JPS63500008A - 発酵装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発酵装置 本発明は攪拌される懸濁培養の細胞を受取るための連続的発酵装置容器に関する 。

細胞の生体内発酵によって生じる生底物の商品化における最近の進歩は改良した 発酵装置容器および発酵工程の設計における関心を漸増に導いた。

発酵は通常バッチ法または連続法の何れかで行なわれる。連続法はそれらが与え られる発酵装置の生産性を高めそして通常バッチ式発酵装置において必要とされ る清掃および殺菌のための生産力休止時間を減じるので有利である。

既知の連続発酵装置容器において、妥当な培養基中の細胞の懸濁は攪拌されそし て発酵のための好適な温度に保たれる。懸濁培養物は連続的に発酵装置から抜き 出され、そして新鮮な培養基の連続的供給によって均衡が保たれる。そのような 発酵装置の著しい欠点は培養物の除去によって引き起こされる細胞の連続的損失 である。除去される懸濁培養物が連続的遠心分離装置中に通されその装置が培養 物上層液から細胞を分離する発酵装置が知られている。細胞は次いで懸濁培養中 に戻して供給されろ。

いま１つの既知の発酵装置では、濾過材料でできた回転バスケットが一部分培養 物中に水没されて、バスケットの内部は濾過材料によって懸濁培養物から分離さ れるようにして与えられる。培養物上層液は濾過装置を通過しそして連続的に抜 き出すことができ、一方細胞は懸濁培養物中に残存する。懸濁培養物中のバスケ ットの回転は濾過材料の目詰まりを減少させる。

連続的懸濁培養物中に細胞のフィードバック（ｆｅｅｄｂａｃｋ）を与えるため のこれらの既知の装置は機械的に複雑であり、それらの操作のためにエネルギー を必要としそして細胞破壊のような不利な効果を懸濁物に対してひきおこすであ ろう。これらの特徴は組合わさってそのような発酵装置に基づく発酵法の経済的 生育力を減じる。

本発明の目的はこれらの不利に実質的に打ち勝つ連続発酵装置容器を提供するこ とである。

本発明に従えば細胞の懸濁培養物を受け取るための連続発酵装置容器が与えられ 、この容器は；容器の第１部分内に受け入れた懸濁培養物を攪拌するだめの手段 ：使用に際し静止沈降帯域を限定する容器の第２部分、その第２部分の少な（と も底の部分は第１部分と連絡する；容器への培養基の連続的供給のための入口手 段：および第２部分の底の上に間隔を置いて配置される地点から容器の第２部分 からの培養物上層液を連続的に抜き出すだめの出口から底りそして、使用に際し 、第２部分中に沈降する細胞は攪拌される懸濁培養物に返送され、そして懸濁培 養物よりも低濃度の細胞を有する培養物上層液は第２部分から抜き出される。

本発明の発酵装置において、細胞分離および細胞フィードバックの段階は静止沈 降帯域の設備によって達成される。静止沈降帯域に入る懸濁培養物は（静止沈降 帯域から除去される培養物上層液と入れ代って）攪拌される懸濁培養物から低乱 流帯域中に移動する。この帯域内で、細胞は重力の作用下で下方に沈降し始めそ して、静止沈降帯域の底において攪拌される懸濁培養物の方に返送される。沈降 は静止沈降帯域内の細胞の濃度勾配が静止沈降帯域の底の上部に間隔な置いて配 置される位置から培養物上層液の排除を許容する結果となる。この地点における 培養物上層液は攪拌される懸濁培養物よりも実質的に低い細胞濃度を有する。

本発明の発酵装置の細胞分離およびフィードバック構成部分は何等の可動部分を 有せずそして何等の付加的エネルギー投入を要しない。

静止沈降帯域は発酵装置内の何処に位置させてもよ（または攪拌される懸濁培養 物を運転中続けるために容器の部分に従層物をつ（つてもよい。しかし、静止沈 降帯域内の移動を最小にするために、静止沈降帯域は、運転中攪拌される懸濁培 養物を維持するため完全に発酵装置の部分内に配置することが好ましい。この事 は望ましくない対流を引き起こ丁であろう静止帯域内の温度勾配を著しく減じる 。

