼの製造法」参照）などのマルトースデヒドロ
ゲナーゼ生産菌を培養して得られる酵素が用いら
れる。使用されるバチルス・メガテリウム・Ｂ−
0779菌株は静岡県田方群大仁町浮橋のすいか畑の
土壌より分離し、同定したもので、本菌の詳細な
菌学的所見は以下の通りである。 Ａ 生育の特徴 (イ) 普通寒天斜面培地 生育は良好で、線状に生育し、半光沢で、灰白
色〜灰色を呈す。可溶性色素は産生しない。 (ロ) 普通寒天平板培地 円形で、周囲はやや波状で、丘状の集落を形成
する。 (ハ) ペプトン水培地 生育はやや弱いが、一様に混濁後、柔毛状沈澱
を生ずる。 Ｂ 形態的特徴 単独、二連または短連鎖する。まつすぐな大き
な桿菌で、端は丸い。大きさは1.0〜1.5×2.0〜
3.0μで、まれに1.0〜1.5×1.5〜7.0μの細胞もみら
れる。莢膜（カプセル）を形成し、運動性はな
い。芽胞の確認は困難であるが、中央または端に
近い位置に形成する。 Ｃ 生化学的、生理的特徴 グラム染色 ＋ 抗酸性染色 − OFテスト ０（酸化） 嫌気での生育 − ゼラチンの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 − カゼインの加水分解 （＋） エスクリンの加水分解 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ （＋） レシチナーゼ − ウレアーゼ SSR培地 − クリステンゼン培地 − H2Sの産生 − VP、MRテスト − フオスフアターゼの産生 − リゾチーム耐性 − インドールの産生 − 硝酸塩の還元 ＋ クエン酸の利用（シモンズ培地） ＋ 炭水化物より酸の産生性（ガス非産生） 酸産生 Ｌ（＋）アラビノース、セロビオース、フラク
トース、グルコース、グリセリン、イヌリン、マ
ルトース、ラフイノース、シユクロース、トレハ
ロース、キシロース、 酸非産生 アドニトール、ヅルシトール、メソーエリスリ
トール、フコース、ガラクトース、イノシトー
ル、ラクトース、マンノース、メレジトース、メ
リビオース、Ｌ（＋）ラムノース、サリシン、Ｌ
−ソルボース、ソルビトール、デンプン、 DNAのGC含量 40.1ｇ 以上の通り、本菌Ｂ−0779菌株は、グラム染色
陽性、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性、芽胞を形
成する好気性の大きな桿菌、アセトイン非産生、
リゾチーム非耐性、レシチナーゼ非産生、アラビ
ノース、マンニトール、キシロースより酸を産生
するとの主たる性状を有することから、バチルス
属に属する菌と認められる〔Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology 第７版
（1957）、同第８版（1974）、医学細菌同定の手引
き（1974、坂崎利一訳）およびAgriculture
Handbook427、The genus Bacillus〕。さらに
後述第１表に示す詳しい対比により、本菌Ｂ−
0779菌株は、バチルス・メガテリウムに属すると
固定され、よつて本菌をバチルス・メガテリウ
ム・Ｂ−0779（Bacillus megaterium Ｂ−0779）
と命名したものである。
【表】
【表】
さらに、マルトースデヒドロゲナーゼを得るに
当つては、このマルトースデヒドロゲナーゼ生産
菌を、抗生物質、酵素などを生産する通常の方法
で培養する。培養の形態は液体培養でも固体培養
でもよいが工業的にはマルトースデヒドロゲナー
ゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深部
通気撹拌培養を行なうのが有利である。培地の栄
養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用される。窒素源としては利用可能な
窒素化合物であればよく、例えばコーン・スチー
プ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母
エキス、種々の肉エキスなどが使用される。炭素
源としては資化可能な炭素化合物であればよく、
例えば糖蜜、グルコース、グリセリン、シユクロ
ース、デキストリンなどが使用される。その他、
食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、第一リ
ン酸カリウム、第二リン酸カリウムなどの種々の
無機塩が必要に応じて使用される。培養温度は菌
が発育し、マルトースデヒドロゲナーゼを生産す
る範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは25〜30
℃である。培養時間は、条件によつて多少異なる
が、通常30〜72時間程度であつて、マルトースデ
ヒドロゲナーゼが最高力価に達する時期をみはか
らつて適当な時期に培養を終了すればよい。かく
して得られたマルトースデヒドロゲナーゼ生産菌
の培養物中において、マルトースデヒドロゲナー
ゼはその菌体内に含有、蓄積されている。このよ
うにして得られた培養物中よりマルトースデヒド
ロゲナーゼを抽出するために一例を挙げれば、ま
ず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を、トリ
ス―塩酸緩衝液などの溶液を用いて、リゾチーム
処理、超音波処理、フレンチプレス処理などの
種々の菌体処理手段を適宜選択組合せて、粗製の
マルトースデヒドロゲナーゼ含有液を得る。次い
でこの粗製のマルトースデヒドロゲナーゼ含有液
は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製
手段を用いて精製されたマルトースデヒドロゲナ
ーゼを得る。例えば粗製のマルトースデヒドロゲ
ナーゼ含有液に、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食
塩、硫酸アルミニウムなどによる塩析法などを用
いて溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さら
にこの沈澱物を、トリス―塩酸緩衝液などの溶媒
に溶解せしめ、これをジエチルアミノエチル―セ
ルロース、ジエチルアミノエチル―デキストラン
ゲル、トリエチルアミノエチル―デキストランゲ
ルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポ
リアクリルアマイドゲルなどのゲル過剤による
吸着クロマトグラフイーを行なつて精製せしめ、
次いでこれを凍結乾燥してマルトースデヒドロゲ
ナーゼの粉末を得る。 このようにして得られたマルトースデヒドロゲ
ナーゼの活性測定法、理化学的性質は、以下に述
る通りである。 (1) 活性測定法 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％ニトロテトラゾリウム・ブルー（NTB）
0.1ml １％トリトンＸ−100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％フエナジンメトサルフエート（PMS）
0.02ml 1Mマルトース 0.1ml蒸留水 0.08ml 計 1.00ml よりなる組成を有する反応液1.00mlを、37℃、３
分間予備加温し、次いで酵素液0.05mlを加えて37
℃、10分間反応せしめた後0.1N塩酸2.0mlを加え
て反応を停止せしめ、生成するNTBH2O量を波
長550nmにおける吸着度（AS）として測定する。
また盲検として酵素液の代りに蒸留水0.05mlを用
い、同様にして波長550nmにおける吸光度（Ab）
を測定する。 上記の活性測定法の反応系は次式に示す通りで
ある。 本発明のマルトースデヒドロゲナーゼにおい
て、上記の反応条件にて１分間に1μモルの
NTBH2を生成する酵素活性を１単位（1U）と
するものである。 また酵素活性の算出は、次式に定つた。 活性（Ｕ／ml）＝（As−Ab）×3.05／12.4×10×0.05 ＝（As−Ab）×0.49 (2) 基質特異性 活性測定法における反応液のマルトースの代り
