JPS63500491A - Ｎ−ホルミル−ｌ−ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ−ホルミル− 発明の分野 本発明は、ペプチド化学の技術、さらに具体的には、ホルミルペプチドの製造方 法、さらに詳しくは、Ｎ−ホルミル−し−ペプチドの製造方法に関する。

ホルミルペプチドは、生物学及び医学において、食作用及び走化性のような現象 を研究することに有用である。食作用（細胞による大きな固形粒子の吸収）は、 細胞の栄養及び自己防御の目的を提供する。走化性は種々の化学的化合物の効果 のもとて細胞の動きを方向づける。これらの両現象は、有機体の防御メカニズム 、特に炎症過程において大きな役割を示す．食作用−誘発剤及び走化性剤として 、蟻酸によってアシル化されたメチオニン成分をそれらのＮ−末端部分に含むペ プチドを使用する。分子中でのホルミルメチオニンの存在は、不可欠である。な ぜならば、それは、走化性ペプチド及び食作用誘発性ペプチドと細胞表面上の特 定の受容体との相互作用を１旦当するからである。その同じペプチドがまた、細 胞の他の機能、たとえば細胞集合、酵素の分泌、毒性酸素代謝物の形成を刺激す る。

ホルミルペプチドは、アスパルテームの前駆体−ホルミルアスパルテーム、すな わちＮ−ホルミル−し−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンによって例示され 得る。

従来の技術 ホルミルペプチドの合成への異なったアプローチが存在する。カルボジイミド法 のようなペプチド合成の典型的な方法は、混合された無水物又は活性化されたエ ステルの方法である．たとえば、ｔａｒｔ．−ブチルオキシアルボニル−し−ア ミノ酸とＣ−保護のアミノ酸との連続的な縮合によるホルミル−メチオニル−ロ イシル−フェニルアラニン及びホルミルーメチオニルーリシルーブロリイルーア ルギニンの合成は、当業界に知られている。ペプチド鎖の段階的な伸長が完結し た後、Ｎ−末端のアミノ酸が非阻止され、そして一部保護されたペプチドが蟻酸 の活性化エステルによってホルミル化されホルミルペプチドの合成へのこのアプ ローチは、高い光学純度を有する化合物を生成することを可能にする．しかしな がら、追加段階の導入による長時間の合成が、結局、目的とする生成物の合計収 量の実質的減少をもたらす。さらに、この場合、合成における多官能価アミノ酸 の使用が妨げられる。

ホルミル化の段階における副反応を妨げるために、生成物の合成を複雑化し、そ れを不経済的に１、７ぞして非加工性にする、すべての付加機能的基の持前保護 が必要とされる。

高度の光学純度を示す生成物を得ることを可能にする、ペプチドの合成のアジド 方法は、当業界において十分知られている（Ｋｉｎｇ　Ｆ．Ｅ．、Ｃｌａｒｋ− Ｌｅｗｉｓ　Ｊ．％Ｉ１．，Ｋｉｄｄ　Ｄ．Ａ．Ａ．、Ｓｎ＋ｉｔｈ　Ｇ．Ｒ． 。

Ｊ．Ｃｔ＋ｅｍ．Ｓｏｃ。、１９５４．　１０３９〜１０４３べ・−ジ）、シか しながら、゛アアジド方法によるホルミル含有性ペプチドの合成において、著者 は、たとえばホルミル−グリシンアニリド及びｐ−（ホルミル−グリシル）−ア ミノ安息香酸の合成を示す。

ホルミル−グリシンヒドラジドが、エタノール中、ホルミルーグリシンエチレー トの溶液を処理することによって７４％の収率で得られる。次に、ＩＮのＨｔＪ 中、ホルミル−グリシンの溶液を０℃で亜硝酸ナトリウム水溶液と共に撹拌し、 炭酸ナトリウムにより中和した後、アニリンと共に混合し、そして２時間後、目 的とする反応生成物、ホルミルグリシンアニリドを回収する．しかしながら、こ の方法は、低収率の・目的の生成物を与える。

前記のようにして製造されたホルミル−グリシンアジドとｐ−アミノ安息香酸と の反応に基づく反応生成物の収率は、１３％である。前記ですでに述べたように 、アジド方法は、光学的に純粋なペブギドを得ることを可能にする．しかしなが ら、たとえば、ホルミル−グリシンアニリド及びｐ−（ホルミル−グリシル）− アミノ安息香酸のエチルエステル、すなわち光学活性を持たない化合物の合成が 与えられる．この理由のために、ホルミル含有性ペプチドの合成において、アジ ド方法の利点を討論することは困難である．さらに、このアジド方法は二段階で あり、そしてそれは、目的とする化合物の製造を相当複雑化し、そして一層高価 なものにする、すべての付加機能性基の保護及び次にそれらの除去が必要である 。

ペプチド合成のための典型的な方法は、スウィートペプチド（アスパルチル）、 その類慎体及び前駆体の製造のために適切であることはまったく当然である。

従って、アスパルテームの合成のための方法は、当業界において知られていて、 そしてここで、α−２．４．５−）リクロロフェニルエステル−（β−ベンジル エステル）−Ｎ−・α−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸とメチルア ラニンメチレート塩酸塩とを活性化エステルの方法によって縮合し、その結果、 Ｎ−α−ベンジルオキシカルボニル−（β−ベンジルエステル）−アスパルチル −フェニルアラニンのメチルエステル、すなわち十分に保護されたアスパルテー ムの前駆体を得る。保護基： アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル、すなわちアスパルテームのβ− ベンジルエステル及びＮ−α−ベンジルオキシカルボニル基の続く除去が接触水 素添加により提供される（Ｄａｖｅｙ　Ｊ．Ｍ．＋Ｌａｉｒｄ　Ａ．Ｈ．＋Ｍｏ ｒｌｅｙ　Ｊ．Ｓ．＋Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１．（ｅ）＋１９６６、　５５５〜 ５６６ページ〕．この方法はひじょうに労力消費的でありそして多（の段階を有 する。さらに、その縮合生成物の光学純度は保証され得ない。この縮合段階での 生成物の収率は９６％である。

