JPS6339231B2 - - Google Patents
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- JPS6339231B2 JPS6339231B2 JP54086544A JP8654479A JPS6339231B2 JP S6339231 B2 JPS6339231 B2 JP S6339231B2 JP 54086544 A JP54086544 A JP 54086544A JP 8654479 A JP8654479 A JP 8654479A JP S6339231 B2 JPS6339231 B2 JP S6339231B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nutrient solution
- methanol
- amount
- alcohol oxidase
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/93—Hansenula
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はハンゼヌラ・ポリモルフア
（Hansenula polymorpha）なる名称の通性メタ
ノール資化性酵母を、無機栄養物、ビタミン類並
びに炭素源及びエネルギー源としてのメタノール
を含む栄養溶液中に存在せしめ、連続的に更に栄
養溶液を添加し、この際酵母細胞を含み反応容器
中に存在せしめた4.0ないし6.0のPH価を示す栄養
溶液を25ないし45℃の反応温度に保持せしめ、こ
れに空気又は空気及び酸素の混合物を通気せし
め、生成した培養培地から細胞物質、即ち細胞物
質中に含まれるアルコールオキシダーゼを、添加
した栄養溶液の量に相当する量で採取することに
よるアルコールオキシダーゼを微生物学的に製造
する方法に関する。
（Hansenula polymorpha）なる名称の通性メタ
ノール資化性酵母を、無機栄養物、ビタミン類並
びに炭素源及びエネルギー源としてのメタノール
を含む栄養溶液中に存在せしめ、連続的に更に栄
養溶液を添加し、この際酵母細胞を含み反応容器
中に存在せしめた4.0ないし6.0のPH価を示す栄養
溶液を25ないし45℃の反応温度に保持せしめ、こ
れに空気又は空気及び酸素の混合物を通気せし
め、生成した培養培地から細胞物質、即ち細胞物
質中に含まれるアルコールオキシダーゼを、添加
した栄養溶液の量に相当する量で採取することに
よるアルコールオキシダーゼを微生物学的に製造
する方法に関する。
酵素アルコールオキシダーゼは下記反応を接触
する： CH3OH＋O2→HCHO＋H2O2 従つてこの酵素はメタノールからフオルムアル
デヒド並びに過酸化水素を得るために使用され
る。更にこの酵素はアルコール類のメタノール、
エタノール、Ｎ―プロパノール及びＮ―ブタノー
ルの分析上の測定のために使用することが出来、
この場合、測定装置として例えば酵素電極が使用
される。
する： CH3OH＋O2→HCHO＋H2O2 従つてこの酵素はメタノールからフオルムアル
デヒド並びに過酸化水素を得るために使用され
る。更にこの酵素はアルコール類のメタノール、
エタノール、Ｎ―プロパノール及びＮ―ブタノー
ルの分析上の測定のために使用することが出来、
この場合、測定装置として例えば酵素電極が使用
される。
カンデイダ、ハンゼヌラ、ピヒア及びトルロプ
シス等の菌株のようなメタノール中で使用される
酵母は、メタノールでの生長に際してフラビン―
アデノーシン―ジヌクレオチド（FAD）を含有
するアルコールオキシダーゼが誘導され、これは
物質代謝中メタノールのフオルムアルデヒドへの
酸化を接触する。
シス等の菌株のようなメタノール中で使用される
