JPS633786A - コラ−ゲンゲル包括カプセル - Google Patents
コラ−ゲンゲル包括カプセルInfo
- Publication number
- JPS633786A JPS633786A JP61144784A JP14478486A JPS633786A JP S633786 A JPS633786 A JP S633786A JP 61144784 A JP61144784 A JP 61144784A JP 14478486 A JP14478486 A JP 14478486A JP S633786 A JPS633786 A JP S633786A
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- Japan
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- cells
- collagen
- salt
- capsule
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- Pending
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Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
- B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
- B01J13/10—Complex coacervation, i.e. interaction of oppositely charged particles
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、細胞培養に関するものでちる。さらに詳しく
は、単位培養液あｔり高密度に細胞を増殖させるカプセ
ルに関するものである。
は、単位培養液あｔり高密度に細胞を増殖させるカプセ
ルに関するものである。
（従来の技術）
細胞培養用のカプセルとしては、まず、アルギン酸カル
シウムゲルで一時的カプセルを作り１次に、恒久的な膜
を設は比後、再びゲルを液比させる２段階カプセル化法
（特公沼６Ｏ−３８１１１）Ｋよるもの、また、細胞増
殖用培地を含んだ細胞懸濁液を可溶性キチン誘導体１次
はその塩を用いて１段階でカプセル比する方法（日経産
業新聞。
シウムゲルで一時的カプセルを作り１次に、恒久的な膜
を設は比後、再びゲルを液比させる２段階カプセル化法
（特公沼６Ｏ−３８１１１）Ｋよるもの、また、細胞増
殖用培地を含んだ細胞懸濁液を可溶性キチン誘導体１次
はその塩を用いて１段階でカプセル比する方法（日経産
業新聞。
昭和６０年１月２２日、特開昭６Ｏ−１７５５３９）が
知られて−る。
知られて−る。
（発明が解決しようとする問題点）
従来の細胞培養用のカプセルのうち、２段階カブセル化
法（特公昭６Ｏ−３８１１１）によるものの場合は、カ
プセル製造時の操作が煩雑で時間がかかるため、細胞九
対するダメージが大きい。
法（特公昭６Ｏ−３８１１１）によるものの場合は、カ
プセル製造時の操作が煩雑で時間がかかるため、細胞九
対するダメージが大きい。
また、コラーゲンゲルａ度が０．１重量−以下の場合、
ゲル化卆不十分な７ｔ−ａｆ＞Ｋゲル強度かたもてず。
ゲル化卆不十分な７ｔ−ａｆ＞Ｋゲル強度かたもてず。
細胞によっては固定基質材料（三次元増殖マトリックス
）としての役割を果たすことができない。
）としての役割を果たすことができない。
したがって、単位培養液あたシ高密度の細胞を増殖させ
ることはできない。そこで、充分なゲル強度を得ようと
して０．１重量％以上の高濃度のコラーゲンゲ、１％−
を包括させようとした場合には、カプセル化工程が終了
する前にコラーゲンがゲル化してしまい、アルギン酸カ
ルシウムゲルの再液化が困雌となる。アルギン酸カルシ
ウムグルを再液ｆヒしないと、細胞の増殖に悪影ＩＩＩ
を与える。
ることはできない。そこで、充分なゲル強度を得ようと
して０．１重量％以上の高濃度のコラーゲンゲ、１％−
を包括させようとした場合には、カプセル化工程が終了
する前にコラーゲンがゲル化してしまい、アルギン酸カ
ルシウムゲルの再液化が困雌となる。アルギン酸カルシ
ウムグルを再液ｆヒしないと、細胞の増殖に悪影ＩＩＩ
を与える。
′ ま友、培地を含んだ細胞懸濁液を可溶性キチン誘導
体またはその塩を用いて１段階でカプセル化する方法（
日経産業新聞、昭和６１年１月２２日。
体またはその塩を用いて１段階でカプセル化する方法（
日経産業新聞、昭和６１年１月２２日。
特開昭６Ｏ−１７５５３９）の場合は、芯部が流動体で
ある次め、接着依存性細胞の培養には適していない。
ある次め、接着依存性細胞の培養には適していない。
