JPS6157288B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、細胞により産生されるタイプの生物
質を製造する方法に関する。 細胞生物学の発達によつて、種々の高等生物の
細胞が、病気の治療ないし診断において有意な潜
在的若しくは明白な有用性を示す物質を少量産生
することがわかつている。かかる物質の例は文献
に多く記されており、それには、ホルモン、イン
ターフエロンおよびリンフオキンの如き種々の生
物学的応答改変剤並びに、診断テストに用いられ
る抗体の如き他物質が含まれる。また、抗生物質
を大量生産するのに、微生物系統の細胞培養が長
い間用いられてきた。 特に、高等動物からの細胞培養においては、バ
クテリアその他による汚染の危険が常に存在す
る。また、ほとんどの場合、細胞の培養によつて
産生される興味深い物質の量は非常に少く、しか
もそれは、血清たん白質および他物質の複雑な混
合物を含む培養基に集まる。これは、興味深い物
質の単離ないし精製を困難なものとする。 概記するに、本発明は、生きている細胞によつ
て産生される物質の製造系および製造方法を提供
する。本発明の実施によつて、培養する細胞のた
めの保護環境がもたらされ且つ混入異質成分をほ
とんど含まない培養基に興味ある物質を集める手
段が提供されるという二つの個有な利点が達成さ
れる。本発明は、興味ある物質を、より高分子量
の血清たん白質その他、産生性細胞の継続的生存
能力および代謝を保持するのに通常必要とされる
類似物から分離するのに使用されうる。別法とし
て、本発明は、比較的少量の低分子量栄養又は細
胞代謝生成物を含む培養基に興味ある物質を集め
るのに使用されうる。 本方法は、細胞の標準的代謝作用ないし継続的
生存能力に必要な栄養、イオンおよび他の比較的
低分子量の材料を透過しうる膜の中に細胞を封入
カプセル化する工程を含む。この膜は、細胞が分
泌した興味ある物質を透過してもよく透過しなく
てもよいが、いずれにせよ、分子量が一般に、約
2.0×10⁵ダルトンよりも小さな或る選定レベルに
ある分子の通り抜けないし貫通を許容するのに十
分な透過度上限を有する。このようにして産生さ
れたカプセルを次いで、慣用の水性培養基に懸濁
させて、該カプセル内の細胞に通常のインビトロ
代謝作用を行わせる。細胞によつて分泌された、
分子量が膜の透過度上限よりも小さな物質は膜を
通り抜けて培養基中に集まる。有利なことに、高
等動物からの多種の細胞培養物の生存能力ないし
保建に必要なしかも典型的にはそれ自体消費され
ない血清たん白質の如き高分子量物質をマイクロ
カプセルに入れ、そこに閉じ込めて該物質が培養
基中に拡散しないようにすることができる。細胞
培養物が代謝の際消費する物質が、カプセル膜を
通つて拡散しうるのに十分低い分子量を有すると
き、それは培養基を出て膜を貫通する。また、膜
の通り抜けを許容するのに十分小さな分子寸法を
有する、細胞の代謝生成物は、カプセル外部の培
養基中へと拡散する。興味ある物質が、透過度上
限よりも小さな分子量を有する場合、それはカプ
セル外培養基中に拡散し、その培養基中で比較的
容易に収得されうる。なぜなら、従来法のカプセ
ル化しない細胞培養物に存在する汚染性高分子量
材料がないからである。興味ある物質が膜の透過
度上限よりも大きな分子量を有するとき、それは
カプセル内に蓄積するので、後刻、その回収に備
えてカプセルを培養基から分離し、破壊すること
ができる。 本発明は、カプセル膜内に封入することのでき
る細胞の種類に関して本質上制約がない。特に、
企図されることは、微生物や、高等動物全ての組
織からの細胞の培養物が使用されうることであ
る。融合細胞、例えばハイブリドーマ細胞又は、
例として最近の組換えDNA技法により製せられ
る遺伝学的改変細胞も同じく容易にカプセル化す
ることができる。要するに、懸案のタイプの細胞
をインビトロ維持することのできる培養基があれ
ば、その細胞は、ここに開示する方法に従つて用
いられうる。本発明の方法および本発明の系に従
つて製造することのできる物質の種類は、インタ
ーフエロン、およびモノクローナル抗体である。 本発明の系は、生存性細胞をカプセル封入しこ
れを水性培養基に懸濁させたものよりなる。カプ
セル化した細胞は、該細胞の継続的生存能力ない
し代謝に必要な栄養の貫通を許容するのに十分な
透過度上限によつて特徴づけられる膜を有する。
この膜は、細胞の代謝を維持するのに必要なしか
も、膜の透過度上限よりも大きい寸法範囲にある
成分全てを含む培養基に配分された生存性細胞を
封入する。培養基は、膜の透過度上限よりも小さ
な分子量を有する、細胞の生存能力を維持するの
に必要な成分を含む。 従つて、本発明の一つの目的は、細胞によつて
産生されるタイプの生物質を製造する系および方
法を提供することである。本発明の別の目的は、
かかる系にして、産生性細胞を健康的な保護小環
境に入れこれを、該細胞の代謝生成物と、細胞の
生存能力ないし保全に必要な高分子量物質とを分
けるのに役立つ半透膜によつて閉じ込めた系を提
供することである。本発明の他の目的は、細胞培
養物から生物学上活性な物質を製造するための改
良方法を提供することである。本発明の更に他の
目的は、モノクローナル抗体ならびにインターフ
エロンの如き生物学的応答改変剤を血清不含培養
基中で製造することである。 如上および他の目的並びに本発明の特徴は以下
の記載と添付図面より明らかとなろう。 本発明の広い概念は、細胞培養基による完全
な、細胞のための小環境を、半透膜によつて外部
の水性培養基から分離するように個々の細胞若し
くは細胞群周囲に半透膜を介在させることであ
る。哺乳類からの細胞は代表的には、その継続的