ペプチド結合の形成段階において、金属−プロテイナーゼる．この場合、ベンジ ルオキシカルボニル−又はｐ−メトキシベンジル−オキシカルボニル−アルバラ ギン酸を、バシルスサーモプローオーイチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ封μｍ匹ゑ江 胚」１江」］の微生物によって産生される金属−プロティナーゼ、すなわちサー モリシンの存在下で、フェリルイルアラニンメチレート塩酸塩２当量と縮合する 。その反応は、ｐＨ＝６〜８で３〜５時間、４０℃で進行する。Ｎ−ベンジルオ キシカルボニル−又はそれぞれＮ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル− アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステルと共にアスパラギン酸のβ− カルボキシル基でフェニルアラニンメチレートの塩として形成される目的とする 生成物が沈殿せしめられる。酸性媒体中におけるこの付加物の分解の後、アスパ ルテームの前ＸＩｌ：Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１又はそれぞれＮ−ｐ− メトキシベンジルオキシカルボニル−アスパルチル−フェニル−アラニンのメチ ルエステルが得らミノ酸の光学純度を保持し、そしてそれは、アスパラギン酸の α−カルボキシル基でのみ反応を確保する（Ｉｓｏｗａ　Ｙ、ｔＯｈｍｏｒｉＭ 、＋Ｉｃｈｉｋａｗａ　Ｔ−Ｊｏｒｉ　Ｋ、、Ｎｏｎａｋａ　Ｙ、、Ｋｉｈａｒ ａ　Ｋ１０ｙａｎ＋ａ　Ｋ、ｌ５ａｔｏｈ　Ｈ，、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　Ｓ、、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｌ、、１９７９．第２８号、２６１１〜２６１ ２ページ）。

アスパルテームの前駆体のこの合成方法の欠点は、アスパラギン酸のアミン機能 のための保護基として、ベンジルオキシアルボニル又はｐ−メトキシベンジルオ キシカルボニル保護基の使用にある。そのような場合において、そのような保護 基の導入のために使用される、出発のアシル化剤として、たとえばクロロカルボ ン酸のカルボベンゾキシクロリド−ベンジルエステルが使用されるが、しかしそ の製造は、多量のホスゲンの使用を含む。

商業規模上でのアスパルテームの製造においては、よす安く且つより容易に入手 できる、アスパラギン酸のα−アミノ機のための保護基を用いることが好ましい 。

アスパラギン酸のアミン機能のための保護基として、ホルミル保護基ψ使用によ るアスパルテームの前駆体の合成は当業界において知られている。この基は蟻酸 成分を含み、そして最っとも安く、且つ入手できるアミノ−保護基である。その ようなアスパルテームの前駆体の合成においては、ホルミルアスパラギン酸の内 部無水物がフェニルアラニンメチレート塩酸塩と縮合される。この場合の反応生 成物は、４：１の比でのアスパラギン酸のα−及びβ−カルボキシル基の異性体 、すなわちα−Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステ ル及びβ−Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンの混合物を含む（ｐ ｃｔ／ｐＲｔＢ［ｉ、８２１００１８１、出願臼：　１９Ｂ２年１１月５日）。

アスパルテームのα−異性体のみが甘味を有するが、但し、アスパルテームのβ −異性体は苦味を有することが前に示されている。そのために、特殊技法が、異 性体の混合物の分離及び必要とする異性体の回収のために開発され、それによっ て、全体的にその方法が一層複雑化され、そして結局、目的とする生成物の収率 が低められる。

発明の開示 本発明は、目的とする光学的に活性の生成物の製造を簡単にし９．そしてその収 率を高めることを可能にする酵素の使用によりＮ−ホルミル−し−ペプチダーゼ を製造するための方法に向けられる。

この目的は、次の一般式（Ｉ）： Ｆｏ　ｒ　−Ａ−Ｂ−Ｘ　（１） 〔式中、Ｆｏｒはホルミルであり；ＡはＡｓｐ、　Ｉ’ｌｅｔ＋　Ｇ１ｙ＋　Ａ ｆａｒＧｌｙ−Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ−Ａｌａ、　Ａｌａ−Ｇｌｙ、　Ａｌａ−Ａｌ ａ、↑ｙｒ＋　Ｐｈｅであり；ＢはＰｈｅ、　Ｌｅｕ＋　Ｉｌｅ、　Ｖａｌであ り；Ｘは一０ＣＨｚ　、−０ＣＪｓ　−ＣＨｚＣ６Ｈｓ、ＮＨｚ、ＮＨ−ＣＪｓ 、ｐ　Ｎｕ−Ｃ４Ｈ６ＮＯｘ。

Ｎ１（−ＮＨｚ　、ＮＨＮＨＣａ）Ｉｓである〕のＮ−ホルミル−し−ペプチダ ーゼを製造するための方法によって達成され、そして本発明に従えば、この方法 は、ｐ）１．＝６．０〜９．０で、そして０〜６０℃の範囲内の温度で水性又は 水性−打機培地中で五之旦ス属の微生物によって産生されたメタロプロテイナー ゼの存在下で、次の一般式（■）： Ｆ　ｏ　ｒ　−Ａ−ＯＨ（ＩＩ） 〔式中、Ｆｏｒはホルミルであり；ＡはＡｓｐ、　Ｍｅｔ＋　Ｇｌｙ、　Ａｌａ 。

Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ−Ａｌａ、　Ａｌａ−Ｇｌｙ、　Ａｌａ−Ａｌａ、　 Ｔｙｒ、　Ｐｈｅである〕のＮ−ホルミル保護のカルボキシル化合物と、次の一 般式（■）： Ｈ−Ｂ−Ｘ　（Ｉ［Ｉ） 〔式中、ＢはＰｈｅ、　Ｌｅｃ＋、　Ｉｌｅ、　Ｖａｌであり；Ｘは一０ＣＨｓ 　。

−０Ｃ２Ｈ％　、　−０ＣＨｚＣＪｓ　、　−ＮＨｚ　、　−ＮＨ−Ｃ６Ｈｓ　 、　−ｐ　−ＮＨ−ＣｂＦＩ４−ＮＯ□、ＮＨ−ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨＣｂＨｓで ある〕を有する、カルボキシル基で保護されているアミノ酸との縮合を含んで成 る。

本発明によれば、たとえばサブチリシンのセリンプロテイナーゼ又はホルミルメ チオニンアミンアミノペプチダーゼの側基質及びアスパルテームの前駆体（Ｎ− ホルミル−し−アスパルチル−し−フェニルアラニンのメチルエステル）ヲ調製 することが可能になった。式（１）に対応するこれらの化合物は・光学的に活性 の生成物であり；それらの製造は、類似する生成物の製造を確保する従来の技術 に比べて、実質的に−ＭＮ単である。本発明の方法における目的とする生成物の 収率は９５．５％である。