本発明者らは、十分なゲル強度を有するコラーゲングル
中においては、接着依存性細胞が三次元的に生育するこ
とに着目した。しかしながら、この場合、増殖とともに
コラーゲンゲルが収縮し。
中においては、接着依存性細胞が三次元的に生育するこ
とに着目した。しかしながら、この場合、増殖とともに
コラーゲンゲルが収縮し。
細胞が死滅してしまう。本発明者らは、支持体の存在下
で培養を行ない、この問題′に解決しｔ（特ｊｌＩ紹６
Ｏ−１６２８７５）。
で培養を行ない、この問題′に解決しｔ（特ｊｌＩ紹６
Ｏ−１６２８７５）。
ぢらに検討の結果、コラーゲングルに細胞を埋め込み、
ポリアニオン多糖類ま几はその塩の羊独もしくはそれら
の混合物を基材とする流動体と。
ポリアニオン多糖類ま几はその塩の羊独もしくはそれら
の混合物を基材とする流動体と。
可溶性キチン訪導体またはその塩の溶液との接触により
形成され九皮膜で包括し、１００μｍ〜５１のカプセル
として培養し友ところ、カプセル内部に細胞の増殖が認
められ几。さらに培養ｆｔ継続すると、細胞は三次元的
に増殖し、ま九、カプセルの被膜が支持体の役割を果た
し、高密度に細胞が生育しているにもかかわらず、ゲル
収縮がまつ九＜社められないことを発見し、本発明にい
ｔつた。
形成され九皮膜で包括し、１００μｍ〜５１のカプセル
として培養し友ところ、カプセル内部に細胞の増殖が認
められ几。さらに培養ｆｔ継続すると、細胞は三次元的
に増殖し、ま九、カプセルの被膜が支持体の役割を果た
し、高密度に細胞が生育しているにもかかわらず、ゲル
収縮がまつ九＜社められないことを発見し、本発明にい
ｔつた。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、動物細胞、該動物細胞培養用培地。
コラーゲンより成るゲル状組底物を、ポリアニオン多糖
類ま友はその塩の単独もしくはそれらの混合物を基材と
する流動体と、可溶性キチン肪導体またはその塩の溶液
との接触により形底された皮膜で包括したカプセルに関
するものである。
類ま友はその塩の単独もしくはそれらの混合物を基材と
する流動体と、可溶性キチン肪導体またはその塩の溶液
との接触により形底された皮膜で包括したカプセルに関
するものである。
本発明でｂ５妨物細胞とは、昆虫細抱、魚類細胞、両生
類細胞、爬虫類細心、鳥類細胞または哺乳類細胞であシ
、浮遊性細胞でも接着依存性細胞でもよい。着比、正常
細胞でもガン細胞でもよい。
類細胞、爬虫類細心、鳥類細胞または哺乳類細胞であシ
、浮遊性細胞でも接着依存性細胞でもよい。着比、正常
細胞でもガン細胞でもよい。
哺乳類細胞のなかでも、マウス、ラット、チャイニーズ
ハムスター、ヒト、ウマ、サル、ウシ等ノ細胞がよく用
いられる。接着依存性細胞のなかでも繊維芽様細胞が用
いられ、その中でも正常２倍体細胞での効果が著しｈｏ 本発明における培地成分は、通常、動物細胞培養に使用
される一般的な培地をいう。具体的には。
ハムスター、ヒト、ウマ、サル、ウシ等ノ細胞がよく用
いられる。接着依存性細胞のなかでも繊維芽様細胞が用
いられ、その中でも正常２倍体細胞での効果が著しｈｏ 本発明における培地成分は、通常、動物細胞培養に使用
される一般的な培地をいう。具体的には。
Ｍ Ｅ Ｍ 、メディウム（Ｍｅｄｉｕｍ ） ｊ ９
９． Ｈａｍ培地。
９． Ｈａｍ培地。
ＤＰＭＩ−１６４０培地、ウェイマウス培地等、ま几は
それらの混合物が好ましい。場合によっては。
それらの混合物が好ましい。場合によっては。
これに動物血清およびビタミン、グロス７アクター等の
補填液を加えることもある。
補填液を加えることもある。
本発明におけるコラーゲンは、１塁コラーゲンが主に用
いられる。Ｉｎコラーゲンの中でも、中性塩可溶性コラ
ーゲン、酸司溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン、
アテロコラーゲンが用いられる。
いられる。Ｉｎコラーゲンの中でも、中性塩可溶性コラ
ーゲン、酸司溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン、
アテロコラーゲンが用いられる。
ｌｆｆ１コラーゲンのａｆは０．１〜０．５重量％の範
囲が一般的であシ、この範囲金はずれると、細心の増殖
、に影＃を与える。この範囲内で動物細胞の種類によっ
て最適なコラーゲンゲル濃度で、ゲルを被膜でカプセル
化することか可能である。ヒト正常２倍体繊維芽細胞の
場合は、０．２重ｔｈ１％が最適である。
囲が一般的であシ、この範囲金はずれると、細心の増殖
、に影＃を与える。この範囲内で動物細胞の種類によっ
て最適なコラーゲンゲル濃度で、ゲルを被膜でカプセル
化することか可能である。ヒト正常２倍体繊維芽細胞の
場合は、０．２重ｔｈ１％が最適である。
