JPH04501064A - 成長ホルモン融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 成長ホルモン融合蛋白質 本発明は、成長因子、その融合蛋白質としての製造およびその使用、ならびに融 合蛋白質としての他の蛋白質の製造に関する。

インスリン様成長因子−Ｉ　（ＩＣＦ−１）は広範囲の培養細胞の成長を刺激す ることが明らかにされている小さい蛋白質である。動物の成長は、下垂体欠損、 正常および異化状態でも刺激を受ける。

ヒト、ウシおよびブタＩＣＦ−１はすべて同一の配列を存し、それは、単一文字 アミノ酸コードおよびアミノ木端からの番号を用いて示すと次の通りである。

動物および細胞の成長の結果は、ＩＧＦ−１が（１）ヒトの成長ホルモン欠乏の 処置 （２）ヒトの重篤な異化状態たとえば火傷、感染または他の外傷後における体蛋 白質の喪失の抑制（３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配および飼料変 換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に育用に適用できるとの解釈をもたらすものであった。

したがって、動物の成長試験、臨床的検討および細胞培養に使用するための哺乳 動物ＩＣＦ−１には市場の需要がある。しかしながら、天然原料および／または 組換えＤＮＡ合成法からの収率は依然として低いままである。

本発明の目的はしたがって、従来技術における１または２以上の困難を克服し、 また少なくともそれを緩和することにある。

本発明は、その第一の態様として、 適当な発現ベクター； 成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、またはそのフラグメントをコー ドする第一のＤＮＡ配列：および 第一のＤＮＡ配列の３′末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第二の ＤＮＡ配列を包含するプラスミドを提供する。

このような構造体は、封入体内に高収率で融合蛋白質を発現し、これは成長ホル モン単独について開発された従来技術の場合に匹敵する生物学的活性を示すこと が明らかにされた。生物体の破壊、封入体からの融合蛋白質の単離、正しいジス ルフィド結合を作るための酸化および精製により、延長されたポリペプチド、た とえば生物活性インスリン様成長因子が生成する。切断可能な配列をコードする 配列が第一のＤＮＡ配列の３′末端に導入されていれば、切断工程の付加により 、延長されていないポリペプチドを得ることもできる。

適当なりローニングベクターはプラスミドクローニングベクターから選択するこ とかできる。プラスミドクローニングベクターは、以下に延べるように、インス リン様成長因子融合蛋白質の高収率での製造過程に利用することができる。プラ スミドクローニングベクターは、強力なｔｒｃプロモーターの下流に、改良ＲＢ Ｓ／スペーサーおよび戦略的な５゛−コドン変化を有するプラスミドｐＧＨＸＣ ，４（Ｊ、Ｂｒｏｓ　ｉｕｓら：Ｊ、Ｂｉ。

Ｉ　Ｃｈｅｍ、２６０．３５３９，１９８５；　Ｐ、Ｄ。

Ｖｉ　ｚｅ＆Ｊ、Ｒ，Ｅ、Ｗｅ　ｉ　！　ｓ　：　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２１３， １５５．！９８７）であってもよい。

成長ホルモン活性を有するペプチドまたはそのフラグメントをコードする第一の ＤＮＡ配列は、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）活性を存するペプチドをコードする ものであってもよい。メチオニンブタ成長ホルモン＜ｍｅｔｐＧＨまたはＭ　ｐ 　Ｇ　Ｈ）配列が好ましい。第一のＤＮＡ配列は、ｍｅ　ｔ　ｐＧＨのすべての １９１個のＮ−末端アミノ酸、またはその任意のフラグメントをコードするもの であってもよい。第一のＤＮＡ配列は、ｍｅｔｐＧＨのほぼ最初の１００個のＮ −末端アミノ酸をコードするものであり、さらに好ましくはｍｅｔｐＧＨの最初 のほぼ４６個のＮ〜末端アミノ酸、とくに好ましくはｍｅｔｐＧＨの最初の１１ 個のＮ−末端アミノ酸をコードするものである。

本発明の好ましい態様においては、第一のＤＮＡ配列はその３′末端に切断可能 な配列を包含する。

とくに、本発明の好ましい態様においては、第一のＤＮＡ配列は から選ばれるアミノ酸配列をコードする。

これらの配列には、順次、開始メチオニン、ｐＧＨの最初の４５個のアミノ酸、 バリン、アスパラギン、フェニルアラニン、アラニン、ヒスデシンおよびチロシ ンが存在する。

本発明の別の好ましい態様においては、第一のＤＮＡ配列は ＭＦＰＡ＆１ＰＬＳＳＬＦ−。

ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＩ、ＦＶＮ−。

ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦｖＮＰＡＨＹ−またはＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮＧＰ ＡＨＹ−から選ばれるアミノ酸配列をコードする。

これらの配列には、順次、開始メチオニン、ｐＧＨの最初の１０個のアミノ酸、 バリン、アスパラギン、グリシン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシ ンが存在する。

