JPS6344889A - ビオチン合成酵素をコ−ドする遺伝子とその利用 - Google Patents
ビオチン合成酵素をコ−ドする遺伝子とその利用Info
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- JPS6344889A JPS6344889A JP62004404A JP440487A JPS6344889A JP S6344889 A JPS6344889 A JP S6344889A JP 62004404 A JP62004404 A JP 62004404A JP 440487 A JP440487 A JP 440487A JP S6344889 A JPS6344889 A JP S6344889A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はデスチオビオチンからのビオチン生合成反応に
関与する遺伝情報をコードしたデオキシリポ核ＩＩＩ
（ＤＮＡ）及びその利用に関する。更に詳しくは、上記
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組込んだ組換えベクター、該組換え
ベクターを含有する細菌及び該細菌を用いるビオチンの
製造法に関する。
関与する遺伝情報をコードしたデオキシリポ核ＩＩＩ
（ＤＮＡ）及びその利用に関する。更に詳しくは、上記
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組込んだ組換えベクター、該組換え
ベクターを含有する細菌及び該細菌を用いるビオチンの
製造法に関する。
（従来の技術）
ビオチンは、動物、植物、微生物等にとり必要なビタミ
ンで、遺伝子組変え技術の応用による工業的な生産が強
く望まれている物質である。ビオチン生合成反応に関与
する遺伝情報については、近年、大腸菌における解析が
進み［ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−１４，２０
６５（１９６７）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
−±１２．８３０ （１９７２） 、ネーチャー２７６
．６８９ （１９７８）など］、また、その解析結果を
利用した遺伝子組み変え技術の応用により大腸菌による
ビオチン生産技術の検討がなされている。
ンで、遺伝子組変え技術の応用による工業的な生産が強
く望まれている物質である。ビオチン生合成反応に関与
する遺伝情報については、近年、大腸菌における解析が
進み［ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−１４，２０
６５（１９６７）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
−±１２．８３０ （１９７２） 、ネーチャー２７６
．６８９ （１９７８）など］、また、その解析結果を
利用した遺伝子組み変え技術の応用により大腸菌による
ビオチン生産技術の検討がなされている。
しかし、これらの方法は、例えばビオチン前駆体として
デスチオビオチンを利用する場合［特開昭６１−１４９
０９１号］には１２μ９／ｒｒｔｌ程度、また前駆体を
利用せずにグルコースを炭素源として使用する場合［特
開昭６１−２０２６８６号］には２μｇ／ｒｔｆｔ程度
であり、いずれの場合にもビオチン産生量が低いという
欠点を有している。
デスチオビオチンを利用する場合［特開昭６１−１４９
０９１号］には１２μ９／ｒｒｔｌ程度、また前駆体を
利用せずにグルコースを炭素源として使用する場合［特
開昭６１−２０２６８６号］には２μｇ／ｒｔｆｔ程度
であり、いずれの場合にもビオチン産生量が低いという
欠点を有している。
一方、バチルス属に属する微生物を培養することにより
ビオチンを産生ずる方法も知られており、大腸菌に比較
してはるかに多量のビオチンを産生する菌も見い出され
ている（例えば特開昭５６−１６０９９８号、同５８−
６０９９６号、同５８−１５２４９５号など）。しかし
、バチルス属細菌のビオチン生合成に関与する遺伝情報
の解析は殆どなされておらず、それゆえ遺伝子組換え技
術にそれを応用することは極めて困難な状態にあった。
ビオチンを産生ずる方法も知られており、大腸菌に比較
してはるかに多量のビオチンを産生する菌も見い出され
ている（例えば特開昭５６−１６０９９８号、同５８−
６０９９６号、同５８−１５２４９５号など）。しかし
、バチルス属細菌のビオチン生合成に関与する遺伝情報
の解析は殆どなされておらず、それゆえ遺伝子組換え技
術にそれを応用することは極めて困難な状態にあった。
（発明が解決しようとする問題点）
そこで本発明者らは、かかる従来技術の下でバチルス属
細菌からビオチン生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａを採取すべく鋭意検討の結果、ヒオチン生合成経路の
最終経路であるデスチオビオチンからビオチンを生合成
する反応に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ （以下、ビ
オチン合成酵素をコードするＤＮＡと称することがある
）の採取に成功し、かつそのＤＮＡを組込んだ組換えベ
クターによって形質転換された細菌は高いビオチン産生
能を有することを見い出し、本発明を完成するに到った
。
細菌からビオチン生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａを採取すべく鋭意検討の結果、ヒオチン生合成経路の
最終経路であるデスチオビオチンからビオチンを生合成
する反応に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ （以下、ビ
オチン合成酵素をコードするＤＮＡと称することがある
）の採取に成功し、かつそのＤＮＡを組込んだ組換えベ
クターによって形質転換された細菌は高いビオチン産生
能を有することを見い出し、本発明を完成するに到った
。
（問題点を解決するための手段）
かくして本発明によれば、第一の発明として、ビオチン
産生能を有するバチルス属細菌由来のデスチオビオチン
からのビオチン生合成反応に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡが提供され、第二の発明として、そのＤＮＡ又はそ
のＤＮＡとプロモーターを組み込んだ組換えベクターが
提供され、第三の発明として、その組換えベクターによ
って形質転換または形質導入された細菌が提供され、さ
らに第四の発明として、それら細菌の培養によりビオチ
ンを製造する方法が提供される。
産生能を有するバチルス属細菌由来のデスチオビオチン
からのビオチン生合成反応に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡが提供され、第二の発明として、そのＤＮＡ又はそ
のＤＮＡとプロモーターを組み込んだ組換えベクターが
提供され、第三の発明として、その組換えベクターによ
って形質転換または形質導入された細菌が提供され、さ
らに第四の発明として、それら細菌の培養によりビオチ
ンを製造する方法が提供される。
本発明において、ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
を採取する目的に用いられる微生物は、バチルス属、と
くにバチルス・スフエリカスに属するビオチン生産菌、
すなわちビオチン生合成の酵素系を有している微生物で
ある限り、自然界から新たに分離された菌株でも既存の
培養菌株でもよく、また、これらの菌株を通常の微生物
突然変異誘発法（例えば、紫外線、Ｘ線、γ線照射など
の物理的処理やニトロソグアニジンなどの薬剤による化
学的処理による方法）で処理することによって得られた
菌株であっても良い。さらに、ビオチン産生能を高める
ために上記菌株にアクチヂアジン酸（すなわちアシドマ
イシン）または５−（２−チエニル）吉草酸のそれぞれ
単独、あるいは双方に対する耐性を付与した菌株などで
あっても良い。このような菌株の具体例としては、例え
ば、バチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈ
ａｅｒｉｃｕｓ ） Ｉ Ｆ Ｏ３５２５や、そのＮ−
メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン処理変
異株（ＦＥＲＭ Ｐ−６４２２、ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０９８、ＦＥＲＭ Ｐ−６１４３）などが例示され
る。
を採取する目的に用いられる微生物は、バチルス属、と
くにバチルス・スフエリカスに属するビオチン生産菌、
すなわちビオチン生合成の酵素系を有している微生物で
ある限り、自然界から新たに分離された菌株でも既存の
培養菌株でもよく、また、これらの菌株を通常の微生物
突然変異誘発法（例えば、紫外線、Ｘ線、γ線照射など
の物理的処理やニトロソグアニジンなどの薬剤による化
学的処理による方法）で処理することによって得られた
菌株であっても良い。さらに、ビオチン産生能を高める
ために上記菌株にアクチヂアジン酸（すなわちアシドマ
イシン）または５−（２−チエニル）吉草酸のそれぞれ
単独、あるいは双方に対する耐性を付与した菌株などで
あっても良い。このような菌株の具体例としては、例え
ば、バチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈ
ａｅｒｉｃｕｓ ） Ｉ Ｆ Ｏ３５２５や、そのＮ−
メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン処理変
異株（ＦＥＲＭ Ｐ−６４２２、ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０９８、ＦＥＲＭ Ｐ−６１４３）などが例示され
る。
これら細菌株からビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
を採取する方法については特に限定された方法を用いる
必要はなく、例えば上記細菌株から全ＤＮＡを常法によ
り単離精製し、制限酵素で切断した後、該制限酵素と同
じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限酵素で切断した
ベクターと酵素的に結合させ、得られた組換えベクター
を用いてデスチオビオチンス＼らのビオチン生合成能を
欠失したビオチン要求性変異株を形質転換（又は形質導
入）し、得られた形質転換株の中からビオチン産生能を
付与された菌株を選択すれば良い。
を採取する方法については特に限定された方法を用いる
必要はなく、例えば上記細菌株から全ＤＮＡを常法によ
り単離精製し、制限酵素で切断した後、該制限酵素と同
じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限酵素で切断した
ベクターと酵素的に結合させ、得られた組換えベクター
を用いてデスチオビオチンス＼らのビオチン生合成能を
欠失したビオチン要求性変異株を形質転換（又は形質導
入）し、得られた形質転換株の中からビオチン産生能を
付与された菌株を選択すれば良い。
商談ＤＮＡには、同ＤＮＡと実質的に同一の機能を有す
る修飾されたＤＮＡ、即ち、塩基配列の一部が置換され
、挿入され又は欠失されたものであっても同一の機能を
有するものも当然含まれる。
る修飾されたＤＮＡ、即ち、塩基配列の一部が置換され
、挿入され又は欠失されたものであっても同一の機能を
有するものも当然含まれる。
更に上記ＤＮＡとしては、シャイン・ダルガノ配列、翻
訳開始コドン、翻訳終止コドンを含有しているものが好
ましく使用される。
訳開始コドン、翻訳終止コドンを含有しているものが好
ましく使用される。
組換ベクターを構築するに際しては、プラスミドベクタ
ー、λ９を系ファージベクターなどが使用されるが、必
要に応じてプロモーターを同時に組込むことにより形質
転換又は形質導入された細菌のビオチオン産生能を向上
させることができる。
ー、λ９を系ファージベクターなどが使用されるが、必
要に応じてプロモーターを同時に組込むことにより形質
転換又は形質導入された細菌のビオチオン産生能を向上
させることができる。
本発明において組換えベクターを構築するためのベクタ
ーとしては、前記ビオチン要求性変異株を形質転換（ま
たは形質導入）し得るものならどんなものでも良く、例
えばビオチン要求性変異株として大腸菌を用いる場合、
ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント型のｐ
ｓｃｌｏｌ。
ーとしては、前記ビオチン要求性変異株を形質転換（ま
たは形質導入）し得るものならどんなものでも良く、例
えばビオチン要求性変異株として大腸菌を用いる場合、
ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント型のｐ
ｓｃｌｏｌ。
ｐＲＫ３５３．ｐＲＫ６４６．ｐＲＫ２４８゜ｐＤＦ４
１など、リラックス型のものとしてＣｏ ｌ Ｅ １
、 ｐＶＨ５１、ｐＡ’ｃ１０５．Ｒ８Ｆ２１２４、
ｐＣＲｌ、ｐＭＢ９．’ ｐＢＲ３１３゜ｐＢＲ３２２
，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５゜１）ＢＲ３２７，ｐＢ
Ｒ３２ｓ、１）ＫＹ２２８９゜１）ＫＹ２７００．１）
ＫＮ８０．ＤＫＣ７゜ｐＫｓ１５８’、” ｐｖＫ２ｏ
ｏ４．、 ｐＡＣＹＣｌ。
１など、リラックス型のものとしてＣｏ ｌ Ｅ １
、 ｐＶＨ５１、ｐＡ’ｃ１０５．Ｒ８Ｆ２１２４、
ｐＣＲｌ、ｐＭＢ９．’ ｐＢＲ３１３゜ｐＢＲ３２２
，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５゜１）ＢＲ３２７，ｐＢ
Ｒ３２ｓ、１）ＫＹ２２８９゜１）ＫＹ２７００．１）
ＫＮ８０．ＤＫＣ７゜ｐＫｓ１５８’、” ｐｖＫ２ｏ
ｏ４．、 ｐＡＣＹＣｌ。
ｐＡｃｙｃ１ｓ４．ｐｕＣｓ、１）ＵＯ３など、λｇｔ
系ファージベクターとしてλａｔ・λＣ９λｇｔ・λＢ
、λＷＥＳ・λＣ１λＷＥＳ・λＢ。
系ファージベクターとしてλａｔ・λＣ９λｇｔ・λＢ
、λＷＥＳ・λＣ１λＷＥＳ・λＢ。
λＺＪｖ ｉ ｒ−λＢ′、λＡＬＯ−λＢ。
λＷＥＳ−Ｔ５６２２．λＤａｍなどが用イラレる。こ
れらのベクターのなかではプラスミドベクターがとくに
賞月される。
れらのベクターのなかではプラスミドベクターがとくに
賞月される。
また、当該組換えベクターに含まれるビオチン合成酵素
をコードするＤＮＡは、上述の形質転換株中で機能する
プロモーター配列を有するＤ ’Ｎ Ａ（尚、本明細書
及び特許請求の範囲の記載中プロモーターとはプロモー
ター配列を有するＤＮＡを意味する。）の支配下で、か
つその下流に組み込まれている必要がある。
をコードするＤＮＡは、上述の形質転換株中で機能する
プロモーター配列を有するＤ ’Ｎ Ａ（尚、本明細書
及び特許請求の範囲の記載中プロモーターとはプロモー
ター配列を有するＤＮＡを意味する。）の支配下で、か
つその下流に組み込まれている必要がある。
本発明に使用しうるプロモーターとしては、天然のもの
でも人工合成のものでも、宿主細菌中で該プロモーター
が組み込まれている組換えベクターが機能しうるもので
あれば使用可能である。かかるプロモータ〜とじては、
大腸菌由来のｊ！ａｃプロモーター、ｊ！ｐｐプロモー
ター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔｒｐプ
ロモーター、ＴａＣプロモーターなどがエシェリヒア属
細菌を宿主とする場合に、バチルス属細菌由来のα−ア
ミラーゼプロモーター（例えば、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＞ ９
８ 。
でも人工合成のものでも、宿主細菌中で該プロモーター
が組み込まれている組換えベクターが機能しうるもので
あれば使用可能である。かかるプロモータ〜とじては、
大腸菌由来のｊ！ａｃプロモーター、ｊ！ｐｐプロモー
ター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔｒｐプ
ロモーター、ＴａＣプロモーターなどがエシェリヒア属
細菌を宿主とする場合に、バチルス属細菌由来のα−ア
ミラーゼプロモーター（例えば、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＞ ９
８ 。
Ｐ１１４７，１９８５年：ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５８． Ｉ
）、 ３−１３ ＝ ６９．１９８４年：ジーン（Ｇ’ｅｎｅ）”２３． ｐ
、２６７゜１９８３年参照）、バチルス・リケニフオル
ミス由来のベニシリナーゼ・プロモーター、バチルス・
サチルス由来のＴｒｐプロモーター、ファージ５ＰＯ２
の０．３に’ｂプロモーターなどがバチルス属細菌を宿
主とする場合に、またシュードモナス属細菌由来のカテ
コール−２，３−オキシゲナーゼプロモーターがシュー
ドモナス属細菌を宿主とする場合に使用可能と考えられ
る。天然のものとしては、組換えベクターとして使用す
るベクター中に含まれるものをそのま）利用しても良い
。
オロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５８． Ｉ
）、 ３−１３ ＝ ６９．１９８４年：ジーン（Ｇ’ｅｎｅ）”２３． ｐ
、２６７゜１９８３年参照）、バチルス・リケニフオル
ミス由来のベニシリナーゼ・プロモーター、バチルス・
サチルス由来のＴｒｐプロモーター、ファージ５ＰＯ２
の０．３に’ｂプロモーターなどがバチルス属細菌を宿