に、第２表に記載の各基質0.1mlを用いて、以下
活性測定法に基いて、その550nmにおける吸光度
を測定し、その相対活性を求めた。その結果、第
２表に示す通りであつた。
当つては、このマルトースデヒドロゲナーゼ生産
菌を、抗生物質、酵素などを生産する通常の方法
で培養する。培養の形態は液体培養でも固体培養
でもよいが工業的にはマルトースデヒドロゲナー
ゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深部
通気撹拌培養を行なうのが有利である。培地の栄
養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用される。窒素源としては利用可能な
窒素化合物であればよく、例えばコーン・スチー
プ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母
エキス、種々の肉エキスなどが使用される。炭素
源としては資化可能な炭素化合物であればよく、
例えば糖蜜、グルコース、グリセリン、シユクロ
ース、デキストリンなどが使用される。その他、
食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、第一リ
ン酸カリウム、第二リン酸カリウムなどの種々の
無機塩が必要に応じて使用される。培養温度は菌
が発育し、マルトースデヒドロゲナーゼを生産す
る範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは25〜30
℃である。培養時間は、条件によつて多少異なる
が、通常30〜72時間程度であつて、マルトースデ
ヒドロゲナーゼが最高力価に達する時期をみはか
らつて適当な時期に培養を終了すればよい。かく
して得られたマルトースデヒドロゲナーゼ生産菌
の培養物中において、マルトースデヒドロゲナー
ゼはその菌体内に含有、蓄積されている。このよ
うにして得られた培養物中よりマルトースデヒド
ロゲナーゼを抽出するために一例を挙げれば、ま
ず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を、トリ
ス―塩酸緩衝液などの溶液を用いて、リゾチーム
処理、超音波処理、フレンチプレス処理などの
種々の菌体処理手段を適宜選択組合せて、粗製の
マルトースデヒドロゲナーゼ含有液を得る。次い
でこの粗製のマルトースデヒドロゲナーゼ含有液
は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製
手段を用いて精製されたマルトースデヒドロゲナ
ーゼを得る。例えば粗製のマルトースデヒドロゲ
ナーゼ含有液に、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食
塩、硫酸アルミニウムなどによる塩析法などを用
いて溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さら
にこの沈澱物を、トリス―塩酸緩衝液などの溶媒
に溶解せしめ、これをジエチルアミノエチル―セ
ルロース、ジエチルアミノエチル―デキストラン
ゲル、トリエチルアミノエチル―デキストランゲ
ルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポ
リアクリルアマイドゲルなどのゲル過剤による
吸着クロマトグラフイーを行なつて精製せしめ、
次いでこれを凍結乾燥してマルトースデヒドロゲ
ナーゼの粉末を得る。 このようにして得られたマルトースデヒドロゲ
ナーゼの活性測定法、理化学的性質は、以下に述
る通りである。 (1) 活性測定法 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％ニトロテトラゾリウム・ブルー（NTB）
0.1ml １％トリトンＸ−100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％フエナジンメトサルフエート（PMS）
0.02ml 1Mマルトース 0.1ml蒸留水 0.08ml 計 1.00ml よりなる組成を有する反応液1.00mlを、37℃、３
分間予備加温し、次いで酵素液0.05mlを加えて37
℃、10分間反応せしめた後0.1N塩酸2.0mlを加え
て反応を停止せしめ、生成するNTBH2O量を波
長550nmにおける吸着度（AS）として測定する。
また盲検として酵素液の代りに蒸留水0.05mlを用
い、同様にして波長550nmにおける吸光度（Ab）
を測定する。 上記の活性測定法の反応系は次式に示す通りで
ある。 本発明のマルトースデヒドロゲナーゼにおい
て、上記の反応条件にて１分間に1μモルの
NTBH2を生成する酵素活性を１単位（1U）と
するものである。 また酵素活性の算出は、次式に定つた。 活性（Ｕ／ml）＝（As−Ab）×3.05／12.4×10×0.05 ＝（As−Ab）×0.49 (2) 基質特異性 活性測定法における反応液のマルトースの代り
に、第２表に記載の各基質0.1mlを用いて、以下
活性測定法に基いて、その550nmにおける吸光度
を測定し、その相対活性を求めた。その結果、第
２表に示す通りであつた。
【表】
【表】
第２表に示す結果より明らかな通り、本発明の
マルトースデヒドロゲナーゼは、マルトースおよ
びラクトースにその基質特異性を有するものと認
められる。 (3) 補酵素 活性測定法における反応液のNADPの代りに、
NAD、および無添加の条件にて行ない、以下活
性測定法に基いて活性を測定した。その結果、第
３表に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロ
ゲナーゼは補酵素としてNADP、またはNADを
必要とするものと認められた。
マルトースデヒドロゲナーゼは、マルトースおよ
びラクトースにその基質特異性を有するものと認
められる。 (3) 補酵素 活性測定法における反応液のNADPの代りに、
NAD、および無添加の条件にて行ない、以下活
性測定法に基いて活性を測定した。その結果、第
３表に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロ
ゲナーゼは補酵素としてNADP、またはNADを
必要とするものと認められた。
【表】
(4) 酵素作用
下記反応式
にて示される、補酵素NAD（Ｐ）+とともにマルト
ースに作用して、GGL、還元型NAD（Ｐ）を生
成する反応を触媒する酵素作用を有する。 (5) 至適PH 1Mマルトース 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.2M緩衝液（各種PH域） 0.3ml 蒸留水 2.5ml 計 3.0ml の組成よりなる反応液を37℃、３分間予備加温
し、これに酵素液（1U／ml）0.03mlを加えて
37C、10分間反応せしめた後反応によつて生成す
る還元型NADPの増加を波長340nmにて測定し、
その至適PHを求めた。その結果第１図に示す通り
で、図中、〇−〇は0.2Mジメチルグルタル酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（PH4.5〜7.2）、●−●
は0.2Mリン酸緩衝液（PH6.1〜7.4）、□−□は
0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.9〜9.3）の各緩衝
液の場合を示し、本発明のマルトースデヒドロゲ
ナーゼの至適PHはPH7.5付近と認められた。 (6) 至適温度 活性測定法における反応液1.00mlを、25〜55℃
の各温度にて３分間加温した後、これに酵素液
（0.05U／ml）0.05mlを加え、各温度にて10分間反
応せしめた後、0.1N塩酸2.0mlを加えて反応を停
止せしめ、次いで反応によつて生成したNTBH2