酵母は、メタノールでの生長に際してフラビン―
アデノーシン―ジヌクレオチド（FAD）を含有
するアルコールオキシダーゼが誘導され、これは
物質代謝中メタノールのフオルムアルデヒドへの
酸化を接触する。
更に酵素アルコールオキシダーゼを得るために
酵母カンデイダ・ボイデイニ（Candida boidini）
及びハンゼヌラ・ポリモルフア（Hansenula
polymorpha）が使用されることは知られてい
る。この際、酵母カンデイダ・ボイデイニは炭素
―エネルギー源としてのメタノール及びビタミン
類のビオチン及びチアミンを含有する無機塩類培
地で回分的に培養される。しかしこの方法は効果
が極めて低い。従つて、更に高度の細胞密度を得
るために、細胞の生長の期間中培地に更にメタノ
ールを添加することが行なわれている〔これにつ
いてはエム・ロイス（M.Reuβ）等による
“Chemie―Ingenieur―Tech―nik，46，669
（1974年）”参照〕。このようにして採取した酵母
細胞の破壊により、１mgの蛋白質当り0.3ないし
1.0酵素単位の粗製抽出物中のアルコールオキシ
ダーゼの比活性が得られた。
酵母カンデイダ・ボイデイニ（Candida boidini）
及びハンゼヌラ・ポリモルフア（Hansenula
polymorpha）が使用されることは知られてい
る。この際、酵母カンデイダ・ボイデイニは炭素
―エネルギー源としてのメタノール及びビタミン
類のビオチン及びチアミンを含有する無機塩類培
地で回分的に培養される。しかしこの方法は効果
が極めて低い。従つて、更に高度の細胞密度を得
るために、細胞の生長の期間中培地に更にメタノ
ールを添加することが行なわれている〔これにつ
いてはエム・ロイス（M.Reuβ）等による
“Chemie―Ingenieur―Tech―nik，46，669
（1974年）”参照〕。このようにして採取した酵母
細胞の破壊により、１mgの蛋白質当り0.3ないし
1.0酵素単位の粗製抽出物中のアルコールオキシ
ダーゼの比活性が得られた。
メタノール資化性酵母ハンゼヌラ・ポリモルフ
アからのアルコールオキシダーゼの生成に際して
は、培養培地に、メタノール、ビタミン類のビオ
チン及びチアミンを含む栄養溶液が連続的供給の
もとに加えられる。アルコールオキシダーゼの量
は、この公知の方法に於ては炭素エネルギー源の
メタノールによる生育限界に際して及び0.16h-1
〔これは容積×容積-1×時間-1（Vol×Vol-1×h-1）
に相当する〕の生育速度に際して全蛋白質の約７
％に達するが、これは2.5ないし3.0酵素単位／mg
蛋白質の粗抽出物中の比活性に相当する。同じ培
養条件のもとに於ける0.03h-1の生育速度に於て、
アルコールオキシダーゼの量は、全蛋白質に基ず
き約20％であるので、粗抽出物中の比活性は10な
いし11酵素単位／mg蛋白質に達する〔ジエー・ピ
ー・デイーケン（J.P.Dijken）“Arch.
Microbiol.111，137、1976年”参照〕。
アからのアルコールオキシダーゼの生成に際して
は、培養培地に、メタノール、ビタミン類のビオ
チン及びチアミンを含む栄養溶液が連続的供給の
もとに加えられる。アルコールオキシダーゼの量
は、この公知の方法に於ては炭素エネルギー源の
メタノールによる生育限界に際して及び0.16h-1
〔これは容積×容積-1×時間-1（Vol×Vol-1×h-1）
に相当する〕の生育速度に際して全蛋白質の約７
％に達するが、これは2.5ないし3.0酵素単位／mg
蛋白質の粗抽出物中の比活性に相当する。同じ培
養条件のもとに於ける0.03h-1の生育速度に於て、
アルコールオキシダーゼの量は、全蛋白質に基ず
き約20％であるので、粗抽出物中の比活性は10な
いし11酵素単位／mg蛋白質に達する〔ジエー・ピ
ー・デイーケン（J.P.Dijken）“Arch.