これらの例において、Ｃ−末端アスパラギンは、Ｎ−末端グリシンを有するペプ チドと連結すると、ヒドロキシルアミン切断可能部位を与えることは、本技術分 野の熟練者には自明であろう。このようなペプチドはＩＧＦ−Ｉである。また、 フェニルアラニン−アラニン−ヒスチジン−チロシン（ＦＡＨＹ）ペプチドは大 部分のＮ−末端アミノ酸をもつペプチドに連結した場合、切断可能部位を与える ことが知られている（Ｐ、Ｃａｒｔｅｒら：Ｐｒｏｔｅｉｎ−３ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ　Ｆｕｎｃｔｉｌｏ　ｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：２４０．１９８ ９）。この部位は、変異体ズブチリシン酵素、ズブチリシン−ＢＰＮ−によって Ｃ−末端側で切断される。

ポリペプチドをコードする第二のＤ　Ｎ　Ａ配列は、生物活性を有するポリペプ チドをコードしていてもよい。第二のＤＮＡ配列はインスリン様成長因子活性を もつペプチドをコードしていてもよい。インスリン様成長因子はインスリン様成 長因子−１ＣＩＣＦ−１）であってもよい。ＩＧＦ−１以外のペプチドも使用で き、以下のＩＧＦ−１についての言及は単なる例示と理解すべきである。

たとえば、ポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列は、 ヒトＩＧＦ−１およびヒト以外の種からのＩＧＦ−Ｉを含むＩＧＦ−１、 アミノ酸置換または欠失によって形成される類縁体たとえば共存の国際特許出願 、ＰＣＴ／ＡＵ８６１００２４６およびＰＣＴ／ＡＵ８８１０（’Ｉ　４８５＋ ：特定さ、ｈているような１ＧＦ１類縁体 インスリン様成長因Ｐ−Ｋ　（ＩＧＦ＝ＩＩ）またはそのＩＧＦ−ＩＥ類縁体 ニワトリヒス）・ン　Ｈ２Ａ、Ｉ、またはヒト転写因子５ＰＩ−１ａｃＺ融合蛋 白質から選ばれ、使用される。

すなわち、本発明の好ましい態様においては、プラスミド ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／１ＧＦ−［ ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／Ｇ’　ｔＧＦ−１ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／Ｒ’　Ｉ ＧＦ−１ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／　ニワトリヒストンＨ２Ａ、１ｐＭ ｐＧＨ（４６）／　ヒト転写因子５ｐｌ−１ａｃＺ融合蛋白質ｐＭｐＧＨ（４２ ）ＦＡＨＹ／ｄｅｓ（１−３）［ＧＦ−１ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／ＩＧＦ−［ １）ＭｐＧＨ（ｌｉ）ＶＮ／Ｇ’ｌＧＦ−１ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ”１Ｇ Ｆ−［ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＡ）ＩＹ／ｄｅｓ（ｉ−３）ＩＧＦ−ｒｐＭ ｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＡＨＹ／ｒＧＦ−ｒｐＭｐＧＨ（Ｉｆ）ＶＮＦＡＨＹ／ 　二’７トリヒストンＨ２Ａ、１ｐＭｐＧＩ（（１１）／　ヒト転写因子５ｐｌ −１ａｃＺ融合蛋白質を提供する。

また、本発明は他の態様として、 適当な発現ベクター； 成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、またはそのフラグメトをコード する第一のＤＮＡ配列：および 第一のＤＮＡ配列の３′末端に接合し、第二のポリペプチドをコードする第二の ＤＮＡ配列を包含するプラスミド、ならびに単細胞生物体を準備し、上記プラス ミドを上記単細胞生物体中に導入し、得られた生物体を培養し、 上記ＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドを発現させ、ついで 上記ポリペプチドを培養液から単離することを包含する融合蛋白質の製造方法を 提供する。

本発明のこの態様による方法では、単細胞生物体は原核生物であってよい。原核 生物は細菌株たとえば大腸菌株であってもよい。大腸菌株、大腸菌ＪＭＩＯＩは とくに適当であることがわかっている。

本発明のこの態様に用いられるプラスミドは上述の任意のプラスミドとすること ができる。

本明細書に特記したプラスミドを含有する大腸菌のサンプルはアゾレード大学の 細胞培養収集機関（Ｎｏｒｔｈ　ＴｅｒｒａＣｅ、Ａｄｅｉａｉｄｅ、５ｏｕｔ ｈＡｕｓｔｒａｌｉａ、豪州）に維持されている。

本発明の方法の製造工程はよく知られた方法、たとえば以下の実施例に例示する ような方法を用いて実施できる。

プラスミドはそれ自体公知の任意の方法で単細胞生物体中に導入できる。たとえ ば、トランスホーメーション、トランスダクションまたはトランスフェクション 技術が使用できる。

ポリペプチド生成物の単離が望ましい場合には、細胞をたとえば細胞溶解によっ て破壊後に、慣用操作を使用することができる。融合蛋白質の単離工程は、たと えば、イオン交換、アフィニティー、逆相もしくはサイジング技術によるクロマ トグラフィーを用いて、および／または沈降たとえば遠心分離によって、またポ リペプチドの精製のための他の公知技術によって実施できる。

