JPS63500941A - 選択的脱アミノ化による哺乳動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 樽択的脱アミノ化による補光動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強 発明の分野 本発明は、元来、残基９６−１０１間に位置するアスパラギンを有する哺乳動物 ソマトトロピンの脱アミノ形を開示するものである。これらの修飾されたソマト トロピンはその天然様に比して増大した生物学的活性を有する。本発明は特に、 ウシ・ソマトトロピン（ｂＳｔ殖Ｓ８．２の等電点（ｐＩ）を有する主たる電気 泳動種よりなる天然形態からｐＩが７．５と６．５間である主たる電気泳動種を 有するｂＳｔ分子の生物学的に増強された組成物への変換によって修飾されたウ シ・ソマトトロピン化合物よりなる組成物を開示するものである。好ましいウシ ・ソマトトロピンはアミノ酸残基９６−１０１間に位置するアスパラギンの個所 がイソアスパラギン酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸への修飾を受けた種 である（第１図参照）。これらの生物学的に増強された組成物の生産のための化 学的方法および組換体遺伝子法も開示される。

ウシ・ソマトトロピンはかなり研究されかつ文献としても最近バラデイエイ、エ イ・シイら（Ｐａｌａｄｉｎｉ、Ａ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、）Ｃモレキュラー・バ イオロジー・オブ・グロウス：ホルモンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｓ）、シイ・アール・シイ・クリティカ ル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉ ｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５：２５−５６（１９８３）〕によって 総括されている成長ホルモンである。ソマトトロピンは最初、種々の動物種から の下垂体抽出物中で発見された。一般に、ソマトトロピンは保存型分子であり、 アミノ酸の配列および構造における類似性が異なる進化的分類の動物間で見い出 されている。

ウシ成長ホルモンを包含する成長ホルモンは２−３個の領内ジスルフィド結合を 有する約２００個のアミノ酸の単一鎖よりなる球状蛋白質である。従って、ｂｓ ｔは１９０〜１９１個のアミノ酸の単一鎖、２個の領内ジスルフィド結合を持つ 球状構造および約２２０００ダルトンの分子量を有する。

下垂体物質から抽出された天然のｂｓｔは蛋白質の不均一な混合物である。少く とも６種の蛋白質の主要な形態が記載されている。最も長い形態は１９１個のア ミノ酸残基を有するアミノ末端ａｌａ−ｐｈｅ　ｂｓｔである。

第２の形態は１９０個のアミノ酸残基を有するアミノ末端ｐｈｅ　ｂＳｔである 。第３の形態は１８７個のアミノ酸残基を有するアミノ末端Ｍｅｔ”−ｂＳｔで ある。ｂｓｔの残りの３種の形態は、鎖中の位置１２７においてロイシンをバリ ンで置き換える対立遺伝子変異が存在する場合に生じる。前記の明らかにされて いる不均一性に加え、ウシソマトトロ□ピンの明らかにされていない不均一性も ハート、アイ・シイら（Ｈａｒｔ　、１．Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）、ザ・ヘテロジエ ニーテイ・オブ・ボビン・グロウス・ホルモン（Ｔｈｅ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ ｉｔｙ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒ　−ｍｏｎｅ）、バイオケ ミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ−）、２１８：５７３−５８１（１９ ８４）：およびワレイス、エムおよびディクソン、エイチ・ビイ・エフ（Ｗａｌ ｌａｃｅ　、Ｍ、　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｓｏｎ　、　Ｈ，Ｂ、Ｆ、）、ア・クロマ トグラフィツク・プレバレイジョン・オプ・オツクス・グロウス・ホルモン（Ａ 　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｐｒｅｐａｒａｔ　−１ｏｎ　ｏｆ　ｏｘ 　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｊ−）　、　１００　：５９３−６００（１９６５）によって記載されて いる。

明らかにされていない電気泳動的不均一性は、ＤＥＡＥセルロースカラムを用い るアニオン交換クロマトグラフィーによって天然抽出物を分画した場合に見られ る。

該明らかにされていない形態がバイオアッセイにおいて異なる叩対的能力を有す ることは示されたことがない。しかし、イオン交換カラムで分画した場合、ｂＳ ｔの明らかにされていない種がラット成長モデルにおいて種々の程度の生物学的 活性を呈することは示されている。ハートらならびにワレイスおよびディクソン （Ｈａｒｔ　、　ｅｔ　ａｌ、　ａｎｄ　Ｗａｌｌａｃｅ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｓ ｏｎ）、前掲。

本発明は、ｂＳｔ分子を温和な加熱およびアルカリ性状態に付すことによる選択 的脱アミノ化によってｂｓｔの生物学的活性を増大させる方法を開示する。該一 般法は非酵素的酸または塩基触媒反応におけるアスパラギンのアスパラギン酸ま たはイソアスパラギン酸への変換を含む。変換速度はポリペプチド配列中の隣接 するアミノ酸にいくぶん依存する。

ウシ・ソマトトロピンが脱アミノ化反応を受けることができる部位を有すること は公知である。ｉｎ　ｖｉｔｒ。

脱アミノ化および脱アミノ化の反応速度論はルイス、ユウ・ジエイら（Ｌｅｗｉ ｓ　、　Ｕ−３−１ｅｔ　ａｔ、）、カイネテイツク・スタディ・オブ・ザ・デ アミデイション・オブ・グロウス・ホルモン・アンド・プロラフティン（Ｋｉｎ ｅｔｉｃ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏ ｗｔｈ　ｈｏｒｍｏ　−ｎｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ビオシミ力・工 ・ビオフイジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ、　Ａｃｔａ）、２ １４：４９８−５．０８（１９７０）によって記載されている。、　ｂｓｔに関 し、ｐＨが増大するに従い、より低いｐ工種への変換がより急速に起こること、 およびｐＨ１０の緩衝液においてイオン強度が増大するに従い、脱アミノ反応速 度が同様に増大することは公知である。

組換体微生物によって産生されたまたは下垂体組織から抽出されたウシ・ソマト トロピンは大きな商業的価値を有する。それは乳゛牛において乳汁分泌を増大さ せ、肉牛において体格をよくしかつ自生産量を増大させる。ウシへの投与は問題 である。生産において商業的に許容される改良を行うのに１日当たり、１頭につ き１００ηまでが必要であると見積られている。かかる投与量は効果的な投与方 法を必要とする。１日当たり各動物；こ投与すべき薬剤量を減少させることにな るため、本発明で記載する如きｂＳｔの能力の改良は有用本発明はｂＳｔを包含 する哨乳動物ツマ））ロピンの生物学的活性の増強に関する。補光動物ンマトト ロピンの生物学的活性は選択的悦アミノ化によって増強できることを本明細書中 で開示する。さらに詳しくは、本発明は、動物におけるミルク生産および成長速 度が投与に先立ってｂＳｔ分子を部分的に脱アミノ化することによって促進され ることを開示する。

本発明において記載する化学的修飾は約７．０のｐＩを有するｂＳｔの電気泳動 種の割合の増加をひき起こす。

これらの種の存在を増加させるためには、温和なアルカリ性状態および加熱を用 いて天然形を不完全に脱アミ／化する。選択的に脱アミノ化されたｂＳｔ種は天 然の下垂体ｂｓｔまたは組換体ｂｓｔの同量よりも大きな速度で、動物における 成長速度、ミルク生産、および乳房柔軟組繊細胞数を増大させることができる。

化合物を開示するに加えて、脱アミノ化ｂｓｔの製造方法および使用方法を記載 する。

特に、本発明は主たる種が７，５ないし６．５間の等電点を有する電気泳動種の 混合物を有するウシ・ソマトトロビ、ン様化合物よりなる組成物を記載する。

本発明は、また、アミノ酸残基９６＝１０１間に位置するアスパラギンがイソア スパラギン酸またはアスパラギン酸に変換された哺乳動物ソマトトロピンの部分 的脱アミノ化種を含む。

スヘての補乳動物ンマトトロピンがそのアミノ酸配列の残基９６−１０１にアス パラギンを含有するものではないが、ｂＳｔに加えてブタおよびヒト成長ホルモ ンは適当な位置に単一のアスパラギンを含有する。従って、β巻に対応するこの 領域にアスパラギンを有する天然補乳動物ンマ））ロピンは本発明に含まれる。

天然様に加え、天然ソマトトロピンの９６−１０１残基に対応する領域にアスパ ラギンを有するｂＳｔ同族体および他の哺乳動物ソマトトロピンは本発明に含ま れる。かかる同族体は、下垂体切除ラットアッセイまたはそれが由来する補光動 物：こおいて成長応答を引き出すのに十分なアミノ酸配列における類似性を有す るすべての蛋白質を含むソマトトロピン様化合物を包含する。