Microbiol.111，137、1976年”参照〕。
酵母細胞の破壊の後、その精製に必要とする酵
素の分離は慣用のようにカラムクロマトグラフイ
ー及び酵素沈澱を以て行なう。
素の分離は慣用のようにカラムクロマトグラフイ
ー及び酵素沈澱を以て行なう。
本発明の課題は、ハンゼヌラ・ポリモルフア酵
母を使用する公知方法から出発して、この公知方
法より形成された蛋白質当りのアルコールオキシ
ダーゼの更に高度の収率が可能であるようなアル
コールオキシダーゼの製造方法を達成することに
ある。
母を使用する公知方法から出発して、この公知方
法より形成された蛋白質当りのアルコールオキシ
ダーゼの更に高度の収率が可能であるようなアル
コールオキシダーゼの製造方法を達成することに
ある。
本発明の基礎とする課題は、本発明に従つて、
追加的に炭素源及びエネルギー源としての、グリ
セリン又はキシロースのようなアルコールオキシ
ダーゼに対して異化抑止作用を有しない基質の少
なくとも１種類を0.1ないし1.0％の濃度で含む栄
養溶液を0.03ないし0.15h-1の流動速度で添加する
ことによつて解決される。
追加的に炭素源及びエネルギー源としての、グリ
セリン又はキシロースのようなアルコールオキシ
ダーゼに対して異化抑止作用を有しない基質の少
なくとも１種類を0.1ないし1.0％の濃度で含む栄
養溶液を0.03ないし0.15h-1の流動速度で添加する
ことによつて解決される。
従つて栄養溶液にはグリセリン又はキシロース
のような基質が添加されるが、これらはアルコー
ルオキシダーゼに対して異化抑止の作用を行なわ
ない。これに対して酵母について生育基質として
使用される一般の有機炭素化合物が問題となる。
選択した基質が異化抑止作用を有するか否かを確
定するためには簡単な試験法により、即ち試験す
べき基質をメタノールと一緒に栄養溶液に添加
し、これに酵母ハンゼヌラ・ポリモルフアを接種
し、酵母を２日間生育せしめ、次いで生成された
酵母についてその酵素活性を試験する。この簡単
な試験で、選択した基質について、希望する性質
を有する基質として適当なものであるかどうかの
解答が得られる。
のような基質が添加されるが、これらはアルコー
ルオキシダーゼに対して異化抑止の作用を行なわ
ない。これに対して酵母について生育基質として
使用される一般の有機炭素化合物が問題となる。
選択した基質が異化抑止作用を有するか否かを確
定するためには簡単な試験法により、即ち試験す
べき基質をメタノールと一緒に栄養溶液に添加
し、これに酵母ハンゼヌラ・ポリモルフアを接種
し、酵母を２日間生育せしめ、次いで生成された
酵母についてその酵素活性を試験する。この簡単
な試験で、選択した基質について、希望する性質
を有する基質として適当なものであるかどうかの
解答が得られる。
化学平衡条件のもとに行なわれる連続的方法を
実施している間に、培養培地から取り出した細胞
物質は、次いで公知方法により破壊し、そして酵
素アルコールオキシダーゼを単離する。
実施している間に、培養培地から取り出した細胞
物質は、次いで公知方法により破壊し、そして酵
素アルコールオキシダーゼを単離する。
本発明に従いメタノール及びアルコールオキシ
ダーゼに対して異化抑止作用を有しない基質の少
なくとも１種類よりなる混合基質を使用すること
により、驚異的にも本質的に更に高度の酵素単位
に到達することが達成される。この際、本発明に
従つた方法を実施することにより、従来公知の方
法で培養された細胞よりも更に高度のアルコール
オキシダーゼ活性を含む細胞が生成される。この
際、燐酸塩、硝酸塩又はカリウムを細胞の生育に
限界を与える仕込量で含む栄養溶液を使用するの
が有利であることが判明した。この方法による変
法ではアルコールオキシダーゼの更に高度の収率
が達成される。
ダーゼに対して異化抑止作用を有しない基質の少
なくとも１種類よりなる混合基質を使用すること
により、驚異的にも本質的に更に高度の酵素単位
に到達することが達成される。この際、本発明に
従つた方法を実施することにより、従来公知の方
法で培養された細胞よりも更に高度のアルコール
オキシダーゼ活性を含む細胞が生成される。この
際、燐酸塩、硝酸塩又はカリウムを細胞の生育に
限界を与える仕込量で含む栄養溶液を使用するの
が有利であることが判明した。この方法による変
法ではアルコールオキシダーゼの更に高度の収率
が達成される。
例 １
実動容積７を有する12容器中に下記組成を
有する栄養溶液を仕込む： ５ｇ／ キシローズ ４ｇ／ メタノール 0.047ｇ／ KH2PO4 0.013ｇ／ NaH2PO4 0.125ｇ／ Na2SO4 0.4ｇ／ K2SO4 0.5ｇ／ （NH4）2SO4 2.5ｇ／ NH4Cl 0.05ｇ／ MgSO4・7H2O 0.7ｇ／ NaCl 0.5mg／ H3BO3 0.04mg／ CuSO4・SH2O 0.1mg／ KJ 0.2mg／ FeCl3・6H2O 0.4mg／ MnSO4・H2O 0.4mg／ ZnSO4・7H2O 0.2mg／ （NH4）MO7O24・4H2O 0.05mg／ ビオチン 1.0mg／ チアミン 栄養溶液のPH価は5.0であり、 溶液の温度は約37℃である。