な生存能力ないし健康を維持するために血清たん
白質の存在を必要とし、その一部分は約65000〜
150000ダルトンよりも大きな分子量を有する。従
来法のカプセル化しない細胞培養においては、細
胞から分泌された興味ある物質を培養基中に分散
させ、これを高分子量成分、低分子量成分の両者
と混合せしめる。典型的には、細胞産生物の量は
かなり少いため、興味ある物質の単離精製は困難
な仕事となる。更に、哺乳類細胞の培養は、バク
テリア等による汚染に対してまぎれもなく敏感で
ある。そのため、無菌状態を保持する種々の技法
を用いて培養を行わねばならず、また往々培養基
中に抗体を含ませねばならない。 本発明のプラクテイスに従えば、上記問題は、
一般に約200000よりも大きくない選択された透過
度範囲を有する半透膜の中に培養細胞をカプセル
化することによつて軽減される。すなわち、半透
膜は、最大分子量が透過度上限と同じか又はそれ
より小さな物質をして該膜を貫通させる多孔質の
ものである。而して、透過度上限よりも大きな分
子量の物質は膜を通り抜けることができない。こ
のことから、継続的生存能力、代謝作用、更には
有糸分裂に必要な成分全てを含有する培養基と一
緒に細胞をカプセル化することができ、次いでこ
のようにカプセル化された細胞を、該細胞により
消費される低分子量物質を含む（しかし所要の高
分子量物質を含む必要のない）培養基中に懸濁さ
せることができる。 典型的には、高等生物からの細胞は、高分子量
の血清たん白質を摂取せず、継続的な標準生物学
的応答のために近似したものを要求する。細胞に
より摂取され或は代謝作用の行われる塩、アミノ
酸、その他低分子量の要素は膜を自由に通り抜
け、また必要に応じカプセル外培養基を単に変え
ることで補給されうる。膜の透過度上限よりも小
さな分子量を有する、細胞の代謝作用による分泌
物はカプセル外培養基中に蓄積する。この培養基
には高分子量の物質がないため、興味ある代謝物
の収得ないし単離は簡素化される。また、透過度
上限よりも大きな分子量を有する興味ある生成物
の収得も、該生成物がカプセル内部に在つてカプ
セル外容積中に分散していないことで促進され
る。 低分子量の細胞産生物に適用したときの本発明
概念を添付図面に概略例示する。第１図に示す如
く、細胞１０は、孔１６を有するカプセル膜１２
内に配置されている。高分子量の要素１８も膜１
２内部に封入され、その中に在つて培養基１４内
を自由に循環する。細胞に必要な成分２０や、興
味ある物質２２′を含む代謝生成物２２は、カプ
セル内培養基、カプセル外培養基いずれにおいて
も自由に循環し、また孔１６を通つて膜を横切
る。周期的（ないし連続的）基準での作業が必要
とされるとき、カプセル外培養基はその成分全て
と一緒に、カプセルそのものから吸引等によつて
分離され、新たな培養基に置き換えられる。集め
られた培養基には、高分子量の成分１８が事実上
なく、かくして収得、単離の手順が簡易化され
る。しかも、細胞１０は、常時カプセル内部の小
環境内に在つて保護されたまゝである。 いくつかの場合において、例えば、カプセル化
した細胞による特定の興味ある物質の産生を刺激
するために、該細胞を、膜の貫通には大きすぎる
分子寸法の高分子量成分にさらすことが要求され
る。一つの例は、ヒトの線維芽細胞、白血球又
は、或る種のウイルス若しくは高分子量核酸によ
る処理でインターフエロンを分泌するよう誘発さ
れるリンパ芽細胞からのインターフエロン製造で
ある。このような場合、もし膜の透過度上限が誘
発性要素の分子量よりも低ければ、細胞を、カプ
セル化に先立ちインターフエロン誘発に付すか或
は、細胞培養ののちカプセル膜を選択的に破壊し
て高分子量材料を細胞によつて摂取させるかせね
ばならない。米国出願番号243584に相当する同日
出願の明細書には、かかる目的ないし他の目的の
ため、細胞を損うことなく用いられうる特種なカ
プセル膜の選択的破壊方法が開示されている。 本発明の方法は、細胞周囲に半透膜を形成しう
ると同時にその継続的生存能力に悪影響しない方
法に依処する。一つの適当なカプセル化方法を以
下に詳述する。 細胞のカプセル化 カプセル化しようとする組織ないし細胞を、保
全に適した或は、かかわり合う特定タイプの組織
若しくは細胞の継続的代謝作用を保持するのに適
した水性培養基に懸濁させる。この目的に適した
培養基は市販されている。カプセル化しようとす
る原料の平均径は数μｍ〜数mm範囲で広く変動し
うる。しかしながら、最良の結果は、300〜1000
μｍ範囲の大きさのカプセルを以て達成される。
線維芽細胞、白血球、リンパ芽細胞の如き個々の
細胞、これら細胞の種々の比の混成物又は他の組
織単位を所望に応じカプセル化することができ
る。また、組換えDNA法又は他の技法により遺
伝学的に改変されたものを含む微生物もカプセル
化することができる。 このような生物の継続的生存能力は殊に、所要
栄養の入手性、酸素移動、培養基中の有毒物の不
在および培養基のPHに依存する。それ故、かかる
生物を生理学上相容しうる環境に保持ししかも同
時にカプセル化することは従前不可能であつた。
問題は、膜形成の所要条件が組織に対し有害若し
くは致死的であるということだつた。而して、組
織を健康状態で生き残らせる膜形成の方法は、米
国出願番号24600の発明前何ら出現しなかつた。 しかしながら、生きている組織と生理学上適合
し得しかも、それ自体水不溶化して保形性凝着塊
を形成することのできる或る種の水溶性物質が、
個々の細胞若しくは細胞群周囲に保護バリヤー層
すなわち「一時カプセル」を形成するのに用いら
れ、またこの一時カプセルが、細胞を損うことな
く細胞周囲に、より恒久的な半透膜を沈着させる
