JPS6339873B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ビリルビンはヘモグロビンの減成生成物であ
る。 毎日６〜７ｇのヘモグロビンが損傷あるいは老
化した赤血球から生じていると考えられている。
肝臓、脾臓、骨髄内で急速に破壊されるこのよう
なヘモグロビンのプールから、正常な成人におい
て１日あたりほぼ200〜230mgのビリルビン及びそ
の誘導体が生成される。次いで正常な人間の代謝
の一部として、このような日々生成するビリルビ
ンの大部分が排泄されたり他の誘導体に変化した
りする。 しかしながらある場合には、過度の溶血現象に
より、或いは例えば肝臓不全によるビリルビンの
停滞のため、ビリルビンが過度に生成されること
によつて人体内にビリルビンが過大量生じること
がある。 ビリルビンが人体内に過度に生じる結果は、い
ずれの場合でも黄疽である。この広範囲にわたる
病変状態は、血清ビリルビン値の著しい上昇を特
徴とする。この値は、例えば正常な成人の場合に
おいて血清１デシリツトルあたりビリルビンが
0.1〜約１ミリグラムの範囲であるのに対し、血
清１デシリツトルあたりたとえばビリルビンが10
ミリグラムあるいはそれ以上である。また殆んど
の場合、皮膚、鞏膜、或いは粘膜が褐色を帯びた
黄色に変る。更に血液中にビリルビンが過大量生
ずることによつて、生体内のビリルビン濃度が増
大するという望ましくない現象を生じ、そして
種々の細胞学的反応を妨害すること示す証拠が多
数提出されている。例えば、ビリルビンは、細胞
に活力を与えるエネルギーを生ずる多くの酵素反
応の強力な抑制因子として広く知られている。こ
のような背景を考えるならば、肝臓その他の関連
する器官の機能の試験におけるビリルビンの臨床
学的重要性は自明である。 ビリルビン分析方法に関する文献は多数存在す
る。種々のビリルビン測定技法の多くを概括的に
みた好適な文献としては、“臨床化学―原理と技
術（Clinical Chemistry―Principles and
Technics）”、R.J.Henry、D.C.Cannon、及びJ.
W.Winkelman編、Harper and Row
Publishers社、第２版、1042〜1079ページ、1974
年、が挙げられる。ビリルビン測定に関する別の
文献としては“臨床化学の基礎（Fundamentals
of Clinical Chemistry）”、N.W.Tietz編、W.B.
Saunders社、743〜762ページ、1970年、がある。
ビリルビン分析に関するもつとも広く採用されて
いる分析手順は、おそらくいわゆるジアゾ法と呼
ばれるものであろう。 ジアゾ法は、ビリルビンをジアゾニウム塩、例
えばジアゾスルフアニリル酸とカツプリング反応
させて、ビリルビンそれ自体（黄色である）より
も高い吸光率を有する色素を生成する方法であ
る。典型的には、ビリルビン分析のためのジアゾ
反応手順は二つの活動相を含む。第一はいわゆる
“直接反応”であつて、着色が極めて急速に行わ
れる。次は、“間接反応”であつて、この相にお
いては着色はメタノール添加後になつてはじめて
行われる。上述した文献、特にWinkelman等の
文献に要約されているように、これら二つの活動
相が具体的に何を意味するかについて、業界では
若干の混乱がある。ある人々は上記直接反応は結
合されていないか又は遊離しているビリルビンの
量であり、一方間接反応はアルブミンと結合して
いるビリルビンの量であると考えている。他の
人々は、直接反応は共役ビリルビンを測定するも
のであり、一方間接反応はビリルビンの非共役形
を測定する方法であると考えている。 ビリルビン分析のためのジアゾ反応に関する前
記混乱に加え、Winkelman等はジアゾ法批判の
文献のなかで、ジアゾ法には多くの変法がありそ
してジアゾ反応それ自体が複雑であることから、
得られる分析結果がしばしば相違していると結論
している。更に、このようなジアゾ測定法は、測
定直前に混合せねばならないいくつかの異なる試
薬を用いる必要があるため一般的にかなり長時間
を要し、また、ジアゾ化に応答する他の成分が血
清及びその他の体液中に存在するために正確を期
し難い。 ビリルビン分析のための前記ジアゾ分析法及び
その変法のほか、種々のビリルビン分析法が提案
され、採用されている。なかでも、ビリルビンに
固有のモル吸光率を利用した、種々の間接的な、
ビリルビンの分光測光（即ち比色測定）分析法が
挙げられる。即ち、遊離のビリルビンは435nmで
測定した場合約５×10⁴のモル吸光率を有する黄
色顔料である。しかしながら、ビリルビンのモル
吸光率は種々の直接的な分光測光溶液方法に有用
であるのに十分高いけれども、“乾式化学”分析
試験要素、例えば1976年11月16日に発行された米
国特許第3992158号においてPryzbylowicz及び
Millikanにより開示された型の分析要素、を用
いてビリルビンの良好な定量分析を行うことがで
きるほどに十分高くはない。かくして今日の直接
的なビリルビンの分光測光分析法は一般的には、
溶液分析法に限定されており、特に、正確な場合
には定量的な結果が望まれる。更に、種々のビリ
ルビン分析法を概括している前記文献（前記
Winkelman等の文献参照）からわかるように、
ビリルビンの直接的分光測光分析法は、414、540
及び576nmで吸収ピークを示すヘモグロビンの存
在によりスペクトル妨害を受ける。更に、人間の
血清のようなビリルビン含有体液中に存在する他
の材料も、このような直接的分光測光分析法を行
う場合には、スペクトル妨害を引き起こすことが
ある。例えば、カロテノイドはビリルビン分析を
妨害する。これは、カロテノイド主成分の一つで
あるβ―カロテンが約450nmで吸収ピークを示
し、これはビリルビンの吸収ピークに極めて近い
スペクトル領域内であるからである。 直接的分光測光分析法を用いた場合のビリルビ
ンの前記スペクトル妨害に加えて、このような方
法は、アルブミンのような人間の血清の他の蛋白
質物質の存在による妨害も受けることがあること
が見い出された。ビリルビンはこのような他の蛋
白質物質に結合することができそしてこのような
結合の結果、ビリルビンの吸収強度及び吸収ピー
クのシフトが起りうる特に前記問題の故に、当業
者は実質的にビリルビンの前記ジアゾ分析法、も
しくは前記直接的分光測光法の種々の変法に頼ら
なければならなかつた。例えば米国特許第
3569721号においては、ビリルビンの直接的分光
測光分析測定法が開示されているが、この方法で
は、要約すると流体試料をビリルビンの最大吸収
波長、及びヘモグロビンのみが吸収ピークを示す
ことが知られている第二波長で測定することによ
り、ヘモグロビンのスペクトル妨害は除去される
と主張している。この方法では、次に液体試料中
に存在する測定されるべきヘモグロビン量に等し
い量でビリルビン濃度の吸収ピークを調整しなけ
ればならない。 ビリルビン分析のために用いられてきた更に別
の方法は、トリクロロ酢酸或いは有機スルホン酸
等の有機酸もしくはその塩、及び第二鉄イオンを
含有する、ビリルビンの試薬組成物の使用に関す
る。この方法では、ビリルビンは第二鉄イオンの
存在下において有機酸もしくはその塩により酸化
されて反応生成物、例えばビリベルジン又はコレ
シアニンを生じ、このような反応生成物は、もと
もと存在していたビリルビンの量に関連する強度
の特徴的な青もしくは青緑色を示す。このような
ビリルビン分析方法は、例えば米国特許第
3348920号、米国特許第3607093号、及びベルギー
国特許第816927号に記載されている。 しかしながらこの方法もまた、ジアゾ分析法及
び直接的な分光測光分析法に関する前述の数多く
の欠点をもつている。例えば、有機酸もしくは酸
塩を第二鉄イオンと共に使用するこの分析法を用
いる場合は、酸とビリルビンとの反応を完成させ
るために約10分間までの時間を要し、次いで最終
生成物を最初の反応媒質から分離し、それにより
最終生成物が分光測法により分析されるようにす
るためには更に時間を要する。更にこの試験もま
た、ヘモグロビン、種々のカロテノイド等のよう
な青のスペクトル域で最大吸収を示す種々のスペ