本発明のポリアニオン多糖類またはその塩とは。
水溶液中でポリアニオン重合体となる多糖類まｔはその
塩であって、低メトキシペクチン、カラゲナン、カルボ
キシメチルセルロース、アルギン酸。
塩であって、低メトキシペクチン、カラゲナン、カルボ
キシメチルセルロース、アルギン酸。
フンドロイチン硫酸等、またはその塩が好まし込。
このなかでもカルボキシメチルセルロースナトリウムが
一般的である。
一般的である。
本発明の可溶性キチン誘導体は、キチンに化学的処理を
行なって反応活性を高め九もので、キチンを脱アセチル
化処理して得られるキトサンまたはその塩がよい。場合
によっては、キトサンをさらに化学処理してメチル比、
サクシニル化する場合がある。可溶性キチン誘導体ま７
ｔはその塩の水溶液は、ポリイオン多糖類に特徴的な粘
弾性を示し、カプセル形成の際、カプセルの形状を球状
あるいは長球状に導く。
行なって反応活性を高め九もので、キチンを脱アセチル
化処理して得られるキトサンまたはその塩がよい。場合
によっては、キトサンをさらに化学処理してメチル比、
サクシニル化する場合がある。可溶性キチン誘導体ま７
ｔはその塩の水溶液は、ポリイオン多糖類に特徴的な粘
弾性を示し、カプセル形成の際、カプセルの形状を球状
あるいは長球状に導く。
本発明のカプセルは、７ｔとえは、以下のようにして製
造する。
造する。
蒸留水１ｔＫ市販の粉末培地５０〜２００？および必要
に応じて抗生物質（アンビシリ／、ゲンタマイシン、タ
イロシン等１を程度まで）を加えて溶解し、濾過滅菌し
てＡ液とする。０．０５ Ｎ水酸化ナトリウム水溶ａ１
００ｍｌｃ、さらに炭酸水；ｌ−トリウム１〜４ｆを加
え次ものか、あるいは０．０８Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液１００ｓｄｉＣ１Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸２〜５ｆを溶かし、濾過滅
−してＢ液とする。
に応じて抗生物質（アンビシリ／、ゲンタマイシン、タ
イロシン等１を程度まで）を加えて溶解し、濾過滅菌し
てＡ液とする。０．０５ Ｎ水酸化ナトリウム水溶ａ１
００ｍｌｃ、さらに炭酸水；ｌ−トリウム１〜４ｆを加
え次ものか、あるいは０．０８Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液１００ｓｄｉＣ１Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸２〜５ｆを溶かし、濾過滅
−してＢ液とする。
コラーゲン全ｏ、ｔ〜１重ｉチ含んだｐ Ｈ３，０の水
溶液５〜２０−に、水冷下上記のＡ液０．５〜３ｄ、Ｂ
液０．５〜３−を順次加え、さらに、単層培養した動物
細胞を常法により、トリプシン−エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム／Ｐ Ｂ Ｓ（→（ダルベツコ）溶液あ
るいはトリプシン／ＰＢＳ←）（ダルベツコ）溶液では
がし皮細胞＠１１４液０．５〜３−を加えて攪拌する。
溶液５〜２０−に、水冷下上記のＡ液０．５〜３ｄ、Ｂ
液０．５〜３−を順次加え、さらに、単層培養した動物
細胞を常法により、トリプシン−エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム／Ｐ Ｂ Ｓ（→（ダルベツコ）溶液あ
るいはトリプシン／ＰＢＳ←）（ダルベツコ）溶液では
がし皮細胞＠１１４液０．５〜３−を加えて攪拌する。
なお、コラーゲン水溶液は市販のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ
（新田ゼラチン社製）ヲ使用するか、あるいはラット
尾けん、子牛皮などより抽出し調製したものを用いる。
（新田ゼラチン社製）ヲ使用するか、あるいはラット
尾けん、子牛皮などより抽出し調製したものを用いる。
混合液にポリアニオン多糖類またはその塩の１〜５重量
重量溶水溶液え均一に混合しｔ後、よく氷冷した状態で
可溶性キチン誘導体またはその塩の溶液の中に膚下し、
カプセルを形成させる。可溶性キチン誘導体ま九はその
塩は、溶液中に０．５〜５ｘｉｉ％含むのがよい。可溶
性キチン誘導体′１ｆｃはその塩の溶液は、ｐＨ６，０
〜７．０に調整し、浸透圧を食塩で２８０〜５９０ ｍ
ｏｓｍ Ｋ調整する。滴下に際しては、内径１００μｍ
〜１．５！ＩＩの針を用い、液滴を形成させ友後に、可
溶性キチン誘導体またはその塩の溶液に落下させる。落
下させると、 ｆＬＳ表面のポリアニオン多糖類または
その塩は、可溶性キチン誘導体またはその塩とイオン結
合を起こし。
重量溶水溶液え均一に混合しｔ後、よく氷冷した状態で
可溶性キチン誘導体またはその塩の溶液の中に膚下し、
カプセルを形成させる。可溶性キチン誘導体ま九はその