出発化合物の範囲を広くするために、すなわち、目的とする生成物の製造のため に合成アミノ酸を用いるために、本発明によれば、Ｎ−ホルミル保護のカルボキ シル化合物及びそのカルボキシル基で保護されているアミノ酸とに、これらの化 合物のＤＬ−誘導体又は光学的に活性のし一アミノ酸を使用することが望ましい 。

本発明によれば、バシルス属の微生物として、次の種の微目的とする生成物の高 収率を確保するために、本発明に従って、Ｎ−ホルミル保護のカルボキシル化合 物（■）　：そのカルボキシル基で保護されているアミノ酸（ＩＩＩ）とのモル 比が１：１〜１：２の比で縮合を行なうことが好ましい。

目的とする生成物の高収率を確保し、そして最っとも可能なだけ短時間内に合成 過程を実施するために、バ之立玉属の微生物によって産生されたメタロプロテイ ナーゼを、Ｎ−ホルミル保護のカルボキシル化合物（ｎ）のｍモル当り１〜１０ ＸＩＯ−’ｍモルの量で用いることが本発明に従えば、好ましい。

本発明の態様は、水性−有機培地として、水性−ジメチルホルムアミド培地が用 いられることにある。

さらに本発明の目的及び利点は、Ｎ−ホルミル−し−ペプチダーゼを製造するた めの方法の次の詳細な説明及びこの方法を例示する例から一層十分に明らかにな るであろう。

ペプチド結合の酵素による合成の利点は、高いステレオ及びレジオ選択性（ｓｔ ｅｒｅｏ−ａｎｄ　ｒｅｇｉｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）の方法にある。ペプ チド形成の段階において、生触媒として酵素の使用は、生成物の光学純度の保護 及び天然のし一装置のペプチド結合の形成による反応の存在を確保する。側基に おけるさらに機能的な基によるアミノ酸の予備的な保護は必要とされない、たと えば、アスパラギン酸の場合、縮合はα−カルボキシル基でのみ進行し、ところ が、β−カルボキシル基はそのまま残る。

ペプチドの酵素による合成においては、合成サイドの方へその反応平衡を移動す る態様の１つは、反応領域から沈殿物として目的とする生成物の除去である。こ の場合、アミノ基の保護のために、それらのカルボキシル基、疎水性保護基、た とえばベンジルオキシカルボニル基、又はｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ ル基によるペプチド結合の形成において関係するアミノ酸又はペプチドを使用す ることがひじょうに有益である（Ｉｓｏｗａ　Ｙ、、０ｈａａｏｒｉ　Ｍ、＋Ｉ ｃｈｉｋａｗａ　Ｔ、＋Ｍｏｒｉ　Ｋ、。

Ｎｏｎａｋａ　Ｙ、Ｊｉｈａｒａ　Ｋ、Ｏｙａｍａ　Ｋ、、５ａｔｏｈ　Ｈ，、 ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　Ｓａｔ↑ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｌ、、１９７９． 第２８号、２６１１〜２６１２ページ）。

これらの保護基は、反応生成物の疎水性を幾分増大しながら、目的とする生成物 の形成に向って平衡を移動することに貢献する。ホルミル保護基の比較疎水性は 、反応生成物の溶解度の目だった減少及び、それによって、ペプチド結合の形成 に向っての反応平衡の移動をもたらさない。

本発明者は、特別な研究及び実験を行ない、そして選択された酵素の存在におい て本発明者によって選択された出発化合物の好結果をもたらす縮合を確保する条 件を見出した。

ペプチド形成の段階において生触媒としてメタロプロテイナーゼ、たとえばサー モリシンの使用は、一般式：Ｆｏｒ−Ａ−Ｂ−Ｘの合成ペプチドの位？！Ａ及び Ｂに位置するアミノ酸成分の選択に影響を及ぼす。

メタロプロテイナーゼは開裂を行ない、そして従って最っとも高い割合でペプチ ド結合を生成することが知られている。

そこで、アミノ基の供与体は、疎水性アミノ酸の残基又は枝分れの側鎖、たとえ ばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンを有するアミノ酸である 。当発明者は、フラグメントＨ−Ｂ−Ｘの位置Ｂにおける最っとも有益なものは 、ロイシン及びフェニルアラニンの成分であることが実験的に見出した。

位ｆＢに位置し、そしてそのアミノ基によってペプチド結合の形成に貢献するア ミノ酸残基のカルボキシル基は、エステル型及びアミド型の両者の実質的にいづ れかの保護基によって保護され得る。エステル型として、メチル、エチル、ペン ジスエステルの保護基が使用され得る。アミド型の保護基として、アミド、アニ リン、置換されたアニリド、特にｐ−ニトロアニリド、ヒドラジド及び置換され たヒドラジドが使用され得る。

メタロプロテイナーゼの特異性は、一般式：Ｆｏｒ−Ａ−Ｂ−Ｘの合成ペプチド の位ｆＡに位置するアミノ酸成分の特徴に対して厳密すぎる限定を課さない。

位ｆＡにおいて、脂肪族アミノ酸（グリシン及びアラニン）、芳香族又は疎水性 アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、メチオニン）、ジカルボキシルアミノ 酸（アスパラギン酸）の残基又はこれらのアミノ酸残基、たとえばアラニル−ア ラニル、アラニル−グリシル、グリシル−アラニル、グリシル−グリジスを含む ジペプチドフラグメントが位置する。

ペプチド結合の形成の段階における生触媒として、中性プロテイナーゼとして言 及されている種々のメタロプロテイナーゼが使用され得る。このクラスの酵素の 活性中心においては、金属イオンが存在し、そのために、それらのすべては、エ チレンジアミンテトラ酢酸、０−フェナントロリン及び同様のもののような金属 キレート剤に対して敏感である。これらの酵素の酵素活性の最適ｐＨ値は、個々 の酵素のためには１、Ｈ最適値はお互い目だって異なるが、普通約７．０である 。最っとも代表的であり、そして明らかに最っとも研究されたこのクラスの酵素 は１．べ〉ぜにス」二ニエターｌｌ〕−久イ＋左ノヨによって産生されるサーモ ラリシンーメタロプロテイナーゼである。他の種のバシルスによって産生される 他のメタロブロチ）Ｌｔ　Ｘ　、ｊ；　’　ｌ　９　土によって産生される酵素 もまた知られている。