クトル妨害物の作用をうける。 本発明に従つて、水性液体試験試料と、１個も
しくはそれ以上のビリルビンの結合サイトを有す
るビリルビンの反応性媒染剤組成物とを接触させ
てなる前記水性液体中のビリルビンを測定する為
の直接的な比色方法が提供される。この反応性媒
染剤組成物は、疎水性マトリツクス、及び少くと
も１個の荷電性カチオン基を含む。液体試験試料
中に含まれるビリルビンと前記反応性媒染剤組成
物との反応の結果、ビリルビンは触染され、即ち
反応性媒染剤組成物と結合し、その結果ビリルビ
ンの吸収ピークが少なくとも約10nmシフトし、
またビリルビンのモル吸光率が少なくとも50％増
加（新しい吸収ピークで測定）する。本発明のあ
る特に有用な態様に従つて、好ましくは、媒染さ
れたビリルビンの吸収ピークは460nmの波長もし
くはそれ以上にシフトし、そして媒染ビリルビン
のモル吸光率は7.5×10⁴もしくはそれ以上の値に
増加する。 本発明方法は血液、血清、尿等のような体液中
のビリルビンの分析に有用であり、特に血清に有
用である。これは、本発明方法がヘモグロビン、
カロテノイド等のような多くの一般的なビリルビ
ン妨害物の効果を最少化するからである。このこ
とは、媒染ビリルビンのモル吸光率を著しく増大
させることにより一部達成され、そして媒染ビリ
ルビンの吸収ピークをシフトさせることにより一
部達成される。これら両方のスペクトル変化は、
本発明に用いる反応性媒染剤組成物にビリルビン
が結合する結果として生ずる。もちろん、種々の
生体液のビリルビン含量を分析するために、本発
明分析法を用いる場合には、ビリルビンが結合す
ることのできる種々の高分子量蛋白質妨害物、例
えばアルブミンを除去及び解離（ビリルビンか
ら）させ、それにより試験液中に含まれる全ビリ
ルビンの定量分析を行いうるようにすることが望
ましい。それ故本発明の一つの態様に従つて、こ
のようなビリルビン妨害物の分離及び除去のため
に試験液に予備処理を施してもよい。このような
予備処理には、例えば蛋白質沈殿、試料希釈等
の、ビリルビンの高分子量蛋白質妨害物を除去す
るために適用した従来方法が含まれる。 あるいは本発明の特に好ましい態様に従つて、
前記ビリルビン分析を、液体中のビリルビン検出
のための本発明の分析要素を用いて実施する。こ
のような要素は、試薬ゾーン及び拡散ゾーン又は
層からなり、試薬ゾーンは、例えば、ビリルビン
の前記反応性媒染剤組成物を含む層であり、拡散
ゾーン又は層は液体試験試料を試薬ゾーンへ分布
させることができる。所望の場合には、界面活性
剤を拡散ゾーンに組み入れてもよく、その量は、
例えばアルブミンなどの高分子量蛋白質妨害物が
種々の量で存在しているとしても、ビリルビンが
この拡散ゾーンを経て正常に輸送されるのに有効
な量である。分析されるべき特定液体試料にビリ
ルビンの実質的にすべての蛋白質妨害物の除去の
ための独立した予備処理（たとえば蛋白質沈殿又
は試料希釈等）を最初に施すならば、前記試薬ゾ
ーンを含む要素の使用のみに基づく、本発明に従
つたビリルビンの分析要素を考案することができ
る。 本発明の別の態様に従つて、ビリルビン分析の
ための前記分析要素の試薬ゾーンは、分子量が約
60000あるいはそれ以上であるアルブミン及び他
の蛋白質のようなビリルビンの高分子量蛋白質妨
害物に不浸透性であつて、このような物質からの
妨害を更に減少させるのが好ましい。 本発明の別の態様に従つて、本発明の要素は、
拡散ゾーン及び試薬ゾーンが、それぞれ、“輻射
線透過性“支持体のような適当な支持体上に載置
された拡散層及び試薬層である。 本明細書で使用される“輻射線透過性”なる語
は、要素中に生ずる分析結果（検知可能変化）の
検出に使用される電磁輻射線を有効に通過可能
な、分析要素のゾーン及び支持体を意味する。こ
のような透過は、約300nm〜700nmの範囲内の波
長の電磁輻射線の透過を含む。本発明のこの態様
に従つて、別個の中間層を所望により試薬層と支
持体との間に、或いは拡散層と試薬層との間に組
み入れてもよい。このような中間層は例えば、分
析する水性液体試料から種々のありうる妨害物を
除去するために、更に試薬を含んでいてもよい。
また所望の場合にはこのような中間層は、液体試
料の本発明の多層試験要素を通る輸送を高めるた
め親水性材料を含んでいてもよい。 本発明に従つて、本明細書記載の分析要素の
種々のそれぞれのゾーンは、少なくとも使用条件
下において相互に流体接触する。このような流体
接触とは、分析要素の重ねあわされているか又は
隣接しているゾーン相互間を液体が通過する能力
に関係する。別のいいかたをすると、流体接触
は、流体接触するゾーン相互の間を液体成分が通
過する能力をさす。流体接触するゾーンは隣接し
ていてもよいけれども、介在するゾーンにより分
離することもできる。しかしながら相互に流体接
触するゾーンに物理的に介在する要素のゾーンも
前記ゾーンと流体接触し、そしてこのようなゾー
ン間の流体の通過を妨げない。ゾーン間の流体接
触は、もともと隣接しているか、又は流体通過の
為に有効に流体接触するゾーンを有する要素を調
製することにより達成することができる。或い
は、もともと隣接しておらずそして例えば米国特
許第3511608号に記載されているようなそう入紙、
又は米国特許第3917453号及び同第3933594号に記
載されているような弾性のある吸収剤材料もしく
は変形可能な支持体を使用することにより更に離
れて位置させることのできるゾーンを有する要素
を調製することが適当な場合もある。もちろんの
ことであるが、要素が最初は接触していないゾー
ンを有する場合は、要素使用時にゾーンが流体接
触するように、圧縮力を加えるか或いは他の適当
な手段を適用して分析結果を得ることが必要であ
る。 本明細書及び特許請求の範囲で使用されている
“浸透性”なる語は、液体中に運搬される材料、
即ち液体中に溶解もしくは分散により分布する材
料が物質もしくはゾーンを有効に通り抜ける能力
をいう。 操作にあたつては、本発明の好ましい分析要素
は液体試料を受容することができ、液体試料はビ
リルビンが存在する場合には、試薬層中の反応性
媒染剤組成物と反応して遊離のビリルビンの吸収
ピークより少なくとも約10nmシフトし、また遊
離のビリルビンのモル吸光率より約7.5×10⁴多い
値に増加させる（シフトした吸収ピークで測定）。
本明細書において使用される遊離ビリルビンは、
血清蛋白質と結合していない共役もしくは非共役
ビリルビンを含むと定義される。遊離ビリルビン
は典型的には、約435〜約440nmの範囲の波長で
吸収ピークを示し、22℃及び約7.4のPHの水溶液
で測定した場合約５×10⁴のモル吸光率（E_n）を
示す。特にことわらない限りこの明細書記載のす
べてのモル吸光率値は、約22℃、約7.4のPHの水
性媒質中で測定した値である。 拡散ゾーンが要素中に含まれる場合、適用試料
は通常試薬ゾーンに入る前にこの拡散ゾーンを通
過し、ビリルビンは拡散ゾーン中に分布されて試
薬ゾーンに面する拡散ゾーンの表面において見掛
上均一な濃度となる。要素へ適用する広範囲の試
料体積にわたつてこのような見掛濃度を得ること
が可能である。拡散ゾーンと試薬ゾーンとの間の
流体接触により、そして拡散ゾーン内に拡散した
ビリルビンに対する試薬ゾーンの好ましい均一な
浸透性により、均一に分布した成分が拡散ゾーン
から試薬ゾーンに提供され、どの段階でも、試薬
ゾーンにおいて実質的にビリルビンの見掛け濃度
に重要な変化をおこすことなく試薬ゾーンに浸入
することができる。試薬ゾーンにおける反応性媒
染剤組成物の存在により、また拡散ゾーンから試
薬ゾーンに提供するビリルビンの均一な見掛け濃
度により、要素中に均一な定量的に検出可能な変
化を生成することができる。このような変化は輻
射線方法により定量的に検出可能であり、そして
所望の場合には光度計のような自動輻射感応装置
により検出することができる。 本発明のビリルビン分析法は、好ましくは“乾
式化学”を採用しそして拡散ゾーンを含む前記分
析要素を用いて実施される。これは、これら分析
要素がおどろくべきことにはビリルビン分析にお
ける極めてありふれた妨害物を効果的に除去する
ことがわかつたからである。この要素はカロテノ
イドやヘモグロビンからの妨害を除くばかりでな