主とする場合に、またシュードモナス属細菌由来のカテ
コール−２，３−オキシゲナーゼプロモーターがシュー
ドモナス属細菌を宿主とする場合に使用可能と考えられ
る。天然のものとしては、組換えベクターとして使用す
るベクター中に含まれるものをそのま）利用しても良い
。
また、上記ビオチン要求性変異株としては、バチルス属
の遺伝情報を担うＤＮＡが該菌体内で発現可能な菌株で
あればいずれでも良く、そのような変異株は公知の方法
によって再現性よく得ることができる（例えばジャ−ナ
ル・オブ・バクテリオ０ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
） １１５． ｐ６６２．１９７３年：プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・
イン・ＵＳＡ（Ｐｒｏ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳ＾ ）６９． ｐ２２１９．１
９７２年：ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）生２゜Ｄ
４７４．１９７０年など）。
の遺伝情報を担うＤＮＡが該菌体内で発現可能な菌株で
あればいずれでも良く、そのような変異株は公知の方法
によって再現性よく得ることができる（例えばジャ−ナ
ル・オブ・バクテリオ０ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
） １１５． ｐ６６２．１９７３年：プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・
イン・ＵＳＡ（Ｐｒｏ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳ＾ ）６９． ｐ２２１９．１
９７２年：ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）生２゜Ｄ
４７４．１９７０年など）。
例えばエシェリヒア・コリＣ６００［プロシーディング
・オブ・ナチュラル・アカデミイ・オブ・サイエンスヱ
１ ４５７９（１９７４）］を、ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジ−１１９３０（１９６７）記載の方法に準
じて変異誘導処理して得られるデスチオビオチンからビ
オチンへの生合成能の欠如した菌株（以下、エシェリヒ
ア・コリに３と呼ぶ）を利用することができる。
・オブ・ナチュラル・アカデミイ・オブ・サイエンスヱ
１ ４５７９（１９７４）］を、ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジ−１１９３０（１９６７）記載の方法に準
じて変異誘導処理して得られるデスチオビオチンからビ
オチンへの生合成能の欠如した菌株（以下、エシェリヒ
ア・コリに３と呼ぶ）を利用することができる。
形質転換の方法についてもなんら限定すべきものではな
く、例えば、ビオチン要求性変異株として上記エシェリ
ヒア・コリに３を用いる場合は塩化カルシウムで菌体を
処理する常法に従って実施しうる（例えばジャーナル・
オブ・モレキュラー会バイオロジーｉユ、１５４ （１
９７０）参照）。
く、例えば、ビオチン要求性変異株として上記エシェリ
ヒア・コリに３を用いる場合は塩化カルシウムで菌体を
処理する常法に従って実施しうる（例えばジャーナル・
オブ・モレキュラー会バイオロジーｉユ、１５４ （１
９７０）参照）。
かくして得られるビオチン要求性変異株の形質転換体の
中から、バチルス属細菌由来のビオチン合成酵素をコー
ドするＤＮＡが組み込まれた組換えベクターによって新
たにビオチン産生能を付与された菌株を選択する場合は
、例えば、親株のビオチン要求性変異株が成育可能な培
地の組成から、ビオチンが実質的に除去された培地を用
いて、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育
可能な菌株を選択すれば良い。
中から、バチルス属細菌由来のビオチン合成酵素をコー
ドするＤＮＡが組み込まれた組換えベクターによって新
たにビオチン産生能を付与された菌株を選択する場合は
、例えば、親株のビオチン要求性変異株が成育可能な培
地の組成から、ビオチンが実質的に除去された培地を用
いて、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育
可能な菌株を選択すれば良い。
こうして得られる一例示形質転換菌株をエシェリヒア・
コリに３ （ｐＳＢＯｌ）と命名し、またエシェリヒア
・コリに３ （１）ＳＢＯｌ ）の培養菌体から単離さ
れたるハイブリッドプラスミドをｐＳＢＯｌと命名した
。このＩ）ＳＢＯｌは後記実施例１に示すごとく、バシ
ルス・スフエリカス由来のＤＮＡ断片をプラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入したものであり、その制限酵素切断点地
図を第１図に示す。第１図からｐｓＢＯｌ中に含まれる
ビオチンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡは、
ＭｂｏＩに始まり、Ｈｉ ｎｄｌｌ、 Ｈｉ ｎｄｌｌ
。
コリに３ （ｐＳＢＯｌ）と命名し、またエシェリヒア
・コリに３ （１）ＳＢＯｌ ）の培養菌体から単離さ
れたるハイブリッドプラスミドをｐＳＢＯｌと命名した
。このＩ）ＳＢＯｌは後記実施例１に示すごとく、バシ
ルス・スフエリカス由来のＤＮＡ断片をプラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入したものであり、その制限酵素切断点地
図を第１図に示す。第１図からｐｓＢＯｌ中に含まれる
ビオチンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡは、
ＭｂｏＩに始まり、Ｈｉ ｎｄｌｌ、 Ｈｉ ｎｄｌｌ
。
ＥｃｏＲｌ、Ｓａｊ！１．ＨｔｎｄｌｌＩ、ＰｓｔＩ。
ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩの順に並ぶ約８．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片（第１図中の斜線を付した部分）中に存在するこ
とが理解されよう。なお、この地図中のＭｂｏＩは出発
点を示すものであり、この部位以外にＭｂｏＩが存する
可能性を否定するものではない。
Ａ断片（第１図中の斜線を付した部分）中に存在するこ
とが理解されよう。なお、この地図中のＭｂｏＩは出発
点を示すものであり、この部位以外にＭｂｏＩが存する
可能性を否定するものではない。
むろん本発明に含まれるビオチン合成酵素をコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換えベクターは、ｐｓＢＯｌに限
るものではない。例えば、ｐＳＢＯＩのもつ固有の制限
酵素切断サイトを利用し、前記ＤＮＡを組み込んだプラ
スミドを新たにｐｓＢＯｌから誘導することも可能であ
り、具体的にはＩ） Ｓ、Ｂ ０１を、例えば、制限酵
素［Ｃ０ＲＩで完全分解したあと、酵素的な再結合反応
を実施し、得られたプラスミド混合物を用いてデスチオ
ビオチンからビオチンへの生合成能の欠如した菌株を形
質転換し、得られた形質転換株の中からビオチン産生能
を付与された菌株で、ｐＳＢＯＩよりも小型のプラスミ
ドを持つ菌株を選択すれば良い。
ＤＮＡを組み込んだ組換えベクターは、ｐｓＢＯｌに限
るものではない。例えば、ｐＳＢＯＩのもつ固有の制限
酵素切断サイトを利用し、前記ＤＮＡを組み込んだプラ
スミドを新たにｐｓＢＯｌから誘導することも可能であ
り、具体的にはＩ） Ｓ、Ｂ ０１を、例えば、制限酵
素［Ｃ０ＲＩで完全分解したあと、酵素的な再結合反応
を実施し、得られたプラスミド混合物を用いてデスチオ
ビオチンからビオチンへの生合成能の欠如した菌株を形
質転換し、得られた形質転換株の中からビオチン産生能
を付与された菌株で、ｐＳＢＯＩよりも小型のプラスミ
ドを持つ菌株を選択すれば良い。
こうして得られる一例示形質転換菌株をエシェリヒア・
コリに３１ｐｓＢＯ３）と命名し、またその培養菌株か
ら単離されるハイブリッドプラスミドをｐｓＢＯ３と命
名した。ＤＳＢＯ３の制限酵素切断点地図は第２図に示
すとうりであり、ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
は、ＭｂｏＩにはじまりＨｉ ｎｄＴ［１，Ｈｉ ｎｄ
ｌ［［、ＥｃｏＲＩ。
コリに３１ｐｓＢＯ３）と命名し、またその培養菌株か
ら単離されるハイブリッドプラスミドをｐｓＢＯ３と命
名した。ＤＳＢＯ３の制限酵素切断点地図は第２図に示
すとうりであり、ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
は、ＭｂｏＩにはじまりＨｉ ｎｄＴ［１，Ｈｉ ｎｄ
ｌ［［、ＥｃｏＲＩ。
ＢａｍＨＩの順に並ぶ約４．５ｋｂのＤＮＡ断片（第２
図中の斜線を付した部分）中に存在することが理解され
よう。なお、この約４．５ｋｂのＤＮＡ断片はもとの約
８．２ｋｂのＤＮＡ断片中の約３．５ｋｂ（Ｆ）部分（
すなわちＭｂＯＩからＥＣ０ＲＩまでの部分）と約１ｋ
ｂの部分（すなわちＥＣ０ＲＩがらＢ ａ ｒｒＬ）ｌ
Ｊまでの部分）が結合したものであるが、約１ｋｂの
ＤＮＡ１１分を別途１）ＢＲ３２２に組込み、それをビ
オチン要求性変異株に形質転換したところ、ビオチン産
生能を示さなかったことがら、ビオチン合成酵素をコー
ドする部分はＭｂｏＩがらＥＣ０ＲＩまでの約 −３，
５ｋｂの断片中に存在することが確認された。
図中の斜線を付した部分）中に存在することが理解され
よう。なお、この約４．５ｋｂのＤＮＡ断片はもとの約
８．２ｋｂのＤＮＡ断片中の約３．５ｋｂ（Ｆ）部分（
すなわちＭｂＯＩからＥＣ０ＲＩまでの部分）と約１ｋ
ｂの部分（すなわちＥＣ０ＲＩがらＢ ａ ｒｒＬ）ｌ
Ｊまでの部分）が結合したものであるが、約１ｋｂの
ＤＮＡ１１分を別途１）ＢＲ３２２に組込み、それをビ
オチン要求性変異株に形質転換したところ、ビオチン産
生能を示さなかったことがら、ビオチン合成酵素をコー
ドする部分はＭｂｏＩがらＥＣ０ＲＩまでの約 −３，
５ｋｂの断片中に存在することが確認された。
同様にｐｓＢＯ３を、例えば、制限酵素ＨｉｎｄＩ［［
で完全分解し、＠ ｉ ｎｄｌｌで切断した他のベクタ
ーと酵素的な再結合を実施し、得られた形質転換菌株の
中からビオチン産生能を付与された菌株を選択すること
によってより小型のプラスミドを持つ菌株を得ることが
できる。
で完全分解し、＠ ｉ ｎｄｌｌで切断した他のベクタ
ーと酵素的な再結合を実施し、得られた形質転換菌株の
中からビオチン産生能を付与された菌株を選択すること
によってより小型のプラスミドを持つ菌株を得ることが
できる。
こうして得られる形質転換株の例としては、エシェリヒ
ア・コリに３ （ｐＳＢｌ ６）が挙げられる。この形
質転換株中に存在するプラスミド１）ＳＢ１６の制限酵
素切断地図は第３図に示すとうりであり、そのなかに組
み込まれたバチルス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限酵素
切断地図は第４図に示すとうりである。この結果からビ
オチン合成酵素をコードするＤＮＡは、１ｙｌｂｏ ：
［に始まりＴａｑＩ、Ｒｓａｌ、Ｍａｅｌ、、ＭａｅＩ
［［。
ア・コリに３ （ｐＳＢｌ ６）が挙げられる。この形
質転換株中に存在するプラスミド１）ＳＢ１６の制限酵
素切断地図は第３図に示すとうりであり、そのなかに組
み込まれたバチルス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限酵素
切断地図は第４図に示すとうりである。この結果からビ
オチン合成酵素をコードするＤＮＡは、１ｙｌｂｏ ：
［に始まりＴａｑＩ、Ｒｓａｌ、Ｍａｅｌ、、ＭａｅＩ
［［。
Ｔａｑｌ、ＲｓａＩ、Ｍｂｏｌ、Ｍ、ａｅｌ［［。
ＭｂｏＩ、Ｈｉ ｎｃｉｌ［、ＴａｑＩ、ＴａＱＩ。
ＴａＱｌ、Ｈｉ ｎｄｌｌ［の順に並ぶ約１．５ｋｂの
ＮＤＡ断片中に存在することが理解されよう。
ＮＤＡ断片中に存在することが理解されよう。
この約１．５ｋｂＤＮＡ断片について後記実施例３に示
す方法に従って配列分析を行った結果、その塩基配列は
第５図に示すとうりであることが判明した。この配列は
ＭｂｏＩ側の５′−末端からＨｉ ｎｄｌｌＩ側の３′
−末端へ向って−っの大きなオーブンリーディングフレ
ームを保有する。原核生物の翻訳開始コドンのひとつで
あるＧＴＧ配列（アニュアル・レビュー・オブ・マイク
ロバイオロジー（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、旧ｃｒｏｂｉｏｌ
） ■、 ｐ ３６５．１９８１年）は、５′末端か
ら２８２−２８４番目に存在し、翻訳終止コドンＴＡＡ
が存在する１ ２７８−１２８０番目迄、３３２のコド
ンがＧＴＧにつながっている。このＧＴＧの上流の２６
５−２７８番目にシヤイン−ダルガノ配列が存在する。
す方法に従って配列分析を行った結果、その塩基配列は
第５図に示すとうりであることが判明した。この配列は
ＭｂｏＩ側の５′−末端からＨｉ ｎｄｌｌＩ側の３′
−末端へ向って−っの大きなオーブンリーディングフレ
ームを保有する。原核生物の翻訳開始コドンのひとつで
あるＧＴＧ配列（アニュアル・レビュー・オブ・マイク
ロバイオロジー（Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、旧ｃｒｏｂｉｏｌ
） ■、 ｐ ３６５．１９８１年）は、５′末端か
ら２８２−２８４番目に存在し、翻訳終止コドンＴＡＡ
が存在する１ ２７８−１２８０番目迄、３３２のコド
ンがＧＴＧにつながっている。このＧＴＧの上流の２６
５−２７８番目にシヤイン−ダルガノ配列が存在する。
・
このＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列はそ
の塩基配列から第５図のごとく演えきできる。このよう
なアミノ酸配列を有するポリペプチドは３３１個のアミ
ノ酸から構成され、その分子量は３６８８８ダルトンと
計算される。この場合、転写開始コドンＧＴＧによって
コードされるメチオニンが残存し、３３２個のアミノ酸
からなる場合もありえる。このポリペプチドが細菌内に
おいてデスチオビオチンからビオチンを生合成する酵素
として機能する。
の塩基配列から第５図のごとく演えきできる。このよう
なアミノ酸配列を有するポリペプチドは３３１個のアミ
ノ酸から構成され、その分子量は３６８８８ダルトンと
計算される。この場合、転写開始コドンＧＴＧによって
コードされるメチオニンが残存し、３３２個のアミノ酸
からなる場合もありえる。このポリペプチドが細菌内に
おいてデスチオビオチンからビオチンを生合成する酵素
として機能する。
ところでバチルス属細菌では、同一の機能を有する酵素
であっても、そのアミノ酸配列が種によって異なる例が
知られている（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ） １ｉｆｌ。
であっても、そのアミノ酸配列が種によって異なる例が
知られている（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ） １ｉｆｌ。
ｐ３６９．１９８４年）。こうした例ではアミノ酸の一
部が置換されたり、欠失したり、または挿入されており
、ときには塩基配列・の変化はあってもアミノ酸配列そ
のものは全く変わらない場合もある。従って、バチルス
・スフエリカス以外の他の種から採取したビオチン合成
酵素をコードするＤＮＡの塩基配列と、その配列から演
えきできるアミノ酸配列は、第５図の塩基配列やアミノ
酸配列と若干異なることもありうる。熱論、このＤＮＡ
断片のアミノ酸配列や塩基配列を人為的に変更する場合
もありえる。具体的には後記実施例６に示すごとく、開
始配列ＧＴＧを開始配列ＡＴＧとする場合などであるが
、いずれの場合においてもＤＮＡ断片中にコードされる
ポリペプチドがビオチン合成酵素として実質的に同一の
機能する範囲において、修飾されたもの、即ち、アミノ
酸配列や塩基配列が置換、挿入、欠失する場合も本発明
に含まれる。変更の限界は必ずしも一様ではないが、第
５図の塩基配列とハイブリダイズするものであればビオ
チン合成酵素として機能するものと予想される。
部が置換されたり、欠失したり、または挿入されており
、ときには塩基配列・の変化はあってもアミノ酸配列そ
のものは全く変わらない場合もある。従って、バチルス
・スフエリカス以外の他の種から採取したビオチン合成
酵素をコードするＤＮＡの塩基配列と、その配列から演
えきできるアミノ酸配列は、第５図の塩基配列やアミノ
酸配列と若干異なることもありうる。熱論、このＤＮＡ
断片のアミノ酸配列や塩基配列を人為的に変更する場合
もありえる。具体的には後記実施例６に示すごとく、開
始配列ＧＴＧを開始配列ＡＴＧとする場合などであるが
、いずれの場合においてもＤＮＡ断片中にコードされる
ポリペプチドがビオチン合成酵素として実質的に同一の
機能する範囲において、修飾されたもの、即ち、アミノ
酸配列や塩基配列が置換、挿入、欠失する場合も本発明
に含まれる。変更の限界は必ずしも一様ではないが、第
５図の塩基配列とハイブリダイズするものであればビオ
チン合成酵素として機能するものと予想される。
本発明において用いられる組換えベクターの宿主として
は、エシェリヒアφコリなどのエシェリヒア属細菌、バ
チルス・サチルス、バチルス・スフエリカスな′どのバ
チルス属細菌、あるいはシュードモナス・プチダ、シュ
ードモナス・アルギノーザなどのシュードモナス属細菌
などを用いることができる。