有する栄養溶液を仕込む： ５ｇ／ キシローズ ４ｇ／ メタノール 0.047ｇ／ KH2PO4 0.013ｇ／ NaH2PO4 0.125ｇ／ Na2SO4 0.4ｇ／ K2SO4 0.5ｇ／ （NH4）2SO4 2.5ｇ／ NH4Cl 0.05ｇ／ MgSO4・7H2O 0.7ｇ／ NaCl 0.5mg／ H3BO3 0.04mg／ CuSO4・SH2O 0.1mg／ KJ 0.2mg／ FeCl3・6H2O 0.4mg／ MnSO4・H2O 0.4mg／ ZnSO4・7H2O 0.2mg／ （NH4）MO7O24・4H2O 0.05mg／ ビオチン 1.0mg／ チアミン 栄養溶液のPH価は5.0であり、 溶液の温度は約37℃である。
この栄養溶液は1vvm（１／分・１反応容積）
の割合で空気を通じ、1000rpmの回転数で機械的
に撹拌する。反応容器中に存在する栄養溶液では
菌株番号CBS4732の酵母ハンゼヌラ・ポリモル
フアが培養される。
の割合で空気を通じ、1000rpmの回転数で機械的
に撹拌する。反応容器中に存在する栄養溶液では
菌株番号CBS4732の酵母ハンゼヌラ・ポリモル
フアが培養される。
反応容器中で行なわれる酵母培養では、次いで
上記組成を有する栄養溶液が0.05h-1の流動速度
で供給され、そして反応培地からは相当する量の
細胞物質が採取される。
上記組成を有する栄養溶液が0.05h-1の流動速度
で供給され、そして反応培地からは相当する量の
細胞物質が採取される。
この方法に於ては培地１当り約30000アルコ
ールオキシダーゼ単位を採取することが出来、こ
れは細胞物質に基ずき約28単位／mg蛋白質に相当
する。
ールオキシダーゼ単位を採取することが出来、こ
れは細胞物質に基ずき約28単位／mg蛋白質に相当
する。
例 ２
例１に記載したと殆んど同じであるが、5.0
ｇ／のキシロースの代りに５ｇ／のグリセリ
ンを含む栄養溶液を使用して例１に記載したと同
様に培養培地を形成せしめた。
ｇ／のキシロースの代りに５ｇ／のグリセリ
ンを含む栄養溶液を使用して例１に記載したと同
様に培養培地を形成せしめた。
この方法に於ては、培地１当り約25000アル
コールオキシダーゼ単位が得られたが、これは約
22単位／mg蛋白質に相当する。
コールオキシダーゼ単位が得られたが、これは約
22単位／mg蛋白質に相当する。
ここにハンゼヌラ・ポリモルフアを連続的に培
養することによつて酵素アルコールオキシダーゼ
を製造する方法を記述した。この際、炭素源とし
てグリセリン／メタノールまたはキシローズ／メ
タノールの混合基質を使用し、生育制限は燐酸塩
により行なつた。このようにして得られた添加基
質に基ずく酵素の収率は、炭素源としてメタノー
ルのみを使用した従来法よりも著るしく高い収率
であつた。
養することによつて酵素アルコールオキシダーゼ
を製造する方法を記述した。この際、炭素源とし
てグリセリン／メタノールまたはキシローズ／メ
タノールの混合基質を使用し、生育制限は燐酸塩
により行なつた。このようにして得られた添加基
質に基ずく酵素の収率は、炭素源としてメタノー
ルのみを使用した従来法よりも著るしく高い収率
であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ハンゼヌラ・ポリモルフアなる名称の通性メ
タノール資化性酵母を、無機栄養物、ビタミン類
並びに炭素源及びエネルギー源としてのメタノー
ルを含む栄養溶液中に存在せしめ、連続的に更に
栄養溶液を添加し、この際酵母細胞を含み反応容
器中に存在せしめた4.0ないし6.0のPH価を示す栄
養溶液を25ないし45℃の反応温度に保持せしめ、
これに空気又は空気―酸素混合物を通気し、ここ
に形成された培養培地から細胞物質、従つて細胞
物質中に含まれるアルコールオキシダーゼを、添
加された栄養溶液の量に相当する量で採取するア
ルコールオキシダーゼを微生物学的に製造する方
法において、追加的に炭素源及びエネルギー源と
してグリセリン又はキシロースを、0.1ないし1.0
％の濃度で含む栄養溶液を0.03ないし0.15h-1の流
動速度で添加することを特徴とするアルコールオ
キシダーゼの微生物学的製法。 ２ 栄養溶液は燐酸塩、硫酸塩又はカリウムを細
胞の生育に限界を与える仕込量で含む特許請求の
範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2830327A DE2830327C3 (de) | 1978-07-10 | 1978-07-10 | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Alkoholoxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5519094A JPS5519094A (en) | 1980-02-09 |
| JPS6339231B2 true JPS6339231B2 (ja) | 1988-08-04 |
Family
ID=6044028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8654479A Granted JPS5519094A (en) | 1978-07-10 | 1979-07-10 | Microbiological production of alcoholoxidase |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4250261A (ja) |
| JP (1) | JPS5519094A (ja) |
| DE (1) | DE2830327C3 (ja) |