懸濁培養物を攪拌するための手段は細胞の混合を確保するための何れの好適手段 でもよい。好適なそのような手段は５例えば、機械的攪拌機である。しかし。

本発明の好ましい形態においては、ガス入口を通して、ガス、好適には空気、の 注入によって攪拌が引き起こされる。発酵装置は１例えば、いわゆる「空気揚水 ポンプ（エヤーリフト」発酵装置であろう、そして空気のようなガスがこの技術 で上昇管（ｒｉｓθｒ）として知られている発酵装置上方に延びている部分中に 注入される。上昇管は上部および底部においてこの技術で下降管として知られて いる発酵装置のさらに上方に延びている部分のそれぞれの上部および底部と連絡 する。エヤーリフト発酵装置の知られている構成は発酵容器中で容器を２部分に （上昇管と下降管）分離する中央仕切りから取る。エヤーリフト発酵装置のも５ １つの構成は円筒状発酵装置容器と実質的に同心的な通風管を含み、発酵装置を 上昇管（通風管内で）と下降管（発酵装置容器の通風管と側面の間の環状空間） とに分割する。（上昇管は同様に通風管と発酵装置容器の内側面との間の環状空 間が可能であり、そして下降管は通風管内が可能である）。上昇管の低部分への 空気のようなガスの注入は上昇管内の嵩密度の減少を引き起こしその結果上昇管 中の液体の上方流れを生じさせ、このようにして下降管の内容物を置き代えこれ は上昇管の底部中に循還して戻る。このようにして流体の流れが起こり、培養物 を混合しそして細胞を懸濁状に保持する。そのよった発酵装置の利点は同等可動 部分を必要とせずそして培養物の酸素化が起きることである。

典型的には上昇管の横断面積は下降管の横断面積と実質的に同一である。

本発明の好ましい特徴において連続発酵装置容器はエヤーリフト発酵装置であり そして静止沈降帯域は下降管と上昇管との間の仕切り内につくられる導管から成 る。このようにして均一温度な有する良く混合された懸濁培養物によって静止沈 降物が取り囲まれることを確実にすることによって望ましくない対流が防止され る。使用に際しては発酵装置内の作用液体水準は沈降帯域の上部が発酵装置の直 径の０．２５から１．０倍によって覆われることが望ましい。

仕切りは１例えば、実質的に円筒状発酵装置容器中に実質的に同心的に位置を定 められる実質的に円筒状の通風管が可能である。静止沈降帯域は通風管の少なく とも１部の内壁および外壁の間に形成される環状空間で構成することができる。

静止沈降帯域は好ましくは上部において閉ざされそして底部において下降管と連 絡する。小容量、例えば１０立よりも小さいエヤーリフト発酵装置においては、 通風管はその長さに沿った２重壁が可能であり、上部で閉じられ、そして底部に おいて懸濁培養物と連絡する環状沈降帯域を形氏することができる。別法として 、そして特により大きい発酵装置においては静止沈降帯域は通風管だけの上方部 分の内外壁間に環状空間な構成することができる。

大型発酵装置においては静止沈降帯域は充分大きい横断面積を有さねばならずそ のため良好な細胞分離を達成するために上方に流れる液体の速度は細胞の沈降速 度よりも遅い。静止沈降帯域に対し必要とされる横断面積に適応させそして容器 の周囲の循還のための充分な面積ななお与えるためには１発酵装置の上方部分は 発酵装置の下方部分に対してより大きい直径を有するであろう。上方部分中の上 昇管および下降管の横断面積は実質的に等しくそしてそれぞれ発酵装置の底部分 中の上昇管および下降管の横断面積の０．５と１．０倍の間の横断面積を有する であろう。これを達成するためには５上方部分中の同心通風管の内部直径は通風 管の下方部分に対比して減じることができる。発酵装置の上方および下方部分は 発酵装置の一般軸に対して０゜と６０°の間の角度を有する円錐台状（ｆｒｕｓ ｔｏｃｏｎｉｃａ’ｌ）部分によって接続することができる。