これらの酵素は、それらの性質及び基質特異性に関して、サーモリシンに近く、 そしてサーモリシンのようにペプチド形成の反応に使用され得る。

特定の酵素の選択は、まず第一に、製造のための有効性に依存する。

当発明者は、その方法を実施するために、出発のカルボキシル成分として、メチ オニン、フェニルアラニン、アラニル−アラニン、アスパラギン酸のホルミル含 有性誘導体を使用することが最っとも好ましく、そしてアミノ成分として、フェ ニルアラニン及びロイシンのｐ−ニトロアニリド又はフェニルアラニンのメチル エステルを使用することが好ましいことを実験的に見出した。

ペプチド結合の形成の酵素による方法におけるＣ−保護のアミノ酸とホルミルア ミノ酸又はホルミルペプチドとの縮合に使用される高いステレオ選択性酵素の使 用が、目的とする生成物の光学純度を確保する。カルボキシル化合物及びアミノ 化合物の両者の組成物におけるラセミＤＬ−アミノ酸の使用でさえ、天然のＬ− Ｌ配置のアミノ酸成分を含む生成物をもたらす、たとえば、ホルミル−ＤＬ−ア スパラギン酸に基づ（ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンメチレートの 合成において、ホルミル−し−アスパラギン酸のみが縮合の反応中に入り、とこ ろが、Ｄ−異性体は反応混合物中に残存する。類似する方法において、すなわち Ｌ−Ｌ配置のペプチド結合の形成に関しては、アミン化合物の組成物中における ラセミＤＬ−アミノ酸の使用に基づく合成が存在する。

ＤＬ−フェニルアラニンのメチルエステルからのホルミル−アスパルチル−フェ ニルアラニンのメチルエステルの合成においては、フェニルアラニンのメチルエ ステルのし一異性体のみが、ペプチド形成の反応中に入る。同時に、フェニルア ラニンメチレートの非天然り一異性体が、アスパラギン酸の残基のβ−カルボキ シル基で塩を形成し、従って、この反応において、Ｌ−フェニル−アラニンのメ チルエステルの挙動を十分に刺激する。この場合に形成されるホルミル−アスパ ルチル−フェニルアラニンのメチルエステルの収率及び光学純度は実質的に、出 発アミノ化合物としてＬ−フェニルアラニンのメチルエステルの使用により得ら れた結果と一致する。

これはまた、普通使用される縮合剤に関連する他の副反応を排除する。ペプチド 合成の酵素による方法においては、機能的な側基を有するアミノ酸を、前もって その保護をしないで使用することが可能である。従って、反応中にホルミルアス パラギン酸の導入の後、縮合はアミノ酸残基のα−カルボキシル基でのみ生じ、 そして十分にβ−異性体の形成を排除し、従って、かなり精製を促進せしめ、よ って目的とする生成物の収率を上昇せしめる。

本発明の方法に従ってＮ−ホルミル−し−ペプチドを製造するための方法は、た とえばタンパク分解酵素の基質として有用である、ひじように有効に保護された ジー及びトリペプチドの獲得を可能にする。

本発明の方法は、ペプチド合成の実施にホルミル保護のアミノ機能を有するアミ ノ酸の導入を可能にする。現在までに、ホルミルアミノ酸の合成はかなり前に記 載されているが、この種の保護の使用は限定され、そしてそれらの製造のために は、幾分容易に入手可能な反応体、すなわち蟻酸及び無水酢酸が必要とされる。

５〜１０℃の範囲内の温度での反応の実施は、アシル化の段階において光学的に 活性のアミノ酸のラセミ化の危険性を実質的に減じる。中間体として形成された 蟻酸無水物によって示されるアシル化荊の製造法及びホルミル化法の両方法は、 本来１つの装置により行なわれる。たとえばウレタン型保護の場合、ホスゲンの ような高い毒性化合物の使用に関連する合成である、アシル化刻の予（ｆｌ製の 段階をこれにより避けることができる。

ホルミルアミノ酸の有効性にもかかわらず、この保護基はペプチド化学において 広範囲に使されていなかった。なぜならば、はとんどの場合、ペプチド結合形成 の゛反応は不十分に進行するからであった。無水物の形成段階に関与する合成方 法を使用する場合、ラセミ化の反応は、アゾラクトンの形成によりかなり容易に 生じる。

本発明のＮ−ホルミル−し−ペプチド合成のための方法においては、ペプチド結 合の形成の段階に使用される高いステレオ選択性の酵素は、光学的に純粋な生成 物の形成を保証し、そのペプチド合成においてホルミル−アミノ酸の適用を制限 本発明の方法の実質的な特徴の１つは、６．０〜９．０の範囲内のｐｎの培地で 縮合反応を実施することである。このペプチド結合の合成の反応における、使用 されるｐＨの範囲は、普通、反応体の等モル量によって確保され、必要な場合、 要求されるｐＨ値は、濃水酸化ナトリウム溶液の添加によって行なわれる。６以 下のｐＨで、生成物の収率は鋭く減少しく２％及びそれ以下に減少する）：９． ０以上のｐｎで、保護基、たとえばメチルエステルの不安定性に関連するいくつ かの副反応が、これらの条件下で起こりうる。

この反応は普通、２０〜２５℃の温度で進行する。たとえば、ホルミルーアラニ ルーアラニルーホニルアラニンｐ−ニトロラニリドの合成においては、２２℃の 温度での生成物の収率は９３％である。６℃以下の温度の降下は酵素反応の減速 及び従って、減少されたペプチドの収率をもたらし；６℃での生成物の収率は６ ２％である。６０℃以上の温度の使用は、上昇された反応生成物の溶解性及び従 って、減少された目的生成物の収率をもたらす。たとえば、バシルスサブチリス のメタロプロテイナーゼの存在におけるホルミル−アスパルチル−フェニルアラ ニンのメチルエステルの合成においては、１５℃の温度で、その反応生成物の収 率は８５％であり、幾分の反応期間の延長で、２℃での収率は１８％であり、そ して６０℃での収率はたった１１％である。

反応時間は６〜４８時間の範囲内で異なり、そして特定の場合ごとに、反応生成 物の残基の形成の速度に依存する。たとえば、ホルミル−アラニル−アラニル− フェニル−アラニルｐ−ニトロアニリドの合成において、３時間後、生成物の収 率は５４％であり、２４及び４８時間後、それぞれ収率は８５及び８７％である 。従って、インキュベーション時間の減少は、生成物の収率に対して有意義な影 響を提供する。同時に、最適な期間以上の工程期間の延長は、収率の著しい増加 をもたらさず（７２時間以上で９０％）、そして従って不適当である。この工程 の完結は厳格に個別的であり、そして選択された条件下で、出発化合物の構造に 依存する。