量を波長550nmにて測定した。その結果、第２図
に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロゲナ
ーゼの至適温度は約45℃と認められた。 (7) PH安定性 酵素液（10U／ml）0.1ml、各種緩衝液0.1mlお
よび蒸留水0.8mlよりなる溶液を、37℃、60分間
処理した後氷水中にて冷却し、次いでこれを酵素
の活性測定法に基いてその活性を測定した。その
結果、第３図に示す通りで、図中、〇−〇は
0.2Mジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（PH４〜6.6）、●−●は0.2Mリン酸緩衝液
（PH6.3〜7.4）、□−□は0.2Mトリス―塩酸緩衝液
（PH7.6〜8.6）、△−△は0.2Mグリシン―水酸化ナ
トリウム緩衝液（PH8.7〜9.5）を示し、本発明の
マルトースデヒドロゲナーゼは、PH７〜8.5にPH
安定性を有する（37℃、60分処理）と認められ
る。 (8) 熱安定性 酵素液（10U／ml）0.1ml、0.2Mトリス―塩酸
緩衝液（PH7.5）0.1mlおよび蒸留水0.8mlよりなる
溶液を、37〜60℃の各温度にて、10分間処理した
後氷水中にて冷却し、次いでこれを酵素の活性測
定法に基いてその活性を測定した。その結果、第
４図に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロ
ゲナーゼの熱安定性は37℃以下である（PH7.5、
10分処理）と認められた。 (9) 分子量 約93000（セフアクリルＳ−200によるゲル過
法にて） (10) 等電点 PH5.1付近（キヤリアーアンホライトを用いる
電気泳動法にて） (11) Km値 Km＝3.4×10-2M（マルトースに対して） (12) 金属イオン、PCMB、EDTAの影響 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml 0.5％NTB 0.05ml ２％トリトン×−100 0.05ml 1Mマルトース 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％PMS 0.02ml 金属イオン、PCMB、EDTA含有液 0.1ml 蒸留水 0.18ml 計 1.00ml よりなる反応液を、37℃、３分間予備加温した
後酵素液（0.05U／ml）0.05mlを加えて37℃、10
分間反応せしめ、0.1N塩酸2.0mlを加えて反応を
停止した後、波長550nmにおける吸光度を測定し
て、各金属イオン、PCMB、EDTAの影響を測
定した。その結果、第４表に示す通りであつた。
ースに作用して、GGL、還元型NAD（Ｐ）を生
成する反応を触媒する酵素作用を有する。 (5) 至適PH 1Mマルトース 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.2M緩衝液（各種PH域） 0.3ml 蒸留水 2.5ml 計 3.0ml の組成よりなる反応液を37℃、３分間予備加温
し、これに酵素液（1U／ml）0.03mlを加えて
37C、10分間反応せしめた後反応によつて生成す
る還元型NADPの増加を波長340nmにて測定し、
その至適PHを求めた。その結果第１図に示す通り
で、図中、〇−〇は0.2Mジメチルグルタル酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（PH4.5〜7.2）、●−●
は0.2Mリン酸緩衝液（PH6.1〜7.4）、□−□は
0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.9〜9.3）の各緩衝
液の場合を示し、本発明のマルトースデヒドロゲ
ナーゼの至適PHはPH7.5付近と認められた。 (6) 至適温度 活性測定法における反応液1.00mlを、25〜55℃
の各温度にて３分間加温した後、これに酵素液
（0.05U／ml）0.05mlを加え、各温度にて10分間反
応せしめた後、0.1N塩酸2.0mlを加えて反応を停
止せしめ、次いで反応によつて生成したNTBH2
量を波長550nmにて測定した。その結果、第２図
に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロゲナ
ーゼの至適温度は約45℃と認められた。 (7) PH安定性 酵素液（10U／ml）0.1ml、各種緩衝液0.1mlお
よび蒸留水0.8mlよりなる溶液を、37℃、60分間
処理した後氷水中にて冷却し、次いでこれを酵素
の活性測定法に基いてその活性を測定した。その
結果、第３図に示す通りで、図中、〇−〇は
0.2Mジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（PH４〜6.6）、●−●は0.2Mリン酸緩衝液
（PH6.3〜7.4）、□−□は0.2Mトリス―塩酸緩衝液
（PH7.6〜8.6）、△−△は0.2Mグリシン―水酸化ナ
トリウム緩衝液（PH8.7〜9.5）を示し、本発明の
マルトースデヒドロゲナーゼは、PH７〜8.5にPH
安定性を有する（37℃、60分処理）と認められ
る。 (8) 熱安定性 酵素液（10U／ml）0.1ml、0.2Mトリス―塩酸
緩衝液（PH7.5）0.1mlおよび蒸留水0.8mlよりなる
溶液を、37〜60℃の各温度にて、10分間処理した
後氷水中にて冷却し、次いでこれを酵素の活性測
定法に基いてその活性を測定した。その結果、第
４図に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロ
ゲナーゼの熱安定性は37℃以下である（PH7.5、
10分処理）と認められた。 (9) 分子量 約93000（セフアクリルＳ−200によるゲル過
法にて） (10) 等電点 PH5.1付近（キヤリアーアンホライトを用いる
電気泳動法にて） (11) Km値 Km＝3.4×10-2M（マルトースに対して） (12) 金属イオン、PCMB、EDTAの影響 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml 0.5％NTB 0.05ml ２％トリトン×−100 0.05ml 1Mマルトース 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％PMS 0.02ml 金属イオン、PCMB、EDTA含有液 0.1ml 蒸留水 0.18ml 計 1.00ml よりなる反応液を、37℃、３分間予備加温した
後酵素液（0.05U／ml）0.05mlを加えて37℃、10
分間反応せしめ、0.1N塩酸2.0mlを加えて反応を
停止した後、波長550nmにおける吸光度を測定し
て、各金属イオン、PCMB、EDTAの影響を測
定した。その結果、第４表に示す通りであつた。
【表】
【表】
(13) 界面活性剤の影響
1Mマルトース 0.1ml
10mMNADP 0.1ml
0.2Mトリス―塩酸緩衝液 0.4ml
各種界面活性剤 0.1ml
蒸留水 2.3ml
計 3.0ml
よりなる反応液を37℃、３分間予備加温し、こ
れに酵素液（1U／ml）0.05mlを加えて37℃、10
分間反応せしめた後、生成する還元型NADPを
波長340nmにて測定して、界面活性剤の影響を測
定した。その結果、第５表に示す通りであつた。
れに酵素液（1U／ml）0.05mlを加えて37℃、10
分間反応せしめた後、生成する還元型NADPを
波長340nmにて測定して、界面活性剤の影響を測
定した。その結果、第５表に示す通りであつた。
【表】
【表】
以上の理化学的性質より、本発明の酵素は、ラ
クトース、セロビオース、マルトトリオースなど
に対しても作用するものの、マルトースに強く作
用し、かつその酵素作用、その他の諸性質から、
公知のマルトースデヒドロゲナーゼ〔NAD（Ｐ）
−Dependent Maltose dehydrogenase；Agric.