は、エシェリヒアφコリなどのエシェリヒア属細菌、バ
チルス・サチルス、バチルス・スフエリカスな′どのバ
チルス属細菌、あるいはシュードモナス・プチダ、シュ
ードモナス・アルギノーザなどのシュードモナス属細菌
などを用いることができる。
これら宿主を形質転換（又は形質導入）してビオチオン
産生能に優れた形質転換体を得るためには、前述の如く
、宿主細菌中で複製可能であることが必要であることに
加え、ビオチン生合成反応に関与する遺伝情報をコード
したＤＮＡは、宿主細菌中で機能しうるプロモーターの
支配下にある形態で組み込まれている必要がある。プロ
モータ−は上記ＤＮＡの上流に組み込まれるのであるが
、ＤＮＡに近接した距離に存在することが好ましく、具
体的には３００塩基以内、更に好ましくは１５０塩基以
内に組み込まれる。
産生能に優れた形質転換体を得るためには、前述の如く
、宿主細菌中で複製可能であることが必要であることに
加え、ビオチン生合成反応に関与する遺伝情報をコード
したＤＮＡは、宿主細菌中で機能しうるプロモーターの
支配下にある形態で組み込まれている必要がある。プロ
モータ−は上記ＤＮＡの上流に組み込まれるのであるが
、ＤＮＡに近接した距離に存在することが好ましく、具
体的には３００塩基以内、更に好ましくは１５０塩基以
内に組み込まれる。
プロモーターの支配下で該ＤＮＡを含む組換えプラスミ
ドベクターは次のような手順により調製される。例えば
、ｐｓｓｏｉ、ｐＳＢＯ３、ＤＳＢ１６、Ｉ）ＳＢ１０
３などを始めとする該ＤＮＡを含むプラスミドから該Ｄ
ＮＡを含む領域を制限酵素により切断し、例えばＴｒ・
ｐプロモーターを利用する場合にはｐＤＲ７２０（Ｇｅ
ｎｅ２０゜２３１ （１９８２））のプロモーター配列
の下流にこの切断されたＤＮＡを挿入すれば良い。宿主
エシェリヒア属細菌についてはエシェリヒア・コリＣ６
００、同ＪＭ１０３．同ＭＣ１６９、ＣＡＧｌ １３８
．ＪＥ８４７６、ＧＣ４６７０゜ＡＢ１８９９、ＪＥ８
４７５、ＧＷ５２２９など遺伝子工学分野で多用される
細菌はむろんのこと、自然界から新たに分離された菌株
でも既存の培養菌株でもよく、また、これらの菌株を通
常の微生物突然変異誘発法で処理することによって得ら
れた菌株でも良いが、特にＭＣｌ６９など菌体内プロテ
アーゼ活性の弱い大腸菌が賞月される。こうして得られ
る組換えベクターの例として第６図に示されるｐｓＢ３
０１が挙げられ、Ｔｒｐプロモーターの支配下にそれと
近接してビオチン合成酵素をコードするＤＮＡが組み込
まれていることが理解できる。
ドベクターは次のような手順により調製される。例えば
、ｐｓｓｏｉ、ｐＳＢＯ３、ＤＳＢ１６、Ｉ）ＳＢ１０
３などを始めとする該ＤＮＡを含むプラスミドから該Ｄ
ＮＡを含む領域を制限酵素により切断し、例えばＴｒ・
ｐプロモーターを利用する場合にはｐＤＲ７２０（Ｇｅ
ｎｅ２０゜２３１ （１９８２））のプロモーター配列
の下流にこの切断されたＤＮＡを挿入すれば良い。宿主
エシェリヒア属細菌についてはエシェリヒア・コリＣ６
００、同ＪＭ１０３．同ＭＣ１６９、ＣＡＧｌ １３８
．ＪＥ８４７６、ＧＣ４６７０゜ＡＢ１８９９、ＪＥ８
４７５、ＧＷ５２２９など遺伝子工学分野で多用される
細菌はむろんのこと、自然界から新たに分離された菌株
でも既存の培養菌株でもよく、また、これらの菌株を通
常の微生物突然変異誘発法で処理することによって得ら
れた菌株でも良いが、特にＭＣｌ６９など菌体内プロテ
アーゼ活性の弱い大腸菌が賞月される。こうして得られ
る組換えベクターの例として第６図に示されるｐｓＢ３
０１が挙げられ、Ｔｒｐプロモーターの支配下にそれと
近接してビオチン合成酵素をコードするＤＮＡが組み込
まれていることが理解できる。
また、宿主をバチルス属細菌とする場合には既に述べた
如くプロモーターとしては例えばバチルス属細菌で一般
的に機能すると考えられるバチルス・リケニホルミスや
バチルス・ステアロサーモフィラスのα−アミラーゼ・
プロモーターなどを利用することができる。また、これ
らプロモーターに前記ＤＮＡを接続する場合、第５図に
示すＤＮＡ断片中の翻訳開始コドンＧＴＧ配列を含む５
′側配列を当該プロモーターの３′側配列と同一にする
ために、実施例６に示すごとく合成リンカ−などを使用
しても良い。もちろん、バチルス属細菌を宿主とする場
合には、完成した組換えベフタ−が当該宿主の中で複製
できるものである必要があり、そのためには当該ベクタ
ーの一部にｐＬＪＢｌ １０などバチルス属細菌で一般
的に複製可能と考えられるプラスミドの複製開始領域が
含まれていなければならない。
如くプロモーターとしては例えばバチルス属細菌で一般
的に機能すると考えられるバチルス・リケニホルミスや
バチルス・ステアロサーモフィラスのα−アミラーゼ・
プロモーターなどを利用することができる。また、これ
らプロモーターに前記ＤＮＡを接続する場合、第５図に
示すＤＮＡ断片中の翻訳開始コドンＧＴＧ配列を含む５
′側配列を当該プロモーターの３′側配列と同一にする
ために、実施例６に示すごとく合成リンカ−などを使用
しても良い。もちろん、バチルス属細菌を宿主とする場
合には、完成した組換えベフタ−が当該宿主の中で複製
できるものである必要があり、そのためには当該ベクタ
ーの一部にｐＬＪＢｌ １０などバチルス属細菌で一般
的に複製可能と考えられるプラスミドの複製開始領域が
含まれていなければならない。
宿主バチルス属細菌に関して言えば遺伝子工学分野で多
用されるバチルス・サチルスに分類される細菌はむろん
のこと、ビオチン生合成反応に関与する遺伝情報、例え
ば同゛物質合成酵素をコードするＤＮＡを採取する目的
に用いることのできるバチルス・スフエリカスに属する
ビオチン生産菌なではすべて本発明の目的に使用するこ
とができる。こうして得られる組換えベクターの例とし
ては第８図に示されるｐＢＨＢ１３が挙げられる。
用されるバチルス・サチルスに分類される細菌はむろん
のこと、ビオチン生合成反応に関与する遺伝情報、例え
ば同゛物質合成酵素をコードするＤＮＡを採取する目的
に用いることのできるバチルス・スフエリカスに属する
ビオチン生産菌なではすべて本発明の目的に使用するこ
とができる。こうして得られる組換えベクターの例とし
ては第８図に示されるｐＢＨＢ１３が挙げられる。
このベクターはバチルス・リケニホルミス由来のα−ア
ミラーゼ・プロモーターの支配下にピオチン合成酵素を
コードするＤＮＡが組み込まれており、しかもｐＵＢｌ
ｌｏの複製開始領域をもつことが理解できる。
ミラーゼ・プロモーターの支配下にピオチン合成酵素を
コードするＤＮＡが組み込まれており、しかもｐＵＢｌ
ｌｏの複製開始領域をもつことが理解できる。
同様に、宿主をシュードモナス属細菌とする場合には、
該プロモーターとしてはカテコール−２゜３−オキシゲ
ナーゼ・プロモーターなどを利用し、組換えベクターの
一部にプラスミドＲ８Ｆ１０１０とその誘導体［イン・
ブラスミズ・オブ・メディカル、エンバイロナメンタル
・アンド・コマーシャル・インボータンス（Ｉｎ Ｐｌ
ａｓｍｉｄｓ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｎｐｏ
ｒｔａｎｃｅ ）、 ｐ４１１．１９７９年］の複製開
始領域を含ませれば良い。
該プロモーターとしてはカテコール−２゜３−オキシゲ
ナーゼ・プロモーターなどを利用し、組換えベクターの
一部にプラスミドＲ８Ｆ１０１０とその誘導体［イン・
ブラスミズ・オブ・メディカル、エンバイロナメンタル
・アンド・コマーシャル・インボータンス（Ｉｎ Ｐｌ
ａｓｍｉｄｓ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｎｐｏ
ｒｔａｎｃｅ ）、 ｐ４１１．１９７９年］の複製開
始領域を含ませれば良い。
本発明においては、以上に述べた方法で得られる組換え
ベクターを用いてそれぞれ対応する宿主菌を形質転換し
形質転換体を得るわけであるが、その際採用する形質転
換方法については、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、シュードモナス属細菌のそれぞれに応じた常法に従
えば良く、例えばバチルス属細菌バチルス・スフエリカ
スを形質転換する場合には、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー１３０．２０３（１９８４
）記載の方法に準じて形質転換を行えば良い。
ベクターを用いてそれぞれ対応する宿主菌を形質転換し
形質転換体を得るわけであるが、その際採用する形質転
換方法については、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、シュードモナス属細菌のそれぞれに応じた常法に従
えば良く、例えばバチルス属細菌バチルス・スフエリカ
スを形質転換する場合には、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー１３０．２０３（１９８４
）記載の方法に準じて形質転換を行えば良い。
本発明においては、このようにして得られた形質転換体
を培養しビオチンを産生させ、産生じたビオチンを分離
・精製するビオチンの製造法もまた提供される。ビオチ
ンの産生にあたっては前記組換えベクターを用いて形質
転換しようとする宿主菌体がデスチオビオチン生産能を
有するか否かによって、培養時に使用する培地に添加す
るビオチン前駆体が異なってくる。例えばデスチオビオ
チン生産能を実質的に有しないエシェリヒア属細菌をｐ
ｓＢ３０１で形質転換した形質転換体を培養してビオチ
ンを製造しようとする場合には実施例７に示すように培
地、にデスチオビオチンを添加する必要がある。一方、
バチルス・スフエリカス１ＦＯ３５２５やバチルス・ス
フエリカスＮＣｌ８９３７０などのごときビメリン酸や
アゼライン酸の、゛ようなデスチオビオチン前駆体を資
化してデスチオビオチンを生産することのできる細菌を
宿主とする場合には、必ずしもデスチオビオチンを添加
する必要がなく、デスチオビオチン前駆体としてのビメ
リン酸やアゼライン酸を培地に添加するだけでも良い。
を培養しビオチンを産生させ、産生じたビオチンを分離
・精製するビオチンの製造法もまた提供される。ビオチ
ンの産生にあたっては前記組換えベクターを用いて形質
転換しようとする宿主菌体がデスチオビオチン生産能を
有するか否かによって、培養時に使用する培地に添加す
るビオチン前駆体が異なってくる。例えばデスチオビオ
チン生産能を実質的に有しないエシェリヒア属細菌をｐ
ｓＢ３０１で形質転換した形質転換体を培養してビオチ
ンを製造しようとする場合には実施例７に示すように培
地、にデスチオビオチンを添加する必要がある。一方、
バチルス・スフエリカス１ＦＯ３５２５やバチルス・ス
フエリカスＮＣｌ８９３７０などのごときビメリン酸や
アゼライン酸の、゛ようなデスチオビオチン前駆体を資
化してデスチオビオチンを生産することのできる細菌を
宿主とする場合には、必ずしもデスチオビオチンを添加
する必要がなく、デスチオビオチン前駆体としてのビメ
リン酸やアゼライン酸を培地に添加するだけでも良い。
デスチオビオチンやその前駆体の添加量はとくに制限さ
れず、宿主菌体のビオチン産生能に応じて適宜選択すれ
ばよい。
れず、宿主菌体のビオチン産生能に応じて適宜選択すれ
ばよい。
本発明に係る微生物の培養に際して用いられる培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、グリセリン、フラクトース、シュー
クロース、マンドース、マンノース、澱粉、澱粉加水分
解液、糖蜜などの炭水化物が使用できる。また窒素源と
しては、アンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アン
モニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類
、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カ
ゼイン加水分解物、脱脂大豆粕やその消化物などの天然
有機窒素源などが使用可能である。天然有機窒素源の多
くの場合は、窒素源であるとともに炭素源にもなりうる
。さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸
第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マ
ンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモニウム、硫
酸などが使用で、きる。
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、グリセリン、フラクトース、シュー
クロース、マンドース、マンノース、澱粉、澱粉加水分
解液、糖蜜などの炭水化物が使用できる。また窒素源と
しては、アンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アン
モニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類
、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カ
ゼイン加水分解物、脱脂大豆粕やその消化物などの天然
有機窒素源などが使用可能である。天然有機窒素源の多
くの場合は、窒素源であるとともに炭素源にもなりうる
。さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸
第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マ
ンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモニウム、硫
酸などが使用で、きる。
また、造成された微生物に抗菌薬剤耐性が付与されてい
る場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによ
り、微生物の所有する抗菌薬剤耐性をマーカーとするプ
ラスミドＤＮＡの脱落を防止するとともに汚染菌の混入
を防ぐことができる。
る場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによ
り、微生物の所有する抗菌薬剤耐性をマーカーとするプ
ラスミドＤＮＡの脱落を防止するとともに汚染菌の混入
を防ぐことができる。
さらにデスチオビオチン前駆体からビオチンを主台・成
する過程において一部もしく全部の反応が培地中のビオ
チンによって抑制される場合は、ビオチンを除去した培
地を使うことが好ましい。またビオチンによるフィード
バックレブレツション作用を回避するために、デスチオ
ビオチン前駆体の添加を菌体の対数増殖期の末期に行う
ことが好ましい（特公昭６１−３２９５’９参照）。
する過程において一部もしく全部の反応が培地中のビオ
チンによって抑制される場合は、ビオチンを除去した培
地を使うことが好ましい。またビオチンによるフィード
バックレブレツション作用を回避するために、デスチオ
ビオチン前駆体の添加を菌体の対数増殖期の末期に行う
ことが好ましい（特公昭６１−３２９５’９参照）。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行うのが好ましく、通常２０〜４５℃で１日から５
日程度行なわれる・。・その際、ビオチン合成酵素遺伝
子を転写するプロモーターが、適度に働く条件が必要で
あり、例えばエシェリヒア属細菌においてＴｒｐ・プロ
モーターを用いる場合には・インドールアクリル酸を添
加することにより、プロモーターの転写活性を誘導する
こと・ができる。
下で行うのが好ましく、通常２０〜４５℃で１日から５
日程度行なわれる・。・その際、ビオチン合成酵素遺伝
子を転写するプロモーターが、適度に働く条件が必要で
あり、例えばエシェリヒア属細菌においてＴｒｐ・プロ
モーターを用いる場合には・インドールアクリル酸を添
加することにより、プロモーターの転写活性を誘導する
こと・ができる。
（発明の効果）
かくして本発明によれば、ビオチン産生能を有するバチ
ルス属細菌由□来のビオチン合成酵素をコードするＤＮ
Ａ断片が提供され、そのＤＮＡ断片を組み込んだ組換え
ベクターで細菌を形質転換（・または形質導入）するこ
とにより、ビオチン産生能に優れた細菌を得ることがで
き、さらにそれら細菌を培養して効率よくビオチンを製
造する方法が提供されることになる。
ルス属細菌由□来のビオチン合成酵素をコードするＤＮ
Ａ断片が提供され、そのＤＮＡ断片を組み込んだ組換え
ベクターで細菌を形質転換（・または形質導入）するこ
とにより、ビオチン産生能に優れた細菌を得ることがで
き、さらにそれら細菌を培養して効率よくビオチンを製
造する方法が提供されることになる。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１．９
（１）全ＤＮＡ断片の調製
バチルス争スフエリカスＩＦＯ３５２５のアクヂチアジ
ン酸及び５−（２−チエニル）−吉草酸併用耐性株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０９８）を１１のＬＢ培地（バクト
ドリプトン１％、イーストイクストラクト０．５％、Ｎ
ａＣＪ！１％、グルコース０．１％：ｐＨ７，５に調整
）中２８℃で約５時間振盪培養を行ない、対数増殖期に
菌体を遠心分離により集めた。この菌体からフェノール
法［バイオケミ・バイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。
ン酸及び５−（２−チエニル）−吉草酸併用耐性株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０９８）を１１のＬＢ培地（バクト