融合蛋白質が不溶性の凝集体として発現されたり変性している場合には、慣用技 術を用いて可溶化および／または再生を行うことができる。

本発明の方法の好ましい態様においては、したがって、適当な発現ベクター、成 長ホルモン活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列また はその中に含まれるそのフラグメント；および第一のＤＮＡ配列の３′末端に連 結し第二のポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を包含するプラスミドを 準備し；プラスミドＤＮＡを消化して発現ベクターおよび第一のＤＮＡ配列を包 含するＤＮＡのフラグメントを単離し； 第一のＤＮＡ配列を突然変異に付してその３゛末端に切断可能な配列を導入し； ついで 発現ベクターと第一のＤＮＡ配列を含有するフラグメントを第二のＤＮＡ配列に リゲートする予備的工程がさらに包含される。

消化に続いて所望により精製工程を含めて精製ＤＮＡフラグメントを得ることが できる。

適当なプラスミド発現ベクターは任意の適当なタイプであってよい。プラスミド ｐＧＨＸＳＣ，４が使用できる。プラスミドｐＧＨＸＳＣ，４はｐＧＨコード領 域を包含する。

第二のＤＮＡ配列は天然または合成起源から得られる。

すなわち、本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の方法はさらに、第二 のＤＮＡ配列を化学的に合成する予備工程を包含する。

化学的合成は任意の慣用方法で行うことかできる。

消化およびリゲーション工程は任意の慣用方法で行うことができる。

突然変異工程はｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異とすることができる。ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ突然変異反応では適当なオリゴマーヌクレオチドを用いて第一および第二のＤ ＮＡ配列の間に切断可能な結合を導入できる。ヒドロキシルアミン切断可能な結 合か導入できる。別法として、またはさらに、ズブチリシン切断可能結合を導入 してもよい。

所望により、突然変異工程は、成長ホルモンのコード配列のサイズの低減および ／またはさらに突然変異工程を行うことを容易にする認識部位の導入を包含する こともできる。

すなわち、本発明のさらに好ましい態様においては、本発明の方法はさらに、 適当な発現ベクター；成長ホルモン活性を育する第一のポリペプチドをコードす る第一のＤＮＡ配列またはそれに含まれるそのフラグメント；および第一のＤＮ Ａ配列の３′末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列 を包含するプラスミドを準備し；このプラスミドＤＮＡを消化して、発現ベクタ ーと第一のＤＮＡ配列を包含するＤＮＡのフラグメントを単離し； 第一のＤＮＡ配列を突然変異に付して成長ホルモンコード配列のサイズの低減お よび／または認識部位の導入を行い；ついで 発現ベクターと第一のＤＮＡ配列を含有するフラグメントを第二のＤＮＡ配列に リゲートする予備的工程を包含する。

好ましくは、突然変異工程は、 ”ａｌＧｏ　４２　ｗｉｒ＋： ぎ（Ｎ凛「■ぼα名匡　−ざ °ａＩω→Ｃ： ５′　晶απ艶πＯ釘にａロロ印−ｊ ”０ＬＩＧＯ−１１”　： ５°−ＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＣ’ＥＡＣＡＡＧｍ丁−ｆ’ａＬｒＧｏ−７５６” ： ぎ−＾閃ズＭ届αｍ直心−カエ■んに一１＠ＯＬＩα）７１３”　： ５−緬０α京嶌λ逼π＾ＴＭ　Ｔ−１ ”０ＬＩＣｊＯ−８１ｒニ ラ−ＡＴＭｆ［−ｒおよび ＠ａＩば： ５’　−ＴｒＣＡｃＴｃｃｃＴｃｃｃＡＴｃＴＴｍ−πＡｆｆｌざから選択され るオリゴマーヌクレオチドを使用するｉｎ本発明のこの態様によって形成された 融合蛋白質は、操作された単細胞生物体内に封入体として単離される。

この融合蛋白質は所望によりさらにプロセッシング工程に付すことができる。

所望により、本発明のさらに他の態様では、本発明の方法はさらに、第一および 第二のＤＮＡ配列の間の切断可能な結合を切断する工程を包含する。

この切断は任意の慣用方法で実施できる。生成した融合蛋白質を封入体から抽出 し、ヒドロキシルアミンで切断可能なアスパラギン／グリシン結合または配列Ｆ ＡＨＹに続くズブチリシンで切断で可能な結合で切断し、得られたＩＣＦ−１ま たは置換体ペプチドを酸化し、従来技術について知識ある者にはよく知られた技 術で精製される。

上述の方法によれば、生物学的に活性なインスリン様成長因子が高収率で生成す ることが明らかにされた。

しかしながら驚くべきことに、成長ホルモン残基を除去する配列切断は、成長ホ ルモンフラグメントが小さい場合、適当な生物学的活性の達成には必要でないこ とが明らかにされた。たとえば、成長ホルモン配列が約１０個のアミノ酸を包含 する場合には、成長ホルモン残基の切断は必要ではない。