Biol. Chem.44(1)，41〜47，1980〕に属する酵素
作用を有する酵素と認められるものであつた。ま
た、本発明において前記のバチルス属に属するマ
ルトースデヒドロゲナーゼのみでなく、マルトー
スデヒドロゲナーゼに属すると認められる酵素で
あれば何んら限定されるものでなく、例えばコリ
ネバクテリウム・エス・ピー・No.93−１菌株
〔Agric.Biol.Chem.，44(1)，41〜47，1980〕の培
養物から得られるマルトースデヒドロゲナーゼを
使用してもよい。 このようにして基質分解物に、マルトースデヒ
ドロゲナーゼを作用せしめることにより、基質分
解物たるマルトースのみならず、グルコースやマ
ルトトリオース、マルトペントースなどのオリゴ
糖にも作用し、著しく良好に基質分解物と作用し
てなるもので、その結果、マルトースデヒドロゲ
ナーゼの酵素作用に示す通り、定量的に還元型
NADまたは還元型NADPを生成してなるもので
ある。 次いでこの生成した還元型NADまたは還元型
NADPを直接的に波長340nmにて定量せしめて
アミラーゼ活性測定としてもよく、またこの還元
型NADまたは還元型NADPに、この還元型水素
伝達系呈色反応試薬を作用せしめて、還元型
NADまたは還元型NADPの水素を別の伝達系に
て呈色せしめ、これを定量し、間接的に行なつて
アミラーゼ活性の測定を行なつてもよい。この間
接的な測定において使用される還元型水素伝達系
呈色反応試薬としては、例えばテトラゾリウム塩
とジアホラーゼを含有する試薬やテトラゾリウム
塩とフエナジンメトサルフエートを含有する試薬
などが挙られ、反応によつて生ずる呈色を波長
550nmで吸光度測定すればよい。 さらに好適なアミラーゼ活性測定のための系と
しては、例えば0.2Mトリス―塩酸緩衝液0.4部、
１％牛血清アルブミン0.1部、0.25％NTB0.1部、
１％トリトンＸ―1000.1部、10mMNAD（Ｐ）0.1
部、0.05％PMS0.02部、10％基質溶液0.1部、
200U／mlマルトースデヒドロゲナーゼ0.05部、
蒸留水0.03部よりなる反応液や、0.2Mトリス―
塩酸緩衝液0.3部、10mMNAD（Ｐ）0.1部、10％
基質溶液0.1部、200U／mlマルトースデヒドロゲ
ナーゼ0.05部、蒸留水0.45部よりなる反応液が挙
られ、この反応液１部当り、通常0.01〜0.5部程
度の被検液を加えて、通常37℃にて、一定時間反
応せしめればよく、反応時間としては５分間程度
で十充である。反応後、反応を停止せしめ、次い
で適宜の波長にて定量せしめればよい。 また対象とする被検液としては、通常血清、尿
や唾液が挙られ、これらは適宜希釈して用いても
よい。さらにこれらの被検液には、あらかじめ、
グルコースやマルトースが共存している場合が多
く、この際、例えばマルトースにα―グルコシダ
ーゼを作用せしめてグルコースにまで分解せし
め、またグルコースにはATP、Mg++好ましくは
MgCl2の存在下、ヘキソキナーゼまたはグルコキ
ナーゼなどのキナーゼを作用せしめてグルコース
―６―リン酸としてリン酸化せしめ、さらにマル
トースホスホリラーゼを用いてもよく、被検液中
の溶存酸素量に悪影響を及ぼすことなく、もはや
共存するグルコースやマルトースによるアミラー
ゼ活性測定の際にも悪影響を及ぼすことのない化
合物に変換せしめればよい。 以上の如く、本発明は、アミラーゼ例えばα―
アミラーゼやβ―アミラーゼなどを含有する被検
液について、その基質として変性還元性末端グル
コース残基を有するグルコース重合体または還状
グルコース重合体を用いて、被検液中のアミラー
ゼ活性により基質を分解せしめ、次いで好ましく
はこの基質分解物にマルトースデヒドロゲナーゼ
およびNADまたはNADPを作用せしめ、次いで
生成する還元型NADまたは還元型NADPを直接
的または間接的に定量せしめてなるアミラーゼ活
性測定法で、より好ましくは、あらかじめ被検液
中に共存するマルトースやグルコースをα―グル
コシダーゼやMg++、ATPの存在下キナーゼにて
グルコース―６―リン酸として変換せしめてなる
手段を組合せて行なうもので、このようにして本
発明のアミラーゼ活性測定法は、用いる試薬を簡
便なる反応液のキツトとして調整し、簡便かつ正
確になし得る優れた方法で、かつ自動化のために
も良好な測定法である。 次に本発明の実施例および参考例を挙げて具体
的に述べるが、本発明はこれらによつて何んら限
定されるものではない。 実施例 １ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％NTB 0.1ml １％トリトンＸ−100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％PMS 0.02ml 10％の参考例１で得られた変性還元性末端ググ
ルコース残基（グルコン酸残基）を有するグル
コース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.1ml 200U／mlの参考例４で得られたマルトースデ
ヒドロゲナーゼ 0.05ml蒸留水 0.03ml 計 1.0ml よりなる組成の反応液1.0mlを、37℃、３分間予
備加温した後、これに、20μlの唾液（300倍希釈）
を加え、37℃にて、各々０，2.5，5.10，20，30
分間反応せしめた。反応後、0.1N塩酸2.0mlを加
え、その呈色を波長550nmにて吸光度測定した。 その結果、第５図に示す通り、反応時間2.5分
のラグタイムの後は良好な直線性が得られた。 実施例 ２ 実施例１と同一組成を有する反応液1.0mlを用
い、37℃、３分間予備加温した後、1000倍希釈し
た唾液を各々０、10、20、30、40、50μを加
え、37℃、10分間反応せしめ、反応後、0.1N塩
酸2.0mlを加え、その呈色を波長550nmにて測定
した。 その結果、第６図に示す通りで、極めて良好な
直線性を得たものであつた。 実施例 ３ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.2ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％NTB 0.1ml １％トリトンＸ―100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml α―グルコシダーゼ（200U／ml） 0.1ml ヘキソキナーゼ（100U／ml） 0.1ml 100mMMgCl2 0.05ml 0.05％PMS 0.02ml 計 0.8ml よりなる組成の反応液を調整した。 また反応液として 10％の参考例１で得られた変性還元性末端グル