べく処理されうることが発見された。かかる物質
は組織培養基に対し数重量％程度の濃度で加えら
れる。なお、この培養基には、培養細胞と必要に
応じ血清成分が含まれ、また随意成分として、コ
ラーゲンの如き細胞基質又は、固定基質として作
用する水分散性高分子量物質が含まれる。コラー
ゲンを用いる場合、その濃度を約10μｇ/ml〜約
１mg/ml範囲内とすべきであるが、好ましくは100
〜500μｇ/ml程度とする。 次いで、組織をその培養基と一緒に含む上記溶
液を小滴形状にし、これを直ちに水不溶化し、そ
して少くとも表面層をゲル化させる。しかるの
ち、この保形性一時カプセルに、より恒久的な膜
を付与する。もし組織を、損うことなく放出する
ことが望まれるなら、引続いて膜そのものを選択
的に破壊することができる。一時カプセルの形成
に用いられる材料に依つては、この恒久的な膜を
形成したあとカプセル内部を再液化させてもよ
い。これは、培養基中に、該材料が溶けうる条件
を確立させることによつて遂行される。 一時カプセルの形成に用いられる材料は、イオ
ン環境又はイオン濃度の変化によつて保形性のも
のに転化しうる水溶性無毒材料ならいずれであつ
てもよい。又、この材料は、複数のカチオン基を
有する重合体と反応して塩形成することのできる
複数の易イオン化アニオン部分例えばカルボキシ
ル基を含むべきである。あとで説示する如く、こ
の種の材料を用いることにより、一時カプセルの
表面層において、選択された透過度上限を有する
恒久的な膜を、困難を伴わずに沈着させることが
できる。 一時カプセルを形成するのに現在好ましい材料
は、水に可溶の天然ないし合成の酸性多糖類ゴム
であり、かかる材料は市販されている。これらは
典型的には、植物から抽出され、各種食品の添加
剤として往々用いられている。アルギン酸ナトリ
ウムが今日好適な水溶性ゴムであり、150000ダル
トン以上の分子量範囲にあるアルギン酸塩を用い
ることができるが、しかし該塩はその分子量寸法
および粘度故に、最終的に形成されたカプセル膜
を透過することは通常不可能である。これよりも
低分子量例えば50000〜80000ダルトンのアルギン
酸塩は、十分な多孔性を有する膜を経てカプセル
内部容積から、拡散によつて、より容易に除去さ
れ、それ故に好ましい。使用しうる他のゴムに、
グアーガム、カラジーナン、ペクチン、トラガカ
ントゴム又はキサンタンゴムが包含される。 これらの材料は、グリコシド結合した糖類鎖を
含む。その遊離酸基は往々、アルカリ金属イオン
形例えばナトリウムイオン形状で存在する。もし
カルシウム若しくはアルミニウムの如き多価イオ
ンがこのアルカリ金属イオンと交換するなら、水
溶性多糖類分子は「架橋」されて、水に不溶の保
形性ゲルを形成し、そして該ゲルは、イオン交換
により或は金属イオン封鎖剤を通してイオンを除
去するとき再溶解せしめられうる。酸性ゴムと塩
形成することのできる多価アオンなら本質上全て
が作動性であるが、生理学上相容しうるイオン例
えばカルシウムを用いることが好ましい。これは
組織を生きている状態で保全しやすい。他の多価
カチオンも使用することができる。ただし、マグ
ネシウムイオンはアルギン酸ナトリウムをゲル化
するのに有効でない。 代表的な溶液組成物は、培養基中等容量の細胞
培養物と生理的食塩水中１ないし２％のゴム溶液
よりなる。アルギン酸ナトリウムを用いるとき、
1.2〜1.6％溶液が首尾よく使われている。もし、
カプセル化しようとする細胞が有糸分裂するのに
固定基質への付着を要求する種類のものなら、ま
た該細胞がカプセル内部で増殖されるべきものな
ら、コラーゲンか或は、水に分散しうる天然ない
し合成の高分子量たん白質若しくはポリペプチド
を細胞培養物に含ませることができ、そして最終
的に形成されたカプセル内部の容積中に留められ
る。この目的に、複数のカチオン基を有する重合
体例えばポリリシンが用いられる場合、該カチオ
ン基は水溶性ゴムのアニオン箇所と反応して、ゴ
ムと絡み合わされた実質上水に不溶のマトリツク
スを形成する。かかる原料の好ましい濃度は、懸
濁物（ゴム溶液を含む）１ml当り100〜500μｇ程
度である。 次工程のカプセル化において、組織を含むゴム
溶液は所望寸法の小滴形状にされる。しかるの
ち、該小滴は直ちにゲル化されて好ましくは球状
ないし扁球状を保持するものとなるが、しかし必
ずしもかかる形態を呈さない。小滴形成は既知の
方法によつて実施されうる。その手順例は以下の
如くである。 多価カチオンの水溶液例えば1.5％のCaCl₂溶液
を入れたチユーブに、小滴形成装置を保持するス
トツパーを嵌合させる。この装置は、上方空気取
入口と、ストツパー内にうまく設けられた細長い
中空体部分を有するハウジングよりなる。このハ
ウジングの頂部に、段階式ポンプを備えた10c.c.注
入器を、例えば長さ方向に沿いハウジングを貫通
するテフロン被覆された内径0.01in針によつて取
付ける。ハウジングの内部は、針の先端が、エア
ナイフとして機能する一定の空気層流にさらされ
るように設計されている。使用時、注入器に、カ
プセル化しようとする原料を含む溶液を満たし、
針の先端から溶液の小滴を増分的に強制押出すべ
く段階式ポンプを作動させる。空気流れによつ
て、液滴同士を「切り離」し、而してこの液滴は
CaCl₂溶液中約2.5cmに落下し、そこでカルシウム
イオンを吸収して直ちにゲル化する。この場合、
針の先端とCaCl₂溶液面との距離は、アルギン酸
ナトリウム／細胞懸濁物をして物理的に最も有利
な形状である球体（最小の表面積に最大容積）を
呈させるに十分長い。ストツパー中の開口部を通
つてチユーブ内の空気が流出する。これはゲルの
「架橋」をもたらし、また懸濁せる組織とその培