く、塩化ナトリウム或いは所定液体試験試料中に
含まれている全蛋白質に対する妨害を殆んど又は
全く示さない。 しかしながら、本発明方法は種々の“湿式化
学”分析法又は溶液分析法を用いることによつて
も好都合に実施することができる。この場合には
適当な液体媒質に組み入れられたビリルビンの反
応性媒染剤組成物が、ビリルビンを含む液体試料
と接触する。“湿式化学”分析又は溶液分析を用
いる場合、ビリルビン含有液体試験試料に予備処
理工程を施してビリルビンの高分子量蛋白質妨害
物を除去することが好ましい。これは、前記分離
法のいずれかを用いて好都合に実施することがで
きる。 本発明以前に、本明細書に記載されている分析
要素のあるものといくらか似通つた構成の、媒染
剤を含む種々の多層一体型分析要素が製造されて
いるか又は提案されている。このような分析要素
は、例えば、ベルギー国特許第831660号に記載さ
れている。この特許はしかしながらビリルビンの
検出あるいは試験を目的とする特定の試薬材料を
含む要素を記載したものではない。更に、媒染剤
が、これら要素が検出しようとしている選定した
被検体以外の材料を媒染する為に組み込まれてい
る。これと対照的に本明細書記載の一体型分析要
素は、試薬ゾーン又は試薬層中に、ビリルビン検
出の為の反応性媒染剤組成物が組み入れられてい
る。 添附の図面における第１図及び第２図はそれぞ
れ本発明の分析要素を示す好ましい態様の拡大断
面図を示す。第３図は、本発明の好ましい多層分
析要素においてビリルビンの濃度レベルを様々に
変化させた場合の分光測光応答を示すグラフであ
る。 以上に述べたように本発明の本質的特徴は、ビ
リルビンの１個もしくはそれ以上の結合サイトを
有する反応性媒染剤組成物を用いることである。
媒染剤組成物は、疎水性有機マトリツクス及び少
くとも１個の荷電性カチオン基を含む。本発明に
従つて、前記性質及び組成を有する材料がビリル
ビンと結合し、そしてそれ故前記性質を有する材
料はビリルビンの媒染剤として働くことが見い出
された。しかしながら、このような材料はビリル
ビンの媒染剤の役割を果たすだけでなく、更に、
このような組成とビリルビンとの反応の際、ビリ
ルビンは反応性組成物の結合サイトによつて媒染
され、その結果媒染されたビリルビンにおいて遊
離のビリルビンと比較した場合、スペクトル特性
において著しい変化が生じることが見い出され
た。詳しくは、遊離ビリルビンの吸収ピークと比
較して媒染ビリルビンによつて示される吸収ピー
クに著しいシフトが生じると共に、遊離ビリルビ
ンに比して媒染ビリルビンによつて示されるモル
吸光率に実質的な増加が生じる。 本発明のある好ましい態様に従つて、種々の写
真フイルム、紙及びその他の分野に従来より使用
されており、そして荷電性カチオン基を含むモノ
マー反復単量単位を有する組成物を含んでなり、
そして疎水性を付与する有機基を同じか又はその
他のモノマー単位上に有しているポリマー媒染剤
は、ビリルビンに対する特に有効な反応性媒染剤
組成物を提供することが見い出された。勿論、前
記性質及び化学的組成を有するが、写真技術の面
において有用な写真媒染剤とは従来考えなれてい
なかつた他のポリマー材料もまた、本発明の範囲
内において使用することができる。 本発明に用いることができる特に有用なポリマ
ー反応性媒染剤組成物は、ポリマー鎖中に下記式
のモノマー単位を有する材料を含む。 （式中、Ａは有機基を示し、そしてポリマー主鎖
の一部を構成し、ＱはMをＡに結合する化学結
合もしくは化学基を示し、Mは陽イオン基であ
つて好ましくは第四アンモニウムもしくはホスホ
ニウム基を示し、そしてXはハライドイオン、
例えばクロリド又はブロミド、ニトレート、メト
サルフエート、ｐ―トルエンスルホネートのよう
な酸アニオンを示す。） 本発明のある特に好ましい態様に従つて、M
は以下の式又はで表わされる第四アンモニウ
ム又はホスホニウム基を示す。 （式中、R¹、R²及びR³はそれぞれ同一であつて
も異つていてもよく、炭素数が５以上20未満のア
リールもしくはアラルキル基を示すか、又は炭素
数が１以上10未満のアルキル基を示す。 好ましくは、式におけるＱは炭化水素基を示
し、好ましくはアリーレン、アリーレンアルキレ
ン、アルキレンアリーレン、アリーレンビスアル
キレン、もしくはアルキレンビスアリーレン基で
ある。典型的には、必ずしも絶対的ではないけれ
どもＱは約５〜約10個の炭素原子を含む。 もちろんのことであるが前記式におけるＡ
は、使用される特定のポリマー主鎖に依存して変
りうる。しかしながら特に良好な結果はＡがアル
キレン基である時に得られた。典型的にはこのよ
うなアルキレン基は２〜約10個の炭素原子を含
む。好ましい範囲は炭素原子数が２〜４個であ
る。 本発明に有用であることが見い出されたポリマ
ー反応性媒染剤組成物はホモポリマーもしくはコ
ポリマーであつてよく、コポリマーが特に有用で
あることが見い出された。このようなコポリマー
の代表例の一部には、前記式の反復単位と更に
非妨害性モノマーの残渣を含む約75重量％までの
別の反復単位を含むポリマー反応性媒染剤組成物
が含まれる。本発明において用いられる“非妨害
性反復単位”なる語には、ビリルビンの前記媒染
を化学的もしくは物理的に妨害しない化学単位が
含まれる。このような非妨害性反復単位を提供
し、そして得られる媒染ポリマーに疎水性を付与
するモノマー前駆体としては、オレフイン、置換
オレフイン、スチレン及び置換スチレンのような
脂肪族及び芳香族炭化水素；アルキルアクリレー
ト及びメタクリレート及びそれらの誘導体；この
ようなモノマー前駆体の公知の均等物が挙げられ
る。更に、所望なら、本発明に有用なポリマー反
応性媒染剤組成物を架橋し、それによつて個々の
ポリマー鎖を例えばジビニルベンゼン、エチレン
ジメタクリレートのような二官能性架橋基、並び
に同等であつて種々のその他の公知の二官能性架
橋基により共有結合により架橋することができ
る。典型的にはこのような二官能性架橋基が存在
している場合には、これら架橋基を、このような
架橋ポリマーを調製するために使用するモノマー
の共重合可能ブレンド中に存在するモノマーの全
重量の約５重量％までの範囲、好ましくは約0.1
〜約２重量％の範囲で本発明のポリマー反応性媒
染剤組成物中に含有させる。典型的には本発明に
おいて反応性媒染剤組成物として有用な代表的な
コポリマーは、(イ)前記式で表わされる反復単位
のモノマー前駆体約25〜90重量％、(ロ)非妨害性反
復単位のモノマー前駆体約10〜約75重量％、及び
(ハ)存在する場合には二官能性架橋剤０〜約５重量
％を含むモノマーブレンドから共重合される。 本発明に使用されるある好ましい反応性媒染剤
組成物をポリマー材料として前述したけれども、
このほかにも、必要な疎水性及びビリルビンを媒
染する為のカチオン基を備えた非ポリマー材料を
使用できることももちろんのことである。本発明
において“乾式化学”を利用する分析要素中にこ
のような非ポリマー媒染剤材料が使用される場合
には、このような非ポリマー媒染剤組成物は要素
の試薬ゾーン内で材料を固定できるように十分高
い分子量を有するか又は固定できるような分子構
成をもつことが好ましい。 本発明に係るビリルビンの代表的な反応性ポリ
マー媒染剤組成物の一部として以下の材料が挙げ
られる。

【表】

【表】

【表】 本発明に有用な反応性媒染剤組成物は、写真技
術の分野で同一もしくは同様の材料の使用に関連
して広く記載されているよく知られた化学反応方
法により調製することができる。従つて本発明に
使用する種々の媒染剤材料の調製に関して詳しく
述べることは不要である。しかしながらこのよう
な材料の調製について特に詳細が望される場合に
は、下記特許を参照することができる。即ち英国
特許第1261925号；米国第3488706号；同第
3557066号；同第3625694号；同第3709690号；同
第3770439号；同第3758445号；同第3773509号；
同第3859096号；同第3898088号；同第3944424
号；及び同第3958995号。 本発明のビリルビン分析に必要なビリルビン前
記反応性媒染剤組成物の量は可変である。典型的
には、所定の場合、このような反応性媒染剤組成
物の量はビリルビン含量の特定範囲、即ち特定の