さらに詳しくは、アミノ酸残基９６−１０１間に位置するアスパラギンがイソア スパラギン酸またはアスパラギン酸に変換されるｂＳｔ様化合物の種が好ましい 。

ソマトトロピンの多形ゆえに、各種ソマトトロピンのアミノ酸残基の位置番号は 異なる可能性がある。［天然哺乳動物ソマトトロピン」なる語はこれらの天然に 生じる種を含む。本明細書において、第１図は本発明の好ましい修飾部位に対応 するｂｓｔ’の１の種の特異的領域である。同族体が含まれかつ注目するアスパ ラギンがチョウおよびファスマン（Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎ）、ジャー ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏ１−　Ｂｉｏｌ、）、１１５：１３５（１９７７）およびアニュアル・レビ ュー・オブ・バイオケミストリ（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、４７　：２５１　（１９７８）により計算した β巻内にあるようだということに注目するのが役に立つ場合、他のソマトトロピ ンについての番号付与は異なる可能性がある。天然配列の９６−１０１として数 えた一般領域および該領域がβ巻であるという知見を用いると、当業者ならば、 別の天然哨乳動物ソマトトロピンにおいて脱アミノ化を受けることができる対応 するアミノ酸配列を容易に位置決めして所望の増強された生物学的活性を得るこ とができる。

この領域の化学的および遺伝子的修飾は共に本発明に含まれる。化学的脱アミノ 化の結果、天然に生じるアスパラギンの代りにアスパラギン酸およびインアスパ ラギン酸が共に形成される。７．５ないし６．５間の等電点を有するウシソマト トロピンの電気泳動様の割合を増大させる好ましい化学的方法は組換体もしくは 下垂体ウシ・ソマトトロピンを温和なアリカリ性処理または加熱あるいはその双 方で処理することを含む。加えて、クロマトグラフィー的もしくは電気泳動的技 術またはその組合せを用いて７．５ないし６．５の範囲外の等電点を有する種を 除去することにより所望の電気泳動様の割合をさらに増大させる方法が開示され る。好ましい単離方法は逆相高速液体クロマトグラフィーを利用する。

好ましい遺伝子修飾は負に荷電したアミノ酸を天然に生じるアスパラギンと置き 換えであるいはそれに付加して挿入する単一部位特異的突然変異法によるもので ある。荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。

７．５ないし６．５間の等電点を有する電気泳動様が増加するように修飾された ウシ・ソマトトロピンの有効量で処理することによる動物の成長速度を促進する 方法も開示される。加えて、動物の成長速度を増大させるこの方法はウシ型動物 ；こおける使用についてさらに詳しく開示される。

青春期の開始の頃と最初の分娩間の発育段階において、７．５ないし６．５間の 等重点を有する電気泳動様を増加させるように修飾されたウシ・ソマトトロピン の有効量で反別動物を処理することよりなる雌の反別動物において乳房柔軟組繊 細胞量を増加させる使用方法も開示される。加えて、修飾されたウシ・ソマトト ロピンが青春期の開始の頃から最初の妊娠に至る間に投与される場合、前記方法 をさらに詳しく記載する。

７．５ないし６．５間の等重点を有する電気泳動様が増加するように修飾された クシ・ソマトトロピンの有効量を投与することよりなる雌の反銅動物においてミ ルク生産を増加させる使用方法も開示される。最後に、反協動物が乳牛である場 合、この方法をさらに詳しく記載する。

［脱アミノ化されたまたは脱アミノ化」なる語は、その結果アスパラギンのイソ アスパラギン酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸への変換が起こる化学的に または組換体遺伝子的に導入されるソマトトロピンへの修飾をいう。化学的に導 入された修飾はアスパラギンの代りにイソアスパラギン酸またはアスパラギン酸 を生ぜしめる。組換体遺伝子的に導入された修飾はアスパラギンの代りにアスパ ラギン酸またはグルタミン酸残基のいずれかを生ぜしめる。開示される化学的処 理では最初、好ましいアスパラギン残基を脱アミノ化するが、時間がたつと利用 可能ないずれのアスパラギンまたはグルタミンも脱アミノ化する。アスパラギン 残基の負に荷”電した残基への変換は等重点電気泳動ゲル上のソマトトロピンの 像を変化させ、等電点電気泳動法を用いてモニターできる。「部分的もしくは選 択的脱アミノ化」なる語句は７．５および６．５間の等電点を有する不完全に脱 アミノ化されたソマトトロピン様蛋白質をいう。

「最も関連する天然ソマトトロピン」なる語句は、特定のソマトトロピン様蛋白 質と比較する場合、他のいずれの補元動物ソマトトロピンの天然に生じる形態よ りもアミノ酸配列においてより類似した同一性を持つ補元動物ソマトトロピンの 天然に生じる形態をいう。

「ソマトトロピン様蛋白質」なる語句はソマトトロピンの天然の形態、およびも し天然ソマトトロピンの同族体が成長促進物質またはミルク生産の刺激物質のい ずれかとしての生物学的活性を示すのに十分な蛋白質同一性そその親代合物；こ 関して有するならば該同族体も共にいう。

［哺乳動物ソマトトロピン」なる語句は補光動物由来のソマトトロピンをいい、 天然源、例えば下垂体組織またはソマトトロピンの天然に生じる形態を産生する 組換体遺伝子によって形質転換された微生物のいずれかに由来するソマトトロピ ンを包含する。特定の哺乳動物源がウシソマトトロンビンまたはウシ由来ノソマ トトロピンの如く称される場合、該ソマトトロピンは天然源または形質転換微生 物のいずれかに由来するものを包含する。

「微生物」なる語は細菌、酵母、放線菌の如き単細胞の原核生物および真核生物 ならびに細胞培養において増殖させた場合の高等植物または高等動物からの単一 細胞を共にいう。

「天然の」なる語は天然源、例えば下垂体組織ある由来し得るソマトトロピンの 天然に生じる形態をいう。

「ベクター」なる語は、微生物によって認識され得るプロモータに対してソマト トロピンが作動可能な状態で連結されるようにコード付けする　ｃＤＮＡ　の能 力によってソマトトロピンの表現を管理でキルクローニングプラスミドおよびプ ラスミドを共に包含する。

詳細な説明 哺乳動物ソマトトロピンはアミノ酸配列および物理的構造において非常に類似す る。以下に記載する方法はｂＳｔの脱アミノ化についてのものであるが、該方法 は脱アミノ化に利用できる必要なアスパラギン残基を有するいずれの哺乳動物ソ マトトロピンにも等しく適用できる。

下垂体または組換体微生物からのｂｓｔ”の典型的試料におけるイオン種は等電 点が９．０−５．５の範囲である。

化学的修飾ｂｓｔも種の混合物である：しかじ、７．５ないし６゜５の生物学的 に促進された領域内の等電点を有する種が支配的である。

本発明の基礎は、ｂＳｔの天然電気泳動的不均一性は脱アミノ化によって変化さ せることができて約７．０のｐｌ　を有する種の割合を増大させ、増大された生 物学的効果を得ることができるという知見にある。ハートらならびにワレイスお よびディクソン（ＨａＢ％ｅｔ　ａｌ、ａｎｄ’Ｗａｌｌａｃｅ　ａｎｄ　Ｄｉ ｃｋｓｏｎ）　、前掲。先行文献は生物学的活性の変化はｂＳｔの電気泳動種間 に存在することを示すものであり、ｂＳｔの天然に生じる形態の最も酸性のもの が最大の生物学的能力を有することが示されていた。混和な化学的処理の後、最 大の生物学的能力を有するイオン種は最も酸性の等電点を有する種ではなくむし ろ６．５′ｊ６よび７．０間のｐＩ　を有する中間域の種にあることが本発明に より示される。さらに、文献は脱アミノ化とｂＳｔの不均一抽出物において見い 出される生物学的活性の変化性との間の関係を示唆していない。事実、不均一の 原因は前記文献において推測されておらず、生物学的変化を示す明らかにされて いない不均一性のいずれが遺伝子変化、ｉｎ　ｖｉｖｏポスト翻訳修飾、リン酸 化における差異（リベルティ、ジエイ・ビイら（Ｌｉｂｅｒｔｉ　、　Ｊ、Ｐ、 　ｅｔ　ａｌ、）、バイオケミカル・ア゛シト・バイオフィジカル・リサーチ・ コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ 、　Ｃｏｍｍ、）、１２８ニア１３−７２０．１９８０）または単離の人工物に よるものなのかは公知でない。例えば多形によるｂＳｔのアミノ酸配列における 少数の差異の存在は本発明とは関係がない。記載する修飾は、下垂体から得られ たものであるかまたは組換体微生物から得られたものであるかにかかわらずｂｓ ｔのすべての生物学的活性形態を増強できる。化学的脱アミノ化に好ましいｂＳ ｔの形態は組換体微生物によって産生された種である。なぜなら、それは下垂体 抽出ｂＳｔよりも不均一性が小さく、生産するのにより経済的であるからである 。約７．０のｐＩ　を有するｂＳｔの最も好ましい脱アミノ化種は残基９６−１ ０１間に位置するアスパラギンがイソアスパラギン酸となる選択的修飾を受けた ものである。

