JPS6349094A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は消化器癌に含まれる抗原と反応するモノクロー
ナル抗体に関するものである。

〔従来の技術〕

胃癌中に含まれる抗原と反応するモノクローナル抗体が
種々提案されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、現在のところ、胃癌の血清診断法はまだ
確立されていない。従って、胃癌の血清による早期診断
法の確立が望まれている。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明者は、胃癌に対するモノクローナル抗体について
種々検討を行った結果１本発明を完成した。

即ち１本発明は。

［ヒト胃癌に含まれる分子量７０万ダルトン以上含まれ
る抗原部位と反応し１次の性質を有する工ｇＭのクラス
に属するモノクローナル抗体。

（リ　ヒト胃癌と反応する。

（２）　　ヒトの膵臓、肝１食道上皮、大腸粘、模及び
腎の正常組織の一部と反応する。

（３）　　正常人及び癌患者の血清中にこのモノクロー
ナル抗体と反応する抗原が存在する。」に関するもので
ある。

本発明のモノクローナル抗体と反応する抗原は。

癌患者血清において高値を示す例が多く０診断的価値が
高い。

なお、以下の説明において、抗体産生Ｉ・イブリドーマ
の製造のために免疫原として使用する癌細胞及び１本発
明のモノクローナル抗体の各組織との反応性を調べるた
めに用いる各種組織は全て人の組織である。

コブロスキー等の報告した抗大腸癌モノクローナル抗体
１９−９　（ＣａｎＣｅｒＲｅ８．．４２＋　４８２０
−４８２５．１９８２）は膵、胃、大腸、胆道等の癌と
反応すると報告されている。しかし、同一検体を本発明
のモノクローナル抗体と１９−９抗体で完投染色して地
紋したところ、ある胃癌検体は本発明のモノクローナル
抗体と強く反応したが１９−９抗体とは全く反応しなか
った。従って両者は異なった抗原決定基を認識している
。

本発明のモノクローナル抗体は新らしい層関連抗原と反
応するモノクローナル抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は、甲状腺、心筋。

屏、腎儲、小腸、畢丸の正常組織とは反応しない。

胃癌組織をンアルＬ便分解酵素であるニューラミニダー
ゼで処理すると該胃癌組織に対する本発明のモノクロー
ナル抗体の反応性は失われる。よって１本発明のモノク
ローナル抗体の認識する抗原部位にンアル酸が存在する
。

本発明のモノクローナル抗体が反応する胃癌て含まれる
抗原の分子量は７０万ダルトン以上（ゲルテ適法）であ
り該抗原は生理食塩水で抽出することが出来、又１Ｍ過
塩素酸溶液によっても抽出することが出来る。

本発明のモノクローナル抗体はＩｇＭのクラスニ属する
ものであり１分子量は約９０万である。

本発明のモノクローナル抗体の製法は１例えば次のよう
にして行うことが出来る。即ち、本発明の抗体に対する
抗原（本発明の抗°体に対する抗原を含む細胞例えば胃
癌細胞等が使用出来る）でマウス又はラット等の動物を
免疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、これと
骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン化し
、ヒト胃癌に対する抗体を産生ずる融合細胞を選択し、
これを培養し抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細
胞の選択等は通常の方法によって行うことが出来、具体
的には１例えば後述の方法によって行うことが出来る。

本発明のモノクロール抗体は、これと反応する抗原で免
疫された１例えば本発明のモノクローナル抗体と反応す
る細胞等１例えば胃癌細胞等で免疫された動物の抗体産
生細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成されるノ・イ
ブリドーマによって産生される。

更に詳しくは１例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。

まず、マウスを胃癌ｄＪ胞で免疫する。免疫する動物は
マウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他
の動物を使用してもよいが１通常はマウスが用いられる
。例えばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに胃癌細胞又は
そのホモジネート又はそれから採取された抗原を数日〜
数週間おきに数回接種する。