ビリルビン分析が有用であるように考案されてい
る“動的範囲（dynamic range）”に依存する。 １モルのビリルビンが１モル等量のビリルビン
の結合サイトを含む材料に結合もしくは媒染され
る本発明の種々の好ましい態様に従つて、十分な
量の反応性媒染剤組成物が必要であり、それによ
り、要素が意図するビリルビンの最大モル数に対
して少なくとも１モル当量の、反応性媒染剤組成
物中に存在するビリルビンの結合サイトが存在す
る。もちろんのことであるが、ビリルビンの反応
性媒染剤組成物がポリマー材料を含む場合には、
必要とされるこのようなポリマー材料の量は、こ
のような材料中に存在する、ビリルビンの結合サ
イトを含む反復単位の平均数、並びに前述のごと
くこのようなポリマー媒染剤を用いる特定のビリ
ルビン分析が有用であると考案されている動的範
囲に依存する。前記ポリマー媒染剤１〜６のいず
れかであるようなポリマー媒染剤材料が使用さ
れ、そしてこのようなポリマー媒染剤が固有粘度
約0.15〜約1.0（0.25ｇ/dlの濃度のベンゼン中で25
℃で測定）である、スチレンと塩化ビニルベンジ
ルとの中間体コポリマーから製造する本発明の好
ましい態様に従つて、典型的には約0.1〜50mg/dl
のビリル被検体の動的範囲に対し約0.01〜1.0ｇ/
dlの範囲にあるような媒染剤組成物の量を用い
る。一般に、本発明分析要素の試薬ゾーン中に過
剰量の反応性媒染剤組成物を存在させ、それによ
り媒染剤材料とビリルビンとの反応を促進し、媒
染ビリルビンのスペクトル特性に望ましい変化を
起こすことができることが有用であることが見い
出された。 既に述べたように本発明方法は溶液分析とし
て、或いは例えば本発明の一体型分析要素を用い
た“乾式化学”の使用により本発明の好ましい態
様に従つて実施することができる。 本発明方法を溶液分析として実施する時には、
先ず、非妨害性液体媒質に溶解もしくは分散させ
た前述の適当な反応性媒染剤組成物を輻射線透過
性容器のような適当な“湿式”反応ゾーン中に調
製することにより分析を実施する。このような非
妨害性液体には、使用条件下において、ビリルビ
ンと媒染剤組成物との反応を実質的に妨害しない
か又は、遊離及び媒染ビリルビンの吸収ピークを
実質的に妨害しない液体材料が含まれる。このよ
うな非妨害性液体には種々の水性及び有機液体の
両方が含まれる。典型的には、本発明方法が体液
の分析に適用されるため、反応ゾーン中に使用さ
れる非妨害性液体として、水などの水性液体或い
は種々の同様の極性有機溶媒、例えば低級アルキ
ルアルカノール等を選ぶことが有利である。所望
の場合には、特定の反応性組成物に依存して、反
応性組成物に加えて反応ゾーン中に更に種々の緩
衝物質を含有させることが有利である。 一般に、本発明に係る“湿式化学”法により実
施されるビリルビン分析は、温度約15〜約60℃、
好ましくは約22〜約50℃において、約6.8〜約9.5
のPH範囲を有する緩衝水性液体を用いて実施する
場合に有利な結果が得られることが見い出され
た。勿論選んだ特定の反応性組成物に依存して、
試薬ゾーンの前記PH及び温度を前記範囲よりも上
或いは下に変えることができるが、ビリルビン或
いは反応性媒染剤組成物に不望の副反応或いは著
しい減成をもたらすようなPH値或いは温度は採用
できないことはいうまでもない。更に、本発明方
法を溶液分析として実施する場合には、ビリルビ
ンの光による減成を防止するため分析を暗所か或
いは黄色安全光の条件下で行うことが望ましい。 本発明方法を“湿式”ビリルビン分析法により
実施する場合、前述のごとく、先ずビリルビンを
その結合している種々物質から解離するため、ビ
リルビン含有液体試験試料に予備処理を施すこと
が望ましい。例えば液体試験試料が血清である場
合、血清中の多量のビリルビンが同じく血清中に
存在するアルブミン結合していることが知られて
いる。例えばアルブミンのような物質からビリル
ビンを解離するため種々の方法が考案されてお
り、そしてこのような方法は本発明に従つた予備
処理工程として用いることができ、それにより血
清試料中に含まれる全ビリルビンを正確に測定す
るための分析が行われるようにする。ビリルビン
を種々の血清蛋白質、特にアルブミンから解離す
るこのような公知方法としては、種々の蛋白質沈
殿法、試料希釈法等がある。多くのこれら種々の
方法についての概括的なレビユーは、例えば先述
のWinkelman等による刊行物、即ちClinical
Chemistry―Principles and Technics、第二版、
1974年刊、1042乃至1079ページ、に見られる。 以上に述べたように、本発明のビリルビン分析
法は溶液及びいわゆる“乾式”化学分析法の両方
に適応される。取り扱いが容易であり、定量分析
結果を得ることができ、そしてその他全体的に便
利であるため、ビリルビンの“乾式”分析のため
の第１図及び２図に図示した本発明の分析要素を
用いることが特に好ましい。第１図に示すような
要素は、前記反応性媒染剤組成物を含有する実質
上乾式の試薬ゾーン７を含む。この分析要素には
実質的に乾式の拡散ゾーン６又は更に中間層も存
在することができ、その結果本発明の好ましい分
析要素は、典型別には使用条件下において相互に
流体接触する少なくとも二つの別個のゾーンを含
む。好ましくは、本発明の要素中には、種々のゾ
ーンが重ねあわされた、隣接した層の形で存在す
る。典型的にはこれら層は支持体８、好ましくは
輻射線透過性支持体上に被覆されている。しかし
ながら、本発明の好ましい分析要素は重ねあわさ
れた、隣接する層からなるけれども、異なる構造
配置を有する他の要素も本発明に従つて製造でき
ることも当然のことである。これは例えば第２図
に示した要素であつて、二つの隣接して並置した
ゾーン、即ち拡散ゾーン６と試薬ゾーン７が必要
な場合或いは好ましい場合には支持体８上に支持
されている構成である。便宜のためまた本発明の
最もよい態様を説明するため、以下の文において
は、本発明の要素を、種々のゾーンが輻射線透過
性支持体上に支持される重ねあわされた連続層と
して存在する多層一体型分析要素に見られる構造
及び特徴により記載する。 本発明の一体型要素は、典型的には、拡散層と
試薬層とを含み、両層とも好ましくは輻射線透過
性である。このような要素は好ましくは輻射線透
過性である支持体上の層を有することができる
が、両層が適当な耐久性及び完全性を示す場合に
は、支持体は必要でない。 一つの好ましい態様においては、本発明の一体
型分析要素は、(1)少なくともビリルビンに浸透性
であり、そして前記のような、ビリルビンの反応
性媒染剤組成物を含む試薬層と、(2)ビリルビンに
浸透性である拡散層とを載置した輻射線透過性支
持体を含む。試薬層は支持体と拡散層との間には
さむ。また拡散層はビリルビンに対して実質的に
均一に浸透性であることが好ましい。試薬層はビ
リルビンよりも実質的に大きい分子量を有する蛋
白質物質、例えばアルブミン及び分子量が60000
（ダルトン単位）もしくはこれより大きいその他
の蛋白質物質に対して、実質的に不浸透性である
のが好ましい。 本発明の別の態様に従つて、試薬層及び拡散層
を載置した支持体を有する一体型分析要素が提供
され、前記拡散層は非繊維性であり、そして望ま
しくは等方的に多孔性である。この態様の一面に
おいては、要素の定量分析性を高めるためすべて
の層が非繊維性であることが好ましい。この明細
書で用いる“非繊維性”なる語は層又は材料に関
して用い、このような層又は材料が繊維性物質を
含まないか又は実質的に含んでいないこと、即
ち、このような層又は材料が、前述の試料拡散を
妨害しないか又は輻射線分析手段による分析結果
の検出を妨害しない程度にしか繊維性成分を含ん
でいないことを示す。 拡散層と協働して使用する場合、本発明の要素
の試薬層はビリルビンには均一に浸透性である
が、高分子量蛋白質物質に対しては実質的に不浸
透性でかつ非多孔性であることが望ましい。本明
細書で使用する浸透性なる語は、多孔性であるこ
とから生じる浸透性、膨潤性又はその他の特徴を
含む。試薬層は、反応性媒染剤組成物が分布、即
ち溶解又は分散するマトリツクスを含んでもよ
い。しかしながら本発明においてしばしばそうで