塩は、溶液中に０．５〜５ｘｉｉ％含むのがよい。可溶
性キチン誘導体′１ｆｃはその塩の溶液は、ｐＨ６，０
〜７．０に調整し、浸透圧を食塩で２８０〜５９０ ｍ
ｏｓｍ Ｋ調整する。滴下に際しては、内径１００μｍ
〜１．５！ＩＩの針を用い、液滴を形成させ友後に、可
溶性キチン誘導体またはその塩の溶液に落下させる。落
下させると、 ｆＬＳ表面のポリアニオン多糖類または
その塩は、可溶性キチン誘導体またはその塩とイオン結
合を起こし。
ゲル被膜を形成しカプセルとなる。表面に被膜ができる
と、可溶性キチン誘導体またはその塩は。
と、可溶性キチン誘導体またはその塩は。
もはやカプセル内部に浸入することなく、このイオン結
合反応はカプセル表面で停止する。このようＫして、カ
プセル内部はコラーゲンのゲルｆヒに最適の条件が保持
される。
合反応はカプセル表面で停止する。このようＫして、カ
プセル内部はコラーゲンのゲルｆヒに最適の条件が保持
される。
場合によっては、これに空気層流を送９．液簡の微小比
をはかる場合もある。通常、１００μｍ〜５鳳１程度の
ものが攪拌培養に適当である。形成されたカプセルは１
球状あるいは長球状で、３０分程度で内部のコラーゲン
はゲルイヒする。ただし。
をはかる場合もある。通常、１００μｍ〜５鳳１程度の
ものが攪拌培養に適当である。形成されたカプセルは１
球状あるいは長球状で、３０分程度で内部のコラーゲン
はゲルイヒする。ただし。
コラーゲンがｌ型以外のものは１通常、ゲルｆヒを起こ
しにくいので、場合によってはＩ型との混合物を用いる
。
しにくいので、場合によってはＩ型との混合物を用いる
。
顕微鏡下で観察すると、膜の形成とその内部にコラーゲ
ンゲルにより三次元的に固定式れ九動物細胞が観察され
る。以上の操作は、すべて無菌的に行なう。この方法は
、そのままスケールアップすることができる。ま友、こ
れよシ小スケールでもよい。
ンゲルにより三次元的に固定式れ九動物細胞が観察され
る。以上の操作は、すべて無菌的に行なう。この方法は
、そのままスケールアップすることができる。ま友、こ
れよシ小スケールでもよい。
以上の操作で製造し次カブ七ルは、攪拌培養器の中で、
該動物細胞培養用培地に懸濁させて用いる。カプセル内
に埋め込まれ７’Ｃ細砲は、Ｖ、拌によるせん断力から
保譲され、物理的にマイルドな１境に保たれる。
該動物細胞培養用培地に懸濁させて用いる。カプセル内
に埋め込まれ７’Ｃ細砲は、Ｖ、拌によるせん断力から
保譲され、物理的にマイルドな１境に保たれる。
１日間培養後、顕微鏡下で細胞の生前が認められる。式
らに培養を続けると、細胞は順調に増殖し、′；ｆｉ用
物質の生産に用いることができる。培養７日目のカプセ
ルの内部は、細胞が３次元的に増殖しているのが認めら
れ、コラーゲングルの効果が示され九。
らに培養を続けると、細胞は順調に増殖し、′；ｆｉ用
物質の生産に用いることができる。培養７日目のカプセ
ルの内部は、細胞が３次元的に増殖しているのが認めら
れ、コラーゲングルの効果が示され九。
産生し几有用物質は、カプセル被膜の分子透過上限によ
って、カプセル内部に蓄積させることもでき、また、カ
プセル外部に放出させることもできる。カプセル被膜の
分子透過上限は、ポリアニオン多糖類ま几はその塩の単
独もしくはそれらの混合物の濃度、および可溶性キチン
誘導体’ｉ友はその塩のａ度によってコントロールでき
る。
って、カプセル内部に蓄積させることもでき、また、カ
プセル外部に放出させることもできる。カプセル被膜の
分子透過上限は、ポリアニオン多糖類ま几はその塩の単
独もしくはそれらの混合物の濃度、および可溶性キチン
誘導体’ｉ友はその塩のａ度によってコントロールでき
る。
（発明の効果）
カプセルに動物細胞を該動物細胞培養用培地およびコラ
ーゲンゲルとともに封じ込め、該動物細胞培養用培地中
で浮遊攪拌すると、ｚ、ｏｘｔｏｓｃｅｌｌｓ／ＴＲｔ
ｇｅｌで植込み、最大５．ＯＸ １０フｃｅｌｌｓ／ａ
１ｔｇｅｌ’ｊで増殖シ友。
ーゲンゲルとともに封じ込め、該動物細胞培養用培地中
で浮遊攪拌すると、ｚ、ｏｘｔｏｓｃｅｌｌｓ／ＴＲｔ
ｇｅｌで植込み、最大５．ＯＸ １０フｃｅｌｌｓ／ａ
１ｔｇｅｌ’ｊで増殖シ友。
（実施例）
実施例１
イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍ粉末（フロ
ー）ヲ９６ ｔ／ｌ、アンピシリンを５００１Ｌ９／ｌ
の濃度で蒸留水に溶解し、濾過滅菌し之。この溶液をＡ
液とじ比ゆ ０．０５ Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１００−に重炭酸
ナトリウム２，２９．Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸４．７７ｆｔ−溶かし、