接種ｔは１匹あたり１回につき１０５〜１０７個の細胞
を使うのが好ましい。その後マウスより、Ｗｕを摘出し
遠心分離により抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖し
ていく能力を持たないので、自己増殖能力を有する細胞
と融合させる。自己増殖能力を有する細ｊ泡としては骨
＊ｍ細胞が特に好ましい。骨髄１禎細胞としては、同種
の動物のものを用いるのが好ましい。又、骨髄腫細胞と
しては、抗体を産生じないものを選択するのが好ましい
。

抗体産生細胞と骨髄＋ＢＬ細胞をポリエチレングリコー
ル等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸陶液）に加え細胞
融合を行う。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、
細胞数比で５８１〜１０：１とするのが好ましい。得ら
れた融合細）泡は限界希釈法により分離し１分離した融
合細ノ泡は増殖泗せたのち、各ウーエルにおいて産生さ
れる抗体は公知の方法、例えば螢光抗体法又は酵素抗体
法等により、各種細胞組織等と反応させ、七の結果から
所望の抗体を産生ずる・・イブリドーマを選択する。選
択したー・イブリドーマを培養器中で培養し上清液から
抗体を得ることも出Ｘるが、生体内例えばヌードマウス
腹腔内に・・イブリドーマを注入し、ヌードマウス体内
でｌ這瘍として生育させ、ヌードマウス血清あるいは腹
水から抗体を回収する方法によることも出来る。

本発明のモノクローナル抗体を作るために免疫原として
使用する細胞としては胃癌細胞等が使用出来る。これら
胃癌細胞は特定の株のものに限定されず、胃癌細胞で本
発明の抗体と反応する抗原を含むものであれば使用可能
である。

本発明のモノクローナル抗体を作るために用いる抗体産
生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが牌臓
等に蓄積するので牌臓を摘出して使用するのが好ましい
が、必ずしも牌臓でなくてもよ（、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。

本発明のモノクローナル抗体は、胃癌の診断薬の材料と
して使用することが出来、又１本発明のモノクローナル
抗体と抗癌剤を組合わせてミサイル瞭法に用いることが
出来る。

〔実施例〕

実施例１ （１）　　モノクローナル抗体の製造 ヒト胃癌をヌードマウスに移植継代した株（Ｓｔ−１３
）をリン酸ａ＠食塩水に１０％の割合でホモジエネート
したものと同量のフロイント完全アジュバントとを混合
したものを０．２　ｍｌ　８退会の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃマウスの腹腔に投与、１ケ月問おいて更に２回１
次いで３ケ月後に更に１回同量を投与した。最終免疫は
ホモジエ不−トのみ０，１ＪＩｇを腹腔に投与（前回よ
り２ケ月後）し、その３日後にマウスから片隼臓を摘出
した。

細胞融合の方法は、ｆｉ辺等の方法（免疫実験操作法■
％２９６３−２９６７．１９７８）に準じて行った。

即ち、摘出したＮ臓を細切したのち、ステンレスメツシ
ュを通し、１５００ｒｐｍ、２０ｏＧで遠沈して得た沈
渣に５０　ｒａｔの０．７　％　ＭＨ４Ｃ１を加え赤血
球を除き、ＲＰＭニー１６４０で２回洗浄して得た牌細
胞浮遊液２．８Ｘ１０８個／　２０　ｄにマウス骨髄４
ｇ細胞（Ｐ５−Ｘ６５−Ａｇ８−Ｕｌ）（以下ｐ３Ｕｌ
という）をＲＰＭニー１６４０で２回洗浄して得たＰ３
［Ｔ＋６．４Ｘ１０６個／　２　ｍｌ　（５：　１　）
を混合し、　　２０００　ｒｐｍ、　２００　Ｇで１０
分間遠沈した。沈殿細胞をよくときほぐした後、４５％
（”ＩＩ／Ｖ　）のポリエチレングリコール４０００（
メルク社）を含有した５７℃、ｐＨ７，４のＲＰＭニー
１６４０、Ｉｄを加え８分間処理した。