このようにして形成された融合蛋白質は、そのようなポリペプチドたとえばイン スリン様成長因子−Ｉにそれ自体知られている様々の任意の適用において使用で きる。

すなわち、本発明はさらに他の態様として、成長ホルモン活性を有する第一のア ミノ酸配列またはそのフラグメント；および生物学的活性を有し、第一のアミノ 酸配列のＣ末端に連結した第二のアミノ酸配列を包含する融合蛋白質を提供する 。

好ましい形態においては、第一のアミノ酸配列は、メチオニンブタ成長ホルモン 配列、またはそのフラグメントである。

さらに好ましい形態においては、第二のアミノ酸配列は、 インスリン様成長因子−１（ＴＣＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−１類縁体、 インスリン様成長因子−ＩＩ　（ＩＧＦ−ＩＩ）もしくはそのＩＧＦ−ＩＩ類縁 体、 トリヒストンＨ２Ａ、１．または ヒト転写因子５ＰＩ−１ａｃＺ融合蛋白質から選択される。

とくに好ましい形態においては、インスリン様成長因子活性を示し、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列、またはそのフラグメント、およ び インスリン様成長因子活性を育する第二のアミノ酸配列またはその類縁体で第一 のアミノ酸配列に連結した配列を包含する、 融合蛋白質を提供する。

第一および第二のアミノ酸配列は、切断可能な結合、好ましくはヒドロキシルア ミンで切断可能な結合またはズブチリシンで切詰可能な結合によって互いに連結 していてもよい。

第二のアミノ酸配列は、インスリン様成長因子−１または■活性を示してもよい 。また、第二のアミノ酸配列は、インスリン様成長因子−■の配列に欠失または 置換を有するその類縁体の活性を示してもよい。このような欠失または置換は、 それに限定されるものではないが、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の Ｎ−末端近くに存在する。たとえば、ある種の類縁体は、インスリン様成長因子 −■に比べて生物学的効力の増強を示すことが明らかにされている（たとえば、 本出願人の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８６１００２４６およびＰ　ＣＴ／ＡＵ８ ８１００４８５参照）。インスリン様成長因子−Ｉは哺乳動物インスリン様成長 因子であってよい。ヒト、ウシまたはブタインスリン様成長因子−■が使用でき る。

第一のアミノ酸配列はブタ成長ホルモン活性を示してもよい。ブタ成長ホルモン はメチオニンブタ成長ホルモン（ｍｅｔｐＧＨまたはＭ　ｐ　Ｇ　Ｈ）であって もよい。アミノ酸配列は、成長因子配列のＮ−末端にそのＣ−末端が連結したｍ ｅ　ｔ　ｐＧＨの全１９１個のＮ−末端アミノ酸を包含してもよく、またそのフ ラグメントを包含してもよい。

第一のアミノ酸配列はｍｅｔｐＧＨの最初のほぼ１００個のＮ−末端アミノ酸を 包含してもよく、さらに好ましくはｍｅｔｐＧＨの最初のほぼ４６個のＮ−末端 アミノ酸またはｍｅｔｐＧＨの最初のほぼ４２個のＮ−末端アミノ酸、とくに好 ましくはｍｅｔｐＧＨの最初のほぼ１１個のＮ−末端アミノ酸を包含する。とく に、本発明の好ましい態様においては、第一のアミノ酸配列は以下の配列から選 択される。

ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦ　＋。

ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮ　−。

ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮＦＡＨＹ　−＋！−タＩｔＭＦＰＡ＆ＩＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＦＡＨＹ−融合蛋白質は生物学的に純粋な形で提供することもできる。

本発明の好ましい態様における融合蛋白質は、（１）ヒトの成長ホルモン欠乏の 処置、（２）ヒトの重篤な異化状態たとえば火傷、感染または他の外傷後におけ る体蛋白質の喪失の抑制、（３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配およ び飼料変換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に、ＩＣＦ−Ｉの適当な置換体とすることができる。

さらに詳しくは、融合蛋白質は、ウシ、ヒツジ、ブタおよびニワトリを含めた畜 産用温血動物の成長促進および飼料変換効率の向上のために投与することができ る。

改良融合蛋白質は、単独で、または意図された投与方法に関連して選択された各 種の希釈剤、担体または賦形剤とともに投与できる。

したがって、本発明は、さらに他の態様として、哺乳動物における蛋白質の蓄積 欠乏または蛋白質喪失の処置用の、 （ａ）成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列またはそのフラグメント、 およびインスリン様成長因子活性を有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体 であって第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結した配列を包含するインスリン様 成長因子活性を示す融合蛋白質の有効量：ならびに （ｂ）医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、担体または賦形剤 を含む医薬または獣医薬組成物を提供する。