コース残基（グルコン酸残基）を有するグルコ
ース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.1ml 200U／mlのマルトースデヒドロゲナーゼ
0.05ml200mMEDTA 0.05ml 計 0.2ml よりなる組成の反応液を調整した。 まず、反応液0.8mlを37℃にて予備加温後、
これに血清50μを加えて37℃、５分間反応せし
めて血清中のグルコースやマルトースの消去のた
めの反応を行ない、次いで反応後、これに反応液
0.2mlを加えて、37℃にて、各々０、2.5、５、
10、15、20、25分間反応せしめ、反応後0.1N塩
酸2.0mlを加え、その後波長550nmにて測定した。 また対象として、反応液におけるヘキソキナ
ーゼのみを含有しない反応液′を用いて、以下、
同様に行なつた。 その結果、第７図に示す通りで、また図中、〇
―〇は反応液、反応液を用いた定量結果、●
―●は反応液′、反応液を用いた定量結果を
示すもので、反応液、反応液を用いて定量す
る方法がより好ましいものであつた。 実施例 ４ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 1.2ml 10mMNADP 0.3ml α―グルコシダーゼ（200U／ml） 0.1ml ヘキソキナーゼ（10U／ml） 0.1ml 100mMMgCl2 0.15ml蒸留水 0.55ml 計 2.4ml よりなる反応液を調整した。 また反応液として 10％の参考例１で得られた変性還元性末端グル
コース残基（グルコン酸残基）を有するグルコ
ース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.3ml 200U／mlのマルトースデヒドロゲナーゼ
0.05ml200mMEDTA 0.15ml 計 0.5ml よりなる組成の反応液を調整した。 まず反応液2.4mlを37℃に予備加温後、これ
に血清50μ（希釈倍率1/5〜5/5）を加えて37
℃、５分間反応せしめ、反応後、これに反応液
0.5mlを加えて37℃にて、正確に20分間反応せし
め、次いで波長340nmにおける吸光度測定した。 また対象として、反応液におけるヘキソキナ
ーゼのみを含有しない反応液′を用いて、以下、
同様に行なつた。 その結果、第８図に示す通りで、図中、〇―〇
は反応液、反応液を用いた定量結果、●―●
は反応液′、反応液を用いた定量結果を示す
もので、反応液、反応液を用いて定量する方
法がより好ましいものであつた。 実施例 ５ 実施例３の反応液における基質の代りに、参
考例２で得られた変性還元性末端グルコース残基
（メチルエーテル化されたグルコース残基）を有
するグルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて
反応液を調整し、以下実施例３と同様に行なつ
た結果、第７図に示す測定結果と同様の各反応時
間に対して極めて良好な直線的定量結果を示し
た。なお、その反応時間10分での吸光度を示せば
0.52であつた。 実施例 ６ 実施例４の反応液における基質の代りに、参
考例２で得られた変性還元性末端グルコース残基
（メチルエーテル化されたグルコース残基）を有
するグルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて
反応液を調整し、以下実施例４（希釈倍率5/5の
血清を使用）と同様に行なつた結果、その吸光度
は1.06で良好な結果を得た。 実施例 ７ 実施例３の反応液における基質の代りに、参
考例３で得られた変性還元性末端グルコース残基
（アセチル化されたグルコース残基）を有するグ
ルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて反応液
を調整し、以下実施例３と同様に行なつた結
果、第７図に示す結果と同様の各反応時間に対し
て極めて良好な直線的定通結果を得た。 実施例 ８ 実施例３の反応液における基質の代りに、γ
―サイクロデキストリンの５％溶液0.3mlを用い
て反応液を調整し、以下実施例３（反応時間と
して30分）と同様に行なつた結果、その吸光度は
0.12であつた。 参考例 １ 50ｇの可溶性澱粉を、水200mlに溶解した後こ
れを、１のフエーリング試薬液（CuSO4・
5H2O35ｇ、酒石酸カリウム・ナトリウム173ｇ、
水酸化ナトリウム65ｇ含有）に加え、20分間煮沸
反応せしめた。次いでこれを300mlまで減圧濃縮
した後、この濃縮液に100mlメタノールを添加し、
生じた沈澱物を除去して得られた上清を、100ml
まで減圧濃縮し、これを、セフアデツクスＧ―
100を充填したカラム（７cm×100cm）にチヤージ
して、分子量約1000以上の流出区分を回収し、こ
れを凍結乾燥して、可溶性澱粉の還元性末端グル
コース残基がグルコン酸残基として酸化された変
性還元性末端グルコース残基（グルコン酸残基）
を有するグルコース重合体33.6mgを得た。 参考例 ２ 可溶性澱粉20ｇを、４％メタノール性塩酸溶液
400mlに分散せしめた後、70℃で６時間反応せし
めた。反応後、5N水酸化ナトリウム溶液で中和
し、脱塩後、減圧濃縮し、この濃縮液をセフアデ
ツクスＧ―25のカラム（５cm×100cm）にチヤー
ジし、分子量約1000以上の流出区分を回収し、減
圧濃縮後、凍結乾燥して、可溶性澱粉の還元性末
端をメチルエーテル化せしめた変性還元性末端グ
ルコース残基を有するグルコース重合体8.3ｇを
得た。 参考例 ３ 可溶性澱粉20ｇを、乾燥ピリシン200ml、無水
酢酸3.5mlに加えて、０℃で一夜反応せしめた。
反応後これにアセトン１を加えて沈澱せしめ、
さらにこの沈澱物をアセトン200mlにて洗浄した
後水に溶解せしめ、これを、セフアデツクスＧ―
25のカラム（５cm×100cm）にチヤージして、分
子量約1000以上の流出区分を回収し、凍結乾燥し
て、可溶性澱粉の還元性末端をアセチル化せしめ
た変性還元性末端グルコース残基を有するグルコ
ース重合体10.3ｇを得た。 参考例 ４ デキストリン１％、酵母エキス粉末１％
K2HPO40.1％、KCl0.05％、MgSO4・7H2O0.05
％よりなる培地100ml（120℃、20分間滅菌、PH
7.2）含有500ml容三角フラスコに、バチルス・メ
ガテリウム・Ｂ―0779菌株の斜面培地（ブイヨン
寒天培地）よりの一白金耳を接種し、28℃、24時
間振盪培養して種培養物を得た。次いでこの種培
養物を、デキストリン１％、酵母エキス粉末１
％、K2HPO40.1％、KCl0.05％、MgSO4・