濾過滅菌し友。この溶液をＢ液とした。
ー）ヲ９６ ｔ／ｌ、アンピシリンを５００１Ｌ９／ｌ
の濃度で蒸留水に溶解し、濾過滅菌し之。この溶液をＡ
液とじ比ゆ ０．０５ Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１００−に重炭酸
ナトリウム２，２９．Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸４．７７ｆｔ−溶かし、
濾過滅菌し友。この溶液をＢ液とした。
Ｃｅｌ １ｍａｔｒｉｘ Ｉ Ａ （新田ゼラチ７ 、
３，０１Ｌ９ ／ ｔｄ 。
３，０１Ｌ９ ／ ｔｄ 。
ｐＨ５，０） １４，１ｄＶｃｓ氷冷下Ａ液２ｄとＢ液
２−を順次加え、さらに単層培養したＨＥＬ細胞（大日
本裂薬）を常法により、濾過滅菌したトリプシン−エチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム／ＰＢＳ（−）（ダル
ベツコ）溶液ではがし′ｆｉ−細胞懸濁液（２，ＯＸ
１０’ ｃｅｌｌｓ／ｄ ） ２ ｔｄ ｆ加え攪拌Ｌ
ｌｔ。
２−を順次加え、さらに単層培養したＨＥＬ細胞（大日
本裂薬）を常法により、濾過滅菌したトリプシン−エチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム／ＰＢＳ（−）（ダル
ベツコ）溶液ではがし′ｆｉ−細胞懸濁液（２，ＯＸ
１０’ ｃｅｌｌｓ／ｄ ） ２ ｔｄ ｆ加え攪拌Ｌ
ｌｔ。
この溶液［５重量％カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム塩水溶液２ｄｆｔ加え、泡をたてないよう均一に混
合し、この溶液６ｃとし比ゆ一方、キトサン塩酸塩の２
重量係水溶液を調製し、アルカリを加えてｐ Ｈ６，０
とし、ＮａＣ４で浸透圧ｆ ２９０ ｍｏｓｍ Ｋ調整
し友。この溶液５〇−に、上記の溶液ｃｌ攪拌下、内径
０．５１ＩＩの針を通してゆつくシ滴下し、平均粒径２
ｍ冨のカプセルを形成させた。得られたカプセルを、胎
児牛血清１０％に含むイーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ ）
ＭＥＭ培地４〇−中で、５チ炭酸ガＡを含む空気の存在
下１’（３７Ｃで攪拌培養し友。容器は１００ｄ容量の
スピナーフラスコ（索出科学）を用い１回転速度Ｓ Ｏ
ｒｐｍで行なつ几。
ウム塩水溶液２ｄｆｔ加え、泡をたてないよう均一に混
合し、この溶液６ｃとし比ゆ一方、キトサン塩酸塩の２
重量係水溶液を調製し、アルカリを加えてｐ Ｈ６，０
とし、ＮａＣ４で浸透圧ｆ ２９０ ｍｏｓｍ Ｋ調整
し友。この溶液５〇−に、上記の溶液ｃｌ攪拌下、内径
０．５１ＩＩの針を通してゆつくシ滴下し、平均粒径２
ｍ冨のカプセルを形成させた。得られたカプセルを、胎
児牛血清１０％に含むイーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ ）
ＭＥＭ培地４〇−中で、５チ炭酸ガＡを含む空気の存在
下１’（３７Ｃで攪拌培養し友。容器は１００ｄ容量の
スピナーフラスコ（索出科学）を用い１回転速度Ｓ Ｏ
ｒｐｍで行なつ几。
１０日間培養後に４．ＯＸ １０フｃｅｌｌｓ／１１Ｉ
ｔｇｅｌの細胞密度を得友。ＨＥＬ細胞のかわりに、Ｍ
Ｌｇ細胞（ｄｄＹマウス肺細胞二大日本Ｍ４薬）、ＣＧ
ＢＱ細胞（ガチョウ胚胸骨由来細胞二大日本＃ｉ）’ｉ
ｉ−用いても同様の効果を得た。
ｔｇｅｌの細胞密度を得友。ＨＥＬ細胞のかわりに、Ｍ
Ｌｇ細胞（ｄｄＹマウス肺細胞二大日本Ｍ４薬）、ＣＧ
ＢＱ細胞（ガチョウ胚胸骨由来細胞二大日本＃ｉ）’ｉ
ｉ−用いても同様の効果を得た。
実施例２
実施例１の液滴を形成する時、空気層流を用いて平均粒
径６００μｍのカプセルを形成場せた。
径６００μｍのカプセルを形成場せた。
得られ友カプセルを増殖培地中で攪拌培養を行なつ友と
ころ、培養１０日目で２．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／
ｄｇｅｌの細胞密度を得た。
ころ、培養１０日目で２．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／
ｄｇｅｌの細胞密度を得た。
実施例３
実施例２のＨＥＬ細胞のかわ’）Ｉ／Ｃ７” （Ｆｌ
ｏｗ）７０００（ヒト胎児包皮由来細胞二大日本展薬）
を使い、カルボキシメチルセルロースナトリウムのかわ
、９にアルギン酸ナトリウムを用いてカプセルを作製し
た。
ｏｗ）７０００（ヒト胎児包皮由来細胞二大日本展薬）
を使い、カルボキシメチルセルロースナトリウムのかわ
、９にアルギン酸ナトリウムを用いてカプセルを作製し
た。
得られ次カプセルを攪拌培養したところ、培養１４日目
で５．ＯＸ １０丁ｃｅｌｌｓ／ｍ ｇｅｌの細胞密度