反応１分後からＲＰＭニー１６４０　　を徐々に加え総
ｉｉ　５０　ｍｌとして細胞融合を終了した。１０００
ｒＩ）ｆｆ＋＋２ｏｏＧで遠沈後１０％牛脂児血清を含
んだＲＰＭニー１６４０．１００ａ／を加えて細胞浮遊
液を作り、　Ｆａｌｃｏｎｍｉｃｒｏ　ｃｕｌむｕｒｅ
　ｐｌａｔｅ　（３０４２）の１ウエルあたり０・２　
ｍｌずつ分注しＳ７℃、５％Ｃ０２充填培養器中で培養
した。２４時間後から２日毎に上清の生殖をＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン。

アミノプテリン、チミジン及び１０％牛脂児血清を含む
ＲＰＭニー１６４０培地）と入れ換えた。

１０日１に上清を取り出し、胃癌組織のホルマリン固定
、パラフィン切片を酵素抗体法で染色する事により抗体
産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したフェル中
のハイブリドーマを１ウエルあたり０．３〜０．６個と
なるよう限界希釈法によって行った。培地は最初ＨＴ（
ヒポキサンチン。

チミジン、１０チ牛脂児血清を加えたＲＰＭニー１６４
０培地）を用イ、　ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ　　とし
てＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　マウスの胸腺細胞５Ｘ１ｏ
５／ウェルを加えた。次に１０％牛脂児血清を加えたＲ
ＰＭニー１６４０培地に置換した。

限界希釈法によるクローニングは２回行った。

を用いた。ｆｌａｓｋ培養で得た上清にＮａＮ、を０・
１チ加え４℃にて保存した。

（２）　　本発明のモノクローナル抗体の選定及びモノ
クローナル抗体による各種組織の染色。

本発明のモノクローナル抗体選定のだめの各種組織の染
色及び該モノクローナル抗体による各種組成の染色はＨ
ｅｕ、　Ｓ、Ｍ、　　等の方法（Ｊ、Ｈｌｓｔｏｃｈｅ
ｍ。

ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　　２　９　、　５　７　７　−
　５　８　０　、　１　９　８　１　　）　　ｉＣ準じ
てアビジン−ビオテン−ベルオキシダーゼ複合体法によ
るホルマリン固定、パラフィン切片の染色により行った
。即ち、広く一般的に用いられている１０％ホルマリン
固定後パラフィン包埋。

薄切されたヒト胃癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正常
組織を脱パラフイン後、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノ
ールにて２０分間処理した。その後リン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で洗った後、１０％牛脂児血清を含むＰＥ５Ｉ
にて３０分間処理した。次いで、抗体を含む溶液（抗体
濃度２ｐ？／ａｔ）と室温で１時間反応させた。そして
ＰＢＳで１５分間洗った後、ビオチン化抗マウス免疫グ
ロブリン（７−５ｐ？　／　ａｔ　）にて６０分間処理
した。これをＰＢＳで１５分間洗った後、アビジンＤＨ
−ビオチン化ベルオキ７ダーゼ複合体と室温で３０分間
処理した。これをＰＢＳで１５分間洗った後ジアミノペ
ンテジン溶液（１η／ａジアミノペンテジン、０．０１
％Ｈ２Ｏ２、トリスバッファーｐＨ７，６）にて５〜１
０分間反応泗せた。細胞核をヘマトキシリンにて染色後
１通常の方法で封入し横規した。

１・１− の反応性が認められ、その中から本発明のモノクロナー
ル抗体を産生ずるハイプリドーマ１株を選択した。

本発明のモノクローナル抗体の胃癌組誠又は各種正常組
織との反応試験は、上記（２）に記載した方法に従って
行った。

（Ａ）　　表−１に本発明のモノクローナル抗体の前動
組織に対する反応性試１１Ｍ果を示した。

表−１本発明のモノクローナル抗体ノ 胃癌組織との反応性 検体数　　１１Ｍ１８：例数 胃　　　癌　　　　　　　　　　２４　　　　　　　　
　　　１４表−１に示したとおり、胃癌組、熾について
は。

２４例中１４例が電性であったが、この内作陽性は６例
であった。又、ルイス式血液型陰性（Ｌｅ（ａ−ｂ−）
　）が１例あり、その組織に含まれていた胃癌細胞が１
本発明の抗体による染色では陽性であった。