所望により、第二のアミノ酸配列は第一のアミノ酸配列から切断されてもよい。

本発明はさらに好ましい形態として、融合蛋白質が、約０．０１−１０、好まし くは０　、　１−１　ｍｇ／Ｋｇ体重／日の用量比を与えるのに十分な置台まれ る組成物を提供する。融合蛋白質は、約０．０２〜２０００ｍｇの量を、単位投 与量形態として含有されてもよい。

畜産的に重要な動物に対する好ましい投与方法としては、慣用実務において応用 されている徐放性ペレット移植体がある。

したがって、本発明はさらに他の態様として、処置すべき対象に、 成長ホルモン活性を存する第一のアミノ酸配列またはそのフラグメント：および インスリン様成長因子活性を存する第二のアミノ酸配列またはその類縁体であっ て第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結された配列を含有し、インスリン様成長 因子活性を示す融合蛋白質の有効量を投与する、哺乳動物における蛋白質蓄積の 欠乏の処置方法を提供する。

処置はまた、哺乳動物における蛋白質の喪失にも適用できる。

本発明の融合蛋白質は、成長ホルモン不全およびソマトメジン不全を包含する慢 性的成長障害に対する処置としてヒトに投与することができる。改良ＩＧＦ−１ は、この目的では、非経口的に、または畜産動物での使用について上に概述した 操作を用いて投与できる。

融合蛋白質は、不十分な成長または組織の消耗を伴う疾患、それらに限定される ものではないがたとえば癌、膵嚢胞性線維症、デュシエンヌ型筋ジストロフィー 、ベラカー型ジストロフィー、営巣包体ジストロフィー、多発性筋炎ならびに他 のミオバシーに対する処置として、ヒト対象に投与することができる。改良ＩＧ Ｆ−Ｉペプチドは、成長障害について上述した操作を用いて投与できる。

融合蛋白質は、それらに限定されるものではないがたとえば火傷、骨格筋外傷お よび感染を包含する貧弱な窒素状態に伴う急性症状の処置としてヒトに投与する ことができる。これらの重篤な保護状態では非経口的液体への添加を介して投与 する方法が好ましいか、他の操作、たとえば成長障害について上述した方法も適 当である。

本発明の融合蛋白質は、成長を促進するため、窒素状態を改良するためおよび異 化疾患を処置するため、ヒト未熟児または他の小児に投与することができる。蛋 白質は、急性のヒトの症状について上に概述したようにまたは経腸的経路で投与 できる。

融合蛋白質のヒト対象への投与の用量比および回数は、約０．０１〜１０ｍｇ／ ｋｇ／日にセットできる。約０．　１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の用量が好ましい。

次に、本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。しかしながら、以 下の記述は、単に例示の目的のちのであって、上述の一般的な記述をいかなる意 味においても限定するものではないことを理解すべきである。

図面中、 図１は、（Ａ）ＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−Ｉ（例４）、（Ｂ）ＭｐＧＨ（ １１）ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ−■ （例６）、（Ｃ）ＭｐＧＨ（１１）ＶＮＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）　ＩＣＦ −１（例８）および（Ｄ）ＭｐＧＨ（４２）ＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧ Ｆ−１（例７）を含有する封入体の５ＤＳＰＡＧＥを示す。矢印は誘導されたバ ンドを示す。

図２は、（Ａ）ＭｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／Ｈ２Ａ、　１　（例９）および （Ｂ）　ＭｐＧＨ（４６）　／　１　ａ　ｃｚｓｐｌ（例１０）の、（Ｕ）非誘 導および（Ｉ）ＩＰＴＧ−誘導ＪＭＩＯＩ培養体の溶解物中での発現を示す。

矢印は誘導されたバンドを示す。

図３、（Ａ）ＩＧＦ−１（Ｋａｂｉ）、（Ｂ）ＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ− １から切断されたＩＧＦ−１（例４）および（Ｃ）ＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ” 　ＩＧＦ−１（例６）の用量−反応曲線を示す。

図４は、ＩＧＦ−１ラジオイムノアツセイを示す。

（Ａ）ＩＧＦ−１（Ｋａｂｉ）、（Ｂ）ＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＣＦ−１から 切断されたＩＧＦ−１，および（Ｃ）ＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ−１ （例６）のＩＧＦ−Ｉ　ＲＩＡである。

例１ ＩＧＦ−■配列のｐＧＨＸＳＣ，４中ｐＧＨ配列へのクローニング 修飾ＲＢＳ／スペーサー領域および戦略的５′−コドン変化を有するプラスミド ｐＧＨＸＳＣ，４（Ｐ、Ｄ。

Ｖｉｚｅ＆Ｊ、Ｒ，Ｅ、Ｗｅｌｌｓ　：ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２１３：１５５， １９８７）を含有する大腸菌ＪＭ１０１細胞中で、ｍｅｔｐＧＨを封入体として 高収率に発現させる。