ドリプトン１％、イーストイクストラクト０．５％、Ｎ
ａＣＪ！１％、グルコース０．１％：ｐＨ７，５に調整
）中２８℃で約５時間振盪培養を行ない、対数増殖期に
菌体を遠心分離により集めた。この菌体からフェノール
法［バイオケミ・バイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。
Ｂ１１１）ｈｅ’ｓ、 Ａｃｔａ） Ｌ２．６１９〜．
１９７３年１により全ＤＮＡを抽出、Ｉ！製し、最終的
に全ＤＮＡ３．ＯＩＲｇを得た。
１９７３年１により全ＤＮＡを抽出、Ｉ！製し、最終的
に全ＤＮＡ３．ＯＩＲｇを得た。
得られた全ＤＮＡ５００μｑをとり、制限エンドヌクレ
アーゼＭｂｏＩを加え、３７℃、３０分間反応させて部
分的に切断し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動
にかけ、約４ｋｂから約１０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。
アーゼＭｂｏＩを加え、３７℃、３０分間反応させて部
分的に切断し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動
にかけ、約４ｋｂから約１０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し
た。
（２） ベクターｐＢＲ３２２の切断アンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性をマーカーとしてもつｐＢＲ
３２２（市販品、ファルマシア社Ｉａ）を制限エンドヌ
クレアーゼ３μｍＨＩで完全分解せしめた後、アルカリ
ホスファターゼで処理した。
性、テトラサイクリン耐性をマーカーとしてもつｐＢＲ
３２２（市販品、ファルマシア社Ｉａ）を制限エンドヌ
クレアーゼ３μｍＨＩで完全分解せしめた後、アルカリ
ホスファターゼで処理した。
（３）再結合反応
（１）テ調製しりＤ Ｎ Ａ断片（０，１μｇ）および
（２）でｍ製した開裂されたｐＢＲ３２２（０，１μ９
）を１０ｍＨＭＯ（、Ｊ！ 、１１１８ ＡＴＰお
よび１０１１８デチオスレイトールを含むｐＨ７，４の
５０ＩｌｌＨトリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．
３単位と共に混合し、４℃で一晩反応させることによっ
てＤＮＡ断片をＩ）ＢＲ３２２に組込んだハイブリッド
プラスミドを得た。
（２）でｍ製した開裂されたｐＢＲ３２２（０，１μ９
）を１０ｍＨＭＯ（、Ｊ！ 、１１１８ ＡＴＰお
よび１０１１８デチオスレイトールを含むｐＨ７，４の
５０ＩｌｌＨトリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．
３単位と共に混合し、４℃で一晩反応させることによっ
てＤＮＡ断片をＩ）ＢＲ３２２に組込んだハイブリッド
プラスミドを得た。
（４） ハイブリッドプラスミドの大腸菌への導入エ
シェリヒア・コリ［）Ｈｌ ［モレキュラー・クローニ
ング・ア・ラボラトリイ・マニュアル（Ｎｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ） ｐ 。
シェリヒア・コリ［）Ｈｌ ［モレキュラー・クローニ
ング・ア・ラボラトリイ・マニュアル（Ｎｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ） ｐ 。
５０５．１９８２年］を１００ａｅのφ培地（イースト
イクストラクト０．５％、バクトドリプトン２％、ＭＧ
ＳＯ４０，５％：ＥＩＨ７，６に調整）中３７℃で約５
時間振盪培養今行ない、対数増殖期に菌体を遠心分、Ｗ
ｔにより集めた。この菌体をｔｆｂ Ｉ液（３０１１１
８酢酸カリウム、１００ｍＭＲｂＣｊ！、１０ｍＨＣａ
ＣＪ！２．５０ｍＭＭｎＣＪ 、１５％グリセリン：
ｐＨ５，８に調整）４０１ｄで洗浄し、得られた菌体を
ｔｒｂ ｍ液（１０ｍＨＭＯＰ８．７５ｍＨＣａＣｊ！
２．１０ｍＭＲｂＣオ、１５％グリセリン；ｐＨ６，５
に調整）１０ｍに懸濁し、０℃で９０分間静置し、許容
（コンピテント）細胞とした。
イクストラクト０．５％、バクトドリプトン２％、ＭＧ
ＳＯ４０，５％：ＥＩＨ７，６に調整）中３７℃で約５
時間振盪培養今行ない、対数増殖期に菌体を遠心分、Ｗ
ｔにより集めた。この菌体をｔｆｂ Ｉ液（３０１１１
８酢酸カリウム、１００ｍＭＲｂＣｊ！、１０ｍＨＣａ
ＣＪ！２．５０ｍＭＭｎＣＪ 、１５％グリセリン：
ｐＨ５，８に調整）４０１ｄで洗浄し、得られた菌体を
ｔｒｂ ｍ液（１０ｍＨＭＯＰ８．７５ｍＨＣａＣｊ！
２．１０ｍＭＲｂＣオ、１５％グリセリン；ｐＨ６，５
に調整）１０ｍに懸濁し、０℃で９０分間静置し、許容
（コンピテント）細胞とした。
この許容細胞懸濁液０．２ｍに（３）で得たハイブリッ
ドプラスミド０．１μｊを加えて０℃で３０分間静置し
た。４２℃で９０秒間保った後、φ培地０．８＃ｄ！を
加えて３７℃で１時間培養したのち、この培養液０．１
−を１００μＳＦ／ｍｅアンピシリンを含むＬＢ培地の
１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて一晩培養した。
ドプラスミド０．１μｊを加えて０℃で３０分間静置し
た。４２℃で９０秒間保った後、φ培地０．８＃ｄ！を
加えて３７℃で１時間培養したのち、この培養液０．１
−を１００μＳＦ／ｍｅアンピシリンを含むＬＢ培地の
１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて一晩培養した。
次いで、出現したコロニー約２．５００１１爪楊枝で釣
菌し、１５μｇ／Ｉｄｌテトラサイクリンを含むＬＢ培
地の１．５％寒天培地に植菌し、３７℃にて一晩培養し
た。これより、アンピシリンを含む培地上にて生育可、
能であり、テトラサイクリ−３３−： ンを含む培地上では生育不可能なアンピシリン耐性、テ
トラサイクリン感受性株約１０００株を得た。
菌し、１５μｇ／Ｉｄｌテトラサイクリンを含むＬＢ培
地の１．５％寒天培地に植菌し、３７℃にて一晩培養し
た。これより、アンピシリンを含む培地上にて生育可、
能であり、テトラサイクリ−３３−： ンを含む培地上では生育不可能なアンピシリン耐性、テ
トラサイクリン感受性株約１０００株を得た。
（５） ハイブリッドブラスミ１ド♀単離かくして得
られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株を
５つのグループに分け（その各グループは約２００の異
なるハイブリッドプラスミドを含む）、５０μ９のアン
ピシリンを含むＬＢ培地５０ｄ中で３７℃で一晩振盪竺
養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。この菌体か
らビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドーリ−（Ｄｏ
ｌｙ）の方法［ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ＞ ７．１５１３〜
． （１９７９）］によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ベク
ターであるｐＢＲ３２２にバチルス・スフエリカスＩＦ
Ｑ３５２５より得た様々なりＮＡ断片が挿入されたもの
であり、このハイブリッドプラスミドＤＮＡ群における
挿入ＤＮＡ断片の平均鎖長は約６ｋｂであった。
られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株を
５つのグループに分け（その各グループは約２００の異
なるハイブリッドプラスミドを含む）、５０μ９のアン
ピシリンを含むＬＢ培地５０ｄ中で３７℃で一晩振盪竺
養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。この菌体か
らビルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドーリ−（Ｄｏ
ｌｙ）の方法［ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ＞ ７．１５１３〜
． （１９７９）］によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ベク
ターであるｐＢＲ３２２にバチルス・スフエリカスＩＦ
Ｑ３５２５より得た様々なりＮＡ断片が挿入されたもの
であり、このハイブリッドプラスミドＤＮＡ群における
挿入ＤＮＡ断片の平均鎖長は約６ｋｂであった。
（６） ビオチン要求性大腸菌へのハイブリッドプラ
スミドの導入 エシェリヒア・コリＣ６００からパイ（Ｐａｉ ）とり
ヒシュタイン（Ｌｉｃｈｓｔｅｉｎ ）の方法［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ ）９４、ｐ１９３０．１９６７年］に準じてＮ−
メチル−Ｎ’ −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変
異誘導処理し、デスチオビオチン（ＤＴＢ）からビオチ
ンへの生合成能を欠失した変異株エシェリヒア・コリに
３を得た。これを１００１１１１！のＬＢ培地中３７℃
で約２時開平振盪培養し、対□数増殖期に菌体を遠心分
離により集めた。この菌体をクシュナ−（Ｋｕｓｈｎｅ
ｒ ）の方法［ジエネテイツク・エンジニアリング（ａ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｏｉｎｅｅｒｉｎａ ） ｐ 。
スミドの導入 エシェリヒア・コリＣ６００からパイ（Ｐａｉ ）とり
ヒシュタイン（Ｌｉｃｈｓｔｅｉｎ ）の方法［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ ）９４、ｐ１９３０．１９６７年］に準じてＮ−
メチル−Ｎ’ −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変
異誘導処理し、デスチオビオチン（ＤＴＢ）からビオチ
ンへの生合成能を欠失した変異株エシェリヒア・コリに
３を得た。これを１００１１１１！のＬＢ培地中３７℃
で約２時開平振盪培養し、対□数増殖期に菌体を遠心分
離により集めた。この菌体をクシュナ−（Ｋｕｓｈｎｅ
ｒ ）の方法［ジエネテイツク・エンジニアリング（ａ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｏｉｎｅｅｒｉｎａ ） ｐ 。
１７．１９７８年］により許容細胞とした。
次に（５）で得たハイブリッドプラスミドＤＮＡ群を各
グループごとに０．１μ９ずつ上記許容細胞懸濁液０．
２ｄに加えて０℃で３０分門静置した。
グループごとに０．１μ９ずつ上記許容細胞懸濁液０．
２ｄに加えて０℃で３０分門静置した。
４３．５℃で３０秒間保った後、ＬＢ培地１．８−を加
えて３７℃で１時間培養したのち、遠心分離によって集
菌した。この菌体をｏ、８５％ＮａＣｆで２回洗浄した
後、ｏ、８５％ＮａＣｆ１１１ｄに懸濁した。次に菌体
懸濁液０．１ｄを５０μｇ／Ｉｄアンピシリンを含むＯ
Ａ培地［グリセリン２％、カザミノＩＩ（ビタミンフリ
゛−）１％、Ｋ２ ＨＰ’０４０．２％、ＫＨ２ＰＯ４
０，１％、ＭＧＳＯ４・７Ｈ２００，００５％、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１％、 ＭｎＳＯ４−４〜６８２０ ０．００１％、チアミン塩
酸塩０．００００１％］の１．５％寒天培地に塗抹し、
３７℃にて二晩培養した。生じた２つのコロニーはアン
ピシリン耐性、ビオチン非要求性であり、かくして目的
とするビオチンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａを組込んだハイブリッドプラスミドによる形質転換株
２株を得た。
えて３７℃で１時間培養したのち、遠心分離によって集
菌した。この菌体をｏ、８５％ＮａＣｆで２回洗浄した
後、ｏ、８５％ＮａＣｆ１１１ｄに懸濁した。次に菌体
懸濁液０．１ｄを５０μｇ／Ｉｄアンピシリンを含むＯ
Ａ培地［グリセリン２％、カザミノＩＩ（ビタミンフリ
゛−）１％、Ｋ２ ＨＰ’０４０．２％、ＫＨ２ＰＯ４
０，１％、ＭＧＳＯ４・７Ｈ２００，００５％、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１％、 ＭｎＳＯ４−４〜６８２０ ０．００１％、チアミン塩
酸塩０．００００１％］の１．５％寒天培地に塗抹し、
３７℃にて二晩培養した。生じた２つのコロニーはアン
ピシリン耐性、ビオチン非要求性であり、かくして目的
とするビオチンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａを組込んだハイブリッドプラスミドによる形質転換株
２株を得た。
（７） ハイブリッドプラスミドの解析（６）で得ら
れた形質転換株２株を５０μ９／ｒｄアンピシリンを含
むＣＡ培地５＃Ｉｌ！中で一晩振盪培養して遠心分離で
集菌後、前述のビルンボイムとド一り−の方法によりハ
イブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。
れた形質転換株２株を５０μ９／ｒｄアンピシリンを含
むＣＡ培地５＃Ｉｌ！中で一晩振盪培養して遠心分離で
集菌後、前述のビルンボイムとド一り−の方法によりハ
イブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。
それぞれの株から得られたハイブリッドプラスミドＤＮ
Ａは、共に全鎖長的１２．５ｋｂであり、約８．２ｋｂ
のＤＮＡ断片が挿入されていた。この２つのハイブリッ
ドプラスミドＤＮＡについて、各種の制限エンドヌクレ
アーゼ（ＢａｍＨＩ、）１ｉｎｄｌ［［、ＰＳｔＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、３ａｊ！Ｉ）による切断パターンを作成し比
較したところ、まったく同一のパターンを有しているこ
とから２つのハイブリッドプラスミドＤＮＡは同一のも
のであることが判明した。なお、このハイブリッドプラ
スミドはＢＱＪ！ＩＩ、ｘｈＯ工、ＫＤｎＩによる切断
点を有していないことも確認された。このハイブリッド
プラスミドＤＮＡをＩ）ＳＢＯｌと命名し、その制限エ
ンドヌクレアーゼ切断地図を第１図に示す。なお、第１
図中の数字はｂｐの概略値を示したものである。
Ａは、共に全鎖長的１２．５ｋｂであり、約８．２ｋｂ
のＤＮＡ断片が挿入されていた。この２つのハイブリッ
ドプラスミドＤＮＡについて、各種の制限エンドヌクレ
アーゼ（ＢａｍＨＩ、）１ｉｎｄｌ［［、ＰＳｔＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、３ａｊ！Ｉ）による切断パターンを作成し比
較したところ、まったく同一のパターンを有しているこ
とから２つのハイブリッドプラスミドＤＮＡは同一のも
のであることが判明した。なお、このハイブリッドプラ
スミドはＢＱＪ！ＩＩ、ｘｈＯ工、ＫＤｎＩによる切断
点を有していないことも確認された。このハイブリッド
プラスミドＤＮＡをＩ）ＳＢＯｌと命名し、その制限エ
ンドヌクレアーゼ切断地図を第１図に示す。なお、第１
図中の数字はｂｐの概略値を示したものである。
次にｐｓＢＯ１プラスミドＤＮＡに挿入されているＤＮ
Ａ断片がバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤＮ
Ａ断片であることを証明する為に、サザン・ハイブリダ
イゼーションを行なった。まず、（１）で抽出、精製し
た全ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断
せしめたのち、生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ）の方法［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ、Ｈｏ１． Ｒｉｏ
ｔ、） ９８ 、１） ５０３．１９７５年］によりニ
ド０セルＯ−スフイルターに移行した。これとは別にｐ
＄８０１プラスミドＤＮＡ１μびを Ｐにより標識して
プローブＤＮＡとした。調製はリグビー（Ｒｉａｂｙ
）らの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ、Ｈｏ１． Ｂｉｏｌ ） １１３． ｐ２
３７．１９７７年］に従ってニックトランスレージジョ
ンにより行ない、１１４Ｘ１０ ＣＤｍ／μ９ＤＮＡ
の比活性を有するプローブＤＮＡを得た。このプローブ
ＤＮＡ０．１μグを使用して、先に用意したニトロセル
ロースフィルターに対して以下の手順に従いハイブリダ
イゼーションを行なった。まずフィルターとＳＳＣ（０
，１５ＭＮａＣＪ！。
Ａ断片がバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤＮ
Ａ断片であることを証明する為に、サザン・ハイブリダ
イゼーションを行なった。まず、（１）で抽出、精製し
た全ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断
せしめたのち、生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ）の方法［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ、Ｈｏ１． Ｒｉｏ
ｔ、） ９８ 、１） ５０３．１９７５年］によりニ
ド０セルＯ−スフイルターに移行した。これとは別にｐ
＄８０１プラスミドＤＮＡ１μびを Ｐにより標識して
プローブＤＮＡとした。調製はリグビー（Ｒｉａｂｙ