あるように、反応性媒染剤組成物がポリマー状で
ありそしてそれ自体フイルム形成性であるか或い
は均一層又はゾーンとして容易に被覆されうるよ
うな場合には、更にこのようなマトリツクス材料
は必要でない。もちろんマトリツクス材料の選択
は、それが分布する反応性媒染剤組成物の成分に
依存する。どの場合もマトリツクス材料は媒染剤
組成物に対して“非妨害性”でなければならな
い。即ちマトリツクス材料はそれ自体反応性媒染
剤組成物に結合又は媒染しえないものでなければ
ならない。拡散層と協働する試薬層の望ましいマ
トリツクス材料は非繊維性で非妨害性親水性材料
を含まなければならない。このような材料には、
約9.1の等電点を有する加水分解ゼラチン（例え
ば粗ゲル）及びその誘導体、親水性セルロース誘
導体、多糖類例えばデキストラン、アラビアゴ
ム、アガロース等、並びに合成物質例えばポリ
（ビニルアルコール）及びポリ（ビニルピロリド
ン）のような水溶性ポリビニル化合物、アクリル
アミドポリマー等が挙げられる。非妨害性親油性
材料、例えばセルロースエステル等もまた有用で
ありえる。多孔性でない場合には、試薬層の浸透
性を高めるために、分析下の液体の溶媒又は分散
媒質中で膨潤性であるマトリツクス材料を使用す
ることがしばしば有用である。また、要素製造に
際しては例えば被覆手段による隣接層の適用と両
立しうる材料を選ぶことも必要である。例えば別
個の隣接した層の形成が望まれ、そして目的とす
る分析が水性液体についてである場合は、試薬層
には実質的に水溶性のマトリツクスを、拡散層の
ような隣接層には実質的に有機溶媒可溶性もしく
は有機溶媒分散性の成分を選ぶことが適当であ
る。このようにして、相互の溶媒作用が最少にさ
れ、そして、明瞭に境界のある層構造体を形成す
ることができる。多くの場合、高分子量の蛋白質
物質（潜在的なビリルビン妨害物）が試薬層中に
拡散するのを防止するために、拡散層それ自体よ
りも試薬層の浸透性が低いことが望ましい。この
ことは、試薬層の有効な孔径を小さくすることに
よつて容易に達成することができる。相対的な浸
透性或いは孔径はよく知られた方法により決定す
ることができる。 試薬層中には、ビリルビンの反応性媒染剤組成
物が分布される。反応性組成物は、これを用いて
いる場合にはマトリツクス材料に溶解又は分散さ
せることによつて分布させることができる。均一
な分布がしばしば好ましいけれども、必要という
わけではない。 本明細書記載のビリルビンの反応性媒染剤組成
物を用いた“湿式化学”又は溶液分析の場合に
は、本発明の“乾式化学”分析要素に、適当なPH
緩衝組成物をも含めることができる。緩衝組成物
は要素の使用条件下において、試薬層に、溶液分
析に用いたPHと実質的に等しいPHを付与するの
に、有効な量で本発明の特定分析要素に存在する
試薬層、或いは一つ又はそれ以上の他の層に組み
入れることができる。リン酸塩緩衝剤及びGood
によりBiochemistry第５巻、第467ページ（1966
年）に記載されているような他の緩衝剤を含む
種々の緩衝組成物を使用することができる。 前述のごとく、本発明の一体型要素には拡散層
が含まれる。拡散層は液体試料を受容しうる層で
あつて、この試料は拡散層に直接適用するか又
は、拡散層と流体接触する層もしくは数層から拡
散層へ提供するかのいずれかである。そしてこの
拡散層に試料及びビリルビンの溶媒又は分散媒質
が、要素の試薬層に面する拡散層の表面にビリル
ビンの均一な見掛け濃度が提供されるように分布
する。もちろんのことであるがこのような見掛け
濃度は、拡散層中に或いはその厚さ全体にわたつ
て存在する濃度勾配によつて達成される。このよ
うな勾配は、定量試験結果を得るのになんの困難
を呈することもなく、公知の較正方法を用いて調
節できる。 拡散機構は完全には解明されていないが、拡散
は、液体試料の静水圧、拡散層内の毛管作用、試
料の表面張力、拡散層と流体接触する層の燈心作
用等のような力の組み合わせから生じ、そしてそ
れらに制限されると考えられる。もちろんのこと
であるが、拡散の程度は、拡散さるべき液体の体
積に幾分依存する。しかしながら、拡散により得
られる均一な見掛け濃度は実質的に液体試料体積
に依存せず、そして拡散の種々の程度により得ら
れることを強調せねばならない。その結果、本発
明の要素は正確な試料適用技術を必要としない。
しかしながら、好ましい拡散時間等の理由により
特定の液体試料体積が望ましい。本発明の要素は
拡散層の好都合な寸法領域内（例えば一平方セン
チ）に完全に採取されうる非常に小体積の試料を
用いることによつて定量的結果を生成しうるの
で、液体試料を適用した後要素から過剰の水分を
除去する必要はない。更に、拡散が拡散層で生
じ、そして拡散物質が、流体接触している試薬層
に明らかに実質的に側面の静水圧を生じることな
く提供されるため、先行技術の分析要素にしばし
ばみられる“輪形成”問題が生じない。 拡散層は、これと流体接触する試薬層に面する
表面の単位面積あたりに拡散物質の均一な見掛け
濃度を生ぜしめることのみが必要であり、そして
拡散目的のために特定の層が適当であるうるかど
うか決定することは極めて好都合である。見掛け
濃度のこのような均一性は、デンシトメトリーヌ
はその他の分析法により決定でき、そして所望な
ら、この性質のための特殊な試験が前記米国特許
第3992158号に詳細に記載されている。 有用な拡散層は、好ましくは等方的に多孔性の
層である。等方的に多孔性なる語は、本明細書に
おいては、拡散層中においてあらゆる方向に向か
つて多孔性を有している状態をいう。このような
多孔性の程度については、例えば孔径、空隙率や
その容積その他によつて異なる。等方的多孔性な
る語についての更に詳しい内容については、前記
米国特許第3992158号に記載されている。 有用な拡散層は種々の成分を用いて調製するこ
とができ、更に詳しくは前記米国特許第3992158
号に記載されている。一つの態様においては、粒
状材料を用いてこのような層を形成することがで
き、このような層においては、等方的な多孔性が
粒子間の相互連絡空隙により創成される。分析下
の試料成分に望ましくは、化学的に不活性である
種々の型の粒状物質が有用である。例えば二酸化
チタン、硫酸バリウム、酸化鉛、酸化亜鉛等の顔
料が望ましい。他の望ましい粒子は、ケイソウ土
や天然もしくは合成のポリマー、例えば微結晶セ
ルロースに由来する微結晶コロイド物質である。
均一サイズの球状粒子、例えば樹脂ビーズ或いは
ガラスビーズもまた使用することもでき、これは
たとえば選択的過目的のために均一な多孔が有
利である場合には特に望ましい。ガラスビーズ等
の場合のように選んだ粒状材料に接着性がない場
合には、接触点で相互に接着することのできる粒
子を得るように処理することができ、それにより
等方的に多孔性の層の形成が容易になる。 このような粒状材料の代りにか、或いはこれに
加えて、等方的に多孔性のポリマー組成物を用い
て拡散層を製造することができる。このようなポ
リマー組成物は、例えば米国特許第3555129号及
び前記米国特許第3992158号に記載されているよ
うなブラツシユ（blushed）ポリマーの製造に有
用な方法を用いて調製することができる。またこ
のような等方的に多孔性のポリマー組成物を調製
するのに有用な他の方法には、米国特許第
2960728号及び同第2946095号に記載されているよ
うな多孔を創成するためのガス又はその他の膨潤
性成分の使用に関する方法、或いは例えば米国特
許第3816575号に論じられているような溶解して
多孔を提供する溶解性固体のポリマー相内におけ
る使用に関する方法が挙げられる。本発明に使用
する等方的多孔性ブラツシユポリマー拡散層を調
製するために、単独或いは組合わせて多くの異な
るポリマーを用いることができる。その、典型的
な例としては、ポリカーボネート、ポリアミド、
ポリウレタン及びセルロースエステル例えば酢酸
セルロースが挙げられる。種々の微孔質フイルタ
ーはブラツシユポリマー組成物であるか、その一
部がブラツシユポリマー組成物であり、例えばミ
リポア社より市販されている種々の膜フイルター
が挙げられ、これらは米国特許第2783894号及び
同第2772322号に記載されている。 拡散層の厚さは色々にすることができるが、そ