ｐＧＨＸＳＣ，４ＤＮＡをｐｖｕＩ［で消化して位置５６３でｍｅｔｐＧＨＤＮ Ａ配列を切断し、ＨｉｎｄＩで消化して、ｐＧＨ遺伝子がクローン化されている ｐｋｋ２３３．２　（Ｅ、Ａｍｍａｎ＆Ｊ、Ｂｒｏｓ　ｉｕｓ：Ｇｅｎｅ　４０ ：１８３，１９８５）から誘導される細菌発現ベクター、ＰＫＴ５２のポリリン カー中で切断した。ベクターおよびｐＧＨ遺伝子の大部分を含存する３、４ｋｂ フラグメントを精製した（ａ）。

細菌のコドン利用について至適化した化学合成ｍｅｔＩＧＦ−Ｉ構造遺伝子（Ｂ 、５ｐｒｏａｔ　＆　Ｍ、Ｇａ１ｔ：Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　ＲｅＳ、１３：　 ２９５９．１９８５）をＭ１３ｍｐ８中、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

突然変異で修飾して、開始コドンに隣接したＮｃｏ１部位（Ｃ↓ＣＡＴＧＧ）を 導入した： ＴＣＣＡＴＧ　ＧＧＣＣＣＧ　−−− Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、　Ｐｒ。

このＭ１３中修飾ｍｅｔｌＯＦ−１をＮｃｏｌで消化し、粘着端をクレノーで末 端充填し、ついでＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ［で消化する。プラントＨｉｎｄＩＩ［ フラグメントを精製し、これをベクター（ａ）にリゲーションすると、ｍｅ　ｔ 　ｐＧＨの最初の１８８個のアミノ酸のコード領域にｍｅｔｌＧＦ−１のコード 領域が続く配列が生成する。

この構築体はｐＭｐＧＨ（１８８）ＭＩＣＦ−１と命名され、以下の境界配列を 有する。

Ｐｈｅ、　Ｖａｌ、　Ｇｌｕ、　Ｓｅｒ、　Ｓｅｒ、　Ｍｅｔ、　Ｇｌｙ、　Ｐ ｒｏ、　Ｇｌｕ−−−ＴＴＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＧＣＡＴＧ　ＧＧＣＣＣ Ｇ　ＧＡＡ　−−−ｍｅｔｐＧＨｍｅｔｌＧＦ−［ 例２ 突然変異：失われたｐＧＨアミノ酸の返還、ｍｅｔの除去およびａｓｎの導入に よるヒドロキシルアミン切断可能ｍｅｔｐＧＨＳａｓｎ　ＩＧＦ−１構築体、ｍ ＭｐＧＨ（１９１）Ｎ／ＩＣＦ−１の生成 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ部位特定の突然変異を実施するためには、関連配列をまず、細 菌発現ベクターから一本鎖ベクターたとえばＭＩ３ｍｐ８中にクローン化しなけ ればならなかった。

この目的では、ｐＭｐＧＨ（１８８）ＭＩＧＦ−１のＥｃｏＲＩ−Ｈｆｎｄｌ［ Ｉフラグメント（発現ベクターのｔｒｃプロモーター、およびｐＧＨ−ＩＧＦ融 合蛋白質の構造遺伝子を含有）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［切断Ｍ１３ｍｐ８中 にクローン化した。

このリゲーションからの組換えファージを突然変異反応に対する鋳型として使用 した。４２塩基長のオリゴヌクレオチド、 ５′係「煎にば匪耽富閣口Ｃ□−５ を標準操作で使用して、ｐＧＨおよびＩＧＦコード配列の連結部における所望の 配列を以下のように生成させた。

Ｓｅｒ、　Ｓｅｒ、　Ｃｙｓ、　Ａｌａ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ、　Ｇ　ｌｙ、　 Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ−−−ＡＧＣＡＧＣＴＧＴ　ＧＣＣＴＴＣＡＡＣＧ ＧＣＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣｍｅｔｐＧＨＩＧＦ−ｒ この構築体はｍＭｐＧＨ（１９１）Ｎ／ＩＧＦ−１と呼ばれる。それは、ｍｅｔ ｐＧＨの全配列、ＩＧＦ−１配列のＮ−末端、および連結部にヒドロキシルアミ ンで切断可能な結合をコードしている。

例、３ ｍＭｐＧＨ（１９１）Ｎ／ＩＧＦ−１からＣ−末端ｐＧＨコード配列の制限酵素 欠失 ｍＭｐＧＨ（１９１）Ｎ／ＩＧＦ−１によってコードされる融合蛋白質ｐＧＨ− ＩＧＦからｐＱＨの末端部分の大部を除去するためには、ｐＧＨＤＮＡ配列３０ ０ｂｐを除去するのに限制エンドヌクレアーゼ、６．ｖａ　ＩおよびｐｖｕＩ［ を使用した。

Ｍ１３ｍｐ８は２個のＡｖａｌ部を含有するので、ｍｐＭｐＧＨ（１９１）ＮＩ ＧＦ−１からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｎ［フラグメントをまず、ｐＫＴ５２のＥ ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［切断部に再クローニングした。この組換体からのＤＮＡ をＡｖａｌで消化し、５′突出端をクレノー酵素で充填し、ついでＰｖｕＩ［で 消化した。ベクター、Ｎ−末端ｐＧＨ配列およびＩＧＦ配列を含む３．３ｋｂフ ラグメント（プラント末端）を精製し、リゲーションするとｐＭｐＧＨ（９１） Ｎ／ＩＧＦ−１が得られる（これは、ｍｅｔｐＧＨの最初の８８個のアミノ酸、 ついで最後の３個、およびａｓｎ−ＩＧＦ−■をコードする）。