に到達した。
で５．ＯＸ １０丁ｃｅｌｌｓ／ｍ ｇｅｌの細胞密度
に到達した。
実施例４
実施例２のＨＥＬ細胞をニワ） ＋７胚軟骨細胞にかえ
、イータＡ／ （Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍのか
わシにノーム（Ｈａｍ’ｒ、 ） Ｆ’−１２を用いて
カプセルを作製し友。
、イータＡ／ （Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍのか
わシにノーム（Ｈａｍ’ｒ、 ） Ｆ’−１２を用いて
カプセルを作製し友。
得られ之カプセルをウシ胎児血清１０チを含むハム（Ｈ
ａｍ’ｓ ） Ｆ −１２培地中で攪拌培養を行なった
ところ、培養１４日目で１．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ
／ｗｔｇｅｔの細胞密度を得た。
ａｍ’ｓ ） Ｆ −１２培地中で攪拌培養を行なった
ところ、培養１４日目で１．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ
／ｗｔｇｅｔの細胞密度を得た。
実施例５
実施例１のＨＥＬ細胞を乳腺上皮細胞にかえ、イーグル
（Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍのかわｐ［１０％ウ
シ胎児血清を含んだメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ ） １
９９Ｋかえカプセルを作製し友。得られｔカプセルをウ
シ胎児血清ｔｏｏｋ含むメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１
９９中で７日間攪拌培養し、最終到達密度４．Ｏｘ １
０’ ｃｅｌｌｓ／ａ（ｇｅｌを得友。
（Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍのかわｐ［１０％ウ
シ胎児血清を含んだメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ ） １
９９Ｋかえカプセルを作製し友。得られｔカプセルをウ
シ胎児血清ｔｏｏｋ含むメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１
９９中で７日間攪拌培養し、最終到達密度４．Ｏｘ １
０’ ｃｅｌｌｓ／ａ（ｇｅｌを得友。
実施例６
実施例１のＨＥＬ細胞を培養血管平滑筋細胞にかえ、カ
プセルを作製し次。得られ友カプセルを増殖培地中で７
日間培養し、最終到達密度２．０×１ ロ’ ｃｅｌ
ｌｓ／ｓｄ ｇｅｌ ｆ 得１ヒ。
プセルを作製し次。得られ友カプセルを増殖培地中で７
日間培養し、最終到達密度２．０×１ ロ’ ｃｅｌ
ｌｓ／ｓｄ ｇｅｌ ｆ 得１ヒ。
実施例７
ウシ皮膚をペプシン処理して抽出し几アテロコラーゲン
全１を中Ｋ ３．ＯＩＲ９含むｐ Ｈ３，０の溶液１４
−に、実施例１のＡ液２−を加え、 ＮａＯＨでｐＨ７
，Ｏｉｃ Ｆ整し、さらに、ＣＶ−１細胞（アフリカミ
ドリザル腎由来二人日本Ｍ栗）ｔ−単層培養し。
全１を中Ｋ ３．ＯＩＲ９含むｐ Ｈ３，０の溶液１４
−に、実施例１のＡ液２−を加え、 ＮａＯＨでｐＨ７
，Ｏｉｃ Ｆ整し、さらに、ＣＶ−１細胞（アフリカミ
ドリザル腎由来二人日本Ｍ栗）ｔ−単層培養し。
トリプシン−エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム処理
した細胞ｓｉ液（２，ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／ｄ
）２−を加え、さらに、カルボキシメチルセルロースナ
トリウムの５チ水溶液２−を加え、カプセルを作製し友
。得られ次カプセルをウシ胎児血清１０％を含むイーグ
ル（Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍ培地中テ１０日間
培養し、最終到達密度４．ＯＸ １０” ｃｅｌｌｓ／
ｓｄｇｅｔを得友。
した細胞ｓｉ液（２，ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／ｄ
）２−を加え、さらに、カルボキシメチルセルロースナ
トリウムの５チ水溶液２−を加え、カプセルを作製し友
。得られ次カプセルをウシ胎児血清１０％を含むイーグ
ル（Ｅａｇｌｅ’ｓ ） Ｍ Ｅ Ｍ培地中テ１０日間
培養し、最終到達密度４．ＯＸ １０” ｃｅｌｌｓ／
ｓｄｇｅｔを得友。
実施例８
実施例７のウシ皮膚をペプシン処理して抽出して得ｔア
テロコラーゲンのかわ５に、ラットｖを酢酸で抽出して
得７を酸可溶性コラーゲンを用いてカプセルを作製した
。得られたカプセルを増殖培地中で１２日間培養し、最