）らの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ、Ｈｏ１． Ｂｉｏｌ ） １１３． ｐ２
３７．１９７７年］に従ってニックトランスレージジョ
ンにより行ない、１１４Ｘ１０ ＣＤｍ／μ９ＤＮＡ
の比活性を有するプローブＤＮＡを得た。このプローブ
ＤＮＡ０．１μグを使用して、先に用意したニトロセル
ロースフィルターに対して以下の手順に従いハイブリダ
イゼーションを行なった。まずフィルターとＳＳＣ（０
，１５ＭＮａＣＪ！。
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）の６倍濃縮液とｏｅ
ｎｈａｒｄｔ液（０，０２％ウシ血清アルブミン、０．
０２％ポリビニールピロリドン、０．０２％フィコール
）からなる予備的ハイブリダイゼーションバッファー２
０ｄに熱処理したサケ精子ＤＮＡを２０μｇ／ｌｌｉ！
となるように加えて得られた混液とを用い６５℃で４時
間予備的ハイブリダイゼーションを行なった。その後、
ＳＳＣの６倍濃縮液とＤｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％Ｓ
ＤＳからなるハイブリダイゼーションバッファー２０ｍ
に熱処理したサケ精子ＤＮＡを５０μ９／ｒｄとなるよ
うに加え、熱処理したプローブＤＮＡ０．１μ９を更に
加えて、６７℃で１晩ハイブリダイゼーシヨンした。次
いでフィルターをハイブリダイゼーションバッファーで
よく洗い、更にＳＳＣの６倍濃縮液中６５℃で３０分間
洗い、ＳＳＣの２倍濃縮液中６５℃で３０分間洗い、こ
れを２回繰返した後風乾後オートラジオグラフィーした
。この結果、全ＤＮＡ中にこのプローブＤＮＡに対して
反応する断片があることが１１認され、ｐＳＢＯ１プラ
スミドＤＮＡ中の約８．２ｋｂ挿入ＤＮＡ断片はバチル
ス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤＮＡ断片であるこ
とが証明された。
ｎｈａｒｄｔ液（０，０２％ウシ血清アルブミン、０．
０２％ポリビニールピロリドン、０．０２％フィコール
）からなる予備的ハイブリダイゼーションバッファー２
０ｄに熱処理したサケ精子ＤＮＡを２０μｇ／ｌｌｉ！
となるように加えて得られた混液とを用い６５℃で４時
間予備的ハイブリダイゼーションを行なった。その後、
ＳＳＣの６倍濃縮液とＤｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％Ｓ
ＤＳからなるハイブリダイゼーションバッファー２０ｍ
に熱処理したサケ精子ＤＮＡを５０μ９／ｒｄとなるよ
うに加え、熱処理したプローブＤＮＡ０．１μ９を更に
加えて、６７℃で１晩ハイブリダイゼーシヨンした。次
いでフィルターをハイブリダイゼーションバッファーで
よく洗い、更にＳＳＣの６倍濃縮液中６５℃で３０分間
洗い、ＳＳＣの２倍濃縮液中６５℃で３０分間洗い、こ
れを２回繰返した後風乾後オートラジオグラフィーした
。この結果、全ＤＮＡ中にこのプローブＤＮＡに対して
反応する断片があることが１１認され、ｐＳＢＯ１プラ
スミドＤＮＡ中の約８．２ｋｂ挿入ＤＮＡ断片はバチル
ス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤＮＡ断片であるこ
とが証明された。
一方、エシェリヒア・コリのビオチンオペロンをプロー
ブとしてギブス（Ｇｉｂｂｓ ）らの方法［プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミツクφサイエンス
・イン・Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ブとしてギブス（Ｇｉｂｂｓ ）らの方法［プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミツクφサイエンス
・イン・Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）迂ユ、ｐ３３６５．１
９８４年］に従って、バチルス・スフエリカスＩ ＦＯ
３５２５全［）ＮＡのＥｃｏＲ工切５Ｉｌｉ片に対し、
サザン・ハイブリダイゼーションを実施したが、ＤＮＡ
間に相補性があればハイブリダイズする条件下でもハイ
ブリダイズしなかったので、エシェリヒア・コリのビオ
チンオペロンとバチルス・スフエリカスのＤＮＡとの間
では相補性が極めて低い事、それ故１）ＳＢＯｌの挿入
ＤＮＡ断片はエシェリヒア・コリのものとは大きく異な
る事が判明した。
９８４年］に従って、バチルス・スフエリカスＩ ＦＯ
３５２５全［）ＮＡのＥｃｏＲ工切５Ｉｌｉ片に対し、
サザン・ハイブリダイゼーションを実施したが、ＤＮＡ
間に相補性があればハイブリダイズする条件下でもハイ
ブリダイズしなかったので、エシェリヒア・コリのビオ
チンオペロンとバチルス・スフエリカスのＤＮＡとの間
では相補性が極めて低い事、それ故１）ＳＢＯｌの挿入
ＤＮＡ断片はエシェリヒア・コリのものとは大きく異な
る事が判明した。
（８）形質転換の再現性の確認
１）ＳＢＯ１プラスミドＤＮＡを用いて（６）で述べた
方法によりエシェリヒア・コリに３を再度形質＝ ４０
− 転換したところ、ｐｓＢＯｌをプラスミドとして所有す
るエシェリヒア・コリに３すべてがアンピシリン耐性、
ビオチン非要求性となった。これより、ｐｓＢＯ１プラ
スミドＤＮＡはエシェリヒア・コリに３のデスチオビオ
チンからビオチンへの生合成能欠失を相補しうる遺伝情
報を持ったバチルス・スフエリカスＩ’ＦＯ３５２５の
ＤＮＡ断片を少なくとも所有していることが判明した。
方法によりエシェリヒア・コリに３を再度形質＝ ４０
− 転換したところ、ｐｓＢＯｌをプラスミドとして所有す
るエシェリヒア・コリに３すべてがアンピシリン耐性、
ビオチン非要求性となった。これより、ｐｓＢＯ１プラ
スミドＤＮＡはエシェリヒア・コリに３のデスチオビオ
チンからビオチンへの生合成能欠失を相補しうる遺伝情
報を持ったバチルス・スフエリカスＩ’ＦＯ３５２５の
ＤＮＡ断片を少なくとも所有していることが判明した。
このｐＳＢＯ１ＳＢＯ１プラスミドＤＮＡミドとして所
有するエシェリヒア・コリに３をエシェリヒア・コリに
３ （ｐｓＢＯｌ ）と命名した。なお、この菌はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０９９として微工研に寄託されている
。
有するエシェリヒア・コリに３をエシェリヒア・コリに
３ （ｐｓＢＯｌ ）と命名した。なお、この菌はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０９９として微工研に寄託されている
。
実施例２゜
（１） ハイブリッドプラスミドの再構築実施例１で
得たｐｓＢＯ１プラスミドＤＮＡＩμグな制限エンドヌ
クレアーゼＥＣ０ＲＩで完全分解し、得られた３種のＤ
ＮＡ断片の混合物１μ９を１０ｍＨＭＱＣｊ！２．１＋
１１８ ＡＴＰおよび１０ｍＨデチオスレイトールを
含むＥｌｆ（７，４の５０ｍＨｔ−リス−塩酸中でＴ４
ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応さ
せることにより再結合を行った。
得たｐｓＢＯ１プラスミドＤＮＡＩμグな制限エンドヌ
クレアーゼＥＣ０ＲＩで完全分解し、得られた３種のＤ
ＮＡ断片の混合物１μ９を１０ｍＨＭＱＣｊ！２．１＋
１１８ ＡＴＰおよび１０ｍＨデチオスレイトールを
含むＥｌｆ（７，４の５０ｍＨｔ−リス−塩酸中でＴ４
ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応さ
せることにより再結合を行った。
（２） ビオチン要求性大腸菌の形質転換上記のＴ４
ＤＮＡリガーゼによる反応混合物０．１μ９を用いるこ
と以外は実施例１の（６）と同様にしてハイブリッドプ
ラスミドによる形質転換株を得た。
ＤＮＡリガーゼによる反応混合物０．１μ９を用いるこ
と以外は実施例１の（６）と同様にしてハイブリッドプ
ラスミドによる形質転換株を得た。
（３）ハイブリッドプラスミドの解析
（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｒｄアンピシ
リンを含むＣＡ培地５＃ｌｌ！中で一晩振盪培養して遠
心分離で集菌後、前述のビルンボイムとドーリ−の方法
によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出
したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長的８
．８Ｓｔｂであり、ｐＳＢＯ１ＳＢＯ１プラスミドＤＮ
Ａ、７ｋｂのＥＣ０Ｒ１切断断片が欠落したものであっ
た。このハイブリッドプラスミドをｐＳＢＯ３と命名し
、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２図に示す
。
リンを含むＣＡ培地５＃ｌｌ！中で一晩振盪培養して遠
心分離で集菌後、前述のビルンボイムとドーリ−の方法
によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出
したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長的８
．８Ｓｔｂであり、ｐＳＢＯ１ＳＢＯ１プラスミドＤＮ
Ａ、７ｋｂのＥＣ０Ｒ１切断断片が欠落したものであっ
た。このハイブリッドプラスミドをｐＳＢＯ３と命名し
、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２図に示す
。
このｐＳＢＯ３プラスミドＤＮＡを所有する工シエリヒ
ア・コリに３をエシェリヒア・コリに３（ｐｓＢＯ３）
と命名した。（ＦＥＲＭ Ｐ−８３６９）。
ア・コリに３をエシェリヒア・コリに３（ｐｓＢＯ３）
と命名した。（ＦＥＲＭ Ｐ−８３６９）。
実施例３゜
（１） ハイブリッドプラスミドの再構築実施例２で
得たｐｓＢＯ３プラスミドＤＮＡ３μグを制限エンドヌ
クレアーゼＨｉ ｎｄｌｌ［で完全分解した。これとは
別にＩ）ＢＲ３２２１μ９を制限エンドヌクレアーゼＨ
ｉ ｎｄｌ［［で完全分解した。次いで１）ＳＢＯ３を
切断して得られた３種のＤＮＡ断片の混合物（１μｇ）
と開裂されたｐＢＲ３２２＜１ｕ９）を１０ｍＨＭａＣ
ｊ！２．１ｍＨＡＴＰおよび１Ｑｎ＋Ｈデチオスレイト
ールを含むｐＨ７，４の５０ＩＩＩＭトリスー塩酸中で
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、反応混合物を
調製した。これを夫々４℃で一晩反応させることによっ
てハイブリッドプラスミドを得た。
得たｐｓＢＯ３プラスミドＤＮＡ３μグを制限エンドヌ
クレアーゼＨｉ ｎｄｌｌ［で完全分解した。これとは
別にＩ）ＢＲ３２２１μ９を制限エンドヌクレアーゼＨ
ｉ ｎｄｌ［［で完全分解した。次いで１）ＳＢＯ３を
切断して得られた３種のＤＮＡ断片の混合物（１μｇ）
と開裂されたｐＢＲ３２２＜１ｕ９）を１０ｍＨＭａＣ
ｊ！２．１ｍＨＡＴＰおよび１Ｑｎ＋Ｈデチオスレイト
ールを含むｐＨ７，４の５０ＩＩＩＭトリスー塩酸中で
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、反応混合物を
調製した。これを夫々４℃で一晩反応させることによっ
てハイブリッドプラスミドを得た。
（２） ビオチン要求性大腸菌の形質転換上記の反応
混合物１μ９を用いること以外は実施例１の（６）と同
様にしてハイブリッドプラスミドによる形質転換株を得
た。
混合物１μ９を用いること以外は実施例１の（６）と同
様にしてハイブリッドプラスミドによる形質転換株を得
た。
（３） ハイブリッドプラスミドの解析（２）で得ら
れた形質転換株を５０μｇ／１ｌＥｉ！アンピシリンを
含むＣＡ培地５ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブ
リッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミ
ドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長的６．２ｋｂであっ
た。このプラスミドはＩ）ＳＢＯ３ＤＮＡの約２．０ｋ
ｂｈ＋ｎｄｍ切断断片が挿入されたものであり、ｐｓＢ
１６と命名した。その制限エンドヌクレアーゼ切断地図
は第３図に示すとうりである。
れた形質転換株を５０μｇ／１ｌＥｉ！アンピシリンを
含むＣＡ培地５ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブ
リッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミ
ドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長的６．２ｋｂであっ
た。このプラスミドはＩ）ＳＢＯ３ＤＮＡの約２．０ｋ
ｂｈ＋ｎｄｍ切断断片が挿入されたものであり、ｐｓＢ
１６と命名した。その制限エンドヌクレアーゼ切断地図
は第３図に示すとうりである。
この挿入断片中に含まれるバチルス舎スフエリカスＩＦ
０３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩからＨ＋ ｎｄ
ｌ［［までの約１．５ｋｂであり、その詳細な制限エン
ドヌクレアーゼ切断地図は第４図に示すとうりである。
０３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩからＨ＋ ｎｄ
ｌ［［までの約１．５ｋｂであり、その詳細な制限エン
ドヌクレアーゼ切断地図は第４図に示すとうりである。
この約１．５ｋｂＤＮＡ断片をさらに調査するためにＭ
１３ファージを用いたメツシングらの方法［ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）１９．Ｉ）２６９．１９８２年。
１３ファージを用いたメツシングらの方法［ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）１９．Ｉ）２６９．１９８２年。
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ） ２１４． ｌ）１２
０５．１９８１年１により配列分析を行った。その塩基
配列は第５図に示すとうりであり、ＭｂｏＩ側の５′末
端からＨｉｎｄｌｌＩ側の３′末端に向かって一つの大
きなオーブンリーディングフレームを保有し、具体的に
は５′末端から第２８２〜２８４番目の翻訳開始コドン
ＧＴＧに続いて３３２のコドンがつながっている。また
翻訳開始コドンの上流の塩基配列とバチルス・ズブチル
スについて既知の１６８リボゾームＲＮＡの配列とを対
比することにより、第２６５〜２７８番目の配列がシヤ
イン−ダルガノ配列に相当することが′ＭＩ認できた。
０５．１９８１年１により配列分析を行った。その塩基
配列は第５図に示すとうりであり、ＭｂｏＩ側の５′末
端からＨｉｎｄｌｌＩ側の３′末端に向かって一つの大
きなオーブンリーディングフレームを保有し、具体的に
は５′末端から第２８２〜２８４番目の翻訳開始コドン
ＧＴＧに続いて３３２のコドンがつながっている。また
翻訳開始コドンの上流の塩基配列とバチルス・ズブチル
スについて既知の１６８リボゾームＲＮＡの配列とを対
比することにより、第２６５〜２７８番目の配列がシヤ
イン−ダルガノ配列に相当することが′ＭＩ認できた。
なおｐＳＢ１６プラスミドＤＮＡを所有するエシェリヒ
ア・コリに３をエシェリヒア・コリに３（ｐｓＢ１６）
と命名した。
ア・コリに３をエシェリヒア・コリに３（ｐｓＢ１６）
と命名した。
実施例４゜
エシェリヒア・コリに３ （ＤＳＢＯｌ ’） 、エシ
ェリヒア・コリに３ （ｐＳＢＯ３） 、エシェリヒア
・コリに３ （ｐｓＢ１６）及びｐＢＲ３２２をプラス
ミドとして所有するエシェリヒア・コリＣ６００（ｐＢ
Ｒ３２２）の４種の菌株を、５０μｇ／ｄのアンピシリ
ンと１０μＳＦ／ｄのＤＬ−デスチオビオチンを含むＧ
Ｐ培地［グリセリン２％、プロテオース・ペプトン３％
、カザミノ酸（ビタミンフリー）０．５％、Ｋ ＨＰ
Ｏ４０，１％、ＫＣｊｔ ０．０５％、ＭｎＳＯ４・
、７）１ ０ ０．０５％、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ
Ｏ０，００１％、Ｆｅ５０ ・７日２００．００１％、
チアミン塩酸塩０．０００００２％、ｐＨ７，０］３−
にそれぞれ植菌し、３７℃で４日間振盪培養した。
ェリヒア・コリに３ （ｐＳＢＯ３） 、エシェリヒア
・コリに３ （ｐｓＢ１６）及びｐＢＲ３２２をプラス
ミドとして所有するエシェリヒア・コリＣ６００（ｐＢ
Ｒ３２２）の４種の菌株を、５０μｇ／ｄのアンピシリ
ンと１０μＳＦ／ｄのＤＬ−デスチオビオチンを含むＧ
Ｐ培地［グリセリン２％、プロテオース・ペプトン３％
、カザミノ酸（ビタミンフリー）０．５％、Ｋ ＨＰ
Ｏ４０，１％、ＫＣｊｔ ０．０５％、ＭｎＳＯ４・
、７）１ ０ ０．０５％、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ
Ｏ０，００１％、Ｆｅ５０ ・７日２００．００１％、
チアミン塩酸塩０．０００００２％、ｐＨ７，０］３−
にそれぞれ植菌し、３７℃で４日間振盪培養した。
培養後、培養液１ｄを遠芯分離して菌体を沈殿させ、そ
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトバシルス・ブランクラム（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定量法により上清中に蓄積し
たビオチンを定量した。各々の菌株によるビオチンの蓄
積量を第１表に示す。