Ｌｅｕ、　Ｇｌｙ、　Ｃｙｓ、　Ａ　Ｉａ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｙ、　 Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ−−−ＣＴＣＧＧＣＴＧＴ　ＧＣＣＴＴＣＡＡＣＧ ＧＣＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ−−−ｍｅｔｐＧＨＩＧＦ−［ 例４ ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＴＧＦ−Ｉを創成ｔ６突然変異 ｐＭｐＧＨ（９１）Ｎ／ＩＧＦ−１からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［フラグメン トをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断Ｍ　１３ｍｐ　８にクローニングした。

４５ｍｅｒ　０ＬＩＧＯ−４６” ５−に紅Ｍαη１窓ηに国■んに口儒ＡＩＴ／Ｊｌπ廐πππ【ずを合成して、 ｐＭｐＧＨ（９１）Ｎ／ＩＧＦ−１中のｐＧＨのＣ−末端配列部分をさらに欠失 させ、Ｈｐａｌ認識部位（ＧＴＴ　ＡＡＣ）を導入し、ＩＧＦ−Ｉ中のＡｓｎの −１位置を保持させた。この方法でｍＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−１が作成 された。

Ｓｅｒ、　ｒ　ｌｅ、　Ｇｉｎ、　Ｖａｌ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｙ、　Ｐｒｏ、　 Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ−−−ＴＣＣＡＴＣＧＡＧ　ＧＴＴ　ＡＡＣＧＧＣＣＣＧ　Ｇ ＡＡ　ＡＣＣ−−−ＨｐａＩ ｍＭｆ）ＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−Ｉから増殖したＤＮＡの複製可能型からの ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｎＩ挿入体を、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［Ｉ切断ｐＫＴ５ ２にクローニングするとｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−１が得ｐＭｐＧＨ（ １１）ＶＮ／ＩＧＦ−１を創成する突然これは４５−ｍｅｒ　”０ＬＩＧＯ−Ｉ Ｉ”５’−ｆｆＣＧＴｒＡＡＣＡＡＡＴ［ＣＡ丁−ｒを使うほかは例４に記載し たと同様にして、ｍＭｐＧＨ（Ｉ　Ｉ）ＶＮ／ＩＧＦＩが作成された。

１ＪｅＬ　Ｐｈｅ、　Ｐｒｏ、ＡＩＬ　Ｉ！ｅｔ、　Ｐｒｏ、　Ｌｅｌ、　Ｓｅ ｒ、　Ｓｅｒ、　Ｌｅ＋＋、Ｆｈｅ、　Ｖｍ　１．　Ａｓｒａ@Ｇｌｙ、　Ｐｒ ｏ、　Ｇｌ　ｔ　Ｔｈｒ＾ＴＯＴｒＣＣＣＡ（ｉＣＣＡＴＣＣＣＣＴｒＧＴＣＣ ＡＧＣＣＴＡｍＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＣＧＧＡ＾ＡＣＣ−＝例４と同様に、ｍＭ ｐＧＨ（１１）ＶＮ／ＩＧＦ−１から生育したＤＮＡの複酸可能ＭからのＥｃｏ ＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［挿入体をＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ■切断ｐ　Ｋ　Ｔ　５２中 にクローニングすると、ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／ＩＧＦ−１が得られる。

例６ ｐＧｐＧＨ（＋、１）ＶＮ／Ｒ３１ＧＦ−１を創成スル突然異変 ｍＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＴＧＦ−１（例４）の−重鎖ＤＮＡを鋳型とし、て、 および合成２７−ｍｅｒ″０ＬＩＧＯ−７５６” ５−−ＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＧＧＧＣＣＧＴＴＡＡＣ−３−を、ｊ ｎ　Ｖｉｔｒｏ突然変異反応に用いて、ｍＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／Ｒ’　−ＴＧ Ｆ−１を作成した。

Ｓｅｒ、　［１ｅ、　Ｇｌｎ、　Ｖａｌ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｙ、　Ｐｒｏ、　Ａ ｒｇ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ−−−ＴＣＣＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＡＣＧＧＣＣ ＣＧ　ＣＧＴ　ＡＣＣＣＴＧ　−−−ｍｅｔｐＧＨ（１−４６）　ＨｐａＩ　Ｒ ”ｒＧＦ−１このベクターの複製可能型ＤＮＡからのＨｐａｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ フラグメントを、ＨｐａｌおよびＨｆｎｄＩ［で切断したｐＭｐＧＨ（１１）Ｖ Ｎ／ＩＧＦ−Ｉ　（例５）ニリゲーションすると、ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ ’ＩＧＦ−Ｉが作成された。