仕切りは容器中に据付けられる実質的に垂直なプレートで構成する通風プレート 形状にすることができる。

静止沈降帯域はプレートの上方部分中またはその長さに沿ったプレート中に形成 される導管で構成することができる。

連続的発酵装置は既知のやり方において培養基の連続的供給および連続的に培養 物上層液の抜き出しな使用して操作することができる。連続的発酵装置は０．０ ２　ｆＦ１ト０．０８　倍”　ノ間、好マｔ、＜ハ約０−０４２倍−１の希釈速 度（即ち、流速対発酵装置容積の比率）において連続的に操作することができる 。

発酵装置は懸濁液体培養中で生体内異長が可能な何れの細胞の培養に対しても、 （マイクロキャリヤー（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉθｒ）培養を含めて）、使用する ことができるが、例えば、ハ・ｆブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）細胞系列 のような動物細胞の培養に対して特に有用である。

動物細胞は重力下で０．９　Ｘ　１　［］−５５ｍ５−と４．ＯＸ　１　［］− ５５ｍ５−の間そして普通は約１−８　Ｘ　ｉ　Ｑ−５ｍｓ−１の速度で沈澱す るであろうことが測定された。従って高連続的生産高と小寸法の静止沈降帯域と の妥当な均衡を許容するためには、発酵装置の容積１ｍ３につき０．１から１． ５　ｍ２までの横断断面積を有する静止沈降帯域が望ましい。

普通は１ｍ３の発酵装置容積につき０．６５　ｍ２の横断断面積な有する静止沈 降帯域が使われる。

培養中の動物細胞は完全な成長中の細胞、全部が死んだ細胞および細胞破片間の 差異を表わす成る範囲の粒子寸法を示し従って成る範囲の速度で沈降するであろ ５゜沈降帯域内の沈降の全般的速度を増すためには、例えば、０．０１と０．３ ％（ｗ／ｖ　）の間のポリガラクツロン酸な培養基に添加することによって細胞 を凝集の状態において培養−ｒることか可能である。この処理は細胞および細胞 破片を個々の気泡質粒子よりも大きい全般的粒子寸法の凝集塊に凝集させ、この ようにして増加した沈降速度を生じさせる。この現象は沈降帯域の横断面積の減 少を可能になし従って発酵装置の上方部分の直径もまた減じること？可能ならし める。

本発明はここで添付した概略図面を参照しながら以下の記述によって説明するが 、 第１図は一中心の仕切りプレー）Ｑ含む本発明のエヤーリフト発酵装置の軸方向 横断面 であり、 第２図は一発酵装置容器と同心の通風管な含む本発明のエヤーリフト発酵装置の 軸方向 横断面であり、そして 第６図は−２重壁の同心通風管を含む本発明のエヤーリフト発酵装置の軸方向横 断面で ある。

第１図は懸濁培養物から培養上層液を分離するための静止沈降帯域を組み込んだ エヤーリフト発酵装置を示す。エヤーリフト発酵装置は一般に１に示される外側 容器を含む。外側容器は下方円筒部分３および上方円筒部分５を含み、上方円筒 部分はより大きい直径のものでありモして円錐台状部分７によって下方円筒部分 ３に接続される。下方円筒部分３は底面１５を与えられて外側容器１を完全なも のにする。一般に９に示される仕切りプレートは外側容器１内に支持されて容器 の内部を一般に１１で示される上昇管、および一般に１３で示される下降管に分 割する。底面１５は真下にそして上昇管１１のはソ中心に空気人口１７を有する 。一般に９で示される仕切りプレートは外部容器の上方円筒部分５および円錐台 状部分７内に静止沈降帯域１９を形成する。軸方向横断面が角形である静止沈降 帯域１９は、下降管１３と連絡する静止沈降帯域１９の底部における出口を除い て上昇管１１および下降管１３から封じられる。静止沈降帯域１９の頂部は培養 上層液を抜き出すために出口２３が備えられる。