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトバシルス・ブランクラム（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定量法により上清中に蓄積し
たビオチンを定量した。各々の菌株によるビオチンの蓄
積量を第１表に示す。
第１表
第１表の結果から、本発明の微生物はエシェリヒア・コ
リＣ６００（ＤＢＲ３２２）に比べ大量のヒオチンを培
地中に蓄積することが明らかである。
リＣ６００（ＤＢＲ３２２）に比べ大量のヒオチンを培
地中に蓄積することが明らかである。
４７ 一
実施例５゜
（１）ハイブリッドプラスミドｏｓＢ１０３の構築実施
例３で用いたｐＢＲ３２２に代えてアンピシリン耐性を
マーカーとしてもっ１）ＵＯ３（市販品、ファルマシア
社製）を用いること以外は実施例３と同様にして実験を
行い、ｐＳＢ１６の場合と同様に約２．ＯｋｂのＤＮＡ
断片を挿入した全鎖長的４．６ｋｂのハイブリッドプラ
スミド（ｐｓＢ１０３）を得た（第６図参照）。このｐ
ＳＢ１０３によって形質転換されたエシェリヒア・コリ
に３をニジエリコア・コリに３ （ｐＳＢ１０３）と命
名した。
例３で用いたｐＢＲ３２２に代えてアンピシリン耐性を
マーカーとしてもっ１）ＵＯ３（市販品、ファルマシア
社製）を用いること以外は実施例３と同様にして実験を
行い、ｐＳＢ１６の場合と同様に約２．ＯｋｂのＤＮＡ
断片を挿入した全鎖長的４．６ｋｂのハイブリッドプラ
スミド（ｐｓＢ１０３）を得た（第６図参照）。このｐ
ＳＢ１０３によって形質転換されたエシェリヒア・コリ
に３をニジエリコア・コリに３ （ｐＳＢ１０３）と命
名した。
（２） ハイブリッドプラスミドｐｓＢ３０１の構築
（第６図参照） Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペレーター領域にｂｉ
ｏ３遺伝子を直結するために以下の操作を行った。ｐｓ
Ｂ１０３を制限エンドヌクレアーゼＭａｅＩで完全分解
せしめた後、分解したＤＮＡ断片（２，０／ｌｚｇ）を
３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、２５０ｍＨＮ
ａＣｊ！、１ｍＭＺｎＳ０４．５％グリセロール中で８
１ヌクレア一ゼ１単位と混合し、３７℃、３０分間反応
させることによってＤＮＡ断片の両端末を平滑にした。
（第６図参照） Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペレーター領域にｂｉ
ｏ３遺伝子を直結するために以下の操作を行った。ｐｓ
Ｂ１０３を制限エンドヌクレアーゼＭａｅＩで完全分解
せしめた後、分解したＤＮＡ断片（２，０／ｌｚｇ）を
３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、２５０ｍＨＮ
ａＣｊ！、１ｍＭＺｎＳ０４．５％グリセロール中で８
１ヌクレア一ゼ１単位と混合し、３７℃、３０分間反応
させることによってＤＮＡ断片の両端末を平滑にした。
次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約２，
１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
一方Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペレーターを含み
、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつｐＤＲ７２０
（市販品、ファルマ、シア社製）を制限エンドヌクレア
ーゼＳｍａＩで完全分解せしめた後、アルカリホスファ
ターゼで処理した。
、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつｐＤＲ７２０
（市販品、ファルマ、シア社製）を制限エンドヌクレア
ーゼＳｍａＩで完全分解せしめた後、アルカリホスファ
ターゼで処理した。
アガロースゲルより回収した約２．１ｋｂのＤＮＡ断片
（０，１μｇ）と開裂されたｐＤＲ７２０（０，１μｇ
）を１０ｍＨＭＱＣｊ！ 、１ｍＮＡＴＰおよび１０
ＩＩＩＭデチオスレイトールを含むＤＨ７，４の５０１
１１８トリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共
に混合し、１５℃で４時間反応させることによってハイ
ブリッドプラスミドを含む反応混合物を得た。
（０，１μｇ）と開裂されたｐＤＲ７２０（０，１μｇ
）を１０ｍＨＭＱＣｊ！ 、１ｍＮＡＴＰおよび１０
ＩＩＩＭデチオスレイトールを含むＤＨ７，４の５０１
１１８トリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共
に混合し、１５℃で４時間反応させることによってハイ
ブリッドプラスミドを含む反応混合物を得た。
この反応混合物０．２μグを用いること以外は実側１の
（６）と同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質
転換株を得た。
（６）と同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質
転換株を得た。
得られた形質転換株を５０μｇ／ｄアンピシリンを含む
ＬＢ培地３ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後、
ビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブリッドプラ
スミドＤＮＡを抽出した。
ＬＢ培地３ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後、
ビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブリッドプラ
スミドＤＮＡを抽出した。
抽出、したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長
的′６．１ｋｂであった。このプラスミドはＴｒｐプロ
モーターの転写開始部位の約７０塩基下流からバチルス
・スフエリカス由来のビオチン合成酵素遺伝子の翻訳間
・始コドンＧＴＧが始まっていた。これをｐｓＢ３０１
と命名した。
的′６．１ｋｂであった。このプラスミドはＴｒｐプロ
モーターの転写開始部位の約７０塩基下流からバチルス
・スフエリカス由来のビオチン合成酵素遺伝子の翻訳間
・始コドンＧＴＧが始まっていた。これをｐｓＢ３０１
と命名した。
マンデル（Ｈａｎｄｅ ｌ ）とセガ・（旧ａａ）の方
法しジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（
Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、）５３． ｐ１５４．１９７０
年］に準じて、エシェリヒア・コリＭＣ１６９［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー、１４３．ｐ８５２．１
９８０年］をｐＳＢ３０１で形質転換し、得られた形質
転換体をエシェリヒア・コリＭＣ１６９（ｐｓＢ３０１
）と命名したわ 、実施例６゜ バチルス・リケニフオルミスのα−アミラーゼ遺伝子プ
ロモーター領域にビオチン合成酵素遺伝子を直結するた
めに以下の操作を行った。
法しジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（
Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、）５３． ｐ１５４．１９７０
年］に準じて、エシェリヒア・コリＭＣ１６９［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー、１４３．ｐ８５２．１
９８０年］をｐＳＢ３０１で形質転換し、得られた形質
転換体をエシェリヒア・コリＭＣ１６９（ｐｓＢ３０１
）と命名したわ 、実施例６゜ バチルス・リケニフオルミスのα−アミラーゼ遺伝子プ
ロモーター領域にビオチン合成酵素遺伝子を直結するた
めに以下の操作を行った。
（１） ｐ Ｂ ＨＢ １０の構築
ｐｓＢ１０３を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌ［［
で完全分解せしめた後、反応物をアガロースゲル電気泳
動にかけ、約２．０に、ｂ（７）ＤＮＡ断片を回収した
。このＤＮＡ断片２．０μグに制限エンドヌクレアーゼ
Ｍａｅｌを加え、４５℃、１０分間反応させて部分的に
切断し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約１，２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
で完全分解せしめた後、反応物をアガロースゲル電気泳
動にかけ、約２．０に、ｂ（７）ＤＮＡ断片を回収した
。このＤＮＡ断片２．０μグに制限エンドヌクレアーゼ
Ｍａｅｌを加え、４５℃、１０分間反応させて部分的に
切断し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約１，２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
一方、全自動合成＠ （Ｇｅｎｅｔ Ａ−ｍ、日本ゼオ
ン社製）を用いて第７図に示すごときオリゴヌクレオチ
ドのフラグメントＢｂＯｊ！−１とＢｂＱｊ！−２を得
た。このうち、Ｂｂｏｊ！−１フラグメント１μ３を５
０ｍＨｔ−リス塩酸（ｐＨ７，６） 、１０ｍ）４Ｍａ
Ｃｊ！２．５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＨスペ
ルミジン中でＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドカイネ
ース１単位を用いて、３７℃、３０分間反応させて５′
−末端の水酸基をリン酸化したのち、ＢｂＱＪ！−２フ
ラグメント１μｑを加え、アニ−リグさせた。
ン社製）を用いて第７図に示すごときオリゴヌクレオチ
ドのフラグメントＢｂＯｊ！−１とＢｂＱｊ！−２を得
た。このうち、Ｂｂｏｊ！−１フラグメント１μ３を５
０ｍＨｔ−リス塩酸（ｐＨ７，６） 、１０ｍ）４Ｍａ
Ｃｊ！２．５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＨスペ
ルミジン中でＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドカイネ
ース１単位を用いて、３７℃、３０分間反応させて５′
−末端の水酸基をリン酸化したのち、ＢｂＱＪ！−２フ
ラグメント１μｑを加え、アニ−リグさせた。
次いで、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつＩ）Ｕ
Ｃｌ３（市販品、ファルマシア社製）を制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌ［［で完全分解せしめ
た後、アルカリホスファターゼで処理した。
Ｃｌ３（市販品、ファルマシア社製）を制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌ［［で完全分解せしめ
た後、アルカリホスファターゼで処理した。
開裂された約２．７ｋｂのｐＵｃｌ ８ＤＮＡ断片１μ
９と先にアニーリングした合成フラグメントｅ１０ｍＨ
ＭＯＣｊ！ 、１ｍＨＡＴＰ＃にび１０ｍＨデチオス
レイトールを含むｐＨ７，４の５０ｍＭトリス−塩酸中
でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、１５℃で２
時間反応させ、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次いで、回収
したＤＮＡ断片（０，４μｇ）と先に調製した約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片（０，０１５μｇ）を上記と同じ組成
の反応液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、
１５℃で３時間反応させた。
９と先にアニーリングした合成フラグメントｅ１０ｍＨ
ＭＯＣｊ！ 、１ｍＨＡＴＰ＃にび１０ｍＨデチオス
レイトールを含むｐＨ７，４の５０ｍＭトリス−塩酸中
でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、１５℃で２
時間反応させ、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次いで、回収
したＤＮＡ断片（０，４μｇ）と先に調製した約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片（０，０１５μｇ）を上記と同じ組成
の反応液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、
１５℃で３時間反応させた。
この反応混合物を用いること以外は実施例１の（６）と
同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質転換株を
得た。
同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質転換株を
得た。
得られた形質転換株を５０μｇ／Ｉｄアンピシリンを含
むＬＢ培地３ｄ中て一晩振盪培養して遠心分離で集菌後
、ビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。
むＬＢ培地３ｄ中て一晩振盪培養して遠心分離で集菌後
、ビルンボイムとドーリ−の方法によりハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出した各々のプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩと）ｌ ｉ ｎｄｌ［［で完全分解せし
めた後、アガロースゲル電気泳動にかけたところ、合成
りＮＡとバチルス・スフエリカス由来のｐＳＢｌ ０３
から調製した約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を含む約１．３
ｋｂのＤＮＡ断片とｐＬＩＣｌ ８由来の２．７ｋｂの
２断片からなる約４．ＯｋｂのプラスミドＤＮＡを得た
。これをｐＢＨ８１０と命名した。
ーゼＢａｍＨＩと）ｌ ｉ ｎｄｌ［［で完全分解せし
めた後、アガロースゲル電気泳動にかけたところ、合成
りＮＡとバチルス・スフエリカス由来のｐＳＢｌ ０３
から調製した約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を含む約１．３
ｋｂのＤＮＡ断片とｐＬＩＣｌ ８由来の２．７ｋｂの
２断片からなる約４．ＯｋｂのプラスミドＤＮＡを得た
。これをｐＢＨ８１０と命名した。
（２１Ｄ ＬＪ Ｃ１８−Ａ Ｐの構築ｐＵｃ１８を制
限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩで完全分解せしめた後、
開裂せしめたＤＮＡ断片（２，０μ９）を３ＱｍＨ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４，５）、２５０ｍＨＮａＣ，ｅ、１
ｍＭＺｎＳＯ４，５％グリセロール中で８１ヌクレア一
ゼ１単位と混合し、３７℃、３０分間反応させることに
よってＤＮＡ断片の両末端を平滑にした。
限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩで完全分解せしめた後、
開裂せしめたＤＮＡ断片（２，０μ９）を３ＱｍＨ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４，５）、２５０ｍＨＮａＣ，ｅ、１
ｍＭＺｎＳＯ４，５％グリセロール中で８１ヌクレア一
ゼ１単位と混合し、３７℃、３０分間反応させることに
よってＤＮＡ断片の両末端を平滑にした。
次いで反応物（１，Ｏ・μｇ）を１０ｍＮＭｇＣＪ！
、ｌ＋ＨＡＴＰ及び１０ｍＭデチオスＬ／イトールを
含むＤＨ７，４の５０ｍＨトリス塩酸中でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ５単位と共に混合し、４℃で一晩反応させること
により、再度、環化させしめた。
、ｌ＋ＨＡＴＰ及び１０ｍＭデチオスＬ／イトールを
含むＤＨ７，４の５０ｍＨトリス塩酸中でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ５単位と共に混合し、４℃で一晩反応させること
により、再度、環化させしめた。
マンデルとヒガの方法に準じて、この反応混合物により
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／ｄを含むＬＢ寒天培地上に生育した形質
転換株より抽出したプラスミドＤＮＡは、ＤＬＪＣＩ
８からＮｄｅＩ切断部位が除去された約２．７ｋｂのプ
ラスミドであり、ｐＵｃｌ Ｂ−Ｎと命名した。
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／ｄを含むＬＢ寒天培地上に生育した形質
転換株より抽出したプラスミドＤＮＡは、ＤＬＪＣＩ
８からＮｄｅＩ切断部位が除去された約２．７ｋｂのプ
ラスミドであり、ｐＵｃｌ Ｂ−Ｎと命名した。
このｐＬＪＣｌ ８−Ｎを制限エンドヌクレアーゼＥＣ
０ＲＩとＰＳｔＩで完全分解して得た断片と、バチルス
・リケニフオルミスのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断部位を