養基を含む高粘度保形性保護一時カプセルの形成
をもたらす。カプセルは別個の相として溶液中に
蓄積し、吸引によつて分離されうる。 次の処理工程において、この一時カプセルの表
面周囲に、表面層を「架橋」することによつて半
透膜を沈着させる。これは、ゲル化した一時カプ
セルを、該ゲル分子中のアニオン官能基と反応し
うるカチオン基を有する重合体の水溶液にさらす
ことによつて遂行されうる。遊離イミンないしア
ミン基の如き酸反応性基を有する重合体が好まし
い。この状況において、多糖類ゴムは、カルボキ
シル基とアミン若しくはイミン基との相互作用
（塩結合形成）によつて架橋される。用いられる
架橋性重合体の分子量を選定し且つ重合体溶液の
濃度および暴露時間を調節することにより、透過
度を範囲内に制御することができる。低分子量を
有する重合体の溶液は、一定期間では、高分子量
重合体の場合よりも一層、一時カプセル内部に侵
入する。架橋剤の侵入度は、得られる透過度と相
関関係がある。一般に、分子量が高く侵入が少い
ほど、細孔寸法は大きい。反応の期間、重合体溶
液の濃度および所望される透過度に依拠して、広
くいえば3000から100000ダルトン以上の分子量範
囲内の重合体を用いることができる。平均分子量
約35000ダルトンのポリリシンを用いるとき、一
つの好首尾な反応条件組合せとして、ポリリシン
含量0.0167％の生理的食塩水溶液を２分間撹拌し
ながら反応させることが挙げられる。これは、約
100000ダルトンの透過度上限を有する膜をもたら
す。所定の系で透過度を制御するのに最適な反応
条件は上記指針にかんがみて実験により容易に決
定されうる。この方法を用いるなら、膜の透過度
上限約200000ダルトンよりも小さな選定レベルに
設定することができる。 適当な架橋用重合体の例には、遊離アミノ若し
くはイミノ基を有する天然ないし合成のたん白質
およびポリペプチド、ポリエチレンアミン、ポリ
エチレンイミンおよびポリビニルアミンが含まれ
る。現在、ＤおよびＬ両形のポリリシンが首尾よ
く使われている。ポリアルゲニン、ポリシトルリ
ン又はポリオルニチンの如きたん白質も亦作動す
ることができる。正電荷の濃度がより高い範囲に
ある重合体例えばポリビニルアミンはゲル分子の
アニオン基に激しく結合して安定な膜を形成する
が、しかしこの膜は破壊するのにかなりむづかし
い。 ゴムの稀溶液で処理すると、カプセルの表面に
遊離アミノ基が結合するが、処理しないなら、カ
プセル同士が凝集しやすくなる。 カプセル化でのこの時点において、カプセルを
集めることができる。それは、ゴム、細胞、細胞
と相容しうる培養基並びに随意成分としてのコラ
ーゲン若しくは別の固定基質の内部マトリツクス
の溶液ゲル化物を囲繞する半透膜よりなる。カプ
セル内部のまた膜を横切つての物質移動を促進す
べき故、ゲル化物を再液化してその水溶性形状に
戻すことが好ましい。これは、ゴムが液状をなす
条件を再確立させることにより、例えば内部ゲル
からカルシウム又は他の多価カチオンを除去する
ことによつて遂行されうる。また、アルカリ金属
イオンおよび水素イオンを含むりん酸塩緩衝剤入
り食塩水にカプセルを単に浸漬することによつ
て、カプセル内の培養基を再溶解させることがで
きる。而して、カプセルを撹拌下溶液に浸漬する
とき、一価イオンはゴム内部のカルシウム若しく
は他の多価イオンと交換する。同じ目的にくえん
酸ナトリウム溶液を用いることができ、そしてこ
のものは金属イオン封鎖剤として二価イオンを失
活させるのに役立つ。 上記の如くカプセル化した細胞培養物は、関連
せる特定細胞タイプの要件全てを満たすべく特に
設計された培養基に懸濁され得、それによつて該
培養物は標準的なインビトロ代謝を示し続ける。
もし、培養物が血清成分の如き高分子量成分の環
境を必要とするなら、この成分をカプセル外培養
基から省くことができる。細胞によつて通常摂取
される成分は典型的には、比較的低分子量であ
り、該成分が細胞膜を透過するときそれはカプセ
ル膜を横切つて細胞の小環境内に容易に拡散す
る。カプセル内培養基中に分泌された、細胞の代
謝生成物は、そしそれがカプセル膜の透過度上限
よりも小さな分子量を有するなら同様に該膜を横
切つて拡散し、カプセル外培養基中に蓄積する。 カプセル化された細胞は、在来の培養物と同じ
条件例えば温度、PHおよびイオン環境のもとで培
養することができる。また、細胞の産生物も、慣
用技法によつてカプセル外培養基から或はカプセ
ル内から収得することができるが、ここに開示す
る培養技法は次の如き利点を有する。すなわち、 １ 培養中の細胞は、膜の透過度上限よりも大き
な寸法を有する要素による汚染から保護され、
また剪断力ないし機械的損傷からも保護され
る。これは、培養法に通常付帯する取扱い要件
ないし滅菌要件が幾分緩和されうることを意味
する。なぜなら、微生物は、カプセル化された
細胞に達し得ず、またウイルス感染した細胞が
他細胞を汚染することもないからである。 ２ カプセルは、高分子量原料が留めおかれてい
る環境内で細胞を事実上不動にし、しかもより
低分子量の細胞栄養や産生物が容易に取り出さ
れ或は導入される。このことから、細胞を損う
ことなく、栄養流体培養基を既述の如く間欠的
に或は連続的に集め、また補給することが可能
となる。 ３ 細胞によつて産生された興味ある物質は、一
層容易に回収される。カプセル膜を貫通するの
に十分小さな分子寸法の細胞分泌物は栄養との
混合状態でカプセル外培養基中に蓄積する。し
かしながら、高分子量の血清成分等はカプセル
外培養基中に解放されず、かくして興味ある細
胞生成物の回収が簡素化される。膜の透過度上
限よりも大きな分子寸法を有する分泌された細