終到達濃度２．ＯＸ １０’ｃｅｌｌｓ ７ｍ ｇｅｌ
ｆ得次。
テロコラーゲンのかわ５に、ラットｖを酢酸で抽出して
得７を酸可溶性コラーゲンを用いてカプセルを作製した
。得られたカプセルを増殖培地中で１２日間培養し、最
終到達濃度２．ＯＸ １０’ｃｅｌｌｓ ７ｍ ｇｅｌ
ｆ得次。
実施例９
メディウム（Ｍｅｄｉｕｍ ） １９９粉末（ギプコ）
１００ｐ、ゲンタマイシン５００９を蒸留水１ｔＫ溶解
し、濾過滅菌し文。この溶液をＤとした。
１００ｐ、ゲンタマイシン５００９を蒸留水１ｔＫ溶解
し、濾過滅菌し文。この溶液をＤとした。
実施例２のＡ液のかわシＫＤｉを用い、ＨＥＬ細胞のか
わシにＡＹａ（ヒト羊膜由来上皮細胞二大日本裂薬）を
用いてカプセルを作製し友。得られたカプセルを増殖培
地中で攪拌培養し、７日間で３、ＯＸ １０・ｃｅｌｌ
ｓ ／−ｇｅｌの細胞密度を得几。
わシにＡＹａ（ヒト羊膜由来上皮細胞二大日本裂薬）を
用いてカプセルを作製し友。得られたカプセルを増殖培
地中で攪拌培養し、７日間で３、ＯＸ １０・ｃｅｌｌ
ｓ ／−ｇｅｌの細胞密度を得几。
実施例１０
０．０８ Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１００−にＮ−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン
酸４．７７ ｔを溶かし、濾過滅菌し定。この溶１夜を
Ｅとした。
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン
酸４．７７ ｔを溶かし、濾過滅菌し定。この溶１夜を
Ｅとした。
実施例１のＢ液のかわりにＥａｋ用い、カプセルを作成
し友。得られたカプセルを増殖培地中で攪拌培養し Ｉ
Ｑ日日間１．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／１ｎｔｇｅｌ
の細胞密度を得友。
し友。得られたカプセルを増殖培地中で攪拌培養し Ｉ
Ｑ日日間１．ＯＸ １０’ ｃｅｌｌｓ／１ｎｔｇｅｌ
の細胞密度を得友。
比較例
Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｉ Ａ （Ｍｒ田ゼラチン社ｍ
、 ３．Ｏｍ９／ｌ、ｐＨ３，０）２１−に実施例１
のＡ液３−１Ｂ液３−を氷冷下順次加え、ざらに単層培
養し沈ＨＥＬ細胞（大日本製薬）を常法により、濾過滅
菌したトリプシン−エチレンジアミン四酢酸二す） Ｉ
Ｊ ラム／Ｐ Ｂ Ｓ （−） （ダルベツコ）溶液で
はがし定細胞ｓ ｒｉ液（４，９Ｘ １０’ ｃｅｌｌ
ｓ／ｄ ） ３ ｔｔｋ加え、均一に混合し友、得られ
７を懸濁液を９６穴マルチプレートに３００μｔずつ滴
下し友。その後３７Ｃで１０分間靜装し、ゲル１ヒを行
なつ友。
、 ３．Ｏｍ９／ｌ、ｐＨ３，０）２１−に実施例１
のＡ液３−１Ｂ液３−を氷冷下順次加え、ざらに単層培
養し沈ＨＥＬ細胞（大日本製薬）を常法により、濾過滅
菌したトリプシン−エチレンジアミン四酢酸二す） Ｉ
Ｊ ラム／Ｐ Ｂ Ｓ （−） （ダルベツコ）溶液で
はがし定細胞ｓ ｒｉ液（４，９Ｘ １０’ ｃｅｌｌ
ｓ／ｄ ） ３ ｔｔｋ加え、均一に混合し友、得られ
７を懸濁液を９６穴マルチプレートに３００μｔずつ滴
下し友。その後３７Ｃで１０分間靜装し、ゲル１ヒを行
なつ友。
マルチプレートからコラーゲンゲルビーズを取シ出し、
イータｋ（Ｅａｇｌｅ’ｓ） ＭＥＭ １００−中で攪
拌培養を行なつ友。コラーゲンビーズは経日的に収縮し
、６日後のセル密度は６．ＯＸ １０Ｓｃｅｌｌｓ／ｓ
ｄｇｅｌであり、細胞の増殖はほとんど認められなかつ
之。
イータｋ（Ｅａｇｌｅ’ｓ） ＭＥＭ １００−中で攪
拌培養を行なつ友。コラーゲンビーズは経日的に収縮し
、６日後のセル密度は６．ＯＸ １０Ｓｃｅｌｌｓ／ｓ
ｄｇｅｌであり、細胞の増殖はほとんど認められなかつ
之。
Claims (6)
- （１）動物細胞、該動物細胞培養用培地およびコラーゲ
ンより成るゲル状組成物を、ポリアニオン多糖類または
その塩の単独もしくはそれらの混合物を基材とする流動
体と、可溶性キチン誘導体またはその塩の溶液との接触
により形成された皮膜で包括したカプセル。 - （２）動物細胞が接着依存性細胞である特許請求の範囲
第１項記載のカプセル。 - （３）動物細胞が接着依存性正常細胞である特許請求の
範囲第１項記載のカプセル。 - （４）動物細胞がヒト由来の接着依存性正常細胞である
特許請求の範囲第１項記載のカプセル。 - （５）可溶性キチン誘導体がキトサンである特許請求の
範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載のカプセル。 - （６）コラーゲンの濃度が０．１％より大きく０．５％