の厚さは幾分目的とする試料体積に依存し、この
体積は簡便さ及び清潔の観点から拡散層が吸収し
うる体積でなければならず、また層に吸収されう
る試料量にも影響する層の空隙体積に依存する。
乾燥厚が約50ミクロンから約300ミクロンの範囲
である拡散層は特に有用である。しかしながら、
この範囲外の厚さであつても許容することがで
き、そして特定の要素にとつては望ましいことが
ある。 等方的に多孔性の拡散層を調製する時、空隙体
積が層全体の体積の少なくとも約25％を占めるこ
とが有用であり、そして50〜95％の空隙体積が望
ましい。多孔性拡散層の空隙体積を種々に変える
ことにより要素の特徴、例えば拡散層の全体的な
浸透性、又は試料の拡散に必要な時間等を有利に
改質することができる。もちろんのことであるが
層内の空隙体積は、たとえば適当なサイズの粒状
材料を選ぶことによつてか、又は拡散層に等方的
に多孔性のブラツシユポリマーを使用する場合溶
媒或いは乾燥条件を色々に変えることにより制御
することができる。拡散層の空隙体積並びに空隙
体積の計算方法については、米国特許第3992158
号に更に詳しく記載されている。 本発明の一体型分析要素を調製するにあたつて
は、層のそれぞれは別々の層として予め形成し、
その後使用する前に積層するか、或いは要素使用
時に流体接触させるまで別々の層として保持する
ことができる。別々の部材として予備形成した層
は、被覆可能である場合、典型的には層が乾燥時
に物理的に剥離されうる表面に、溶液もしくは分
散液から被覆する。しかしながら隣接層が望まれ
る場合には、何度もの剥離及び積層工程問題を回
避しうる便利な方法は、剥離面又は支持体上に最
初の層を被覆し、次に既に被覆した層上に順次層
を直接被覆してなる。このような被覆は、前記米
国特許第3992158号に詳しく記載されているよう
な種々のよく知られた被覆法により達成すること
ができる。中間層の接着問題は、例えば写真フイ
ルムに使用される下塗材料を極めて薄く適用する
ことを含む表面処理により、有害な影響を受ける
ことなく克服することができる。 被覆することができる試薬層のために、マトリ
ツクス材料を含む被覆溶液或いは分散液をその一
つが必要な場合に用いそして反応性媒染剤組成物
を調製することができる。前記溶液或いは分散液
は前述のごとく被覆し、乾燥して寸法的に安定な
層を形成する。試薬層の厚さ及びその浸透性の程
度は広い範囲にわたつて変えることができ、そし
てこれは実際の使用に依存する。ある場合にはも
つと広い範囲にわたつた厚さが有利であることも
あるけれども約10ミクロン〜約100ミクロンの厚
さが好都合であつた。繊維性試薬層は、よく知ら
れた方法に従つて繊維性マトリツクスを含浸させ
るにより形成することができる。 前述のごとく、本発明の分析要素は自己支持性
であつてもよくまた支持体に支持されていてもよ
い。有用な支持体材料には様々のポリマー材料が
含まれ、例えば酢酸セルロース、ポリ（エチレン
テレフタレート）、ポリカーボネート、及びポリ
スチレンのようなポリビニル化合物等があげられ
る。特定要素に対して選んだ支持体は結果検出の
目的とする様式に支障にならないものでなければ
ならない。好ましい支持体は約300mm〜約700mmの
領域の波長を有する電磁輻射線を透過する輻射線
透過性支持体が含まれる。一つ又はそれ以上の狭
い波長バンドを透過し隣りあう波長バンドを通さ
ない支持体を有することも望ましい。このこと
は、たとえば適当な吸収特性を有する一つ又はそ
れ以上の着色剤を支持体に含浸させるか又は被覆
することにより達成しうる。 本発明の要素の特定層の成分及び層構成は色々
に変えることができる。前述のごとく拡散層の孔
サイズは、層が望ましくない試料成分を去でき
るように選ぶことができる。前記望ましくない試
料成分は例えばビリルビンよりも高分子量の蛋白
質であつて、例えば分析置換反応或いは要素中に
生成する試験結果の検出を妨害するような物質で
ある。全血液分析のためには、１〜約５ミクロン
の孔サイズを有する多孔性層が、典型的には約７
〜約30ミクロンのサイズを有する血球をスクリー
ニングするために特に有用である。所望の場合に
は、要素にそれぞれ拡散能及び過能が異なる多
数の拡散層を含めることができる。 アニオン性及び非イオン性界面活性剤材料のよ
うな一つ又はそれ以上の界面活性剤材料を要素の
層に組み入れることは有利でありえる。このよう
にすることにより層調製物の被覆力を向上するこ
とができ、そして界面活性剤のような助けがなけ
れば液体試料により容易にぬれない拡散層におけ
る拡散の程度及び速度を高めることができる。特
に比較的大量の非イオン性界面活性剤のような界
面活性剤を本発明の要素の拡散層に組み入れ、水
性蛋白質含有液体試料に含まれるビリルビンの、
要素の拡散層内及びこの層を通つての輸送を正常
化することが望ましい。このような正常化とは、
このような試料間における蛋白質濃度のバラつき
にもかかわらず、適用される水性蛋白質含有液体
試料中に含まれる溶媒媒質及びビリルビンが拡散
層内に等しく浸透することを言う。更に、ビリル
ビンがしばしば結合状態、例えば血清アルブミン
などの他の蛋白質に結合している場合、本発明の
全ビリルビン分析をする場合には、ビリルビンの
輸送を正常化するための前記のような界面活性剤
の使用によつて、前記のような蛋白質に結合され
ているビリルビンが解離することが有利にも明ら
かである。正常なビリルビンの輸送を行うために
有用な界面活性剤の好ましい量は、典型的には層
の乾燥重量の約１〜約15重量％である。 本発明の分析要素は臨床化学の分野に用いるこ
とができるばかりでなく、化学研究所及び化学方
法制御研究所においても利用することができる。
本発明の分析要素は体液、例えば血液、血清、尿
の臨床試験に用いるのに十分適している。これは
このような試験においては大量の反復試験が頻繁
に行なわれ、そして試料を採取した後非常に短時
間の間に試験結果が必要なことが多いからであ
る。本発明の分析要素を用いて血液を分析する場
合、血球は先ず遠心分離などの手段により血清か
ら分離し、そして血清を分析要素に適用する。し
かしながら、例えば反射分光測光分析法を用いて
媒染ビリルビンの定量分析又はその他の分析を行
う場合には、このような分離を行うことは必要で
はない。全血液を要素へ直接適用することがで
き、そして血球は、過層として働く独立した中
間層（輻射線遮断層でもありえる）の作用により
試薬層から去及び排除される。要素上にこれら
血球が存在しても、反射法により分光測光分析が
実施される場合は、その分析を妨害することはな
い。反射法の場合には、光は支持体及び検出記録
層（registration layer）を通り、輻射線遮断層
又は他の反射層から反射され、検出輻射線は血球
を遮らない。本明細書記載の一体型分析要素の特
に重要な利点は、血清又は全血液いずれをも分析
する為に使用されるこれらの能力である。 既に述べたように本発明の要素は、好ましくは
試薬層と支持体との間にはさまれた輻射線遮断層
を含む。輻射線遮断層は、たとえば検出に用いる
波長における電磁輻射線の通過を妨害する働きを
する。このような層は、吸光度、反射簿の性質に
より、層に組み入れられた時輻射線妨害効果を提
供する乳白剤を含む。一つの態様において、輻射
線遮断層は、炭素のような顔料又は、二酸化チタ
ン、酸化亜鉛、硫酸バリウム等の金属塩のような
無機顔料のような乳白剤を有するマトリツクスを
含むことができる。その性質上一般に反射性であ
るブラツシユポリマーは乳白剤を含んでおり、そ
して拡散層において有用であるようなブラツシユ
ポリマーはまた輻射線遮断層としても使用するこ
とができる。 一つの好ましい態様においてはブラツシユポリ
マー拡散層は拡散又は反射を向上させるため、本
明細書中の別の箇所に記載した高い反射性を有す
る顔料のような反射性無機顔料を組み入れること
ができる。一層中にブラツシユポリマーと共に含
めうる顔料の量は広い範囲で色々であつてよく、
ブラツシユポリマーの重量の５〜約1000重量％の
量が好ましく、また顔料濃度はブラツシユポリマ
ーの約100〜約600重量％であるのが非常に好まし
い。 本発明の一体型分析要素における任意の輻射線