胞産生物はカプセル内に蓄積する。無論、細胞
膜外に分泌されない細胞産生物にも、興味ある
ものがある。これらの産生物は、カプセルを単
離し引続き例えば後述の技法を用いてカプセル
膜を選択的に破壊し、必要に応じて細胞膜を破
壊することにより比較的濃厚な形状で回収する
ことができる。 ４ カプセル内容積は、細胞分割によく適した環
境を供与する。懸濁物培養は、カプセル内部で
有糸分裂することが観察されている。標準培養
においては二次元の単層で増殖する固定基質依
存細胞がカプセル内に配列すべく増加する。か
かる細胞は基質として膜の内面を用い且つ（或
は）、カプセル内部に配置された既述の高分子
量材料に係留する。これは、在来の培養物と比
較したとき細胞密度の有意な増加をもたらす。
かかる細胞群の継続的生存能力は、カプセルの
表面積対容積比がかなり大きく、かくして細胞
全てが所要栄養、酸素等への近づきを得るとい
う事実によつて促進される。 或る特定の状況において、細胞を、損うこと
なく開放するためにカプセル膜を選択的に破壊
することが有利である。注目しうる一つの例は
インターフエロン（INF）の製造にある。INF
を産生することのできる細胞は、INF製造工程
に備えて、用意された或る種のウイルス又は核
酸に付されねばならない。また、いくつかの
INF誘発方法では、たん白質合成を抑制するた
めの試薬を培養物に添加する。従つて、培養の
増殖工程は、INF誘発工程とは全く異なる条件
下で実施されねばならない。もし、INF誘発に
用いられる物質がカプセル膜の透過度上限より
も大きな分子量であるなら、（ウイルス誘発の
場合のように）誘発処理は、カプセル化された
細胞の培養物中で遂行され得ない。従つて、
INF産生性細胞は、これをカプセル内で増殖す
るとき誘発処理に付さしめるために膜の破壊に
よつて解放されねばならない。 膜の破壊 上述せるタイプの膜内に留めおかれた細胞は、
このカプセル化細胞に有意には悪影響しない性質
を有する市販試薬を用いる方法によつて放出せし
められうる。先ず、カプセルをその懸濁培養基か
ら分離し、十分に洗浄して、マイクロカプセル外
部に存在する汚染物を全て除去し、次いで、この
マイクロカプセルを、カルシウムイオンの如き単
原子多価カチオンと、ポリスルホン酸塩若しくは
ポリりん酸塩の如き複数のアニオン部分を有する
ストリツピング重合体との混合溶液に撹拌下で分
散させる。この工程に好ましいのは、天然のスル
ホン化多糖類ヘパリンである。用いられるストリ
ツピング重合体のアニオン電荷濃度は、膜を形成
するのに当初用いられたポリアニオン原料の電荷
密度に等しいか、好ましくは該密度よりも高くあ
るべきである。重合体の分子量は、少くとも、膜
形成時に使用せる複数のカチオン基を有する重合
体の分子量に相応し、好ましくは該分子量よりも
大きくあるべきである。上記混合溶液中のカプセ
ル懸濁物内では、水溶性ゴム上のアニオン箇所に
ついて、カルシウムイオンが膜形成に使用せる多
カチオン重合体鎖と競合し、同時に重合体鎖上の
カチオン箇所について、溶液中に溶解せるヘパリ
ン若しくは、複数のアニオン部分を有する他の重
合体が膜内のゴムと競合する。これは、例えばポ
リリシンおよびヘパリンの水分散性好ましくは水
溶性錯体にして、ゲルの分子により単原子カチオ
ンと結合したものをもたらす。 この工程によつて、膜は、後続の金属イオン封
鎖剤に暴露されるとき溶解しやすくなる。なお、
この金属イオン封鎖剤は、ゲルから単原子イオン
を吸収することによつて破壊処理を完了させる。
培養基中にカプセル膜の破片が残存するとして
も、それは細胞から容易に分離することができ
る。 選択的な破壊処理の第一工程で現在好ましい溶
液は1.1%(w/v)の塩化カルシウムと、溶液１ml当
り500〜1500単位のヘパリンを含む。懸濁物の全
容積に対し約20〜30％を占めるに十分なこの溶液
にマイクロカプセル１容を加える。細胞を収容せ
るカプセル膜を破壊するのに塩化カルシウムとヘ
パリンが好ましい。なぜなら、両試薬はほとんど
の細胞と生理学上相容し得、それ故に細胞損傷の
可能性を最小限におさえるからである。アルミニ
ウム塩又は多価カチオン（但しMg〓イオンを除
外）の混合物も亦、既述タイプのポリスルホン酸
塩若しくはポリりん酸塩と一緒に用いることがで
きる。 一般に、この工程で用いられる単原子イオンお
よびアニオン重合体の濃度は広範囲で変動するこ
とができる。最適濃度は実験によつて容易に決定
されうる。而して、それは、膜形成に用いられる
特定の重合体および暴露時間によつて異なる。 現在、選択的破壊を行なうのに好ましい金属イ
オン封鎖剤はくえん酸ナトリウムであうが、しか
しくえん酸およびEDTAの他のアルカリ金属塩を
用いることもできる。くえん酸ナトリウムを用い
る場合、その最適濃度は55ｍＭ程度である。くえ
ん酸塩又は他の金属イオン封鎖剤を等張性の食塩
水に溶かして細胞損傷を最小限におさえることが
好ましい。 更に、本発明は下記の非制限例から理解されよ
う。 例 １ INF−βの製造 ヒトの包皮組織を既知方法によりトリプシンと
EDTAで５分間37℃で処理して得た線維芽細胞
を、40%(v/v)の精製したウシ胎児性血清、0.8％
のアルギン酸ナトリウム（シグマ）および200μ
ｇ／mlの精製子ウシ皮コラーゲンを補つた完成培
養基（CMLR−1969、Connaught
Laboratories）に懸濁させる。細胞懸濁物の密度
は約1.5×10⁷個細胞／mlである。例１に記載の如
く、アルギン酸塩の一時カプセルを形成する。こ
れをポリリシン（MW43000ダルトン）の0.005%
（ｗ／ｖ）水溶液に３分間懸濁させることによつて、
カプセルの表面層に半透膜を沈着させる。 得られたカプセルを、10％のウシ胎児性血清を