7H2O0.05％、シリコンSAG―471（消汽剤）0.1％
よりなる培地20（120℃、20分間滅菌、PH7.2）
含有30容ジヤーフアーメンターに接種し、28
℃、300rpm、15m3／分の通気条件にて45時間通
気撹拌培養した。培養終了後培養物を遠心分離
（5000rpm、10分間）して湿菌体を回収し、この
湿菌体を、0.1％リゾチーム、5mMEDTA含有ト
リス―塩酸緩衝液（PH7.5）溶液４にて37℃、
60分間処理して可溶化せしめた後、遠心分離
（5000rpm、10分間）して上清（11.8U／ml、3.2
）を得た。次いでこの上清液に、80％飽和硫安
になるように硫安を添加して遠心分離
（15000rpm、10分間）して、その沈澱物を回収し
た。さらにこの沈澱物を、220mlの10mMトリス
―塩酸緩衝液（PH7.5）に溶解せしめ、遠心分離
（15000rpm、10分間）して不溶物を除去して、上
清200ml（123.5U／ml）を得た。この上清液に、
10％塩化カルシウム水溶液20mlを加えて遠心分離
（15000rpm、10分間）して沈澱物を除去して上清
200ml（85U／ml）を得た。さらにこの上清液を
硫安処理（51〜63％硫安で分画）して遠心分離
（15000rpm、10分間）し、その沈澱物を回収し、
さらにこれを、10mMトリス―塩酸緩衝液（PH
7.5）20mlに溶解（417U／ml）した。その後この
溶液をセフアデツクスＧ―25にチヤージし、その
流出区分を回収し、これを凍結乾燥してマルトー
スデヒドロゲナーゼの粉末370mg（20U／mg）を
得た。
クトース、セロビオース、マルトトリオースなど
に対しても作用するものの、マルトースに強く作
用し、かつその酵素作用、その他の諸性質から、
公知のマルトースデヒドロゲナーゼ〔NAD（Ｐ）
−Dependent Maltose dehydrogenase；Agric.
Biol. Chem.44(1)，41〜47，1980〕に属する酵素
作用を有する酵素と認められるものであつた。ま
た、本発明において前記のバチルス属に属するマ
ルトースデヒドロゲナーゼのみでなく、マルトー
スデヒドロゲナーゼに属すると認められる酵素で
あれば何んら限定されるものでなく、例えばコリ
ネバクテリウム・エス・ピー・No.93−１菌株
〔Agric.Biol.Chem.，44(1)，41〜47，1980〕の培
養物から得られるマルトースデヒドロゲナーゼを
使用してもよい。 このようにして基質分解物に、マルトースデヒ
ドロゲナーゼを作用せしめることにより、基質分
解物たるマルトースのみならず、グルコースやマ
ルトトリオース、マルトペントースなどのオリゴ
糖にも作用し、著しく良好に基質分解物と作用し
てなるもので、その結果、マルトースデヒドロゲ
ナーゼの酵素作用に示す通り、定量的に還元型
NADまたは還元型NADPを生成してなるもので
ある。 次いでこの生成した還元型NADまたは還元型
NADPを直接的に波長340nmにて定量せしめて
アミラーゼ活性測定としてもよく、またこの還元
型NADまたは還元型NADPに、この還元型水素
伝達系呈色反応試薬を作用せしめて、還元型
NADまたは還元型NADPの水素を別の伝達系に
て呈色せしめ、これを定量し、間接的に行なつて
アミラーゼ活性の測定を行なつてもよい。この間
接的な測定において使用される還元型水素伝達系
呈色反応試薬としては、例えばテトラゾリウム塩
とジアホラーゼを含有する試薬やテトラゾリウム
塩とフエナジンメトサルフエートを含有する試薬
などが挙られ、反応によつて生ずる呈色を波長
550nmで吸光度測定すればよい。 さらに好適なアミラーゼ活性測定のための系と
しては、例えば0.2Mトリス―塩酸緩衝液0.4部、
１％牛血清アルブミン0.1部、0.25％NTB0.1部、
１％トリトンＸ―1000.1部、10mMNAD（Ｐ）0.1
部、0.05％PMS0.02部、10％基質溶液0.1部、
200U／mlマルトースデヒドロゲナーゼ0.05部、
蒸留水0.03部よりなる反応液や、0.2Mトリス―
塩酸緩衝液0.3部、10mMNAD（Ｐ）0.1部、10％
基質溶液0.1部、200U／mlマルトースデヒドロゲ
ナーゼ0.05部、蒸留水0.45部よりなる反応液が挙
られ、この反応液１部当り、通常0.01〜0.5部程
度の被検液を加えて、通常37℃にて、一定時間反
応せしめればよく、反応時間としては５分間程度
で十充である。反応後、反応を停止せしめ、次い
で適宜の波長にて定量せしめればよい。 また対象とする被検液としては、通常血清、尿
や唾液が挙られ、これらは適宜希釈して用いても
よい。さらにこれらの被検液には、あらかじめ、
グルコースやマルトースが共存している場合が多
く、この際、例えばマルトースにα―グルコシダ
ーゼを作用せしめてグルコースにまで分解せし
め、またグルコースにはATP、Mg++好ましくは
MgCl2の存在下、ヘキソキナーゼまたはグルコキ
ナーゼなどのキナーゼを作用せしめてグルコース
―６―リン酸としてリン酸化せしめ、さらにマル
トースホスホリラーゼを用いてもよく、被検液中
の溶存酸素量に悪影響を及ぼすことなく、もはや
共存するグルコースやマルトースによるアミラー
ゼ活性測定の際にも悪影響を及ぼすことのない化
合物に変換せしめればよい。 以上の如く、本発明は、アミラーゼ例えばα―
アミラーゼやβ―アミラーゼなどを含有する被検
液について、その基質として変性還元性末端グル
コース残基を有するグルコース重合体または還状
グルコース重合体を用いて、被検液中のアミラー
ゼ活性により基質を分解せしめ、次いで好ましく
はこの基質分解物にマルトースデヒドロゲナーゼ
およびNADまたはNADPを作用せしめ、次いで
生成する還元型NADまたは還元型NADPを直接
的または間接的に定量せしめてなるアミラーゼ活
性測定法で、より好ましくは、あらかじめ被検液
中に共存するマルトースやグルコースをα―グル
コシダーゼやMg++、ATPの存在下キナーゼにて
グルコース―６―リン酸として変換せしめてなる
手段を組合せて行なうもので、このようにして本
発明のアミラーゼ活性測定法は、用いる試薬を簡
便なる反応液のキツトとして調整し、簡便かつ正
確になし得る優れた方法で、かつ自動化のために
も良好な測定法である。 次に本発明の実施例および参考例を挙げて具体
的に述べるが、本発明はこれらによつて何んら限
定されるものではない。 実施例 １ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.4ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％NTB 0.1ml １％トリトンＸ−100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml 0.05％PMS 0.02ml 10％の参考例１で得られた変性還元性末端ググ