遮断層の使用に加えて、所望により任意に他の中
間層を組み入れてもよい。例えば、分析下の液体
試料の溶媒又は分散媒質中で膨潤性の、別個の中
間層を使用することができる。好ましくは輻射線
透過性であるこのような膨潤性の中間層、たとえ
ば膨潤性ケンレ層は試薬層と支持体との間にはさ
むことができ、そして要素の拡散層から試薬層へ
のビリルビン含有血清試料の浸透或いは拡散速度
の向上に用いることができる。別の例として、中
間層を本発明の分析要素の拡散層と試薬層の間に
組み入れることができる。このような層は勿論ビ
リルビンに浸透性でなければならず、そしてビリ
ルビンの種々の妨害物質を不活性にしうるか、又
は過する為に用い、このような不活性化又は
過により妨害物質を除きうる試薬材料を組み入れ
る為に使用することができる。更に別の例とし
て、このような中間層はビリルビンと反応する為
に使用しうる試薬を組み入れるために使用するこ
とができる。例えばグルクロニダーゼ酵素を含有
するゼラチン中間層を拡散層と、反応性媒染剤組
成物を含む層との間に用いることができ、このこ
とによりグルクロニダーゼの酵素作用によつて分
析下の液体試料中の共役ビリルビンはビリルビン
の非共役型に転化される。或いはグルクロニダー
ゼ酵素を本発明の分析要素の拡散層中に組み入
れ、酵素がビリルビンの共役型に対してより直接
的でかつ有効な反応を行うようにしてもよい。 もちろんのことであるが、種々の異なる要素を
本発明に従つて調製することができる。要素は
種々の形状にすることができ、例えば所望幅の長
いテープ、シート或いは小チツプの形にすること
ができる。 本発明の一体型要素は、液体試本を適用するこ
とにより使用する。典型的には、適用試料が試薬
層と接触する前に、試薬層に面しない側の拡散層
表面で拡散層と接触するように要素を形成する。
本発明要素の分析精度が適用試料の体積のバラつ
きによつて実質的な低下することはないので、試
料の適用は手でやつても機械でやつてもよい。し
かしながら分析結果の検出に便利であるよう、試
料体積に適当なコンシステンシーがあるのが望ま
しい。前述のごとく、溶解性反応性組成物を試薬
層に使用する場合輪の形成を最小限にとどめるこ
とも極めて望ましい。 手によつて行うか、或いは自動可されてもよ
い、本発明の一体型要素を用いた典型的な分析操
作において、要素を供給ロール、チツプポケツト
又はその他の供給源から採取し、例えば適当な分
配器からの遊離滴、接触スポツト又は他の形状の
液体試料を受けとるように位置させる。試料適用
後、そして望ましくは拡散層により液体試料が採
取された後、試験結果を得るのを速めるか或いは
容易ならしめるのに望ましい加熱、増湿等のよう
な調湿を要素に施す。自動化操作を用いる場合、
拡散層は数秒間のうちにその機能を果たし、分散
するのに十分な時間が与えられることが望まし
く、このことは吸収剤繊維状紙の場合に見られる
ような殆んど瞬間的な未制御拡散とは対照的であ
る。このことは、例えば層の厚さ、多孔性層の空
隙体積等の種々の要因を適当に選ぶことにより好
都合に達成することができる。 検出可能な変化として分析結果が得られた後、
その結果を通常反射もしくは透過分光測光のため
の適当な装置により測定する。このような装置
は、支持体及び試薬層に光のようなエネルギーの
ビームをあてる働きをする。光はたとえば要素の
拡散層又は輻射線遮断層中の乳白剤から検出手段
へ反射されるか、又は透過検出法の場合には要素
を通過して検出器に達する。好ましい態様におい
ては、分析結果は全くこのような結果の生ずる要
素の帯域内で検出される。要素が透過可能であり
そして試薬層内で生成する検出可能な変化を定量
しうるどのような輻射線も使用できるが、一般に
このような測定には約300〜約700nmの範囲内の
電磁輻射線が有用であることが見い出された。
種々の較正手段を用いて分析をコントロールする
ことができる。一つの例として、被検体標準溶液
試料を、試料滴の存在する場所に隣接して適用
し、その差を測定することができる。 以下の例は本発明を更に詳しく説明するために
掲げる。 例 １ ビリルビンの溶液分析 この例では、液体分析媒質中のビリルビンが前
記特定のある媒染剤の存在下において、自身の
λ_nax（最大吸収ピーク）を435〜440nmから460nm
にシフトし、この新らしい吸収ピークにおいてそ
のモル吸光率が著しく増大することを実証した。
このことを実証するために、吸収スペクトル（37
℃において分光光度計により360〜600nmで測定）
を以下４種（Ａ乃至Ｄ）の液体溶液試料について
記録した。 (A) PH7.4の0.05Mりん酸二水素ナトリウム緩衝
液； (B) PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液に第
１表の媒染剤６を0.012％（重量／容量）含む
もの； (C) PH7.4のりん酸二水素ナトリウム緩衝液に１
mg／dlのビリルビンを含むもの； (D) PH7.4のりん酸二水素ナトリウムに１mg/dlの
ビリルビンと第１表の媒染剤６を0.012％（重
量／容量）含むもの。 得られた吸収スペクトルは次の結果を示した： １ 試験したレベルでは、りん酸塩緩衝液のみ
（溶液Ａ）及び媒染剤６のみ（溶液Ｂ）はいず
れも、このスペクトル帯域において吸収が著し
く変化することはない。 ２ ビリルビンのみ（溶液Ｃ）は、435〜440nm
において最大吸収（λ_nax）を有する。 ３ 第１表の媒染剤６の存在下におけるビリルビ
ンは、λ_naxが460nmにシフトし、新らしいピー
クにおいてその吸収は２倍に増加した。即ち、 E_n460 40×10³→Eⁱ _n460 80×10³ （E_n460はビリルビンのみのモル吸光率を示す） （Eⁱ _n460はビリルビン及び第１表の媒染剤６の
モル吸光率を示す）。 例 ２ 分析要素におけるビリルビンと媒染剤との反応
の適用 本発明の好ましい態様において、一体型分析要
素構造を次のように調製した。 透明なポリエチレンテレフタレートウエブ支持
体を、第１表の媒染剤４（0.54ｇ/m²）のみからな
る試薬層；ポリ（ｎ―イソプロピルアクリルアミ
ド）（0.32ｇ/m²）を含む下塗層；及びTiO₂（45.6
ｇ／m²）、酢酸セルロース（6.45ｇ/m²）、トライト
ンＸ―405（即ちロームアンドハース社より市
販されているオクチルフエノキシポリエトキシエ
タノール2.51ｇ/m²）及びポリエチレングリコー
ルのオレイン酸エーテル（0.64ｇ/m²）を含んで
なるブラツシユポリマー拡散層；により被覆し
た。 次いでこの要素を次に下記の方法で評価した。 ７ｇ/dlの人間の血清アルブミン及び100mMの
食塩を含む一連のビリルビン溶液であつて、ビリ
ルビンの量を溶液１デシリツトルあたり０から20
mgまで変化させたものを、前記被覆要素にスポツ
トした（〜10マイクロリツトルずつ滴下すること
により）。この例の分析要素における反射濃度
ΔD_Rの変化を７分間隔で記録した（37℃において
460nmにおいて測定）。第３図は、試験した０―
20mg/dlのビリルビンに対するこの要素の応答を
示す。 曲線上の各点における垂直なバーによつて示さ
れるようにすぐれた再現性がこの要素から得られ
た。 例 ３ 媒染剤及びゼラチンを用いた分析要素における
ビリルビンと媒染剤との反応の適用 本発明のもう一つの態様において、ウエブ構造
を次のようにして調製した。 透明なポリエチレンテレフタレートウエブ支持
体を、第１表の媒染剤６（2.2ｇ/m²）及びゼラチ
ン（4.1ｇ/m²）を含む試薬層、及び例２で用いた
拡散層と等しい拡散層で被覆した。 次いでこのウエブを例２に記載されたような方
法で評価した。PHが7.4でビリルビンの量を異に
した一連の水性溶液、及びPHが7.4であり７ｇ/dl
のアルブミンを含有しビリルビンの量を異にした
一連の食塩溶液を液体試験試料として用いた。そ
の結果、この例の要素は、広い範囲わたる異なる
ビリルビン濃度に応答する非常に直線的な分光測
光応答を示すことが見い出された。また、この要
素のアルブミンに対する非感受性は、液体試験試
料がアルブミンを含んでいるか否かにかかわりな
く、この要素から得られる結果が良好に一致して
いることによつて実証された。 例 ４ ゲルパツドを用いた分析要素におけるビリルビ