ｂＳｔの同族体は公知である（ヨーロッパ特許出願７５４４４号および１０３３ ９５号参照）。かかる同族体はまた修飾されて生物学的活性を増強することがで き、本発明の一部分と考える。さらに、ｂｓｔ同族体または天然種のいずれも選 択的に突然変異を起こさせてｂａｔ分子の９６−１０１領域内にグルタミン酸ま たはアスパラギン酸のいずれかを収容することができる。

例えば、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ 、）　、１０（２０）：６４８７　（１９８２）参照。

ソマトトロピン様蛋白質を化学的に修飾する方法は酸性処理またはアルカリ性処 理を包含する。以下に記載する処理はｂｓｔを部分的に脱アミノ化し、好ましい ものである。効１果的な脱アミノ化はアルカリ性処理および高温により達成され る。７．５ないし１１のｐＨ範囲および２０℃ないし５０℃の温度範囲が一般に 効果的である。イオン強度もファクターであり、個々の緩衝液および存在する塩 に基づく００２ないし２．０の範囲が効果的である。以下に記載する如く、方法 のコントロールなくして、主たるｂＳｔ種は６．０またはそれ以下のｐＩ　を有 することになる。化学的処理の継続時間は温度およびｐＨに従って変化する。高 温かつ高ｐＨでは、脱アミノ化は低温かつ中性ｐＨにおけるよりも急速に起こる 。等電点電気泳動法または逆相高速液体クロマトグラフィー法を用いて該方法を モニターできる。

最も酸性のｂｓｔ種（ｐＨ５，ｏ）　は相対的能力において最も活性が低い種で ある。最もすぐれた種は部分的２このみ脱アミノ化されかつ７．５〜６．５領域 内に入るものである。７．０近傍のｐＩ　を有する生物学的に増強された形態の 生産を最適化するには温和な脱アミノ化法を用いなければならない。例えば、組 換体ｂＳｔは０．０１ないし０．２のイオン強度にてトリス−ＨＣｌ！、ホウ酸 ナトリウム、炭酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムの如きアルカリ性緩衝液中 に懸濁し、次いで脱アミノ化反応速度が温度上昇とともに急速に増大することに 注意しながら３０℃−５０℃まで加熱できる。これらの温和な条件は部分的な脱 アミノ化が４〜５日間の期間にわたってゆっくり起こることを可能とする。組換 体ｂＳｔの濃度は１．０ないし１０■／に９の範囲とする。

選択的脱アミノ化を完了した後、所望によりクロマトグラフィー技術または電気 泳動技術を用いてイオン種の混合物を精製する。精製の目的は７，０近傍の等電 点を有するｂＳｔのイオン種の割合を増大させかつ最終生成物の生物学的活性を 増大させることにある。単離および精製用の技術は予備的等電点電気泳動および アニオン交換クロマトグラフィーが好ましい技術であるイオン交換クロマトグラ フィーを包含する。最も好ましい分離法は逆相高速液体クロマトグラフィーであ る。

好ましい脱アミノ化ｂＳｔ種は容易な分離および精製を可能とする天然種と異な る保持時間を有する。

脱アミノ化ｂｓｔの高い相対的能力は下垂体切除ラットを用いて容易に測定され る。エバンズ、エイチ・エムおよびロング・ジエイ・エイ（Ｅｖａｎｓ　、　Ｈ ，Ｍ、　ａｎｄＬｏｎｇ　Ｊ−Ａ−）　、ジ・エフェクト・オブ・ジ・アンティ アリア・ロウツ・オブ・ザ・ハイポフイシス・アトミニスタート・イントラペリ トニアリ・アボン・グロウス、アンド・ザ・マチュアリティ・アンド・オニスト ラス・サイクルズ・オブ・ザ・ラット（Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅａ ｎｔｅｒｉｏｒ、］ｏｂｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ　ａｄｍｉｎ ｉｓｔｅｒｅｄ　１ｎ−ｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ　ｕｐｏｎ　ｇｒｏｗ ｔｈ　、　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｔｕｒｉｔｙａｎｄ　ｏｅｓｔｒｕｓ　ｃｙｃ ｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ）　、アナトミカル・レコード（Ａｎａｔ、　Ｒ ｅｃ、）。全体重における相対的な増加が下垂体ｂＳｔ、組換体ｂｓｔｃｒｂｓ ｔ〕および脱アミノ化ｒｂＳｔの各種分画物を用いて記録される。約７，０のｐ Ｉ　を有する脱アミノ化ｒｂＳｔ　のイオン種を用いるラットにおける結果によ り、天然の非脱アミノ化ｂｓｔよりも２〜３倍大きい能力が証明される。

乳牛への投与は必要な投与量を動物の循環系に投与するいずれもの効果的な経路 を用いる公知方法による。

投与法は経口投与、筋肉内注射、皮下注射および遅延移植の使用を包含する。好 ましい投与法は遅延移植を用いる皮下注射によるものである。注射用の適当なビ ヒクルは炭酸水素ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム溶液、またはリン酸アンモ ニウム溶液の如き生理学的に適合する緩衝液を包含する。遅延移植は、当該分野 において公知である、例えば米国特許第４３３３９１９号。

効果的な投与量範囲は１日につき１頭当たり１．０ないし２００ミリグラムであ る。投与するｂｓｔ量を大きくするに従い、成長、乳汁分泌または乳房柔軟組繊 細胞数が増加する結果となる。最も好ましくは、投与量範囲は１日当たり１０な いし５０ミリグラムである。

哺乳動物成長ホルモンはアミノ酸配列ｉこおいて非常に類似し、ある動物源由来 のホルモンは他の関係ない動物種の成長を促進できる。動物の成長速度を増大さ せる目的には、脱アミノ化ｂＳｔを用いてウシ、ヒツジ、ラット、サケおよびニ ワトリの如き天然ｂＳｔが成長遅延生物学的活性を有することが示されている同 一の動物種において成長増大をひき起こすことができる。好ましい動物は雄牛、 雌若牛または去勢雄牛の如き肉牛に用いるウシである。

肉牛はちょうど完全な成熟および大きさに達する前に層殺する。脱アミノ化ｂＳ ｔを用いて離乳期から層殺に至る間のいずれかでの投与により肉牛において成長 速度を増大することができる。脱アミノ化ｂｓｔは所望の屠殺時期に応じて最短 で３０日間、最長で４５０日間肉牛に投与する。子牛肉に用いる動物は、典型的 には約６方今において層殺し、３０ｒｎ９／日の脱アミノ化ｂｓｔを層殺の年令 に至るまで投与して成長速度における所望の増加を達成する。

ウシ特に乳牛において乳汁分泌を増大させる目的には、脱アミノ化ｂｓｔを分娩 後３０日および９０日の間に投与し、３００日まで継続する。脱アミノ化ｂｓｔ はヤギまたはヒツジの如き他の商業的ミルク生産動物においても乳汁分泌を増大 させる。

雌の反別動物、特に乳牛雌若牛において乳房柔軟組繊細胞数を増加させる目的に は、米国特許第４５２１４０９号（こ記載されている方法を参照のためにここに 挙げる。簡単に述べると、とりわけ乳牛雌若牛、ヒツジおよびヤギを包含する反 別動物を青春期の開始の頃しばしば脱アミノ化ｂｓｔで処理するものである。処 理は最初の妊娠または分娩に至るまで継続する。さらに詳しくは、乳牛雌若牛に おける脱アミノ化ｂｓｔの投与は予想される青春期の開始の３０日以内に開始し て青春期の開始後１００日に至るまで継続することができる。

青春期は視覚による推測によっては決定できない。

青春期は性的過程の開始に始まり性器官の成熟に至るまでで継続する期間だと定 義される。投与の正確な時期は個々の動物の品種、その栄養状態および育種慣行 に依存する。本節においておよび本明細書を通じて、１ないし５または１〜５ミ リグラム、数日、数時間、数度、またはｐＨ数単位の如き範囲によって記載され るパラメーターは特に断りのない限り包括的であることを意味する。

実施例 ―■■―−―−■■−■−−ζ―−−騨１−■−−−−−―実施例１０組換体ｂ Ｓｔ　ＣｒｂＳｔ　）組換体ｂＳｔは公知であり、ショーナー、ビイ・イーら（ Ｓｃｈｏｎｅｒ％Ｂ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、）、Ｏウ／Ｌ／　−、＋ｊ−ブ・メツ センジャー・アール・エヌ・エイ・トランスレイショナル・エフイシイエンシイ ・イン・ボビン・グロウス・ホルモン・エクスプレジョン・イン・エシェリヒア ・コ　リ　（Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｌａｔ ｉｏｎａｌ　ｅｆｆ　−１ｃｉｅｎｃｙ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｇｒｏｗｔｈ　 ｈｏｒｍｏｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ、）　、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）、米国、８１　：　５４０３〜 ５４’０７　（１９８４）；シーブルグ、ビイ・エイチ（Ｓｅｅｂｕｒｇ　、　 Ｐ、Ｈ−）、エフイシイエント・バクチリアル・エクスプレジョン・オブ・ボビ ン・アンド・ポルシン・グロウス・ホルモンズ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｂａｃｔ ｅｒｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄｐｏｒｃｉｎ ｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ）　、ディ・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、２： ３７〜４５（１９８３）およびヨーロッパ特許出願７５４４４号に記載されてい る如き多くの公開された方法によって産生できる。ｒｂＳｔ　種の選択は本発明 には無関係である。ｂｓｔにＮ末端不均一が存在することは公知である。本明細 書中で例に挙げる２つの種はｒｂＳｔ　のアミノ末端ａｌａ−ｐｈｅおよびｐｈ ｅ形態である。化学的脱アミノ化および生物学的テストではａｌａ−ｐｈｅ　ｒ ｂＳｔ　を例に挙げる。イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）によって表現されるｒｂＳ ｔ　の形態は蛋白質のＮ末端部分において正しい位置にメチオニン残基を有し得 る。この添加残基は本発明の性質に影響を与えず、その存在は任意である。