この反応に使用される酵素の量は、カルボキシル化合物のｍモル当り１．１０− ’〜１０．１０−’ｍモルの広範囲内で異なることができる。たとえば、ホルミ ル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンｐ−ニトロアニリドの合成において 、１．１０−’ｍモルへの酵素量の減少は、工程の減速及び４０％以下の収率の 減少をもたらし、ところが、６Ｘ１０−’又はｌ０ＸＩＯ−’ｍモルの酵素の導 入に基づいては、その反応は、それぞれ８９及び９５％進行し；そして多過ぎる 量の酵素の使用は勧められない。

反応は、水性又は水性−有機培地中において行なわれる。

溶媒として、ジメチルホルムアミドが通常、使用される０反応混合物中における その含有率は５０％までであり、そして出発のアミノ−及びカルボキシル化合物 の溶解性によって完全に決定される。

発明を実施するための最良の態様 本発明者は、次の一般式（■）： Ｆ　ｏ　ｒ　−Ａ−ＯＨ（ＩＩ） 〔式中、Ｆｏｒはホルミルであり、ＡはＡｓｐ、　Ｍｅｔ＋　Ｇｌｙ、　Ａｌａ 。

Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ−Ａｌａ、　Ａｌａ−Ｇｌｙ、　Ａｌａ−Ａｌａ、　 Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ　、である〕の〕Ｎ−ホルミル保のカルボキシル化合物と、次 の一般式（■）： Ｈ−Ｂ　−Ｘ　（Ｉ［Ｉ） 〔式中、ＢはＰｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｖａｌであり；Ｘは一０ＣＨｚ　 。

−０ＣＪｓ、−Ｎ）ｌｚ、ＮＨＣＪｓ、ｐ　ＮＨＣ６Ｈ４ＮＯｘ、ＮＨＮＨｔ　 、　−ＮＨＮＨＣｂＦＩｓである〕の、カルボキシル基で保護されたアミノ酸と を、次の種：バシルスサー−Ｅ７’０−．（−ｙ−（どの微生物によって産生さ れるメタロプロテイナーゼの存在下で縮合せしめ°ることを提案する。

反応は、温和な条件下：中性値に近いｐＨで及び室温で水性又は水性−ジメチル ホルムアミド培地中において行なわれる。

酵素の触媒量は、この反応のために必要とされる。すなわち、カルボキシル化合 物のｍモル当り１〜ｌ０ＸＩＯ−’ｍモルの酵素が必要である。これらの条件下 での反応時間は、特定の場合、出発アミノ酸の構造に依存する反応生成物の沈殿 速度によって定義される。得られる反応生成物の収率は、２５〜９５％の範囲内 にある。

本発明を一層理解するために、その特別な態様を例示するいくつかの特定の例を 下記に与える。他１こ特別に特定されなければ、すべてのアミノ酸は、Ｌ−シリ ーズのアミノ酸である。最終化合物の均質性は、チェコスロバキアから入手でき る“５ｉｌｕｆｏｌ”プレートを用いる薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ） によって次のシステムにおいて調べられた：　（１）１５：１０：１２：３のｎ −ブタノール：ピリジン：水：酢酸又は（２）３ニアのメタノール：クロロホル ム。回転角度を、分光施光計″）Ｉｉｌｇｅｒ”　（イギリス）で測定した。サ ーモリシンを５ｅｒｖａ”社（ＦＲＧ）から得た。他のメタロプロテイナーゼを 当実験室で単離した。使用されるアミノ酸を、“Ｒｅａｎａｌ”ファーム（ハン ガリー）から手に入れ、フェニルアラニン及びロイシンのｐ−ニトロアニリドは ソビエトの生成物のものであり、そして樹脂５Ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５ を、スウェーデン社の＠Ｐｈａｒｎａｃｉａ″から手に入れた。

１１０℃の温度で、５．７ＮのＨＣＮを含むシールアンプル中におけるペプチド の２４時間の加水分解の後、アミノ酸分析を、アミノ酸分析器“Ｄｕｒｒｕｍ″ Ｅｌ−５００（Ｕ　Ｓ　Ａ）により実施した。

例１ ホルミル−メチオニル−ロイシンｐ−ニトロアニリドの合成。

ホルミルメチオニン０．３５４ｇ　（２ｍモル）及びロイシンｐ　−ニトロアニ リド０．５０２ｇ　（２ｍモル）の混合物を、ジメチルホルムアミド１．５ｒｒ ｌに溶解し、ｐＨ＝７．１で塩化カルシウムの５　Ｘｌ０−”Ｍ溶液５ｍｌを、 撹拌しながら注意してそれに添加し、そして次に、サーモリシン５■（１３３ｍ モル）を導入する。撹拌を、２０℃の温度で６時間続け、次にその反応マスを冷 蔵庫に１晩放置する。沈殿物を濾過し、そして０．５ＮのＨ（Ｊ　（２Ｘ０．５ ｍｆ）　、水（２ｘ０．５ｍｆ）　、０．５ＮのＮａＨＣＯｓ　（２Ｘ　Ｏ，５ ｍＡ！　）　、及び水（２Ｘ０．５ｒｒｌ）によりフィルターを洗浄し、そして 真空デシケータ−中で乾燥せしめる。収量は０．７８４　ｇ　（９５，５％）で ある。Ｒｆ＋　、　０．７７、Ｒｈ０．５４ｉミノ酸組成：　Ｍｅｔ　Ｏ，８９ 、Ｌｅｕ　１．１１゜例２〜９は下記の第１表に与えられている。

第一よ−１ ホルミル−メチオニル−ロイシンｐ−ニトロアニリドの収率対反応培地８のｐＨ の関係 例番号　培地のｐＨ収率、％ ２　５．６　１．９７ ３　６．０　Ｂ、８ ４　６．５　１７．２ ５　７．０　？７．０ ６　７．３　７９．８ ？　７．５　８４．４ ８　８．０　？０．３ Ｘ）その反応混合物は、ジメチルホルムアミドＱ、５ｍｊ！及び０．１　Ｍのク エン酸緩衝液０．２ｍｊ！中ホルミルメチオニン０．６３ｍモル及びロイシンｐ −ニトロアニリド０．６３ｍモル（例２〜４）又は０．０５Ｍのホウ酸緩衝液２ ｍｌ中、サーモリシン２．５■（６３ｍモル）（例５〜９）を含み；その混合物 の２２℃で２時間、そして冷蔵庫に１晩保持し、残渣を上記例１に記載されてい るように洗浄する。