発酵装置には培養基を発酵装置に供給するための入口２５が備えられる。サーモ スタット制御の加熱手段を外側容器１の中または周りの何れかに備えることがで きる。外側容器１は、例えば水を充満させるようなジャケットを与えるために２ 重壁にすることができろ。

使用際しては、細胞、好適には動物細胞、は入口２５な通して９仝と指示する仕 切りプレート９の頂部が外部容器１の下方円筒部分３の直径の０．２５から１． ０倍を形成するのに相当する懸濁培養物の深さによって覆われるように発酵装置 中に導入される。空気人口１７を通して空気を押し込むことによって懸濁培養物 は乱流状態に保たれる。空気は上昇管１１内を昇り、上昇管１１円の液体懸濁物 の嵩密度を減じそして第１図中に矢印で指示される方向に液体の全体移動を引き 起こ丁。上昇管１１の頂部において懸濁培養物内の空気は解放される。

培養基の連続的供給は入口２５を通して与えられム培養基には細胞の充分な培養 に対して必要な栄養剤およびその他の要素を含み、そして０．０１から０．０３ ％（Ｗ／Ｖ）までのポリガラクツロン酸を付加的に含む。ポリがラクツロン酸の 使用は動物細胞および動物細胞廃棄物の凝集を促進しこれは生成物の流れからの 動物細胞および廃棄物の効率的分離を助ける。培養物上層液は培養基が入口２５ を通って供給されるのと実質的に同一速度において出口２３を通って連続的に抜 き出される。静止沈降帯域１９からの培養物上層液の除去において、懸濁培養物 は下降管内の乱流環境から出口２１を通って移動される。静止沈降帯域１９は非 乱流区域でありその中で培養物上層液よりもより大きい密度である細胞および細 胞廃棄物は重力の下で下方に沈降する。培養物上層液の除去速度は静止沈降帯域 １９内の細胞が下方に移動しそして結局は出口２１な通って下降管１３に戻され ろような速度である。

定常状態条件下において懸濁培養物から嵩高培養物がほとんどまたは全熱除去さ れずに出口２３を通って培養物上層液の除去が許容される細胞濃度勾配が静止沈 降帯域中に確立される。外側発酵装置容器１の軸に対する円錐台部分子の角度は 個々の操作条件によって要求される静止沈降帯域の寸法に応じてＯｏと６０°の 間である。例えば、成る環境下では低容積の発酵装置内で外側発酵容器１は単円 筒容器が可能でありそして静止帯域は区域は２重壁仕切りプレートによって限定 される。第１図中に示される具体化においては、静止沈降帯域１９はじゃま板２ ７が与えられこれは静止沈降帯域内の乱流を減殺する。発酵装置の軸に対するじ ゃま板の角度はＯｏと６０°の間でありそして、一般に。

対応する円錐台部分７と平行である。じゃま板は任意であり、そしてもしも与え られるときは円錐台部分Ｉの軸方向距離の半分から全部まで延びる。静止沈降帯 域１９は発酵装置内で培養される細胞に応じた横断面積を有する。哺乳類細胞な 使う場合は沈降帯域は好適には発酵装置容積の立方米につき０．１と２．５ｍ２ ０間の横断面積を有する。好ましくは静止沈降帯域１９は発酵装置容積の立方米 当り０．６５　ｍ２の横断面積を有する。