ルコース残基（グルコン酸残基）を有するグル
コース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.1ml 200U／mlの参考例４で得られたマルトースデ
ヒドロゲナーゼ 0.05ml蒸留水 0.03ml 計 1.0ml よりなる組成の反応液1.0mlを、37℃、３分間予
備加温した後、これに、20μlの唾液（300倍希釈）
を加え、37℃にて、各々０，2.5，5.10，20，30
分間反応せしめた。反応後、0.1N塩酸2.0mlを加
え、その呈色を波長550nmにて吸光度測定した。 その結果、第５図に示す通り、反応時間2.5分
のラグタイムの後は良好な直線性が得られた。 実施例 ２ 実施例１と同一組成を有する反応液1.0mlを用
い、37℃、３分間予備加温した後、1000倍希釈し
た唾液を各々０、10、20、30、40、50μを加
え、37℃、10分間反応せしめ、反応後、0.1N塩
酸2.0mlを加え、その呈色を波長550nmにて測定
した。 その結果、第６図に示す通りで、極めて良好な
直線性を得たものであつた。 実施例 ３ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 0.2ml １％牛血清アルブミン 0.1ml 0.25％NTB 0.1ml １％トリトンＸ―100 0.1ml 10mMNADP 0.1ml α―グルコシダーゼ（200U／ml） 0.1ml ヘキソキナーゼ（100U／ml） 0.1ml 100mMMgCl2 0.05ml 0.05％PMS 0.02ml 計 0.8ml よりなる組成の反応液を調整した。 また反応液として 10％の参考例１で得られた変性還元性末端グル
コース残基（グルコン酸残基）を有するグルコ
ース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.1ml 200U／mlのマルトースデヒドロゲナーゼ
0.05ml200mMEDTA 0.05ml 計 0.2ml よりなる組成の反応液を調整した。 まず、反応液0.8mlを37℃にて予備加温後、
これに血清50μを加えて37℃、５分間反応せし
めて血清中のグルコースやマルトースの消去のた
めの反応を行ない、次いで反応後、これに反応液
0.2mlを加えて、37℃にて、各々０、2.5、５、
10、15、20、25分間反応せしめ、反応後0.1N塩
酸2.0mlを加え、その後波長550nmにて測定した。 また対象として、反応液におけるヘキソキナ
ーゼのみを含有しない反応液′を用いて、以下、
同様に行なつた。 その結果、第７図に示す通りで、また図中、〇
―〇は反応液、反応液を用いた定量結果、●
―●は反応液′、反応液を用いた定量結果を
示すもので、反応液、反応液を用いて定量す
る方法がより好ましいものであつた。 実施例 ４ 0.2Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） 1.2ml 10mMNADP 0.3ml α―グルコシダーゼ（200U／ml） 0.1ml ヘキソキナーゼ（10U／ml） 0.1ml 100mMMgCl2 0.15ml蒸留水 0.55ml 計 2.4ml よりなる反応液を調整した。 また反応液として 10％の参考例１で得られた変性還元性末端グル
コース残基（グルコン酸残基）を有するグルコ
ース重合体（可溶性澱粉の酸化物） 0.3ml 200U／mlのマルトースデヒドロゲナーゼ
0.05ml200mMEDTA 0.15ml 計 0.5ml よりなる組成の反応液を調整した。 まず反応液2.4mlを37℃に予備加温後、これ
に血清50μ（希釈倍率1/5〜5/5）を加えて37
℃、５分間反応せしめ、反応後、これに反応液
0.5mlを加えて37℃にて、正確に20分間反応せし
め、次いで波長340nmにおける吸光度測定した。 また対象として、反応液におけるヘキソキナ
ーゼのみを含有しない反応液′を用いて、以下、
同様に行なつた。 その結果、第８図に示す通りで、図中、〇―〇
は反応液、反応液を用いた定量結果、●―●
は反応液′、反応液を用いた定量結果を示す
もので、反応液、反応液を用いて定量する方
法がより好ましいものであつた。 実施例 ５ 実施例３の反応液における基質の代りに、参
考例２で得られた変性還元性末端グルコース残基
（メチルエーテル化されたグルコース残基）を有
するグルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて
反応液を調整し、以下実施例３と同様に行なつ
た結果、第７図に示す測定結果と同様の各反応時
間に対して極めて良好な直線的定量結果を示し
た。なお、その反応時間10分での吸光度を示せば
0.52であつた。 実施例 ６ 実施例４の反応液における基質の代りに、参
考例２で得られた変性還元性末端グルコース残基
（メチルエーテル化されたグルコース残基）を有
するグルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて
反応液を調整し、以下実施例４（希釈倍率5/5の
血清を使用）と同様に行なつた結果、その吸光度
は1.06で良好な結果を得た。 実施例 ７ 実施例３の反応液における基質の代りに、参
考例３で得られた変性還元性末端グルコース残基
（アセチル化されたグルコース残基）を有するグ
ルコース重合体の10％溶液0.3mlを用いて反応液
を調整し、以下実施例３と同様に行なつた結
果、第７図に示す結果と同様の各反応時間に対し
て極めて良好な直線的定通結果を得た。 実施例 ８ 実施例３の反応液における基質の代りに、γ
―サイクロデキストリンの５％溶液0.3mlを用い
て反応液を調整し、以下実施例３（反応時間と
して30分）と同様に行なつた結果、その吸光度は
0.12であつた。 参考例 １ 50ｇの可溶性澱粉を、水200mlに溶解した後こ
れを、１のフエーリング試薬液（CuSO4・
5H2O35ｇ、酒石酸カリウム・ナトリウム173ｇ、
水酸化ナトリウム65ｇ含有）に加え、20分間煮沸
反応せしめた。次いでこれを300mlまで減圧濃縮
した後、この濃縮液に100mlメタノールを添加し、
生じた沈澱物を除去して得られた上清を、100ml
まで減圧濃縮し、これを、セフアデツクスＧ―
100を充填したカラム（７cm×100cm）にチヤージ
して、分子量約1000以上の流出区分を回収し、こ
れを凍結乾燥して、可溶性澱粉の還元性末端グル
コース残基がグルコン酸残基として酸化された変