１９−９抗体ではＬｅ（ａ−ｂ−）例は陽性にはならな
い、しかし不発明の抗体では陽性であった事は非常に有
意義である。

（ＥＪ　　表−２に本発明のモノクローナル抗体の各種
正常組織Ｙζ対する反応試験の結果を示した。

表−２本発明のモノクローナル抗体の 各種正常組織との反応性 正常組織　例数／検体数　　　　　反　応　様　式冑　
　　８／９　　　粘膜中にまれに陽性部位あり１／９　
　　粘膜の上部が陽性 食道上皮　　２／２　　　まれに陽性部＠あり小　腸　
　２／２　　　陽性部位なし 大　腸　　２／２　　　粘膜の上部に陽性部あり肝　　
　５／３　　　肝門胆管は陽性 肝細胞にまれに陽性細胞あり 正常組織　例数／検体数　　　　　　反　応　様　式婢
　　ｓ　／　ｓ　　　　ｆｉＭ性部位なし単　丸　１／
１　　　ｌ′ａ性部位なし腎　　　２／２　　　まれに
陽性部位あり甲状腺　１／１　　　陽性部位なし 気管支　１／１　　　気管支線に陽性部位あり心　筋　
２／２　　　陽性部位なし 籾　胱　１／１　　　まれに陽性部位ありを　髄　１／
１　　　Ｉ９ｊ性部位なし実施例２ ヒト血清中の抗原の定量法 本発明の抗体を産生ずるハイプリドーマをプリスタン（
２，６＋　１０．１４−テトラメチルペンタデカン０．
５．ｌをあらかじめ腹腔に投与してひいたＢ　Ａ　Ｌ　
Ｂ　／　Ｑ　７　＋７　ス（Ｄ　、ｉｊ腔１ｃ　＋　０
６−　Ｉ　Ｑ’　（ｆｌＪ接種する。

１〜２週間後に腹水を採取する。この、腹水をセファロ
ースＣＬ−６Ｂによりゲル濾過を行い、工ｆＭを最も多
く含む分画を集め精製抗体とする。

抗体吸着マイクロプレートの作製：上記精製抗体を５０
μ７／ゴの濃度になる様０．１　Ｍ　　ｐＨ９，６の炭
酸バッファーにて希釈する。この抗体溶液を５０μｔｆ
つ９６クエル、平底マイクロプレート（例えばＮｕｎＣ
社、工ｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ工）の各ウェルに分注し、
４℃、２日間蒸発を防ぎながら静置する。次いでＰＢＳ
（リン酸緩衝食塩水）にて３回れ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ペモノクロー六ル抗体のビオチン化；
ｍ製抗体１７７１につき１０μ２　ＯＮ−ハイドロキシ
サクンイミドビオチン（Ｐθｒａｃθ社製）を０．７Ｍ
の重炭酸ソーダ溶液中にて、室温で５時間反応させ１次
いで、ＰＢＥにて十分透析する。