第２図を参照すると本発明の具体化がさらに示される。図面から明らかなように 、第２図中に示されるエヤーリフト発酵装置は第１図に関連して記載されるエヤ ーリフト発酵装置と同様の多数の特徴を有する。これらの特徴はここにはそれ以 上は記載しない、。異なる点は発酵装置の外側容器内に同心的に設置した通風管 ２９の使用に存する。通風管２９の内側は、使用に際しては、上昇管として作用 しそして通風管２９の外側と発酵容器の内側との間の環状空間は下降管として作 用する。示される具体化において、通風管２９は下方円筒部分３１と上方円筒部 分３３を含み、２つの部分は円錐台部分３５によって接続される。上昇管の直径 の頂部へ向けての減少は静止沈降帯域に対して発酵装置の上方端において使用す べきより大きい横断面積を可能にする。静止沈降帯域３７は通風管２９の上方端 と、それと一体になって取り巻くスカート３８との間に形成される環状空間で構 成される。一般に第２図中に示されるエヤーリフト発酵装置の操作と構成部分は 第１図に関して記載した通りである。第１図の具体化におけるようにうず春泥を 妨げるために静止沈降帯域３７の底にじゃま板３９を備えることができる。第２ 図の具体化においてはじゃま板３９は円錐台状である。

第１図に関して言及した望ましい寸法は第２図のエヤーリフト発酵装置の対応す る部分に当てはまる。

第６図を参照すると、低容量使用に特に好適な形状を有するエヤーリフト発酵装 置が示される。第５図中に示されるエヤーリフト発酵装置は円筒状外側容器４１ と外側容器内に同心的に設備される円筒状通風管４３から収る。通風管４３は環 状静止沈降帯域４５を形成する２壁間に作られる２重壁の環状空間である。

第６図の発酵装置の操作と一般的寸法は第１図に関連して上に記載したとおりで ある。

以下の実施例は動物細胞の連続的懸濁培養のための本発明の発酵装置の使用を説 明する。

実施例１ 既存の５．５　ｊ　（全容量）エヤーリフト発酵装置な生物資源（バイオマス） 戻し供給（フィードバック）を伴なう連続式で哺乳類細胞の培養に使用可能なよ うに改造した。

発酵装置は２重壁通風管の組立てによって改造した。

通風管の壁は第６図中に示されるように平行であった。

発酵装置には２つの採取ラインを取り付けた。第１の採取ラインは培養の主要バ ルクから発酵装置の外側に導かれそのために培養物はバイオマスのフィードバッ クなしで連続的に採取できた。第２の採取ラインは通風管の最上部から発酵装置 の外側に導かれ（第６図）そのために培養流体は連続的に採取できたが培養の主 要バルクへのバイオマスのフィードバックを伴なった。

工ｇＭ抗体を分泌するＮＢｉハイブリドーマ細胞な上記の発酵装置内で培養した 。培養基は肚児の小生血清で補足したダルベツコの（ＤｕｌｂｅＣＣＯ’Ｓ）　 ｉ性イーグルの（Ｅａｇｌ、ｅ’ｓ）培養基であった。溶解した酸素圧力、−お よび＠度を監視しそして自動的に制御した。改造したフックのローゼンタール（ Ｆｕｃｈ’ｓ　Ｒｏｓｅｎｔｈａｉ）計数室な使用して細胞計算を行ないそして トリパンブルー染料な除外して細胞成長力を分析した。■ｇＭ特定酵素−結合− 免疫吸収剤分析によって抗体な分析した。

実験条件および結果は第１表中に要約される。バイオマスのフィードバックなし で、成長性細胞集団密度（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｅｎｓｉｔｙ）は１．３　 Ｘ　１０６細胞／ｍｔでありそして抗体濃度は３０．４ｍｇ／立であった。バイ オマスのフィードバックを伴な５操作では８９％の成長性細胞が流出物から除去 されて培養物中の成長性バイオマス中で５．３Ｘ１０’細胞／ｌｎｔへ４倍増加 した。抗体の全部の生産量は操作中にバイオマスのフィードバックなしで６３■ ／ｌであり操作中にバイオマスの供給を伴えば３２３■／日であった。