補つたCMLR−1969培養基に懸濁させる。上記工
程は全て37℃で行なう。同じ温度でインキユベー
トしたのち、カプセルを顕微鏡下で試験すると
き、それは、有糸分裂を行なつて、マイクロカプ
セル内に３次元の線維芽細胞形態を示す細胞を含
むことがわかる。 ４〜５日間インキユベートしたのち、カプセル
内の線維芽細胞をVilcek法によるINF−β超誘発
技術に付す。５％のCO₂（95％の空気）雰囲気
下、ウイスコンシン州ミルウオーキ所在の
PLBiochemicalsより入手される二重ラセンRNA
（既知のIFN−β誘発剤）ポリＩ−ポリC100μ
ｇ／mlとシクロヘキシイミド（たん白質合成抑制
剤、カルフオルニア州ラジヨラ所在
Calbiochem）50μｇ/mlの存在下37℃で１時間イ
ンキユベートする。１時間後、懸濁せるカプセル
を、シクロヘキシイミド50μｇ/mlを含む培養基
（CMLR−1969）で洗浄し、次いで再び、同じ溶
液中に５％CO₂雰囲気下37℃で３時間懸濁させ
る。このインベーシヨンが完了したとき、洗浄工
程を繰返し、シクロヘキシイミド50μｇ/mlとア
クチモミシンＤ（既知のRNA合成抑制剤、
Calbiochem）５μｇ/mlを含む培養基にカプセル
を再懸濁させて、５％CO₂雰囲気下37℃で２時間
インキユベートする。次いで、カプセルを培養基
で２回洗浄し、血清不含培養基に37℃で18〜24時
間懸濁させる。この間、線維芽細胞はINF−βを
分泌する。これは21000ダルトン程度の分子量を
有し、カプセル外培養基から収得される。 例 ２ 1NF−βの製造 例１の手順を反復したが、但し誘発に先立ち、
カプセル膜を選択的に破壊して、ポリＩ−ポリＣ
が線維芽細胞に一層容易に近づきうるようにす
る。破壊工程は次のように実施する。 １ml当り約500〜1000個のカプセルを含むマイ
クロカプセル懸濁物10ml部分を沈降させ、懸濁培
養基を吸引によつて除く。該カプセルをりん酸塩
緩衝剤入り食塩水（PBS、PH＝7.4）で２回洗浄
する。次いで洗浄したカプセルを、ヘパリン1000
単位／mlおよびCaCl₂1.1%(w/v)を含むアリコー
ト3.0mlと混合する。この懸濁物を37℃で３分間
かき混ぜたのち、カプセルを沈降させ、上澄み液
の吸引除去後、該カプセルを0.15MのNaCl 3.0ml
で２回洗浄する。２回目の洗浄液を吸収したの
ち、カプセルに、等容量の110ｍＭくえん酸ナト
リウムと0.15MNaClよりなる混合溶液（PH7.4）
2.0mlを混合する。該混合物を１分間手で渦動さ
せて膜の溶解を誘い、そのあと細胞を培養基で２
回洗浄する。 次いで、細胞を培養基に懸濁させ、例１に記載
の誘発工程に付したのち、再度例１に記載の如く
カプセル化する。次いで、カプセル懸濁物を血清
不含培養基中で18〜24時間インキユベートし、そ
の間細胞からINF−βが分泌され、このものはカ
プセル膜を通り抜けてカプセル外培養基中に蓄積
する。 例１および例23を、ポリＩ−ポリＣ（5S）（沈
降値、二重ラセンRNAを構成すべくアニールさ
れたポリＩとポリＣ）を用いて実施するとき、そ
れは下記のINF−β産生量（細胞10⁵当りのINF−
β単位数）をもたらす： １ ２ 例１ 25 25 例２ 2500 2500 例１および例２を、ポリＩ−ポリＣ（12S）
（沈降値、購入時二重ラセン）を用いて実施した
場合、それは下記のINF−β産生量（細胞10⁵個
当りのINF−β単位数）をもたらす： １ ２ 例１ 25 25 例２ 2500 2500 例２の手順を用いたとき例１の場合よりも産生
量が100倍高いことの少くとも部分的根拠は、例
３の手順によるときポリＩ−ポリＣが細胞に、よ
り近づきやすいという事実にあると信じられる。 例 ３ 例１の手順を繰返すが、但しコラーゲンを含ま
ないカプセルを用いる。カプセル化した細胞を在
来の単層培養基中で増殖させ、トリビンで処理
し、ポリＩ−ポリＣ（5S）で誘発し、同時にマ
イクロカプセル化した。カプセル外培養基は、細
胞10⁵個当り2500単位のINF−βを含むことがわ
かつた。 例 ４ モノクローナル抗体 MITのHermam Eisenより入手したハイブリド
ーマ細胞を3.0×10⁶個細胞／mlの密度に培養し
た。この細胞は、従来技術で今日よく知られた方
法によりマウスの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞か
ら融合されたもので、培養中ジニトロフエニルウ
シ血清アルブミンに対する抗体を産生した不死の
細胞系を構成する。ウシ胎児性血清0.6mlと生理
的食塩水（150ｍＭ）0.3mlに1.4％のアルギン酸
ナトリウムを含有する懸濁物2.1mlを加えること
によつて、細胞懸濁物３mlをアリコートを調製し
た。この懸濁物の小滴を直ちにCaCl₂溶液中でゲ
ル化し、次いでポリＬリシンの0.016重量％溶液
で処理した。得られたカプセルの内部を、110ｍ
Ｍのくえん酸ナトリウム１部と150ｍＭの食塩水
３部の溶液に６分間浸漬することによつて再液化
した。次いで、ハイブリドーマ細胞を含むカプセ
ルを、20％の熱失活ウシ胎児性血清を含むRPMI
−1640培養基（Gibco）の混合物中に懸濁させ
た。 ハイブリドーマ培養物のカプセル化した場合と
しなかつた場合の細胞のカウント数および、これ
らカプセル化培養物と未カプセル培養物により産
生されたモノクローナル抗体の量を周期的に測定
した。その結果を第２図のグラフに示す。 例 ５ 白血球からのINF−α アメリカンレツドクロス（American Red
Cross）から取得せる軟膜30mlを５％のEDTA3.0
mlで処理し、４℃の0.83％NH₄Clへの反復10分間