ンと媒染剤との反応 本発明の別の態様において、分析要素構造を次
のようにして調製した。 例２で用いた支持体を、牛の血清アルブミン
（1.1ｇ/m²）及びゼラチン（2.3ｇ/m²）を含むゲ
ルパツド；第１表の媒染剤６（1.1ｇ/m²）及びゼ
ラチン（1.1ｇ/m²）を含む試薬層、及び例２に記
載の拡散層で被覆した。 次いでこのウエブを例２に記載の方法と同様の
方法で評価した。生理食塩水中に７ｇ/dlの人間
の血清アルブミンを含み、ビリルビンのレベルを
色々にした水性溶液（アメリカンモニター社、米
国インデイアナ州、インデイアナポリス）を要素
の較正体として用いた。次に既知の量のビリルビ
ンを含む相異なる組成物からなるいくつかの市販
の人間の血清の代用物を試験するために較正要素
を使用した。この例の要素により測定したビリル
ビン値（ビリルビン濃度が0.5〜20.0mg/dl）は、
人間血清の代用物の製造者により特定された値と
極めてよく一致していた。 例 ５ ヘモグロビンによるスペクトル妨害がないこと すべてではないにしてもほとんどの他の直接的
なビリルビンの分光測光分析は、血清中に20mg/
dl未満の量で存在するヘモグロビンによるスペク
トル妨害をうける。本発明の多層分析要素がヘモ
グロビンによるスペクトル妨害を実質的にうけな
い、ということを実証するために、例３のように
して調製したいくつかの同じ要素を、ビリルビン
１mg/dlもしくは15mg/dlを含み、ヘヨグロビンの
量を０〜150mg/dlの範囲で色々とした液体試験試
料をスポツトし、各要素の460nmにおける反射濃
度、D_Rを測定した。この広い範囲にわたるヘモ
グロビン濃度に対して、要素からの応答には変化
はみられず、従つてヘモグロビンは460nmにおい
て、この分析の妨害物となつていないことが示さ
れた。 例 ６ PH値を色々とした場合の効果 血清のような試料に生ずるPHの変化によりこの
ビリルビン分析が影響を受けないことを示すため
に、０〜20mg/dlの範囲にわたる種々のビリルビ
ン濃度を有する二つの系のビリルビン標準であつ
て、一方はPH7.4でありそして他方はPH8.2であ
り、人間血清アルブミン７ｇ/dl、食塩及び
0.05Mりん酸二水素ナトリウム緩衝液を含む標準
を例２に記載のごとくして調製した分析要素上に
スポツトした。これらの要素を例２に記載の方法
と同様の方法で評価した。得られた結果は、試験
した範囲内において、PH値の変化によつて分析結
果になんら影響がないことを示した。 例 ７ 温度変化の影響 例３に記載した方法で調製した分析要素を使用
して温度変化に対する要素の感受性を試験した。
PH7.4における一連のビリルビン標準を用いた。
27℃においては要素の応答はかなり低かつたが、
37℃と42℃の間では実質的に変化はなかつた。 例 ８ 性質保持 例７記載の一連のビリルビン標準及び分析要素
を用いて、室温（20℃）で１ヵ月にわたつて要素
の安全性を試験した。その結果、特別な水分調整
を行わなくても、室温でこの期間を通じて要素は
極めて安定であることが見い出された。要素は較
正可能であつたばかりでなく、古くなつた要素の
応答は実質的に新しい要素のそれと区別できなか
つた。 例 ９ カロテノイイドの妨害がないこと。 成人の主なカロテイドであるβ―カロテンは
450nmで吸収するため、ビリルビンの直接的分光
測光分析の潜在的妨害物として引用されてきた。
この例においては、７ｇ/dlのアルブミン、１も
しくは20mg/dlのビリルビン、0.02もしくは0.2
mg／dlのβ―カロテンを含有する４通りの生理食
塩液試験溶液に対する本発明の分析要素（例２に
記載の方法により調製）の分光測光応答を記録し
た。このレベル（人間血清の正常なレベル）にお
けるβ―カロテンの存在は、要素になんら証明し
うる効果を与えないことが見い出された。 例 10 この例は、第１表の媒染剤１で媒染した時のビ
リルビンの吸収ピークのシフト及びモル吸光率の
増大を示す。 媒染剤１のメタノール75％及び水25％中の10％
溶液を調製した。 Ａ PH7.4のリン酸二水素ナトリウム緩衝液中の
１mg/dlのビリルビンは435nmにおいて吸収ピ
ークを示した。460nmにおける吸光度は0.571
であつた。 Ｂ PH7.4のリン酸二水素ナトリウム緩衝液１ml
中の50μの媒染剤１は400〜600nmにかけて吸
収ピークを示さなかつた。 460nmにおける吸光度は約0.006であつた。 Ｃ PH7.4のリン酸二水素ナトリウム緩衝液１ml
中の100μの媒染剤１とビリルビン１mg/dlは
455nmにおいてピークを示し、そして吸光度は
0.902であつた。この値は1.58倍高い値である。 例 11 媒染剤１のかわりに第１表の媒染剤２を用いた
以外は例10と同様にして別の実験を行つた。 この場合は吸収ピークは460nmにおいて見ら
れ、そして吸光度は1.95倍高くなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、本発明の分析
要素の好ましい態様の斜視図である。第３図は、
本発明の分析要素においてビリルビンの濃度レベ
ル（人間血清アルブミン―生理食塩水溶液中のビ
リルビンmg/dl―横軸）を色々変えた場合の分光
測光応答（460nmにおける反射濃度―縦軸）を示
すグラフである。 第１図、第２図において、番号６は拡散ゾー
ン、７はビリルビンと反応する媒染剤組成物を含
有する試薬ゾーン、８は支持体である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 使用条件下において流体接触する拡散ゾーン
   と試薬ゾーンとを有する水性液体中のビリルビン
   を比色測定により検出するための要素において、 前記要素は、強く着色した染料もしくは蛍光プ
   ローブ或いはこのような材料の前駆体を含む試薬
   ゾーンを含まぬことを特徴とし、そして更に前記
   試薬ゾーンはビリルビンの反応性媒染剤組成物を
   ふくんでなり、このような反応性媒染剤組成物
   は、 (イ) １個以上のビリルビンの結合サイトを有し、
   そして疎水性有機マトリツクス及び少くとも１
   個の荷電性カチオン基を有する、式 （式中、Ａは有機基を示し、ＱはMをＡに結
   合するための化学結合もしくは化学基を示し、
   Mは第四アンモニウムもしくはホスホニウム
   基を示し、そしてXは酸アニオンを示す）の
   反覆単位を有するポリマー材料を含んで成り、
   そして (ロ) ビリルビンの媒染により遊離のビリルビンの
   吸収ピークから少なくとも10nmシフトする吸
   収ピーク、及び遊離のビリルビンのモル吸光率
   よりも少なくとも50％高いモル吸光率を示す組
   成物であることを特徴とする、水性液体中のビ
   リルビンの比色測定検出用要素。 ２ 輻射線透過性支持体上に支持される試薬層上
   に重ねあわされた拡散層を含む、水性液体中のビ
   リルビンの検出用一体型要素において、 前記要素は、強く着色した染料もしくは蛍光プ
   ローブ材料或いはこのような材料の前駆体を含む
   試薬層を含まず、前記拡散層と試薬層とは使用条
   件下において流体接触し、前記拡散層は、ビリル
   ビンのこの層中の輸送を正常化する為に有効な量
   の界面活性剤を有する等方的に多孔性の非繊維性
   組成物を含み、そして前記試薬層はビリルビンの
   反応性媒染剤組成物を含み、このような反応性組
   成物が、 (イ) ビリルビンの媒染により遊離のビリルビンの
   吸収ピークから少なくとも10nmシフトする吸
   収ピーク、及び遊離のビリルビンのモル吸光率
   よりも少なくとも50％高いモル吸光率を示し、
   そして (ロ) 下記式 （式中Ａはアルキレン基を示し、Ｑは炭素数が
   ５〜10の、窒素原子をＡに結合させる基を有す
   る炭化水素を示し、各R¹、R²及びR³は同一で
   あつても異なつていてもよく、炭素数１以上10
   未満のアルキル、又は炭素数５以上20未満のア
   リールもしくはアラルキル基を示し、そして
   Xは酸アニオンを示す）で表わされる反復単
   位を有するポリマー材料を含むことを特徴とす
   る、水性液体中のビリルビン検出用一体型要
   素。