実施例２．　ｒｂＳｔのアミノ酸残基９９におけるアスパラギンの物理的脱アミ ノ化 これらはａｌａ−ｐｈｅ−ｒｂＳｔの残基９９におけるアスパラＡ、精製した組 換体ウシ・ンマトトロピン約３００ηを０．１５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ’Ｈ１０ ，０）　１６．５Ｍｌ中、３７℃にて１６８時間インキュベートする。インキュ ベーションの後、ｒｂＳｔを脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥する。配列中 位置９９における主要アミノ酸としてイソアスパラギン酸を含有するｒｂＳｔ　 成分を逆相ＨＰＬＣによって単離する。ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエ テイ・パーキン・トランスアクションズ（Ｊ　、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋ ｉｎ　Ｔｒｏｎｓ、）、１：２３１１−２３１８（１９８４）。記載されている 機構は開示する発明を限定するものだと解釈されるべきではない。

ｂｓｔを部分的に脱アミノ化する別法では１−２’９／ゴのｂｓｔ濃度を有する ｐＨ９，４５の１００　ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液用い、次いで３７℃にて ９６時間加熱する。次いで、この物質を希ＮａＯＨに対して透析し、続いて凍結 乾燥する。

Ｂ６分析ＨＰＬＣについては、Ａ溶媒として０．１％トリフルオロ酢酸およびＢ 溶媒として１００％アセトニトリルを含有する溶媒の直線グラジェントを用い、 室温にて、ｒｂｓ　ｔ　約５０μｇ　を０，４１　Ｘ　２５　ｃｍＶＹｄａｃ　 Ｃ−４逆相ＨＰＬＣカラムに付す。波速は１ｍ紛で一定とする。グラジェント条 件を以下に示す。

クロマトグラフィーの開始時にはアセトニトリルの濃度は３５％である。３０分 間にわたって溶媒Ｂの濃度を５０％まで増加させ、次いでさらに１５分間５０チ に維持し、その後５分間にわたってＢ溶媒を１００チまで増加させる。これらの 溶媒溶出条件を用い、アスパラギン残基９９を修飾したｒｂＳｔ　成分を天然ｒ ｂＳｔより約２分早く溶出させる。修飾ｒｂＳｔ　の相対保持時間は、天然ｒｂ Ｓｔ　の保持時間と比較すると約０．９４である。

ラット成長バイオアッセイで修飾ｒｂｓｔおよび天然ｒｂＳｔ　を開裂するには 、直列（こ連結した２個の０．４１Ｘ２５　ａｎ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ−４カラムお よび分析実験で用いたのと同一の溶媒グラジェントを用いて逆相ＨＰＬＣを行う 。予備ＨＰＬＣでは１０”ｇまでのｒｂＳｔを各バッチについてのカラムに付す 。予備クロマトグラフィーにおいては、修飾ｒｂＳｔ　成分の相対保持時間は、 天然ｒｂＳｔと比較すると約０．９０である。

次いて７．５すいし６．５のｐＩ　を有する脱アミノ化組換体ｂｓｔを含有する 画分を収集し、尿素中で６Ｍとし、水酸化アンモニウムでｐＨ１０〜１０．５に 調節し、希ＮａＯＨに対して透析し、凍結乾燥する。注射用には、次いでｐＨ９ ，５にて０．０３　Ｍ　ＮａＨＣＯ３および０．１５ＭＮａＣ１！中で該物質を 復元する。

実施例３０組換体遺伝子法を用いるｂＳｔ中の位置「９８」　および「９９」　 におけるヌクレオチド変化の導入 ｒｂＳｔ　のＤＮＡ配列）こおける変化はシラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　 ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）　（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｄ、　Ａｃ １ｄ　Ｒｅｓ、）、１０　：　６４　ｇ　？　−６５００，１９８２および〆ソ ツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、１００：４６８−５００．１９８３）の方法を用いてサイト・ディレクチイ ツト（ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発によって行う。

略言すれば、ｒｂＳｔ　遺伝子からのＤＮＡのセグメントをクローンしてＭ１３ ｍｐファージベクターに入れ、それを用いてイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　を感 染する。Ｍ１３ファージウィルス粒子から一本鎖ＤＮＡを単離し、所望の塩基変 化を含有する合成オリゴマーで交雑することができる。制限エンドヌクレアーゼ での消化によるプライマー伸長の後、二本鎖領域を単離し、クローンして［トラ ンジションベクター」中に入れる。次いでトランジションベクターを含有するク ローンを配列して所望の変化を確認する。トランジションベクターは変化したｒ ｂＳｔ　遺伝子の再組立ておよびその表現ベクターへの導入を可能とする制限部 位を提供する。

ジエネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のヨーロッパ特許出願７５４４４号および 英国特許第２１４７９０２Ｂ号に記載されている如く、実施例３Ａは表現ベクタ ーｐＢＧＨ３３−４中の修飾ｒｂＳｔ　遺伝子に基づく。この遺伝子はそのＮ末 端ＤＮＡ配列において修飾されており、ｒｂＳｔ　蛋白質の表現を促進する。こ の実施例は開示する発明を限定するものと解釈されるべきではない。コードン９ ８におけるｒｂＳｔ　の部位特異的突然変異のよい例となるｐＢＧＨ３３−４の 使用は便利である。ｂＳｔについてコード付けする同等に有用なｃＤＮＡ　を含 有する別のベクターが記載されている。ｐＢＧＨ３３−４はｐｈｅ　−ｒｂＳｔ 　遺伝子を含有し、位置９８に対するアミノ酸参照符号は化学的脱アミノ化およ び生物学的テストで用いるａｌａ−ｐｈｅ−ｒｂＳｔ　における位置９９に対応 することに注意すべきである。

実施例３Ｂはアラニンをｐｈｅ−ｒｂＳｔ　ｃＤＮＡの位置１におけるコードン 中に挿入する便利な方法を開示する。

特に断らない限り酵素反応条件、ＤＮＡの単離および精製、ならびに形質転換細 菌コロニーの培養を包含する遺伝子組換え操作を行う手順に関する以下に示した 方法はマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・ク ロヮニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニア・ラボラトリー−７ ニュア／ｌ／　（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、）、コールド・ス プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ　ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２によるものである。

本願に対してはユニークであるが、チャート１−８においてプラスミドおよびフ ラグメントを表わすのに用いる約束事はプラスミドおよびそのフラグメントの通 常の表現と同意義である。通常の環状図とは異なり、チャート上の単一の線の図 は示されている場合、翻訳開始または転写が左から右に（５′から３′に）起こ る環状および直線状の二本鎖ＤＮＡを共に表わす。星印間はプラスミドの環状形 を完成させるヌクレオチドの架橋を表わす。フラグメントは二本鎖ＤＮＡの直線 状断片であるのでフラグメントは星印を有しない。エンドヌクレアーゼ制限部位 は直線の上方に示す。遺伝子標識は直線の下方に示す。標識間の相対的な間隔は 実際の距離を示すものではなく、単に示したＤＮＡ配列上のそれらの相対的な位 置を示すものである。

実施例３　Ａ　ｐｈｅ−ｒｂＳｔ　の位置「９９」におけるグルタミン酸および アスパラギン酸の導 入 Ａ、）ランジションベクターの組立て トランジションベクターの目的は、サブセグメントが突然変異を受けた後、無１ ％ｒｂｓｔ　遺伝子の再組立てのための操作可能な制限部位を有するベクターを 提供スルコトニある。特に、本実施例は９８番目のコードンの上流に位置するｒ ｂＳｔ　ｃＤＮＡ配列におけるＰｓｔＩ　制限部位を利用する。このＰｓｔｌ　 部位は遺伝子においてはユニークであるが、ジェネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ）ベクターｐＢＧＨ３３−４についてはユニークではない。コードン９８を修飾 するには、この配列を含むＰｓ　ｔ　Ｉ／１３ａｍＨＩ制限フラグメントをクロ ーンしてＭ１３ｍｐ１９ヘクターに入れる（メリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソ ッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、１ｏ１：２０〜７８．１９８３およびヤニスクーペロンら（Ｙａｎｉｓ、： に−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、３３　：１０３ −１１９．１９８５　）。これらのＭ１３ｍｐベクターは商業的に入手可能であ る（インターナショナル・バイオテクノロジー、インコーホレイティド（Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、）、ニュー−／Ｎ −ペン（ＮｅｗＨａｖｅｎ）　、：ｌネティヵット州、米国）。Ｐｓ　ｔ　Ｉ／ ＢａｍＨＩ　ｒｂＳｔサブセグメントの突然変異誘発の後、ｒｂＳｔ　遺伝子を クローンして元のｒｂＳｔ　遺伝子のＰｓｔＩ　およびＢａｍＨＩ制限部位がユ ニークであるトランジョンベクターに入れる。