例１０ ホルミル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンｐ−ニトロアニリドの合成。

ホルミル−アラニン−アラニン０．１８８ｇ　（１ｍモル）及ヒフェニルアラニ ンｐ−ニトロアニリド０゜２９０ｇ（１ｍモル）の混合物をジメチルホルムアミ ド０．４　ｍ　ｌ中に溶解し、ＣａＣｌ　ｚのＩ　Ｘｌ０−”Ｍ溶液（ｐＨ＝　 ６．９　）　０．６　ｍｌを、撹拌しながらそれらに注意して添加し、その後、 ＣａＣｌ　、の１×１０−３Ｍ溶液（ｐＨ＝　６．９　）中、３７．５■／ｍＪ の酵素標準溶液（１ｍＭ溶液、サーモリシンの分子１ｔ３７．５００ドルトンで ある）のサーモリシン溶液４０μ２を添加し、その反応マスを、室温で２４時間 、保持し、得られる沈殿物を濾過し、そのフィルターを前記例１に記載した同じ 方法で洗浄し、そして真空デシケータ−で乾燥せしめる。収量は０．３５０ｇ　 （８５％）０、５　；　ＤＭＦＡ）　、融点＝２０１℃、アミノ酸組成：　Ａｌ ａ　１．９９　：Ｐｈｅ　１．０１゜ 例１１〜１４は下記の第２表に与えられている。

ぶ−」し−表 ホルミル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンｐ　−ニトロアニリドの収率 対酵素量ゞの関係１３　６０　６０　８９” Ｘ）反応混合物は、ジメチルホルムアミド０，４ｍｊ２及びＣａＣｆ　ｔ　Ｏ， ６ｍｌｌ溶液中（ｐＨ＝　６．９　）　、ホルミルアラニル−アラニン１ｍモル 及びフェニルアラニンｐ−ニトロアニリド１ｍモルを含み、３７．５■／ｍβの 標準溶液（１ｍＭ溶液）からのサーモリシンを添加、さらに操作を前記の例１０ に記載しているようにして行なう。

ｘｘ）反応混合物は、ＣａＣ１２ｚのＩ　Ｘｌ０−’Ｍ溶液（ｐＨ＝６．９）の ０．５　ｍｌを含む。

例１５〜１９は下記の第３表に与えられている。

ホルミル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンニトロアニリドの収率対温度 ８の関係 Ｘ）反応混合物は、ジメチルホルムアミド０．２ｍｍ！及び水０、３ｍｆ　（ｐ Ｈ＝６．７）中、ホルミル−アラニル−アラニン０、５ｍモル及びフェニルアラ ニンｐ−ニトロアニリド０．５ｍモルを含み；　３７．５■７ｍｌの標準溶液か らのサーモリシン２０μｌ、すなわち２０ｎモルの酸素を添加し：上の特定の温 度で２４時間、保持し、さらに操作を前記例１に記載しているのと同じようにし て行なう。

例２０〜２３は、次の第４表に与えられている。

メー」Ｌ−表 ホルミル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンｐ−ニトロアニリドの収率対 時間８の関係 Ｘ）この反応は、前記例１６に記載されている同じ方法で行なわれ、その反応混 合物は、上の特定の時間、室温で維持され、そして他の段階は、例１に記載して いるのと類似する。

例２４〜２６は、下記の第５表に与えられている。

Ｘ）この反応混合物は、上の特定の量のアミノ化合物及びカルボキシ化合物、ジ メチル−ホルムアミド０．２ｍｌ、水０、　３　ｍｊ！　（ｐＨ＝　６．　７　 ）及び１ｍＭのサーモリシン溶液２０ｔｔｌを含み；その混合物は、室温で２４ 時間、保持され、そして次に、前記の例１に記載しているように処理される。

例２７ ホルミル−アラニル−アラニルロイシンｐ−ニトロアニリドの合成 ホルミル−アラニル−アラニル０．１８８ｇ　（　Ｌ　ｍモル）及びロイシンｐ −ニトロアニリド０．２５１　ｇ　（　１　ｍモル）の混合物を、ジメチルホル ムアミド１ｍｆｆｉ中に溶解し％　５　ｘｌＯ−”ＭのＣａＣ　ｌ　ｚ溶液（ｐ Ｈ＝　６．　８　）　５　ｍｌを撹拌しなＭａｙ添加シ；サーモリシン５■（１ ３３ｒｎモル）をそれに添加し、２２℃で６時間、保持し、そして次に冷蔵庫の 中で１晩置（、形成された沈殿物を濾過し、前記例１に記載しているのと類似す る方法に従って、フィルターを洗浄し、そして真空デシケータ−により乾燥せし め、生成物０．３０５ｇ　（７２．５％）を得る。