性還元性末端グルコース残基（グルコン酸残基）
を有するグルコース重合体33.6mgを得た。 参考例 ２ 可溶性澱粉20ｇを、４％メタノール性塩酸溶液
400mlに分散せしめた後、70℃で６時間反応せし
めた。反応後、5N水酸化ナトリウム溶液で中和
し、脱塩後、減圧濃縮し、この濃縮液をセフアデ
ツクスＧ―25のカラム（５cm×100cm）にチヤー
ジし、分子量約1000以上の流出区分を回収し、減
圧濃縮後、凍結乾燥して、可溶性澱粉の還元性末
端をメチルエーテル化せしめた変性還元性末端グ
ルコース残基を有するグルコース重合体8.3ｇを
得た。 参考例 ３ 可溶性澱粉20ｇを、乾燥ピリシン200ml、無水
酢酸3.5mlに加えて、０℃で一夜反応せしめた。
反応後これにアセトン１を加えて沈澱せしめ、
さらにこの沈澱物をアセトン200mlにて洗浄した
後水に溶解せしめ、これを、セフアデツクスＧ―
25のカラム（５cm×100cm）にチヤージして、分
子量約1000以上の流出区分を回収し、凍結乾燥し
て、可溶性澱粉の還元性末端をアセチル化せしめ
た変性還元性末端グルコース残基を有するグルコ
ース重合体10.3ｇを得た。 参考例 ４ デキストリン１％、酵母エキス粉末１％
K2HPO40.1％、KCl0.05％、MgSO4・7H2O0.05
％よりなる培地100ml（120℃、20分間滅菌、PH
7.2）含有500ml容三角フラスコに、バチルス・メ
ガテリウム・Ｂ―0779菌株の斜面培地（ブイヨン
寒天培地）よりの一白金耳を接種し、28℃、24時
間振盪培養して種培養物を得た。次いでこの種培
養物を、デキストリン１％、酵母エキス粉末１
％、K2HPO40.1％、KCl0.05％、MgSO4・
7H2O0.05％、シリコンSAG―471（消汽剤）0.1％
よりなる培地20（120℃、20分間滅菌、PH7.2）
含有30容ジヤーフアーメンターに接種し、28
℃、300rpm、15m3／分の通気条件にて45時間通
気撹拌培養した。培養終了後培養物を遠心分離
（5000rpm、10分間）して湿菌体を回収し、この
湿菌体を、0.1％リゾチーム、5mMEDTA含有ト
リス―塩酸緩衝液（PH7.5）溶液４にて37℃、
60分間処理して可溶化せしめた後、遠心分離
（5000rpm、10分間）して上清（11.8U／ml、3.2
）を得た。次いでこの上清液に、80％飽和硫安
になるように硫安を添加して遠心分離
（15000rpm、10分間）して、その沈澱物を回収し
た。さらにこの沈澱物を、220mlの10mMトリス
―塩酸緩衝液（PH7.5）に溶解せしめ、遠心分離
（15000rpm、10分間）して不溶物を除去して、上
清200ml（123.5U／ml）を得た。この上清液に、
10％塩化カルシウム水溶液20mlを加えて遠心分離
（15000rpm、10分間）して沈澱物を除去して上清
200ml（85U／ml）を得た。さらにこの上清液を
硫安処理（51〜63％硫安で分画）して遠心分離
（15000rpm、10分間）し、その沈澱物を回収し、
さらにこれを、10mMトリス―塩酸緩衝液（PH
7.5）20mlに溶解（417U／ml）した。その後この
溶液をセフアデツクスＧ―25にチヤージし、その
流出区分を回収し、これを凍結乾燥してマルトー
スデヒドロゲナーゼの粉末370mg（20U／mg）を
得た。
第１図は参考例４で得られたマルトースデヒド
ロゲナーゼの至適PH曲線、第２図はマルトースデ
ヒドロゲナーゼの至適温度曲線、第３図はマルト
ースデヒドロゲナーゼのPH安定性曲線、第４図は
マルトースデヒドロゲナーゼの熱安定性曲線、第
５図および第６図は唾液中のアミラーゼ活性測定
結果、第７図および第８図は血清中のアミラーゼ
活性測定結果を示す。
ロゲナーゼの至適PH曲線、第２図はマルトースデ
ヒドロゲナーゼの至適温度曲線、第３図はマルト
ースデヒドロゲナーゼのPH安定性曲線、第４図は
マルトースデヒドロゲナーゼの熱安定性曲線、第
５図および第６図は唾液中のアミラーゼ活性測定
結果、第７図および第８図は血清中のアミラーゼ
活性測定結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アミラーゼ活性測定において、その基質とし
て変性還元性末端グルコース残基を有するグルコ
ース重合体または環状グルコース重合体を用い、
該アミラーゼの反応によつて生成する基質分解物
にマルトースデヒドロゲナーゼおよびNADまた
はNADPを作用せしめて生成した還元型NADま
たは還元型NADPを測定することを特徴とする
新規なアミラーゼ活性測定法。 ２ その基質として、少なくとも、グルコース重
合度５以上の変性還元性末端グルコース残基を有
するグルコース重合体または環状グルコース重合
体である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ その基質として、アミロース、アミロペクチ
ン、澱粉または澱粉加水分解物の変性還元性末端
グルコース残基を有するグルコース重合体である
特許請求の範囲第２項記載の測定法。 ４ 変性還元性末端グルコース残基が、エーテル
化した還元性末端の変性還元性末端グルコース残
基である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ５ 変性還元性末端グルコース残基が、エステル
化した還元性末端の変性還元性末端グルコース残
基である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ６ 変性還元性末端グルコース残基が、グルコノ
ラクトンまたはグルコン酸残基またはその誘導体
である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ７ 測定において、還元型NADまたは還元型
NADPに、その還元型水素伝達系呈色反応試薬
を作用せしめてなる呈色反応を測定してなる特許
請求の範囲第１項記載の測定法。 ８ 還元型水素伝達系呈色反応試薬が、テトラゾ
リウム塩とジアホラーゼを含有する試薬である特
許請求の範囲第７項記載の測定法。 ９ 還元型水素伝達系呈色反応試薬が、テトラゾ
リウム塩とフエナジンメトサルフエートを含有す
る試薬である特許請求の範囲第７項記載の測定
法。 １０ α―グルコシダーゼまたはMg++、ATPの
存在下キナーゼの作用にて前処理した被検液中の
アミラーゼ活性を測定してなる特許請求の範囲第
１項ないし第９項のいずれかの項記載の測定法。 １１ キナーゼが、ヘキソキナーゼである特許請
求の範囲第１０項記載の測定法。
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