ｐＬ］ｃ１９　（ｄ　）　の組立て−チャート１このベクターはＰｓｔｌ　部位 を有しない。ｐｔＪｃ１９ベクター（インターナショナル・バイオテクノロジー 、インコーホレイティド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ。

ｉｎｃ、））　はポＩＪ　ＩＪフンカー中位置する単一のＰｓｔＩ　部位を含有 する（ヤニシューペロンら（Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ　ａｌ、）、 １９８５、前掲）。該部位はＨｉｎＩＴおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位間に存在 する。ＰｓｔＩ　部位をＨｉｎＩＩおよびＨｉｎｄｌＩＩ　部位において切断用 精製ＤＮＡによって欠失し、Ｈｉｎｄｌｌｌ　部位の５′突出部分をＰｏ１Ｉ　 クレノー（ＰｏｌＩＫ）で満たし、アガロースゲル電気泳動および電気溶出によ って大きな切断ベクターフラグメントを精製し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼおよびＡ ＴＰで結紮し、アンピシリンに対する耐性を選択する成分細胞を形質転換する。

ビルンボイムおよびド！Ｊ　−（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄＤｏｌｙ）　（ヌク レイツク・アシッズ・リサー＋（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、７　：　１５１３−１５２３．１９７９）の方法を用い ていくつかのクローンからＤＮＡを単離することによりクローン中のｐＴＪＣ１ ９（ｄ　）　の存在の確証を得る。次いで、ＨｉｎｄＩＩ　、　ＨｉｎＩｒ　、 またはＰｓｔＩによって切断されてぃず、ＸｂａＩ　＃よびＢａｍＨＩによって １回切断されたベクターについての制限的消化により単離したＤＮＡを分析する 。これらの手順はマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、モレ キュラー・クロウニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラ トリ−・マニュアル（Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　？ｖｉａｎｕａｌ）、コール ド−スプリング、　ハーバ−酔ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２に詳細に記載されている。得られた ベクターはｐｔＪｃ１９（ｄ）と示す。

ｐＬｌｃ１９（ｄ）−ｂＳｔの組立て一チャート２完全なｒｂＳｔ遺伝子をＸｂ ａ　Ｉ、ＢａｍＨＩ制限フラグメント１（０，９ｋｂ）上のベクターｐＢＧＨ３ ３−４から単離し、クローンしてｐｔｌｃ１９（ｄ）の相補性Ｘｂａ　Ｉ　、　 ＢａｍＨＩ制限部位に入れる。十分なりローニングを保証するために、フラグメ ント１（０，９ｋｂ）をｐＢＧＨ３３−４から単離し、個々のベクターをＸａｂ ＩおよびＢａｍＨＩで消化した後フラグメント２　（２，７ｋｂ港単離する。フ ラグメントをゲルから切り出し、電気溶出によって単離する。包含される工程は ｐｔＪｃ１９（ｄ）　の組立てについて記載したものと同一である。得られたベ クターｆ　Ｉ）ＩＪＣ１９（ｄ）−ｂｓｔと示す。

ｐＭ１３−ｂＳｔ’の組立て一チャート３ｐＭ１３−ｂＳｔ’を得るには、位置 ９８のアスパラギン残基をコード付けするｒｂＳｔ　遺伝子のサブフラグメント をクローンしてＭ１３ｍｐ１９ファージベクターに入れる。

Ｍ１３ベクターは感染細Ｓから単離したファージワイルス粒子から一本鎖閉鎖環 状ＤＮＡを単離することを可能とする。次いでこの一本鎖ＤＮＡを制限されたヘ テロデュプレックスを形成するコードン９８について変化を受けた合成オリゴマ ーで交雑するっｐＢＧＨ３３−４からＰ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｂａｒｎ）（Ｉ　フラグ メント３（０，７ｋｂ）を単離し、次いでクローンしてＭｌ　３ｍｐｌ　、’ｌ ベクターの対応するＰ　ｓ　ｔ　Ｉ／ＢａｍＨＩ　制限部位に入れることによっ てｐＭ］３−ｂＳｔ’を含有するＭ１３クローンを組立てる。

Ｍｌ　３ｍｐ　１９クローニングの実験法はメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）により メソツズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ）　１０１　：２Ｏ−７８（１９８３）中に記載されている。略言すれば、Ｒ Ｆ（複製形）ＤＮＡをＭｌ　３Ｍｐ　１９感染細胞から単離する。単離したＤＮ ＡをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼによる制限的消化に付す。

大きなフラグメント（約７．２ｋｂ）を精製し、フラグメント３へ結紮してｐＭ １３　ｂＳｔ’を得る。イー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　ｍ胞’Ｅ：　）ランスフエクトし、個々のプラークを単離する。再 びＲＦ　ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼでの分析的消化によって７ラ グメントの挿入ヲ確認するｒｂＳｔ　ｃＤＮＡ　についてのＰｓｔＩ　制限部位 はｒｂＳｔ　のアミノ酸８９および９０に対応する。標的コードン９８はＰｓｔ Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　フラグメント内に位置する。

Ｂ９位置９８の（電飾 ＤＮＡオリゴマーの設計 ２種の合成オリゴヌクレオチド、３９個のヌクレオチド長、を第２図に示す。こ れらのオリゴヌクレオチドは位置９８における天然アスパラギン残基をコード付 けするコードンについてその配列が異なる。２種のオリゴマーは位置９８におけ るアスパラギン酸（ａｓｐ）またはグルタミン酸（ｇｌｕ）のいずれかに対する アミノ酸変化をひき起こす。位置９８における修飾の後９個のヌクレオチドが存 在していくつかのポリメラーゼ（すなわち、ＡＭＶリバーストランスクリブター ゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｏ１Ｉ　クレノーフラグメント）のいずれ によっても伸長することができる３′末端の利用可能性を保証する。オリゴマー はアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の ヌクレオチド合成器を用いて調製する。

一本鎖ＤＮＡの調製 Ｍ１３感染イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　クローンからの一本鎖ＤＮＡの調製は メリック（Ｍｅｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ）によって記載されている（前掲）。好ましい イー・コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ潰主は、これもメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）によ って記載されていンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイツクス（Ｅｘｐ−ｅｒ ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｍｅｔｉｃｓ）、コールド・ス プリング・ハーバ−・ラボラタリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９７２）　およびクロラムフェニコール耐性について の選択によって修飾されたものである。

種雌−１３対立遺伝子を含有する適当な株はイー・コリ・ジエネテイツク・スト ック・センター（Ｅ、ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、 エール大学、ニュー・バーベン（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ）、コネティカット州、米 シから公に入手可能である。種雌対立遺伝子を用いて変化したコードンの好まし い訂正を順に防止する一本鎖ＤＮＡの交雑 交雑条件はシラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）（メソツ ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、 １００：４６８−５００．１９８３）によって記載されている。６５℃で加熱し 次いで混合物を室温まで放冷することにより、位置９８に所望のコードン変化を 有するオリゴマーを、その成分に対して２０ないし３０モル過剰で、１ピコモル の一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ分子と交交雑の後、オリゴマーの３′末端をＤＮＡ　Ｐｏ１ Ｉｋによる伸長用プライマーとして用いる。伸長は２０μＣ（アルファ　Ｐ　） 　ｄＡＴＦ’ならびにｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各５ｍＭの存在に おいて行う。混合物を室温で１０分間インキュベートし、その後過剰の非放射性 ｄＡＴＰ　％加える。これによりヘテロデュプレツクスのサイズが増加し、分子 の二本鎖領域が伸長してＢａｍＨ１制限配列を包含し、かくして切断可能なりａ ｍＨＩ制限部位が生成する。

ヘテロデュプレックスの単離およびｐＩＪｃ１９（ｄ）−ｂＳｔ’へのクローニ ング−チャート４ プライマー伸長分子をＰｓｔｌ　ＳよびＢａｍＨＩでの制限的消化に付す。これ により約７００ｂｐ　のへテロデュプレックスが生成し、これは適当なサイジン グマーカと共に反応混合物を非変性アクリルアミドゲル上を移動させた後オート ラジオグラフィーによって目で見えるようにできる（マニアテイスら（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、前掲）。バンドをゲルスライスとして切り出し、フ ラグメントをゲルから溶出する。