有し、かっα−アミラーゼ遺伝子プロモーター領域を含
む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片とを１０ｍＭ ＭＯＣＪ
！ 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ０ｍＭブチオ
スレイトールｐＨ７，４の５０１１ＩＭトリスー塩酸緩
衝液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位と共に混合し、１５
℃で２時間反応させた。
０ＲＩとＰＳｔＩで完全分解して得た断片と、バチルス
・リケニフオルミスのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断部位を
有し、かっα−アミラーゼ遺伝子プロモーター領域を含
む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片とを１０ｍＭ ＭＯＣＪ
！ 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ０ｍＭブチオ
スレイトールｐＨ７，４の５０１１ＩＭトリスー塩酸緩
衝液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位と共に混合し、１５
℃で２時間反応させた。
マンデルとヒガの方法に準じて、この反応混合物により
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／−を含むＬＢ寒天培地上に生育した形質
転換株を５０μｇ／Ｉｄ、のアンピシリンを含むＬＢ培
地３ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後、ビルン
ボイムとドーリ−の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。抽出した各々のプラスミドＤＮＡを制限エンドヌ
クレアーゼＥＣ０ＲＩとＰｓｔＩで完全分解せしめた後
、アガロースゲル電気泳動にかけたところ、バチルス・
リケニフォルミス由来の約１．１ｋｂのＤＮＡ断片とＤ
ｔＪＣｌ ８−Ｎ由来の約２．７ｋｂのＤＮＡ断片から
成る約３．８ｋｂのプラスミドＤＮＡを得た。これをｐ
Ｕｃ１８−ＡＰと命名した。
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／−を含むＬＢ寒天培地上に生育した形質
転換株を５０μｇ／Ｉｄ、のアンピシリンを含むＬＢ培
地３ｄ中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後、ビルン
ボイムとドーリ−の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出
した。抽出した各々のプラスミドＤＮＡを制限エンドヌ
クレアーゼＥＣ０ＲＩとＰｓｔＩで完全分解せしめた後
、アガロースゲル電気泳動にかけたところ、バチルス・
リケニフォルミス由来の約１．１ｋｂのＤＮＡ断片とＤ
ｔＪＣｌ ８−Ｎ由来の約２．７ｋｂのＤＮＡ断片から
成る約３．８ｋｂのプラスミドＤＮＡを得た。これをｐ
Ｕｃ１８−ＡＰと命名した。
＋３） Ｄ Ｂ ＨＢ １１の構築
１）ＢＨ８１０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌで
完全分解せしめた後、切断したＤＮＡ断片６．０μ９に
制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩを加え、３７℃、５分
間反応させて部分的に切断し、次いで反応物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。
完全分解せしめた後、切断したＤＮＡ断片６．０μ９に
制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩを加え、３７℃、５分
間反応させて部分的に切断し、次いで反応物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。
このＤＮＡ断片（０，１μｇ）およびｐｕｃ１８−ＡＰ
を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩとＨｉ ｎｄＩ［［
で完全分解せしめて得られたＤＮＡ断片を１０ｍＨＭｇ
Ｃｊ！ 、ｌ＋ＨＡＴＰおよび１０ｍＨデチオスレイ
トー）Ｌｔヲ含ムｐＨ７、４（７） ５０ｍＨトリス塩
酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位と共に混合し、１５℃
、２時間反応させた。
を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩとＨｉ ｎｄＩ［［
で完全分解せしめて得られたＤＮＡ断片を１０ｍＨＭｇ
Ｃｊ！ 、ｌ＋ＨＡＴＰおよび１０ｍＨデチオスレイ
トー）Ｌｔヲ含ムｐＨ７、４（７） ５０ｍＨトリス塩
酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位と共に混合し、１５℃
、２時間反応させた。
マンデルとヒガの方法に準じて、この反応混合物により
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／ｄ、を含む［Ｂ寒天培地上に生育した形
質転換株を５０μｇ／Ｉｄのアンピシリンを含むＬＢ培
地３ＩＩＩ！！中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後
、ビルンボイムとドーリ−の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。抽出した各々のプラスミドＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌｌで完全分
解せしめた後、アガロースゲル電気泳動にかけたところ
、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域とビオチン
合成酵素遺伝子を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片とｐＬ
ＩＣｌ ８−Ｎ由来の約２．６ｋｂＤＮＡ断片から成る
約５．ＯｋｂのプラスミドＤＮＡを得た。
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンピシ
リン５０μｇ／ｄ、を含む［Ｂ寒天培地上に生育した形
質転換株を５０μｇ／Ｉｄのアンピシリンを含むＬＢ培
地３ＩＩＩ！！中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌後
、ビルンボイムとドーリ−の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。抽出した各々のプラスミドＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌｌで完全分
解せしめた後、アガロースゲル電気泳動にかけたところ
、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域とビオチン
合成酵素遺伝子を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片とｐＬ
ＩＣｌ ８−Ｎ由来の約２．６ｋｂＤＮＡ断片から成る
約５．ＯｋｂのプラスミドＤＮＡを得た。
これをｐＢ）ＩＢＩＩと命名した。
このｐＢＨＢｌ １上のα−アミラーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域とビオチン合成酵素をコードする領域の結合
部を中心にＭ１３ファージを用いたメツシングらの方法
によりＤＮＡ配列の分析を行った。その塩基配列は第９
図に示す通りであり、バチルス・リケニフオルミスのα
−アミラーゼ遺伝子プロモーター配列、シヤイン−ダル
ガノ（ＳＤ）配列及び翻訳開始コドンＡＴＧにバチルス
・スフエリカスのビオチン合成酵素をコードするオープ
ン・リープインク・フレーム（０，Ｒ。
ーター領域とビオチン合成酵素をコードする領域の結合
部を中心にＭ１３ファージを用いたメツシングらの方法
によりＤＮＡ配列の分析を行った。その塩基配列は第９
図に示す通りであり、バチルス・リケニフオルミスのα
−アミラーゼ遺伝子プロモーター配列、シヤイン−ダル
ガノ（ＳＤ）配列及び翻訳開始コドンＡＴＧにバチルス
・スフエリカスのビオチン合成酵素をコードするオープ
ン・リープインク・フレーム（０，Ｒ。
Ｆ）から翻訳開始コドンＧＴＧを除いた配列が結合され
ていることが理解されよう。
ていることが理解されよう。
＋４） ｐ Ｂ ＨＢ １３の構築
１）ＢＨ８１１とバチルス属で複製可能であり、カナマ
イシン耐性をマーカーとしてもつプラスミドｐｔＪＢ１
１０（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 ＞ １３４、Ｐ３１８．１９７８
年〕を制限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで完全分解せ
しめた後、開裂したｐＢＨ８１０’（０，２μｇ）と開
裂したｐＵＢｌ １０ （０，２μｇ）を１０ｍＨＭＱ
Ｃ，ｅ 、１ａＨＡＴＰおよび１０ｍＭ０ｍＭブチオ
スレイトール１）８７．４の５０ｍＨトリス塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、１５℃、２時間
反応させた。
イシン耐性をマーカーとしてもつプラスミドｐｔＪＢ１
１０（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 ＞ １３４、Ｐ３１８．１９７８
年〕を制限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで完全分解せ
しめた後、開裂したｐＢＨ８１０’（０，２μｇ）と開
裂したｐＵＢｌ １０ （０，２μｇ）を１０ｍＨＭＱ
Ｃ，ｅ 、１ａＨＡＴＰおよび１０ｍＭ０ｍＭブチオ
スレイトール１）８７．４の５０ｍＨトリス塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ２単位と共に混合し、１５℃、２時間
反応させた。
マンデルとヒガの方法に準じて、この反応混合物により
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンビシ
リ、ン５０μ９／ａｔｌ！を含むＬＢ寒天培地上に生育
した約４００ケのコロニーをカナマイシン１０μ９／ｄ
！を含むＬＢ寒天培地上にレプリカしたところ、５２株
のアンピシリン耐性、カナマイシン耐性（Ｋｍ ）を
示す形質転換株が得られた。これらをそれぞれカナマイ
シン１０μ３／ｍｅを含むＬＢ培地３ｄ！中で一晩振盪
培養して遠心分離で集菌後、ビルンボイムとドーリ−の
方法によりプラスミド１１）ＮＡを抽出した。抽出した
プラスミドＤＮＡのうち最小のものは全額長約９．５ｋ
ｂであった。このプラスミドは、ｐＢ、ＨＢ１１とｐＵ
Ｂｌｌｏからなるハイブリッドプラスミドであり、エシ
ェリヒア属とバチルス属のどちらでも複製可能なシャト
ルベクターであり、これをｐＢＨ８１３と命名した（第
８図参照）。
エシェリヒア・コリＣ６００を形質転換した。アンビシ
リ、ン５０μ９／ａｔｌ！を含むＬＢ寒天培地上に生育
した約４００ケのコロニーをカナマイシン１０μ９／ｄ
！を含むＬＢ寒天培地上にレプリカしたところ、５２株
のアンピシリン耐性、カナマイシン耐性（Ｋｍ ）を
示す形質転換株が得られた。これらをそれぞれカナマイ
シン１０μ３／ｍｅを含むＬＢ培地３ｄ！中で一晩振盪
培養して遠心分離で集菌後、ビルンボイムとドーリ−の
方法によりプラスミド１１）ＮＡを抽出した。抽出した
プラスミドＤＮＡのうち最小のものは全額長約９．５ｋ
ｂであった。このプラスミドは、ｐＢ、ＨＢ１１とｐＵ
Ｂｌｌｏからなるハイブリッドプラスミドであり、エシ
ェリヒア属とバチルス属のどちらでも複製可能なシャト
ルベクターであり、これをｐＢＨ８１３と命名した（第
８図参照）。
（５）バチルス・スフエリカスの形質転換バチルス・ス
フエリカスＮＧＩＢ９３７０を５０ＩｄのＰＢ培地（デ
イフ］・アンティバイオティック・メディウムＮｏ、３
１．、７５％）中３７℃で対数増殖中期まで振盪培養
を行ない、菌体を遠心分離により集めた。この菌体をＳ
ＭＭＰ液［２ＸＳＭＭ（ＩＭ庶糖、４ＱｍＨリンゴ酸ナ
トリウム、４０ｍＨＭＱＣｊ！ ・６Ｈ２０，ｐＨ６
，５）に４ＸＰＢ（デイフコ・アンティバイオティック
・メデイラムＮｏ、３７％）を等量ずつ混合したもの］
にＢＳＡを１％添加した溶液５ｍに懸濁し、アセチルム
ラミゾイスを０．３塔／ａｅとなるように添加した後、
３７℃、４５分間反応させた。菌体を遠心分離によって
集めた後、ＳＭＭＰによって二度洗浄し、１ａｆＳＭＭ
Ｐに懸濁してプロトプラスト液とした。
フエリカスＮＧＩＢ９３７０を５０ＩｄのＰＢ培地（デ
イフ］・アンティバイオティック・メディウムＮｏ、３
１．、７５％）中３７℃で対数増殖中期まで振盪培養
を行ない、菌体を遠心分離により集めた。この菌体をＳ
ＭＭＰ液［２ＸＳＭＭ（ＩＭ庶糖、４ＱｍＨリンゴ酸ナ
トリウム、４０ｍＨＭＱＣｊ！ ・６Ｈ２０，ｐＨ６
，５）に４ＸＰＢ（デイフコ・アンティバイオティック
・メデイラムＮｏ、３７％）を等量ずつ混合したもの］
にＢＳＡを１％添加した溶液５ｍに懸濁し、アセチルム
ラミゾイスを０．３塔／ａｅとなるように添加した後、
３７℃、４５分間反応させた。菌体を遠心分離によって
集めた後、ＳＭＭＰによって二度洗浄し、１ａｆＳＭＭ
Ｐに懸濁してプロトプラスト液とした。
このプロトプラスト液０．５１ｄにエシェリヒア・コリ
より調製したＤＢＨ８１３を１μグ加えて１．５−の４
０％ＰＥＧ６０００ （ポリエチレングリコール６００
０）４０ｇに２ＸＳＭＭ５０ｄを加え、１００ａｅに蒸
留水でメスアップしたもの）を加え、静かに懸濁後、室
温で２分間放置、５Ｉｌｌｉ！のＳＭＶＰを加え希釈し
た後、遠心分離により集菌した。この菌体をＢＳＡが１
％添加されているＳＭＶ Ｐ １ ｍｇに懸濁後、３０
℃で１時間半静置培養後、この培養液０．１＃！ｌ！を
１５０μ９／ｄカナマイシンを含むＤＭ４培地［寒天０
．８％、カザミノＮｏ、５％、イーストイクストラクト
０．５％、０．３３Ｍコ八りへ！ （ＤＨ７，３）、に
２ＨＰＯ４０，３５％、ＫＨ２ＰＯ４０，１５％、グリ
セリン０．５％、０．０２Ｍ Ｍｏｃ１．０．０１％Ｂ、ＳＡＩに塗抹し、３７℃にて
３日間から１週間培養した。
より調製したＤＢＨ８１３を１μグ加えて１．５−の４
０％ＰＥＧ６０００ （ポリエチレングリコール６００
０）４０ｇに２ＸＳＭＭ５０ｄを加え、１００ａｅに蒸
留水でメスアップしたもの）を加え、静かに懸濁後、室
温で２分間放置、５Ｉｌｌｉ！のＳＭＶＰを加え希釈し
た後、遠心分離により集菌した。この菌体をＢＳＡが１
％添加されているＳＭＶ Ｐ １ ｍｇに懸濁後、３０
℃で１時間半静置培養後、この培養液０．１＃！ｌ！を
１５０μ９／ｄカナマイシンを含むＤＭ４培地［寒天０
．８％、カザミノＮｏ、５％、イーストイクストラクト
０．５％、０．３３Ｍコ八りへ！ （ＤＨ７，３）、に
２ＨＰＯ４０，３５％、ＫＨ２ＰＯ４０，１５％、グリ
セリン０．５％、０．０２Ｍ Ｍｏｃ１．０．０１％Ｂ、ＳＡＩに塗抹し、３７℃にて
３日間から１週間培養した。
次いで、出現したコロニーを爪楊枝で釣菌し、１０ｇｇ
／ｄカナマイシンを含むＧＰ培地に植菌し、３７℃にて
一晩振盪培養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。
／ｄカナマイシンを含むＧＰ培地に植菌し、３７℃にて
一晩振盪培養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。
この菌体からビルンボイムとドーリ−の方法によりプラ
スミドＤＮＡを抽出した。このようにして得られたプラ
スミド［）ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断パターン
を調べたところ、エシェリヒア・コリより抽出したｐＢ
ＨＢ１３と同一のパターンを示し、バ・チルス・スフエ
リカスＮＣＩＢ９３７０にＩ）ＢＨＢ１３が導入された
ことが確認された。ただし、ｐＢＨＢ１３上に存在する
制限エンドヌクレアーゼ１３ ａｍＨＩ切断部位は、バ
チルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０菌体内のメチラ
ーゼにより修飾されたことによって、制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍ）ＩＩでは切断されない。ｐＢＨ８１３に
よ ６１ 一 つで形質転換されたバチルス・スフエリカスＮＣＩＢ９
３７０をバチルス−スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （
ｐＢＨ８１３）と命名した。
スミドＤＮＡを抽出した。このようにして得られたプラ
スミド［）ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断パターン
を調べたところ、エシェリヒア・コリより抽出したｐＢ
ＨＢ１３と同一のパターンを示し、バ・チルス・スフエ
リカスＮＣＩＢ９３７０にＩ）ＢＨＢ１３が導入された
ことが確認された。ただし、ｐＢＨＢ１３上に存在する
制限エンドヌクレアーゼ１３ ａｍＨＩ切断部位は、バ
チルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０菌体内のメチラ