暴露に付して赤血球を溶解させた。NH₄Clによる
処理の合い間に５分間の遠心処理（４℃で
1200rpm）を行なつた結果、残存せる完全な白血
球から残屑が分離された。次いで、細胞をMEN
（最小必須培養基、血清不含、Gibco）に懸濁さ
せ、100の要素によつて稀釈し、トリプタン青で
15分間染色した。試料について行なつた細胞のカ
ウントは、軟膜30ml当り約1.3×10⁹個の白血球が
生き残つたことを示した。次いで、該細胞を、２
％の熱失活ウシ胎児性血清を補なつた培養基に１
×10⁷個細胞／mlの濃度で懸濁させた。 この細胞懸濁物を撹拌下センダイウイルス（各
種濃度のヒーム凝集（HA）単位／ml、メリーラ
ンド所定のFlow Laboratories）に37℃で１時間
暴露することにより、誘発工程を実施した。次い
で、室温で遠心処理することにより、細胞からウ
イルスを分離し、細胞を等容量のMEN−４％熱
失活ウシ胎児性血清と1.4％アルギン酸ナトリウ
ムに再懸濁させた。カプセルを既述の如く形成し
たのち、これを血清不含培養基と血清含有培養基
に再懸濁させた。これら試験試料のカプセル外培
養基中で検出されたINF量に有意な差はなかつ
た。また、未カプセル対照培養物におけるINF産
生量も同じであつた。これらの実験結果を下に示
す：

【表】 例 ６ リンパ芽細胞からのINF−α アメリカンタイプカルチヤーコレクシヨン
（American Type Culture Collection）からのナ
マルワ（Namalwa）細胞を慣用培養基中で増殖
させ、また同細胞をマイクロカプセル封入後、10
％熱失活ウシ胎児性血清を補つたRPMI−1460培
養基中で増殖させた。１客の未カプセル細胞懸濁
物、またカプセル封入した細胞懸濁物をINFの誘
発産生処理に付した。培養基には実質上等数の細
胞が含まれた。未カプセル細胞培養基とカプセル
化細胞培養物に、２回蒸留した水中25μｇ/ml濃
度のブロムデオキシウリジンを加えて有糸系裂を
抑制した。37℃で36時間のインキユベーシヨン
後、両細胞培養物を洗浄し、次いで２％熱失活ウ
シ胎児性血清を補つたRPMI−1640培養基に懸濁
させた。 次いで、カプセル化細胞培養物を処理して、そ
のカプセル膜を選択的に破壊した。該カプセルを
生理的食塩水で３回洗浄し、1.1％のCaCl₂を含む
1000単位／mlヘパリン溶液中37℃で10分間インキ
ユベートしたのち、食塩水で再洗浄した。洗浄せ
るカプセルを次いで、生理的食塩水中稀くえん酸
ナトリウム溶液とともに37℃で５分間インキユベ
ートした。この時点でカプセル懸濁物を撹拌した
ところ、膜の溶解とナマルワ細胞の解放がもたら
された。次いで、細胞懸濁物を遠心処理して残屑
を除き、くえん酸塩／食塩水で数回洗浄した。 そのあと、両培養物を、1.0×10⁶細胞／mlの密
度で、２％熱失活ウシ胎児性血清と緩衝液（PH
7.4）を補つた新たなRPMI−1640培養基中に懸濁
させた。 在来の培養物と以前カプセル化した培養物に、
羊水中のニユーキヤツスル病ウイルスのバンコフ
スキ（Bankowski）株を加えた。このウイルス
は、1.0×10⁸pfu/mlの濃度であり、カルフオルニ
ア州デイビス所在のポウルトリーヘルスラボラト
リーズ（Poultry Health Laboratories）より購
入した。細胞懸濁物10ml毎にウイルス１mlを加え
た。培養物を37℃で24時間インキユベートした。 次いで、慣用培養物を五つの部分（下記１〜
５）に分け、また以前カプセル化した培養物は四
つの部分（下記６〜９）に分けた。培養物の９ア
リコートを各々、下記処理後INF産生に関して試
験した。 １ 処理せず ２ ２％の熱失活ウシ胎児性血清を含むRPMI−
1640に再懸濁 ３ 血清不含RPMI−1640に再懸濁 ４ RPMI−1640培養基と５％熱失活ウシ胎児性
血清と一緒にカプセル化し、生成せしめるカプ
セルを血清不含培養基中に懸濁 ５ RPMI−1640培養基と５％熱失活ウシ胎児血
清と一緒にカプセル化し、得られたカプセル
を、２％ウシ胎児性血清を含む培養基中に懸濁 ６ 血清不含培養基に再懸濁 ７ ２％熱失活ウシ胎児性血清を含む培養基に再
懸濁 ８ 培養基＋５％熱失活ウシ胎児性血清と一緒に
再カプセル化し、得られたカプセルを血清不含
培養基に懸濁 ９ 培養基＋５％熱失活ウシ胎児性血清と一緒に
再カプセル化し、得られたカプセルを培養基＋
２％血清中に懸濁 細胞培養物１〜９各々におけるINF−α１単位
を産生するのに必要な細胞量を次第に示す： １ 30 ６ 40 ２ 45 ７ 40 ３ − ８ 1000360 ４ 680 ９ 200100 ５ 2000 他の具体化も、前掲特許請求の範囲内で実施さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の概念を例示する略図であ
り、第２図は例４に記載の実験結果を示すグラフ
である。第１図中主要な部分を表わす符号の説明
は以下の通りである： １０：細胞、１２：カプセル膜、１４：培養
基、１６：孔、１８：高分子量の要素又は血清成
分、２０：細胞に必要な成分、２２′：興味ある
物質、２２：代謝生成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生きている細胞によつて産生されるインター
   フエロンおよびモノクローナル抗体から選択され
   る物質を製造する方法であつて、 Ａ 該細胞を、選択された透過度上限を有する膜
   の中に封入、カプセル化し、 Ｂ 該カプセル化させる細胞を水性培養基に懸濁
   させ、 Ｃ 該細胞にインビトロ代謝を行わせ且つ前記物
   質を分泌させ、 Ｄ 該物質を前記水性培養基から或は前記膜の中