次いで、一本領ＤＮＡ中に所望のコードン変化を含有するこのＤＮＡを結紮して トランジションベクターｐＵｃ１９（ｄ）−ｂＳｔのＰｓｔＩ　、ＢａｍＨＩ制 限部位に入れる。

ｐＩ］ｃ１９（ｄ）−ｂＳｔベクターをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消 化してフラグメント６　（３，０、ｋｂ）を得、これをゲル電気泳動および電気 溶出によって精製する。これにより位置９８における通常のコーディング配列が 除去される。次いで、フラグメント６をヘテロデュプレックスフラグメントに預 紮し、形質転換してアンピシリンに対する耐性について選択する成分細胞に入れ る。ヘテロデュプレックスフラグメントの単離によりシラー２よびスミス（Ｚｏ ｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）（前掲、１９８３）の実験法におけるアルカリ 性スクロースグラジェントの必要がなくなり、二本鎖の共有結合的ｊこ閉鎖した 分子の形成が保証される。

位置９８における変化の同定 個々の形質転換細胞をクローンしたＤＮＡの精製用ノ個々のコロニーから２回画 線培養する。最初に形質転換された各細胞について１のコロニーを選択し、ベク ターＤＮＡをビルンボイム８よびドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ　Ｄｏｌｙ） 　（前掲）の実験法によって調製するｒｂＳｔ配列５′に対する合成したプライ マーを用いるジデオキシ法によって、ＰｓｔＩ　部位および位置９８に対してご 本領ベクターＤＮＡを配列する（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、）、プ ロシーデイングズ・オブ・ナショナル・ｃｉ、）ＵＳＡ、７４：５４６３−５４ ６７．１９７７　：ザグルスキイら（Ｚａｇｕｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、）、ジー ン・アナリシス・テクニックス（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、）、２：８ ９−９４．１９８５）。

所望の変化を有するベクターの理論収率は５０％である。

Ｃ０表現ベクターｐＢＧＨ３３−４（Ｇ１ｕ９８Ｊ　の組立て−チャート５ 今や、修飾ｒｂＳｔ遺伝子はトランジションベクター、ｐＬ］ｃ１９（ｄ）−ｂ ｓｔ’からのＸｂａＩ　、　ＢａｍＨｌ　フラグメントとして再度クローンして ジエネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）表現ベクター　ｐＢＧＨ３３−４導入れる ことができる。トランジションベクターを制限酵素ＸｂａＩ　ＥよびＢａｍＨＩ で消化し、フラグメント７（１，０ｋｂ）を得る。ｒｂＳｔについて完全なコー ディング配列を含有するフラグメント７を単離する。ｒｂＳｔ表現ベクターｐＢ ＧＨ３３−４を同一の酵素で消化し、ベクターフラグメント８（４，０ｋｂ）を 単離する。２個のフラグメントを結紮し、形質転換して成分細胞に入れる。ｐＢ ＧＨ３３−４ベクターフラグメントはリポソーム結合部位および修飾ｒｂＳｔ遺 伝子の表現についてのトリプトファンプロモータを提供する。このベクターにお ける修飾ｒｂＳｔ遺伝子表現は当該分野において公知の方法により誘導可能であ る。形質転換微生物からのｒｂＳ　ｔの精製も当該分野において公知である。

実施例３　Ｂ、グルタミン酸またはアスパラギン酸のａｌａ　ｐｈｅ−ｒｂＳｔ の位置９９への導入実施例３Ａにおいて概要を述べた方法により、ｒｂＳｔのａ ｈａ−ｐｈｅ−形の位置９９におけるアスパラギンを遺伝子的に変化させること は可能である。ａｌａ−ｐｈｅ−形を得るには、アラニンをコード付けするコー ドンをｐ　ＢＧＨ３３−４のｒｂＳｔ　ｃＤＮＡのＮ末端におけるメチオニンお よびフェニルアラニンコードン間に挿入することかによって記載されたｒｂＳｔ 遺伝子のコーディング配列を変化させることを記載する。この修飾はｒｂＳｔ分 子中の位置ｒ９８Ｊにおけるコードンについて前記した変化の前または後のいず れかで行うことができる。

一般法 プラスミドｐ　ＢＧＨ３３−４はリポソーム結合部位とｒ　ｂＳｔ遺伝子のＡＴ Ｇａ訳開始コードンとの間に位置するＸｂａＩ　制限部位を含有する。この部位 からヌクレオチド約７２個だけ下流には、Ｐｖｕ　ＴＩ制限部位が存在する。

合成二本鎖オリゴマーを、第２のアミノ酸位置においてざらにａｌａコードンを 含有するこれらの２つの制限部位間に挿入することができる。しかし、ＰｖｕＩ Ｉ制限部位は遺伝子についてはユニークではない。この問題は、修飾されるべき かつこのＰｖｕ１１部位がそこでユニークであるｒｂＳｔ　遺伝子の部分のみを 含有するベクターを組立てることによって解決される。遺伝子の前方ｆ［を修飾 し、無傷のｒｂＳｔ　遺伝子を再び組立てる。

ｐＬｌｃ８−ｂＳ　ｔ’の組立て−チャート６ｐ　ＢＧＨ３３−４のＤＮＡをＥ ｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ　制限エンドヌクレアーゼで消化することによってプラ スミドｐＵＣ８−ｂＳ　ｔ’を組立てる。フラグメン）：　９　（ｓｓｏｂｐ） をアガロースゲルから切り取り、電気溶出する。このフラグメントはｔｒｐプロ モータ、リポソーム結合部位２よびｒｂＳｔ遺伝子の前方半分を含有する。（ベ セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏ　−ｒｉｅｓ）、ガイセルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ）　、メリーランド州、米国から商業的に入手可能な）　’ｐｌＪｃ８ベクター をＥｃｏＲＩ　＃よびＰｓｔＩ　で消化し、２．７ｋｂベクターフラグメント　 １０を単離する。２種の精製したＤＮＡ分子を結紮し、形質転換して成分イー・ コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞に入れる。ベクターを含有する細胞をアンピシリ ンに対する耐性によって選択する。ビルンボイムおよびドーリイ（Ｂｉｒｎｂｏ ｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ）の実験法によってＤＮＡを個々のコロニーから阜離し 、分析的制限分析によってベクターの組立てを確認する。得られたベクターをｐ ｔＪｃ８−ｂＳ　ｔ’で示す。該ベクターはｐＢＧＨ３３−４からクローンした フラグメント中のＸｂａ　ＩおよびＰｖｕＩＩ制限部位にとってはユニークであ る。

ｐＴＪｃ８−ｂＳ　ｔ’　ａ　ｌ　ａ　の組立て一チャート７プラスミドｐＵＣ ８−ｂＳｔ’を単離し、Ｘｂａ　Ｉ　およびＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼ で消化する。フラグメント１１（２，７ｋｂ）を単離する。これによりｒｂＳｔ の最初の２３個のアミノ酸についての配列が除去される。

以下の合成オリゴマーを生成する： これらの２種の合成オリゴマーを一緒に交雑し、二本鎖ＤＮＡフラグメントを生 成するが、これは推薦される配列変化に一体化してイー・コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）におけるｒｂＳｔ　の効果的な表現を可能とし、かつ下線を付した配列によ って示される如く２番目の位置において挿入されたアラニンについてのコードン を有する。このＤＮＡ分子は、また、ＸｂａＩについての相補性突出部分および ＰｖｕＩＩについての平滑末端部位を有する。オリゴヌクレオチドを結紮して単 離したｐＬ］ｃ８−ｂＳｔ’ベクターに入れ、形質転換して成分イー・コ！Ｊ　 （Ｅ、ｃｏｌｉＪ］胞に入れる。該領域を配列することによ２て組立ての確証を 得る。新しいベクターをｐＴＪｃ８−ｂＳｔ’−ａｌａで示す。

ａｌａ　ｒｂＳｔ　遺伝子−ｐＬＪｃ１９（ｄ）ｂＳｔ−ａｌａの組立て一チ） のＤＮＡをＸｂａＩおよびＰｓｔｌで消化する。大きなベクターフラグメン）１ ３（２，７ｋｂ）を単離する。次に、ｐＬｌｃ８−ｂＳｔ’　ａｌａ（チャート ７）をＸｂａＴおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ａｌａコード ンを含有するｒｂＳ’を遺伝子の前方半分を含む３００　ｂｐフラグメント１４ を単離する。ｐＩＪｃ１９　（ｄ　）−ｂＳ　ｔ　のベクターフラグメントおよ びフラグメント１４を一緒に結紮し、形質転換して成分イー・コＩＪ　（Ｅ、ｃ ｏｌｉＪＢｌ胞に入れる。この得られたベクターをｐｔＪｃ１９（ｄ）−ｂｓｔ −ａｌａで示すが、これは前記実施例３Ａに記載した工程による位置９８の塩基 変化についてのトランジションベクターとして用いることができる。