より小さい特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
かに記載のカプセル。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61144784A JPS633786A (ja) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | コラ−ゲンゲル包括カプセル |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61144784A JPS633786A (ja) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | コラ−ゲンゲル包括カプセル |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS633786A true JPS633786A (ja) | 1988-01-08 |
Family
ID=15370363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61144784A Pending JPS633786A (ja) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | コラ−ゲンゲル包括カプセル |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS633786A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01245848A (ja) * | 1988-03-29 | 1989-10-02 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 膜透過性制御可能なカプセル体の製造法 |
| WO1989010397A1 (fr) * | 1988-04-18 | 1989-11-02 | Nitta Gelatin Inc. | Procede pour la mise en culture de cellules animales a grande echelle, et procede pour la preparation du substrat de support a cet effet |
| JP2594367B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-03-26 | 新田ゼラチン株式会社 | 動物細胞大量培養法およびそれに用いる培養用支持基質の製法 |
-
1986
- 1986-06-23 JP JP61144784A patent/JPS633786A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01245848A (ja) * | 1988-03-29 | 1989-10-02 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 膜透過性制御可能なカプセル体の製造法 |
| WO1989010397A1 (fr) * | 1988-04-18 | 1989-11-02 | Nitta Gelatin Inc. | Procede pour la mise en culture de cellules animales a grande echelle, et procede pour la preparation du substrat de support a cet effet |
| US5264359A (en) * | 1988-04-18 | 1993-11-23 | Nitta Gelatin Inc. | Methods for large-scale cultivation of animal cells and for making supporting substrata for the cultivation |
| EP0364606B1 (en) * | 1988-04-18 | 1994-03-16 | Nitta Gelatin Inc. | Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process |
| JP2594367B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-03-26 | 新田ゼラチン株式会社 | 動物細胞大量培養法およびそれに用いる培養用支持基質の製法 |
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