標準抗原：ヒト胃癌のヌードマウス移植株Ｓｔ；−１５
の１０チＰＢＳホモジエネートを１５０００回転２０分
遠心した上清を標準抗原とした。

この抽出液が６４０００単位の抗原を含むものと定め、
以下の測定を行った。

測定法：抗体吸着マイクロプレートの各ウェルに。

１０μｔの検体又は俤準抗原と４０　ｐｔ　　の検体希
駅威（２％正常マウス血清と１ｏｚＭＥＤＴＡ　　を含
むＰＢＳ）を加え混合後粘着テープ等でプールしで ３７℃の温水上にうがべ２時間反応製せる。次いで０．
０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにて１０回洗っ
た後０．５μ７／ｄのビオチン化モノクローナル抗体と
１．２５μ？　／　ｍｌ　のアビジン化ホースラデイシ
ュペルオキシダーゼ（ベクター社１３ｒ）ｔ２％正常マ
ウス血清を含むＰＢＳにとがしたものを各ウェル当り５
０μｔ　加え室温で蒸発を防ぎながら３時間反応させる
。次いでＯ，ＯＳ％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにて
１０回洗い発色液を＋００μを各ウェルに加える０発色
液は、オルトフェニレンジアミン１　ｍｙ　／Ｈ１，Ｈ
２Ｏ２０，０＋　％を含むクエ７ｍ’）７戚バッファー
ｐＨ５，０よりなる。室温で２０分１ｉｉＪ反応させた
後２５μｔの２ＭＨ２ＳＯ４をカＤえ反応を停止させる
。４９０　ｎＩｎの吸収を測定し、その結果を標準抗原
の吸光反と比較する事により検体中に含まれていた本発
明の抗体と反応する抗原の単位数を決定する。

正常人血清２１８例について測定したところ正常人血清
の平均＋２標準偏差は５単位であり、８例（３・７％）
が３単位／　ａｔを越えていた。

３単位以上の抗原を含むものを陽性とすると各種の癌患
者及び良性疾患４者の血清例での陽性率は表−３に示す
ごとくである。

表−３ 実施例５ 実施例１の（２）において、アビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼ複合体法による染色をほどこす前にニュー
ラミニダーゼｏｙ＋Ｕ／属ｌによりｐＨ６，４゜室温に
て胃癌組織を１時間処理した。かくして得られた胃癌組
織に対する本発明のモノクローナル抗体の反応試験を実
施例１と同様にして行った所。

ニューラミニグーゼ処理により染色性は失われた。

以上のことより１本発明のモノクローナル抗体の認識す
る抗原部位にはシアル酸の関与があることがわかる。

実施例４ Ｓｔニー１５株及びヒト癌性腹水（胃癌）に含まれる抗
原の５ｅｐｈａｒｏｅｅ　ＣＬ　−６Ｂによるゲルチ過
では、５ｔ−１，５株に含まれる本発明の抗体と反応す
る抗原は分子量７０万ダルトンからｖＯ分画（分子量１
５０万ダルトン以上）にわたった抗原が検出された。一
方癌性腹水ではｖＯ分画にのみ検出された。この抗原は
５ＤＳ−ＰＡＧＥ（５％アクリルアミド）では２−メル
カプトエタノールたのみでろ・た。　　　　　　　　　
　　　　　′イス。上記抗原は、生理食塩水にて抽出す
ることが出来た。更にこの抗原は１Ｍ過塩素酸溶液で抽
出することが出来た。

実施例５ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラス
を知るため１本モノクロ−カル抗体と抗ヒト１ｇ血清と
寒天ゲル内沈降反応による試安を実施した。

本モノクローナル抗体は、抗ヒト１ｇＭ血清に明らかな
沈降線を示したが、工ｇＧ・工ｇＡ・工ｇＤ・工ｇＥの
どの血清とも反応せず１本モノクローナル抗体が工ｇＭ
イムノグロブリンであることが判明した。

〔発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体を用いることによる利点は
例えば次のとおりである。

（１）　　血清により膵、胆、肝、胃等の癌のスクリー
ニングが効果的に行ないうる。

（２）　　血清による上記癌の診断に有用である。

（３）　　血清により上記癌の治療後の再発予知に有用
である。

（４）　　ルイス式血液型陰性（Ｌｅ（ａ−ｂ−）　）
の癌組織で反応することにより、血液型による影響なく
、上記砺のスクリーニングｓ　診Ｍ　％　モニタリング
を行ないうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト胃癌に含まれる分子量７０万ダルトン以上（ゲ
   ルろ過去）で生理食塩水及び１Ｍ過塩素酸溶液にて抽出
   される抗原と抗原抗体反応をし、シアル酸が含まれる抗
   原部位と反応し次の性質を有するＩｇＭのクラスに属す
   るモノクローナル抗体。 （１）ヒト胃癌と反応する。 （２）ヒトの膵臓、肝、食道上皮、大腸粘膜及び腎の正
   常組織の一部と反応する。 （３）正常人及び癌患者の血清中にこのモノクローナル
   抗体と反応する抗原が存在する。