Ｒｆ．　＝　０．７０　；　Ｒｆｔ＝　０．７１　；　（α〕。＝−２１°　（ 　ｃ　−　０．　５、ＤＭＦＡ）　、融点＝１７６℃。

アミノ酸組成：　Ａｌａ．　１．９３、Ｌｅｕ　１．０８。

例２８ ホルミル−フェニルアラニル−ロイシンｐ−ニトロアニリドの合成 ホルミル−フェニルアラニル１９■（１００μモル）及びロイシンｐ−ニトロア ニリド２５■（１００μモル）の混合物を、ジメーＦ−ルホルムアミド０．１５ ｍ１中に溶解し、そして水０．２ｍＪ（ｐＨ＝　６．８　）及びサーモリシン０ ．７ｇ（２０ｎモル）を、撹拌しながら注意して添加し、そして室温で２４時間 、保持する。その得られる沈殿物を、エチルアセテ−１−５ｍ１中に溶解し、そ して０．５　Ｎのクエン酸（ＩＸｌｍｌ）、水（１Ｎ１ｍｌ、０．５ＮのＮａＨ ＣＯｚ　（Ｉ　Ｘ　１　ｍｌ　）により洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ 、そして真空蒸発せしめる。収量は２７■（６６％）である。Ｒｆｌ　＝　０． ８１　；　Ｒｈ＝　０．９１　；アミノ酸組成：　Ｌｅｕ　１．０　、Ｐｈｅ　 １．０゜例２９ ホルミル−アスパルチルフェニルアラニンのメチルエステルの合成 フェニルアラニンメチレート塩）ｆ塩２．１　ｇ　（１０ｍモル）に、水２．　 Ｑ　ｍ　ｌ中、ホルミル−アスパラギン酸０．６６ｇ　（３，１ｍモル）を添加 する。出発化合物の溶解の後、その反応混合物のｐＨを、６ＮのＮａＯＨ溶液を 添加することによって６．６〜６．８にする。次に、その反応混合物を、サーモ リシン２０■（５３０ｎモル）により処理し、そして２５℃で２４時間、電磁撹 拌機で撹拌する。残渣を、ＩＭ酢酸２５ｍ！中に溶解し、そして３０ｍｆｆ１の ５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５により処理し、その樹脂を濾過し、そして１ Ｍ酢酸により洗浄する。エチルアセテート：水の９：１の比の混合物（８Ｎ８ｍ ｌ）により前記酢酸溶液からペプチドを抽出する。集められた抽出物を、真空蒸 発せしめる。エーテル下で冷却することにより油状物を結晶化する。収量は０． ４２０ｇ　（３５％）である。〔α〕、−−２４．５°　（ｃ　＝０．５　；Ｈ ｚＯ）　；〔α〕。＝−１５°　（ｅ　＝　１　；　Ａｃ０Ｈ）　＊アミノ酸組 成：　Ａｓｐ　１．０３　；　Ｐｈｅ　Ｏ，９７゜例３０ ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステルの合成 この合成は、フェニルアラニンメチレート塩酸塩２ｍモル載された方法と類似す る方法により、行なわれる。

反応生成物を回収するために、沈殿物を、酢酸４．５ｍＪ中に溶解し、その溶液 を、エチルアセテート４０ｎｌの添加により希釈し；その得られる沈殿物を分離 し、有機層を水（７Ｎ２ｍ１）により洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ、 そして真空蒸発せしめる。収量は０．１４０■（４３％）である。

例３１ Ｎ−ホルミル−アラニル−アラニル−フェニルアラニンのメチルエステルの合成 Ｎ−ホルミル−アラニルアラニン０．３７６ｇ　（２ｍモル）及びフェニルアラ ニンメチレート塩酸塩０．４３０ｇ　（２ｍモル）の混合物を、４Ｎの水酸化ナ トリウム溶液Ｑ、５ｍ＃　（２ｍモル）中に溶解し、その反応混合物のｐＨを、 ６．７にし、バシルスポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｏｆ　ｍ　ｘ　）のメタ ロプロテイナーゼ３■を導入し、そして２５℃で２４時間、撹拌する。その沈殿 物を、エチルアセテート中に溶解し、そして水により洗浄し；有機層を硫酸ナト リウム上で乾燥せしめ、次に真空蒸発せしめる。生成物の収量は０．２５ｇ（３ ２％）である。Ｒｆ、＝０．７１゜ アミノ酸組成：Ａｌａ　１．９３　；　Ｐｈｅ　１．０６゜例３２ Ｎ−ホルミル−アラニル−アラニルロイシンのメチルエステルの合成。

Ｎ−ホルミル−アラニルアラニン０．３７６　ｇ　（２ｍモル）及びロイシンメ チレート塩酸塩０．３６２ｇ　（２ｍモル）の混合物を、６Ｎの水酸化ナトリウ ム溶液０．３３ｍｆ　（２ｍモル）中に溶解し、その反応混合物のｐＨを６．３ にし、バシルスサーモブー匹ｊ−（乏Δ＋、ｂ、；ｃのメタロプロテイナーゼ３ ■を導入し、２５℃で２４時間、撹拌する。その沈殿物をエチルアセテートに溶 解し、前記例３１に記載したようにして洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ 、そして真空蒸発せしめる。収量は０．２４０ｇ　（３６％）である。Ｒｆ、＝ ０．６９゜アミノ酸組成：　Ａｌａ　１．９８　；　Ｌｅｕ　１．０２゜例３３ Ｎ−ホルミル−アラニル−ロイシンｐ−ニトロアニリドの合成。

Ｎ−ホルミル−アラニル−ロイシンｐ−ニトロアニリド１０．３■（１００μモ ル）及びロイシンｐ−ニトロアニリド２５■の混合物を、ジメチルホルムアミド ０．１５ｍ！！中に溶解し、水０．２ｍｌを添加し、ｐＨを８．７にし、その後 、バシルスアミー監１７クエフアシエ７Ｘからのメタロプロテイナーゼ０．５■ を導入し、２５℃で２４時間、保持する。その沈殿物をエチルアセテート中に溶 解し、そして連続的に、水、０．５　ＮのＨ（Ｊ、水、０．５ＮのＨＣＩ　、水 、０．５Ｎの炭酸水素ナトリウム溶液、水により洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾 燥せしめ、そして真空蒸発せしめる。収量は１２■（３０％）である。融点＝＝ 　０．５　；　Ｄ？１ＦＡ）。

アミノ酸組成：　Ａｌａ　Ｏ，９８；　Ｌｅｕ　１．０６゜例３４ Ｎ−ホルミル−アラニル−フェニルアラニルｐ−ニトロアニリドの合成。

Ｎ−ホルミルアラニン１０．３■（１００μモル）及びフェニルアラニンｐ−ニ トロアニリド２９■（１００μモル）の混合物を、ジメチルホルムアミド０．１ ５ｍｊ！中に溶解し、水００２ｍ１を添加し、ｐＨを８．７にし、そして次にバ シルスアミロリク毛スＬシエンスからのメタロプロテイナーゼ０．５■を添加し 、そして２５℃で２４時間、保持する。その沈殿物を前記例３３に記載した方法 と類似する方法で処理する。その生成物の収量は８．５■（２５％）である。融 点−１５９℃；　Ｒｆ、−０，８０；Ｎ−ホルミル−フェニルアラニル−フェニ ルアラニンｐ　−ニトロアニリドの合成。

ホルミル−フェニルアラニン１９■（１００μモル）及びフェニルアラニンｐ− ニトロアニリド２９■（１００μモル）　の１１物を、ジメチルホルムアミド０ ．２ｍｌ中に溶解し、そして水Ｑ、２ｍ　Ｉｔを添加し、ｐＨを８．７にし、そ の後、バシルスアミロリクエフ　シエンスからのメタロフロテイナーゼ０．５■ を導入し、そして２５℃で２４時間、維持する。その沈殿物を、０．８４　；　 Ｒｆｔ＝　０．９１　；　（α）　Ｄ　＝　”　４°　（ｃ＝ｏ、５　；ＤＭＦ Ａ）。