実施イ列４．生物学的アッセイ 相対的能力を得るために下垂体切除（下垂体を外科的；こ除去した）ラットバイ オアッセイを用いて脱アミノ化ｒｂＳｔ　試料を処理する。体重が７５ｇと１５ ０ｇ間である２００匹の下垂体切除雌スプレイグ・ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ　 Ｄａｗｌｅｙ）ラットを各実験で用いる。それらに市販品であるペレット化した プリナ・ラット・チャウ（Ｐｕｒｉｎａ　Ｒａｔ　Ｃｈｏｗ）を適宜与え、脱イ オン水および再度塩素処理した水を用いて水を与える。室内条件は温度８０°Ｆ および相対湿度５０％に設定する。換気は１時間当たり約２０回とし、照明時間 は１２時間の照射および１２時間の消光とし、照射サイクルは午前６：００頃に 開始する。

Ａ、環境条件および摂食条件への適応を可能とする１２日間の予備期間の間、ラ ットをモニターする。第１日および第１２日の間に４回体重を測定する。該予備 期間の間に１日当たり１ｇもしくはそれ以下の体重減少または２ｇもしくはそれ 以下の体重増加を示すラットをｂＳｔでの注射用に選択する。剖検評価によって 証明される如き完全に下垂体を切除されたラットからのデータのみを最終分析に 包含させる。平均日体重増加（ＡＤＧ）の増大量によりラットを分類し、２５匹 のラットよりなる７つのブロックを得る。各ブロック内での処理はランダムに割 り当てる。

Ｂ、’ｂＳｔ処理を開始し、１０日間継続する。この間、テスト化合物を毎日２ 回、９日間注射し、変動を考慮に入れつつ動物の体重を測定するラブ−パック（ ｌａｂ−Ｐａｃ）プログラムを備えた〆トラ−（Ｍｅｔｔｔｅｒ）社モデル３６ ００１−ツブ・ローディング・バランス（ｔｏｐ　ｌｏａ　−ｄｉｎｇ　ｂａｌ ａｎｃｅ）を用いて体重をモニターする。

・２　”ｙ／　ｖｔｌのｒｂＳｔ貯蔵溶液をｐＨ９，５にて０．０３ＭＮａＩ（ ＣＯ３および０．１５　Ｍ　ＮａＣ１！の緩衝液中で調製する。

ｒｂＳｔの懸濁を容易にするために、凍結乾燥調製物をまずｐＨ１０，８にてこ の緩衝液に溶解し、次いで２　Ｎ　ＨＣｌ！を用いて９．５に調整し、ｐＨ９， ５の貯蔵緩衝液を用いて最終体積に調節し、要すれば濾過する。

貯蔵緩衝液（ｐＨ９，５）を用いて貯蔵溶液を３７．５．７５．１５０および３ ００ｒｎ２蛋白質／＃！ｅの溶液に希釈する。実験用ラットに各溶液１００μｌ を１日２回皮下注射し、対照には緩衝液１００μｌを与える。実験は１０日間続 け、平均口体重増加をモニターする。

的分析は次のとおりである：ＨＰＬＣによって精製すれた非処理ｒｂＳｔ　に１ ．００の相対能力値を与えると：ｒｂＳｔの脱アミノ化種は２．４０　（１，８ ５−３，２５）（７）相対値を有していた。この値は９５チの信頼係数で有意で ある。６．０〜５，０間のｐＩを有するｒｂＳｔの脱アミノ化組成物を下垂体か らのｒｂＳ　ｔに対してテストすると、酸性棟の相対能力は下垂体標準品の０〜 ２０％であった。

実施例５ ウシにおける成長速度を増大させるために若い食用牛を処理用に選択する。組換 体脱アミノ化ウシ・ソマトトロピンを１日当たり５０ミリグラムの投与量で１０ ０日間各動物に皮下投与する。該動物を自由に摂食させ水を飲ます。

実施例６ 乳牛におけるミルク生産を増大させるために、分娩後６０日のウシを処理用に選 択する。１日当たり５０ミリグラムの投与量で３００日間、組換体脱アミノ化ウ シ・ソマトトロピンを各動物に皮下投与する。該動物を自由に摂食させ水を飲ま す。

実施例７ 乳牛若生に２ける乳房柔軟組繊細胞数を増加させるために、予期される青春期開 始の約３０日前であるウシを処理用に選択する。１日当たり５０ミリグラムの投 与量で１００日間、組換体脱アミノ化ウシ・ソマトトロピンを各動物）と皮下投 与し、その時点で該動物は通常の飼胃慣行に従って育生されなければならない。

該動物を自由に摂食させ水を飲ます。

第１図 以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はヨーロッパ特許８８７５４４４号から のものである。それはハイブリッドｂＳｔ分子を表わし、本明細書において注目 する特異的β巻領域内の関連するアスパラギンを指摘するの：こ有用である（下 線を付した残基９８参照）。

第２図 ウシ・ソマトトロピンのもとの配列 ５’　ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＴＴＣ，ＣＴＣ，ＡＧＣ，ＡＧＡ、ＧＴＣ，ＴｒＣ，Ａ Ｃ（：、１．ＡＧＣ，ＴＴＧ、ＧＴＧ　３’合成オリゴヌクレオチド ｓｐ チャート１．　ｐＵｃ１９（ｄ）　の組立てＵｃ１９ ａ）プラスミドｐＵｃ１９をＨｉｎｄ　ｍで切断し、クレノー酵素で処理し、Ｈ ｉｎｎで再切断する。（直線状）ベクターを単離し、結装して大きさが約２．７ ｋｂのｐＵｃ１’（ｄ）を形成する。該ベクターをイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ ）中に維持する。

ｐＵｃ１９（ｄ） 検索表 Ａｍｐ　＝アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 チャート２．　ｐ’ＬＪｃ１９（ｄ）−ｂＳｔの組立てａ）プラスミドｐＢＧＨ ３３−４（５，２ｋｂ）をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ　で切断して無傷のＢＧＨ 遺伝子（０，９ｋ　ｂ　）を単ｂ）チャート１からのプラスミドｐＵｃ１９（ｄ ）をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ　で切断してフラグメント２（２，７ｋｂ）を得 る。

Ｃ）フラグメント１および２を単離し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結紮して プラスミドｐＵｃ１９（ｄ）−ｂＳｔを得る。

ＸｂａＩ　ＰｓｔＩ　ＢａｍＨＩ 検索表 Ａｍｐ−アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 Ｂ　＝　ｒｂＳｔ　ｃＤＮＡ チャート３　ｐＭ１３−ｂＳｔ’の組立てａ）プラスミドｐ　ＢＧＨ３３−４を ＰｓｔｉおよびＢａｍＨＩで切断し、ｂＳｔ遺伝子の３′末端を含有するフラグ メント３　（７００ｋｂ）を単離する。

ｂ）プラスミドｐＭ１３ｍｐ−１９ＲＦ（７，２５ｋｂ）をＰｓｔＩおよびＢａ ｍＨＩ　で切断し、フラグメント４　（７，２０ｋｂ）を単離する。

ＢａｍＨＩ　ＰｓｔＩ Ｃ）フラグメント３および４を結紮してｐＭ１３−ｂｓｔを得る。

ＢａｍＨＩ　ＰｓｔＩ 検索表 Ｂ＝ウシ・ソマトトロピン １ａｃＺ’　＝β−ガラクトシダーゼのαフラグメントＰＬａｏＺ’＝β−ガラ クトシダーゼのフラグメントについてのプロモータ ０ｒｉ＝複製開始点 チャート４．　ｐＵｃ１９（ｄ）−ｂＳｔ　の組立てａ）　ｄａｍ−細胞中で成 長させたＭ１３−ｂＳｔからの一本鎖ＤＮＡを、アスパラギン酸を挿入するアス パラギン９８１こついてコード付けするコードンにおいて適当な塩基変化を有す る合成オリゴヌクレオチドで交雑する。

ｂ）ポルク（Ｐｏｌｋ）　（クレノーフラグメント）を用いてプライマーをｒｂ Ｓｔ　３’末端のＢａｍＨＩ部位を超えて伸長させる。ＰｓｔＩおよびＢａｍＨ Ｉを用いてベクターのへテロデュプレックス部分を切り取り、単離してフラグメ ント５を得る。

ｃ）　ｐＵｃ１９（ｄ）ｂＳｔ　（チャート２）をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで 切断してｂＳｔ　ｃＤＮＡの３′部分を除去する。

ｐｔＪｃ１９　のベクタ一部分およびｂＳｔの５′　部分を含有するフラグメン ト６　（３，０ｋｂ）を単離する。

ｄ）フラグメント５および６を結紮し、得られたヘテロデュプレックスを形質転 換してホモデュプレックスの２の個体群を形成するイー・コ’Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）ζこ入れる。ゲル配列を行うことによって位置９８＋こ適当な修飾（アスパ ラギン酸）を含有するホモデュプレックスを選択し、表現用に単離する。該ベク ターをｐＵｃ１９（ｄ）　ｂＳｔ　で示す。