   より前記物質を収得する 諸工程からなる方法。 ２ カプセル化工程(A)が、水不溶性の塩結合せる
   マトリツクスを生成すべく重合体鎖上のカチオン
   基と水溶性ゴム上のアニオン基とを反応させて膜
   を形成することにより遂行される特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ カプセル化工程(A)が、 (1) 細胞を、該細胞と生理学上相容し得しかも複
   数のアニオン部分を有する水溶性ゴムを含有す
   る水性培養基中に懸濁させ、 (2) 該懸濁物を、細胞を含む小滴に形成し、 (3) この小滴を、生理学上相容しうる多価カチオ
   ンの溶液にさらして、該小滴を、ばらばらな或
   は離散した、水に不溶の保形性一時カプセルと
   してゲル化し、 (4) この一時カプセルを、前記アニオン部分と反
   応しうる複数のカチオン基を有する重合体にさ
   らすことにより該カプセルの表面層を架橋して
   前記小滴周囲に半透膜を生成する、 諸工程によつて遂行される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４ 工程(4)で形成された膜の中のゲルを再溶解さ
   せる追加工程を含む特許請求の範囲第３項記載の
   方法。 ５ 物質が、選択された透過度上限よりも小さい
   分子量を有し、而して該物質を、膜を介して水性
   培養基中に拡散させ、そしてこの物質を該培養基
   から得する工程を含む特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ６ 細胞が、該細胞を維持し且つ物質のインビト
   ロ生合成を許容するのに十分な完全細胞培養基と
   一緒にカプセル化される特許請求の範囲第１項又
   は５項記載の方法。 ７ 工程(B)で用いられる水性培養基が、細胞を維
   持し且つ物質のインビトロ生合成を許容するのに
   十分な完全細胞培養基である特許請求の範囲第１
   項又は５項記載の方法。 ８ 物質のインビトロ生合成を許容するために、
   膜の透過度上限よりも大きな分子量を有する成分
   を細胞が必要とし、而して細胞と一緒に該成分を
   カプセル化する追加工程を含む特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 ９ 細胞が哺乳類の細胞である特許請求の範囲第
   １項又は５項記載の方法。 １０ カプセル内で細胞に有糸分裂を行わせる追
   加工程を含む特許請求の範囲第１項又は５項記載
   の方法。 １１ 細胞が、遺伝子操作された細胞である特許
   請求の範囲第１項又は５項記載の方法。 １２ カプセル化工程(A)において、約0.5mm以下
   の径を有する球状マイクロカプセルが形成される
   特許請求の範囲第１項又は５項記載の方法。 １３ 物質がインターフエロンである特許請求の
   範囲第１項又は第５項の方法。 １４ 物質がモノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第１項又は第５項の方法。 １５ 工程(A)でカプセル化される細胞が、物質の
   産生を保持するために膜の透過度上限よりも大き
   な分子量を有する成分との接触を必要とし、而し
   て工程(A)では、この成分を細胞と一緒にカプセル
   化し、工程(B)で用いられる水性培養基には該成分
   が実質的にない、特許請求の範囲第１項又は第５
   項記載の方法。 １６ 選択された透過度上限が約1.5×10⁵ダルト
   ンである特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７ 細胞がハイブリドーマ細胞よりなり、物質
   が、選択された透過度上限よりも大きな分子量を
   有するモノクローン抗体よりなり、該抗体が膜内
   から収得される特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １８ カプセル化せる生存性細胞を水性培養基中
   に懸濁させたものよりなる、生きた細胞の培養系
   であつて、 前記カプセル化した生存性細胞が該細胞により
   必要とされる栄養の通り抜けないし貫通を許容す
   るのに十分な透過度上限によつて特徴づけられる
   膜と、この膜内に封入されたしかも、該膜の透過
   度上限よりも寸法の大きな細胞の生存能力を保持
   するのに必要な成分(A)全てを含む培養基中に配分
   懸濁された前記生存性細胞とからなり、また 前記水性培養基が、前記膜の透過度上限よりも
   小さな分子量を有する細胞の生存能力を保持する
   のに必要な成分(B)全てを含む、培養系。 １９ 成分(A)が血清成分よりなる特許請求の範囲
   第１８項記載の系。 ２０ 細胞が哺乳類の細胞よりなる特許請求の範
   囲第１８項記載の系。 ２１ 細胞が微生物よりなる特許請求の範囲第１
   ８項記載の系。 ２２ 細胞が、遺伝子操作された細胞よりなる特
   許請求の範囲第１８項記載の系。 ２３ 細胞がハイブリドーマ細胞よりなる特許請
   求の範囲第１８項記載の系。 ２４ 細胞がインターフエロンを分泌することの
   できる細胞よりなる特許請求の範囲第１８項の
   系。 ２５ 細胞がモノクローナル抗体を分泌すること
   のできる細胞よりなる特許請求の範囲第１８項の
   系。 ２６ 膜が、多孔質マトリツクスを構成すべく、
   複数のカチオン部分を有する重合体と複数のアニ
   オン部分を有する重合体ゴムとを結合させたもの
   よりなる特許請求の範囲第１８項記載の系。