例３６ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステルの合成。

フェニルアラニンメチレート塩酸塩１．７２ｇ（８ｍモル）に、水２ｍｐ中Ｎ中 水−ホルミル−アスパラギン酸６４ｇ　（４ｒｎモル）を添加する。６Ｎの水酸 化ナトリウム溶液を添加することによって、その反応混合物のｐＨを６．６にし 、その後、バ之／Ｉ／　Ｘ＋ｙＨチＪ−スからのメタロプロテイナーゼ２０■を 導入し、そして１５℃で２４時間、撹拌する。その沈殿物を酢酸中に溶解し、】 ０倍体積のエチルアセテートにより希釈する。得られた沈殿物を分離し、その有 機層を水により洗浄し、中性値のｐＨにし、硫酸ナトリウム上で乾燥廿Ｌ７め、 そして真空藩発アミノ酸組成：　Ａｓｐ　Ｏ，９８；　Ｐｈｅ　１０３゜例３７ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステルの合成。

例３６の方法をくり返す、但し、反応混合物を１０℃で２４時間、保持する。そ の生成物の収量は０．５１ｇ（４０％）である。

例３８ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンメチルエステルの合成。

前記例３６の方法をくり返す、但し、その反応混合物を２℃で７２時間、保持す る。その生成物の収量は０．２３０　ｇ（１８％）である。

例３９ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンメチルエステルの合成。

例３６の方法をくり返す。但し、その反応混合物を６０℃で２４時間、保持する 。その生成物の収量は００１４ｇ（１１％）である。

例４Ｏ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンメチルエステルの合成。

例３６の方法をくり返す、但し、１７−フエニルアラニンメチレー　）塩！塩の 代わりにＤＬ−フェニルアラニンメチレート４１ Ｎ−ホルミル−アスパルチル−フェニルアラニンのメチルエステルの合Ｊ戊。

フェニルアラニンメチレート塩酸塩１．７２ｇ（８ｒｎモル）に、水４ｍｌ中Ｎ −ホルミルーＤＬ−アスパラギン酸１．２８　ｇ　（８ｍモル）を添加し、その 反応混合物のｐＨを、６Ｎの水酸化ナトリウム溶液を添加することによって６３ ６にし、その後、バシルスサブチリスからのメタロプロテイナーゼ２０■を導入 し、そして２０℃で４８時間、撹拌する。その得られる沈殿物を、前記例３６に 記載した方法と同じ方法で処理する。その生成物の収量は、Ｎ−ホルミル−Ｌ− アスパラギン酸に基産業的適応性 本発明のＮ−ホルミル−し−ペプチドは、実験生物学及び医学に有用であり、よ り具体的には、色素群を含むホルミルペプチドは、いくつかの酵素、たとえばホ ルミルメチオニン−アミノペプチダーゼのための基質として使用され得る。なぜ ならば、大部分、親水性であるそのような基質は、水性培地中で容易に溶解し、 従って酵素によって産生される効果を受けやす（なるからである。

前にすでに述べたように、ホルミルペプチドの１つの例は、アスパルテーム−ホ ルミルアスパルテームの前験体、すなわち、ホルミル−し−アスパルチル−し− フェニルアラニンメチレートである。

すでに知られているように、アスバルテールば、砂糖よりも２００倍近く甘く、 そして砂糖に代わるものとして有用である。特に、糖尿病を有する患者のための 砂糖に代わるものとしてアスパルテールの使用が見込まれている。アスパルテー ルはまた、低カロリー食、非アルコール飲料の製造、及び化粧品に有用である。

微生物に無関係であるが、アスパルテールは特に、医薬的適応、たとえば子供の 治療に重要なものであるせ美性医薬品に適切であり、そしてアスバルテールは、 成人のためにと同様子供のためにも一層安全である。医学的観点から、アスパル チルは、サッカロース以上の１つの重要な利点を有する。

すなわち、それは虫歯の発育を刺激しない。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．次の一般式（Ｉ）： Ｆｏｒ−Ａ−Ｂ−Ｘ（Ｉ） 〔式中、Ｆｏｒはホルミル基であり；Ａは【配列があります】であり；Ｂは【配 列があります】であり；Ｘは【配列があります】基である〕のＮ− ホルミル−Ｌ−ペプチドの製造方法であって、次の一般式（ＩＩ）： Ｆｏｒ−Ａ−ＯＨ（ＩＩ） 〔式中、Ｆｏｒはホルミル基であり；Ａは【配列があります】である〕のＮ−ホ ルミル保護のカルボキシル化合物と、カルボキシ基で保護されそして次の一般式 （ＩＩＩ）：Ｈ−Ｂ−Ｘ（ＩＩＩ） 〔式中、ＢはＰｈｅ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌであり；Ｘは【配列があります】 基である〕を有す るアミノ酸とを、ｐＨ＝６，０〜９．０及び０〜６０℃の範囲内の温度で水性又 は水性−有機培地中において、バシラス属の微生物によって産生されるメタロプ ロテイナーゼの存在下で縮合する方法。
2. ２．Ｎ−ホルミル保護のカルボキシル化合物及びカルボキシル基で保護されたア ミノ酸として、前記化合物のラセミＤＬ−誘導体又は場合によっては活性Ｌ−ア ミノ酸を使用することを特赦とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．バシラス属の微生物として次の種の微生物：バシルスサーモプロテオライチ カス、バシルスステアロセルモフィラス、バシルスアミロリクエファシエンス、 バシルスサプチリス、バシルスポリミクサを使用することを特徴とする請求の範 囲第１項及び第２項記載のＮ−ホルミル−Ｌ−ペプチダーゼの製造方法。
4. ４．前記縮合を、１：１〜１：２のＮ−ホルミル保護のカルボキシル化合物：カ ルボキシル基で保護されているアミノ酸のモル比で行なうことを特徴とする請求 の範囲第１〜第３項記載の方法。
5. ５．バシラス属の微生物によって産生されるメタロプロテイナーゼを、Ｎ−ホル ミル保護のカルボキシル化合物のｍモル当り１〜１０−５ｍモルの量で使用する ことを特徴とする請求の範囲第１〜第４項記載の方法。
6. ６．水性−有機酸として、水性ジメチルホルムアミドを使用することを特徴とす る請求の範囲第１〜第５項記載の方法。