安　観　麻　堕 実施例２ 第２実施例においては３０ｒ（全容量）のエヤーリフト発酵装置をバイオマスの フィードバックを伴なう連続式形態で使用するために改造した。２つの異なる形 状の通風管な試験した点を除き、改造は実施例１に記載した５立発酵装置用のも のと同様であった。第１の形状は第６図中に示されるような平行壁にした通風管 から戊っていた。第２の形状では、通風管壁の間に含有される液体柱内の乱流を 減じるために通風管はその下方側面に向って（第２図中に示されるように）僅か に収縮させた。

細胞ライン、培養基および実験手順は実施例１中に記載されるとおりであり、そ して結果は第２表中に要約される。

バイオマスのフィードバックなしでは成育性細胞集団密度１．６Ｘ１０’細胞／ −が得られた。バイオマスなフィードバックする条件下では、成育性細胞集団密 度は平行壁にした通風管に対しては６．ＯＸ　１０’細胞／ｄであり、そして収 縮開口部を有する通風管に対しては３．５　Ｘ　１０６細胞／ｒｎｔであった。

抗体産出量はバイオマスフィードバックなしによる操作中は６２５■／日であり そして操作中フィードバックを伴なえば６６０■７日であった。

堀 本発明は純粋に実施例のためにだけ上に記載したが、細部の修正は本発明の範囲 および精神内で行１工いうることは云うまでもない。

手続補正書、峠、 昭和６２年　３月２ｏ日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞の懸濁培養物を受け取るための連続発酵装置容器において、その容器が ：容器の第１部分中に受け取る懸濁培養物を撹拌するための手段；使用の際に、 静止沈降帯域を限定する容器の第２部分、その第２部分の少なくとも底の部分は 第１部分と連絡する；培養基を容器に連続的に供給するための入口手段；および 第２部分の底の上に間隔を置いて配置される地点から容器の第２部分からの培養 物上層液の連続的抜き出しのための出口から成りそして、使用に際し、第２部分 中に沈降する細胞は撹拌される懸濁培養物に返送され、そして懸濁培養物よりも 低い濃度の細胞を有する培養物上層液は第２部分から抜き出される連続発酵装置 容器。
2. ２．静止沈降帯域が、撹拌される懸濁培養物を使用の際に保持するために発酵装 置の部分内に完全に設置される請求の範囲第１項に記載の連続発酵装置容器。
3. ３．発酵装置中の作業の液体水準は沈降帯域の最上部が発酵装置の直径の０．２ ５から１．０倍まで懸濁培養物で覆われるほどである請求の範囲第１または２項 に記載の連続発酵装置。
4. ４．連続発酵装置容器がエヤーリフト発酵装置である前項の請求範囲の何れかの １項に記載の連続発酵装置容器。
5. ５．静止沈降帯域が下降管と上昇管との間の仕切り中に形成される導管から成る 請求の範囲第３項に記載の連続発酵装置容器。
6. ６．仕切りが実質的に円筒状の発酵装置容器内に実質的に同心的に置かれる実質 的に円筒状の通風管から成る請求の範囲第５項に記載の連続発酵装置容器。
7. ７．沈降帯域が通風管の少なくとも一部分の内壁と外壁の間に形成される環状空 間から成る請求の範囲第６項に記載の連続発酵装置容器。
8. ８．仕切りが容器内に取り付けた実質的に垂直なプレートから成る請求の範囲第 ５項に記載の連続発酵装置容器。
9. ９．前項の請求範囲の何れかの１項に記載する連続発酵容器中の培養細胞を含む 細胞の懸濁培養のための方法。
10. １０．細胞がハイブリドーマ細胞である請求の範囲第９項に記載の方法。