検索表 Ｂ　＝　ｒｂＳｔ　ｃＤＮＡ Δ−ヌクレオチド変化の部位 Ａｍｐ＝アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 チャー）　５．　ｐＢＧＨ３３−４−ｒＧＩｕ９８Ｊの組立てａ）プラスミドｐ Ｕｃ１９　（ｄ）　−ｂＳｔ　をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ　で切断して位置９ ８において修飾されたｒｂＳｔについての完全なコーディング配列を含有するフ ラグメント７　（１，０ｋｂ）を得る。

ｂ）表現ベクターｐＢＧＨ３３−４をＢａｍＨＩで切断し、フラグメント８　（ ４，８ｋｂ）を単離する。

Ｃ）フラグメント７および８を結紮して表現ベクターｐＢＧＨ３３−４−ｒＧ１ ｕ９８Ｊ（５，８ｋｂ）を形成する。

検索表 ０ｒｉ＝複製開始点 Ａｍｐ＝アンピシリン耐性 Ｐ、ｒｐ＝）リプトフアンプロモータ Ｂ　＝　ｒｂＳｔ　ｃＤＮＡ △＝ヌクレオチド変化の部位 チャー）　６．　ｐＵＣ８−ｂＳｔ’ ａ）プラスミドｐＢＧＨ３３−４（チャート２）をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで 切断してフラグメン）　９　（５５０ｂｐ）を得、これをゲル電気泳動および電 気溶出によって単離する。

ｂ）プラスミドｐｔｒｃ−ｓをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断してフラグメン ト１０　（２，７ｋｂ）を得、これをゲル電気泳動および電気溶出によって単嘲 する。

フラグメント１０ Ｃ）フラグメント９および１０を結紮してｐＵＣ８−ｂＳｔ’（３，３ｋ　ｂ　 ）を得る。

検索表 Ａｍｐ　＝アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 ＰＴｒｐ＝冬リプトフすンプロモータ Ｂ　＝　ｒｂＳｔ　ｃＤＮＡ チャー）　？、ｐＵｃ−ｂＳ　ｔ’　ａ　１　ａの組立てａ）プラスミドｐＵＣ ８−ｂＳｔ’　（チャート６）をＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩで切断してフラグメ ント１１を得、これをゲル電気泳動寥こよって精製し、電気溶出【こよって単ｂ ）フラグメント１２　（７２ｂｐ）、ｂＳｔの５′部分を含有しかつ位置１にお けるアラニンコードンを一体化する二本鎖オリゴヌクレオチドを人工的に合成す る。

フラグメント１２ Ｃ）フラグメント１１および１２をＴ４リガーゼで結紮してｐＵｃ８−ｂＳ　ｔ ’　ａ　１　ａを得る。

検索表 Ａｍｐ　＝アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 Ｂ；ウシ・ンマトトロピンｃ　ＤＮＡ Ａ＝アラニンコードン ｐＴ、ｐ＝　ｌ−リプトフアンプロモータチャー）　８．　ｐＵｃ１９（ｄ）ｂ Ｓｔ−ａｌａａ）プラスミドｐＵｃ１９（ｄ）ｂＳｔ　（チャート２）をＸｂａ ＩおよびＰｓｔＩで切断し、フラグメント１３（２，７ｋｂ）をゲルで単離する 。

ｂ）プラスミドｐＵｃ８−ｂｓｔ’ａｌａ　（チャート７）をＸｂａＩおよびＰ ｓｔＩで切断してフラグメント１４（３００ｂｐ）を得、これをゲルで単離する 。

フラグメント１４ ’　ｃ）　フラグメント１３および１４を結紮してｐＵｃ１γｄ）ｂＳｔ’　ａ ｌａ（３，３ｋｂ）を得る。

検索表 Ａｍｐ　＝アンピシリン耐性 ０ｒｉ＝複製開始点 Ｂ＝ウシ・ソマトトロピンｃ　ＤＮＡ Ａ＝アラニンコードン 国際調査報告 １Ａｌｅ＋＋ｖｌ−＋＋ＭＩＡｅ＠１１ｅｌｉａＭｔｉ１１．ＰＣＴ／ｌゴＳ８ ｇ／Ｉ’）ＩＦＩＡ０六ＮＮＥＸ　Ｔｏ　ｔｉ＝　ＩＮτ＝テ：入τ：ｃｓ；、 ｔ、ＳＥへＲＣ３！　只二：’ＯＲτｏＨ＋ＥＰ−Ａ−０１３１８４３２３１０ １／８５　Ａ、ｔＪ７Ａ−３０３４５８４１７１０１／８５Ｊ？−Ａ−６００９ １９８６２３１０Ｓ／８５

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．主たる種が７．５ないし６．５間の等電点を有する電気泳動種の混合物を有 するウシ・ソマトトロピン様蛋白質よりなることを特徴とする組成物。
2. ２．組換体もしくは下垂体ウシ・ソマトトロピンを温和なアルカリ性処理または 加熱あるいはその双方で処理することを特徴とする７．５ないし６．５間に等電 点を有するウシ・ソマトトロピンの電気泳動種の割合を増大させる方法。
3. ３．７．５ないし６．５の範囲外の等電点を有する電気泳動種をクロマトグラフ ィー技術または電気泳動技術あるいはその組合せによって除去する前記第２項の 方法。
4. ４．動物を前記第１項の組成物の有効量で処理することを特徴とする動物の成長 を促進する方法。
5. ５．該動物がウシの種である前記第４項の方法。
6. ６．青春期開始の項から最初の分娩に至る成長段階にある反芻動物を前記第１項 の組成物の有効量で処理することを特徴とする雌の反芻動物において乳房柔軟組 織細胞量を増大させる方法。
7. ７．ウシソマトトロピン様蛋白質を青春開始の頃から最初の妊娠に至るまでの間 投与する前記第６項の方法。
8. ８．前記第１項の組成物の有効量を投与することを特徴とする雌の反芻動物にお いてミルク生産を増大させる方法。
9. ９．該反芻動物が乳牛である前記第８項の方法。
10. １０．天然ソマトトロピンの残基９６−１０１に対応するいずれか１つのアミノ 酸残基をグルタミン酸、アスパラギン酸、およびイソアスパラギン酸よりなる群 から選択されるアミノ酸で置き換えた哺乳動物ソマトトロピン。
11. １１．ウシ・ソマトトロピン由来である前記第１０項の哺乳動物ソマトトロピン 。
12. １２．アミノ末端の位置１においてアラニンを有する前記第１１項のウシ・ソマ トトロピン。
13. １３．該置き換えられるアミノ酸残基がアスパラギンである前記第１１項のウシ ・ソマトトロピン。
14. １４．該アスパラギンがアスパラギン酸で置き換えられた前記第１３項のソマト トロピン。
15. １５．該アスパラギンがイソアスパラギン酸で置き換えられた前記第１３項のソ マトトロピン。
16. １６．脱アミノ化アスパラギンが最も関連したソマトトロピンの残基９６と１０ １との間に位置するアスパラギンに対応する、蛋白質をアルカリ性もしくは酸性 処理に暴露することによつて哺乳動物ソマトドロピン様蛋白質のアスパラギン残 基を化学的に脱アミノ化する方法。
17. １７．該哺乳動物ソマトトロピンがウシ由来のものである前記第１６項の方法。
18. １８．蛋白質をアルカリ性ｐＨにおいて炭酸塩緩衝液に暴露する前記第１７項の 方法。
19. １９．ソマトトロピンがアミノ末端における位置１においてアラニンを有する前 記第１７項の方法。
20. ２０．最も関連する天然ソマトトロピンの位置９６ないし１０１における残基に 対応するアミノ酸をグルタミン酸もしくはアスパラギン酸のアミノ酸残基で置き 換えるように哺乳動物ソマトトロピン様蛋白質をコード付けするｃＤＮＡの遺伝 子工学的製造方法。
21. ２１．該置き換えられる特異的アミノ酸が残基９６と１０１との間に位置するア スパラギンに対応するアミノ酸である前記第２０項の方法。
22. ２２．該ソマトトロピン様蛋白質がウシ由来のものである前記第２１項の方法。
23. ２３．中性に荷電した残基からグルタミン酸およびアスパラギン酸よりなる群か ら選択される残基に変化した最も関連する天然ソマトトロピンの残基９６ないし １０１に対応するアミノ酸残基の１つを有する哺乳動物ソマトトロピン様蛋白質 をコード付けするＤＮＡよりなることを特徴とするベクター。
24. ２４．ソマトトロピン様蛋白質の表現を方向づけすることができる前記第２３項 のベクター。
25. ２５．中性に荷電した残基からグルタミン酸およびアスパラギン酸よりなる群か ら選択される残基に変化した最も関連する天然ソマトトロピンの残基９６ないし １０１に対応するアミノ酸残基の１つを有する哺乳動物ソマトトロピン様蛋白質 をコード付けするＤＮＡよりなるベクターの宿主である微生物。
26. ２６．細菌属、エシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）から選択される前記第 ２５項の微生物。