ーゼにより修飾されたことによって、制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍ）ＩＩでは切断されない。ｐＢＨ８１３に
よ ６１ 一 つで形質転換されたバチルス・スフエリカスＮＣＩＢ９
３７０をバチルス−スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （
ｐＢＨ８１３）と命名した。
またバチルス・スフエリ力・スＮＣＩＢ９３７０にかえ
てバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５を用い、バチ
ルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （ｐＢＨＢ１３
）より抽出したｐＢＨＢ１３で形質転換する以外は、上
記と同様の方法によって得られた形質転換株をバチルス
・スフエリカスＩ ＦＯ３５２５（ｐＢ）ｌＢ１３）と
命名した。
てバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５を用い、バチ
ルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （ｐＢＨＢ１３
）より抽出したｐＢＨＢ１３で形質転換する以外は、上
記と同様の方法によって得られた形質転換株をバチルス
・スフエリカスＩ ＦＯ３５２５（ｐＢ）ｌＢ１３）と
命名した。
同様にｐＵＢＩ １０によって形質転換されたバチルス
・スフエリカスＮ０ＩＢ９３７０とバチルス・スフエリ
カスＩＦＯ３５２５をそれぞれバチルス・スフエリカス
ＮＣＩＢ９３７０ （ｐＬＪＢｌｌｏ）、バチルス・ス
フエリカスＩＦＯ３５２５（ｐＬＪＢｌｌｏ）と命名し
た。
・スフエリカスＮ０ＩＢ９３７０とバチルス・スフエリ
カスＩＦＯ３５２５をそれぞれバチルス・スフエリカス
ＮＣＩＢ９３７０ （ｐＬＪＢｌｌｏ）、バチルス・ス
フエリカスＩＦＯ３５２５（ｐＬＪＢｌｌｏ）と命名し
た。
実施例７
エシェリヒア・コリＭＣ１６９（、ｐＳＢ３０１ ）及
びｐＤＲ７２０をプラスミドとして所有するエシェリヒ
ア・コリＭ０１６９ （ｐＤＲ７２０）の２種の菌株を
、５０μｇ／１ｔｄｌのアンピシリンと１００μ９／１
ｄのＤＬ−デスチオビオチン（ＧＴＢ）を含むＰＣ培地
（グリセリン２％、プロテオース・ペプトン５％、カザ
ミノ酸２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＫＣｊ！０．０５
％、Ｍｏ２Ｏ３・７ＨＯＯ，０５％、ＭｎＳＯ４・４〜 ６ＨＯＯ，００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１
％、ｐＨ７，０＞の１．２倍濃度培地３ｄにそれぞれ植
菌し、３７℃で１時間振盪培養後、Ｔｒｐプロモーター
を誘ＩＩするためにインドールアクリル酸を１６．７μ
９７ｕｄｌどなるように添加し、さらに３７℃で１晩振
盪培養した。
びｐＤＲ７２０をプラスミドとして所有するエシェリヒ
ア・コリＭ０１６９ （ｐＤＲ７２０）の２種の菌株を
、５０μｇ／１ｔｄｌのアンピシリンと１００μ９／１
ｄのＤＬ−デスチオビオチン（ＧＴＢ）を含むＰＣ培地
（グリセリン２％、プロテオース・ペプトン５％、カザ
ミノ酸２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＫＣｊ！０．０５
％、Ｍｏ２Ｏ３・７ＨＯＯ，０５％、ＭｎＳＯ４・４〜 ６ＨＯＯ，００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１
％、ｐＨ７，０＞の１．２倍濃度培地３ｄにそれぞれ植
菌し、３７℃で１時間振盪培養後、Ｔｒｐプロモーター
を誘ＩＩするためにインドールアクリル酸を１６．７μ
９７ｕｄｌどなるように添加し、さらに３７℃で１晩振
盪培養した。
培養後、培養液１ｍを遠心分離して菌体を沈澱させ、そ
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトバチルス・プランタラムによ
る微生物定置法により上清中に蓄積したビオチンを定量
した。各々の菌株によるビオチンの蓄積量を第２表に示
す。
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトバチルス・プランタラムによ
る微生物定置法により上清中に蓄積したビオチンを定量
した。各々の菌株によるビオチンの蓄積量を第２表に示
す。
第２表
第２表の結果から、本発明の微生物はエシェリヒア・コ
リＭＣ１６９（ＤＤＲ７２０）に比べ大量のビオチンを
培地中に蓄積することが明らかである。
リＭＣ１６９（ＤＤＲ７２０）に比べ大量のビオチンを
培地中に蓄積することが明らかである。
なお、本発明に係る微生物のビオチン蓄積量は、エシェ
リヒア・コリの種々のビオチン高産生変異株（たとえば
特開昭６１−１４９０９１号、特開昭６１−２０２６８
６号）と比較しても高い値を示しており眠のことからバ
チルで属細菌に由来するどオチンの産生に関与する遺伝
子の有用性が理解されよう。
リヒア・コリの種々のビオチン高産生変異株（たとえば
特開昭６１−１４９０９１号、特開昭６１−２０２６８
６号）と比較しても高い値を示しており眠のことからバ
チルで属細菌に由来するどオチンの産生に関与する遺伝
子の有用性が理解されよう。
実施例８゜
バチルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０（ｐＢＨＢ１
３）、バチルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （ｐ
ＬＪＢｌ １０）、バチルス・スフエリカスＩＦＯ３５
２５（ｐＢＨ８１３）及びバチルス・スフエリカスＩＦ
Ｏ３５２５（ｐＵＢｌ １０）の４種の菌株をＧＰ培地
３ｄにそれぞれ植菌し、２８℃で一晩振盪培養後、対数
増殖期の末期に２５μｇ／−となるようにＤＬ−ＤＴＢ
を添加するか、または、５００μｇ／ｄとなるようにビ
メリン酸を添加し、３７℃で２日間振盪培養した。
３）、バチルス・スフエリカスＮＣＩＢ９３７０ （ｐ
ＬＪＢｌ １０）、バチルス・スフエリカスＩＦＯ３５
２５（ｐＢＨ８１３）及びバチルス・スフエリカスＩＦ
Ｏ３５２５（ｐＵＢｌ １０）の４種の菌株をＧＰ培地
３ｄにそれぞれ植菌し、２８℃で一晩振盪培養後、対数
増殖期の末期に２５μｇ／−となるようにＤＬ−ＤＴＢ
を添加するか、または、５００μｇ／ｄとなるようにビ
メリン酸を添加し、３７℃で２日間振盪培養した。
培養後、培養上清をラクトバチルス・ブランクラムによ
るビオチンの微生物定置法により測定した。各々の菌株
と前駆体によるビオチンの蓄積量を第３表に示す。
るビオチンの微生物定置法により測定した。各々の菌株
と前駆体によるビオチンの蓄積量を第３表に示す。
− ６６ 〜
第３表の結果から、本発明の微生物は、ＤＬ−〇ＴＢを
前駆体とした場合と同様にビメリン酸を前駆体としてビ
オチンを生産することが理解されよう。
前駆体とした場合と同様にビメリン酸を前駆体としてビ
オチンを生産することが理解されよう。
第１図〜第３図はそれぞれｐＳＢＯ１プラスミドＤＮＡ
、ｐｓＢＯ３プラスミドＤＮＡ及びＤＳＢ１６プラスミ
ドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断地図を示し、第
４図〜第５図はそれぞれｐｓＢ１６に挿入されたバチル
ス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ切
断地図、塩基配列及びアミノ酸配列を示す。第６図、第
８図はそれぞれｐｓＢ３０１プラスミドＤＮＡ。 ＤＢＨＢ１３プラスミドＤＮＡの造成方法を示す。 第７図は合成りＮＡ ＢｂｏＡ−１及びＢｂｇｊ！−
２の塩基配列を示し、第９図はα−アミラーゼプロモー
ター領域とビオチン合成酵素遺伝子の結合部位の配列を
示す。
、ｐｓＢＯ３プラスミドＤＮＡ及びＤＳＢ１６プラスミ
ドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断地図を示し、第
４図〜第５図はそれぞれｐｓＢ１６に挿入されたバチル
ス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ切
断地図、塩基配列及びアミノ酸配列を示す。第６図、第
８図はそれぞれｐｓＢ３０１プラスミドＤＮＡ。 ＤＢＨＢ１３プラスミドＤＮＡの造成方法を示す。 第７図は合成りＮＡ ＢｂｏＡ−１及びＢｂｇｊ！−
２の塩基配列を示し、第９図はα−アミラーゼプロモー
ター領域とビオチン合成酵素遺伝子の結合部位の配列を
示す。
Claims (30)
- （１）ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来のデ
スチオビオチンからのビオチン生合成反応に関与する遺
伝子情報をコードしているＤＮＡ。 - （２）該ＤＮＡが第５図に示すアミノ酸配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードす
るものである特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （３）該ＤＮＡが第５図に示す塩基配列中、第２８５番
目から第１２７７番目に相当する塩基配列またはそれと
実質的に同一の機能を持つ塩基配列を有するものである
特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ。 - （４）該ＤＮＡが第５図に示すアミノ酸配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードし
、かつその上流に翻訳開始コドン、その下流に翻訳終止
コドンを有するものである特許請求の範囲第１項記載の
ＤＮＡ。 - （５）該ＤＮＡが第５図に示すアミノ酸配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードし
、その上流にシヤイン−ダルガノ配列及び翻訳開始コド
ン、その下流に翻訳終止コドンを有するものである特許
請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （６）該シヤイン−ダルガノ配列がＧＡＡＡＡＧＧＡＧ
ＡＡＴＧＴである特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ。 - （７）該ＤＮＡが第５図に示す塩基配列中、第２６５番
目から第１２８０番目に相当する塩基配列またはそれと
実質的に同一の機能を有する塩基配列である特許請求の
範囲第５項記載のＤＮＡ。 - （８）ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来のデ
スチオビオチンからのビオチン生合成反応に関与する遺
伝情報をコードしたＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ−
。 - （９）該ＤＮＡが第５図に示すアミノ酸配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードす
るものである特許請求の範囲第８項記載の組換えベクタ
ー。 - （１０）該ＤＮＡが第５図に示す塩基配列中、第２８５
番目から第１２７７番目に相当する塩基配列またはそれ
と実質的に同一の機能を持つ塩基配列を有するものであ
る特許請求の範囲第９項記載の組換えベクター。 - （１１）該ＤＮＡがプロモーターの支配下にそれと近接
して組み込まれている特許請求の範囲第８項記載の組換
えベクター。 - （１２）前記プロモーターがエシエリヒア属、バチルス
属またはシュードモナス属の細菌中で機能するものであ
る特許請求の範囲第１１項記載の組換えベクター。 - （１３）ベクターがプラスミドである特許請求の範囲第
８項記載の組換えベクター。 - （１４）ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来の
デスチオビオチンからのビオチン生合成反応に関与する
遺伝情報をコードしたＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
ーによつて形質転換又は形質導入された細菌。 - （１５）組換えベクターがプロモーターの支配下に、そ
れと近接して該ＤＮＡを組み込んだものである特許請求
の範囲第１４項記載の細菌。 - （１６）細菌がエシエリヒア属、バチルス属またはシュ
ードモナス属に属するものである特許請求の範囲第１４
項記載の細菌。 - （１７）細菌がデスチオビオチン産生能を有するもので
ある特許請求の範囲第１６項記載の細菌。 - （１８）該細菌がエシエリヒア属に属し、かつ該プロモ
ーターは同属に属する細菌中で機能するものである特許
請求の範囲第１５項記載の細菌。 - （１９）該細菌がバチルス属に属し、かつ該プロモータ
ーは同属に属する細菌中で機能するものである特許請求
の範囲第１５項記載の細菌。 - （２０）該ＤＮＡが第５図に示すアミノ酸配列またはそ
れと実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコード
するものである特許請求の範囲第１４項記載の細菌。 - （２１）該ＤＮＡが第５図に示す塩基配列中、第２８５
番目から第１２７７番目に相当する塩基配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するものである特許請求の範
囲第２０項記載の細菌。 - （２２）該組換えベクターがハイブリッドプラスミドで
ある特許請求の範囲第１４項記載の細菌。 - （２３）ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来の
デスチオビオチンからのビオチン生合成反応に関与する
遺伝情報をコードしたＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
ーによつて形質転換又は形質導入され細菌をビオチン生
合成の前駆体の存在下に適当な炭素源を含有する培地で
培養し、ビオチンを産生させ、産生されたビオチンを分
離、精製することよりなるビオチンの製造法。 - （２４）該組換えベクターがプロモーターの支配下に、
それと近接して該ＤＮＡを組み込んだものである特許請
求の範囲第２３項記載の方法。 - （２５）当該細菌がエシエリヒア属、バチルス属又はシ
ュードモナス属に属するものである特許請求の範囲第２
３項記載の方法。 - （２６）前記前駆体がデスチオビオチンである特許請求
の範囲第２３項記載の方法。 - （２７）該前駆体がビメリン酸又はアゼライン酸であり
、かつ前記形質転換又は形質導入された細菌がデスチオ
ビオチン産性能を有するものである特許請求の範囲第２
３項記載の方法。 - （２８）該組換えベクターがプロモーターの支配下に、
それと近接して該ＤＮＡを組み込んだものである特許請
求の範囲第２７項記載の方法。 - （２９）該デスチオビオチン産性能を有するものがバチ
ルス属に属する細菌である特許請求の範囲第２７項記載
の方法。 - （３０）該バチルス属に属する細菌がバチルス・スフエ
リカスに属する菌株である特許請求の範囲第２９項記載
の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873786578 DE3786578T2 (de) | 1986-03-25 | 1987-01-28 | Biotin-Synthetase kodierendes Gen und dessen Verwendung. |
| EP19870300716 EP0240105B1 (en) | 1986-03-25 | 1987-01-28 | A gene coding for biotin synthetase and utilization thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9572486 | 1986-04-24 | ||
| JP61-95724 | 1986-04-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6344889A true JPS6344889A (ja) | 1988-02-25 |
Family
ID=14145420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62004404A Pending JPS6344889A (ja) | 1986-03-25 | 1987-01-12 | ビオチン合成酵素をコ−ドする遺伝子とその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6344889A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62275684A (ja) * | 1985-07-29 | 1987-11-30 | Nippon Zeon Co Ltd | 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 |
-
1987
- 1987-01-12 JP JP62004404A patent/JPS6344889A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62275684A (ja) * | 1985-07-29 | 1987-11-30 | Nippon Zeon Co Ltd | 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 |
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