| SE (1) | SE434164B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4540668A (en) * | 1979-06-05 | 1985-09-10 | Phillips Petroleum Company | Alcohol oxidase from Pichia-type yeasts |
| US4430427A (en) | 1980-11-04 | 1984-02-07 | Phillips Petroleum Company | Red absorbing combination of alcohol oxidase and an azide compound |
| US4421668A (en) * | 1981-07-07 | 1983-12-20 | Lever Brothers Company | Bleach composition |
| US4414334A (en) * | 1981-08-07 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Oxygen scavenging with enzymes |
| US4485016A (en) * | 1983-05-13 | 1984-11-27 | Phillips Petroleum Company | Enzymatic removal of aromatic hydroxy compounds and aromatic amines from waste waters |
| US4642286A (en) * | 1984-05-07 | 1987-02-10 | Moldowan Mervin J | Composition and method for ethanol determination |
| US4810633A (en) * | 1984-06-04 | 1989-03-07 | Miles Inc. | Enzymatic ethanol test |
| EP0242007B1 (en) * | 1986-11-24 | 1990-11-07 | Unilever N.V. | Process for preparing a catalase-free oxidase and a catalase-free oxidase-containing yeast, and use thereof |
| US4871669A (en) * | 1988-06-27 | 1989-10-03 | Canadian Patents & Development Limited | Production of natural flavor aldehydes from natural source primary alcohols C2 -C7 |
| DE68922550D1 (de) * | 1988-08-30 | 1995-06-14 | New Oji Paper Co Ltd | Alkohol-oxidase Enzymelektrode und Verfahren zur Bestimmung von Alkoholeinhalt. |
| US4956290A (en) * | 1989-03-27 | 1990-09-11 | Phillips Petroleum Company | Large scale process for the purification of alcohol oxidase |
| US5204261A (en) * | 1991-04-24 | 1993-04-20 | Phillips Petroleum Company | Catalase-negative pichia pastoris |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4168201A (en) * | 1977-08-29 | 1979-09-18 | Phillips Petroleum Co. | Method of increasing yeast yield |
-
1978
- 1978-07-10 DE DE2830327A patent/DE2830327C3/de not_active Expired
-
1979
- 1979-07-06 SE SE7905926A patent/SE434164B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-07-09 US US06/055,533 patent/US4250261A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-07-10 JP JP8654479A patent/JPS5519094A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5519094A (en) | 1980-02-09 |
| DE2830327C3 (de) | 1980-12-04 |
| SE434164B (sv) | 1984-07-09 |
| DE2830327B1 (de) | 1980-03-27 |
| SE7905926L (sv) | 1980-01-11 |
| DE2830327A1 (de) | 1980-01-24 |
| US4250261A (en) | 1981-02-10 |
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