１　２　３　４　５　６　７　Ｉｔ　９　１０　１１＆Ｌ　Ｐｈｔ　Ｐｒｏ、Ａ ＩＬ　ｍｔ、　Ｆｒａ、　ＬｅＩＬＳｅｒ、　Ｓｅｒ、　Ｌｅｔ　Ｐｌｔ　Ｖｍ ｌ、　ｋｎ、　Ｇ　Ｉｙ、　Ｐｒ潤A　Ａｒｚ　Ｔｏｒ、　Ｌｍ ＡＴＧ　ＴｒＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＣＣＴＴＧ　ＴＣＣＡＧＣＣＴＡ　ｍ 　ＧＴｒ　ＡＡＣ（ＣＣＣＣＧ　ＣＧＴ　ＡＣＣＣＴｌ１ｉ@−− ｍｔｐＧＨ（１ｍ）　Ｈｐａｌ　Ｉ”１ＣＦ−１例７ ｐＭｐＧＨ（４２）ＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧＦ−１を創成する突然変 異 ｍＭＩ）ＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＣＦ−Ｔ　（例４参照）からの−重鎖ＤＮＡ、お よび合成４５−ｍｅｒ、”０ＬＩＧＯ−７１３″ ラー届蝉双心ムＵ釘＾ＴＭＴ（体−にσロロ匡Ｃ氾哀−Ｔ−１Ｇｌｙ、　Ｇｉｎ 、　Ａｒｇ、　Ｐｈｅ、　Ａｌａ、　Ｈｉｓ、　Ｔｙｒ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、 　Ｃｙｓ−−−−ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＴＴＣＧＣＣＣＡＴ　ＴＡＴ　ＡＣ ＣＣＴＧ　ＴＧＣ−−−−ｍｅｌｐＧＨ（１−４２）　スブチリシンー　ｄｅｓ （１−３）　［ＧＦ−［ＢＰＮ−認識 および切断 部位 このベクターの複製可能型ＤＮＡからのＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメン トをＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌ［切断ｐＫＴ５２にリゲ・−ジョンすると、ｐＭ ｐＧＨ（４２）ＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧＦ−１が創成される。

例８ ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）を創成する突然変異 ｍＭｐＧＨ（４２）ＦＡＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（例７参照）の− 重鎖Ｄ　Ｎ　Ａと、合成３３−ｍａｒ、”　ＯＬ　ＩＧＯ−８’ｌ　８” ラーＡ丁＾Ａ丁ＧＧＧＣＣ＾＾＾ＣＣＧＴＴＡ＾ＣＣ（コ’ｅｔｃ’ｒｃｃｃｒ ｃ−ｒを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異反応を行い、ｍＭｐＧＨ（４２）ＶＮ ＧＦＡＨＹ／ｄｅ　ｓ　（１−３）Ｉ　ＣＦ−■： ４０４１４２　４５Ｂ Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−ＡｒｚＶｉｌ、＾−５ｌＬＧｌｙ、Ｐｈａ、＾ｌａ、１ｌｌｔ Ｔｙｒ、ＴｈｒルａＣ７ｇ−−−ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＴＴ　ＡＡＣＧＧ Ｔ　ｍ　ＧＣＣＣＡＴ　ＴＡＴ　ＡＣＣＣＴＧ　ＴＧＣ−−ｓ＠ｔ　ｐＧ［１（ １−４２１ｈａ　１　スブチリシンー　ｍ（１−３）ＢＰＩｒ　ｉＥ緻ｂりＵ　 ＩＣＦ−１ 切断部位 を創成した。

このベクターの複製可能型ＤＮＡからのＨｐａＩ−ＨｔｎｄＩＩ［７ラグメント を、ＨｐａｌおよびＨｉ　ｒｉ　ｄ　ｍで切断したｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｉ ＧＦ−Ｉ　（例５）にリゲーションすると、ｐＭｐＧＨ（］　１）ＶＮＧＦＡＨ Ｙ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧＦ−１か得られた。

例９ プラスミドｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／）リヒｐＣＨ，Ｈ２ＡＨ（Ｄ−Ａ ｎｄｒｅａら：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、９：３１１９，１９８１）からの Ｈｉｎｄｍフラグメント（約７００ｂｐ）を、Ｈｉｎｄ■で切断したファージミ ドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ”　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、 ）にサブクローニングした。このクローンから調製した一本＃ｌＤＮＡを突然変 異の鋳型として使用した。”０ＬＩＧＯ”ぎ−η℃届π就πａ＾π買ＭｑＴ工閃 臥ＴＴＡ甘せ印に父鋳航届−ざを使用して突然変異により、指定された配列を次 のような鋳型の開始コドンの後に導入した。

１ｍｌ、Ｓｅｒ、ＧＩｙ、ＡｒｇＪｌｙ、Ｌ７ｇ５’　−ＴＧＴＩＣｘＪＴＣＧ ＣＴＧＣＧＡＴＣＴＣＧ　ＧＧＧ　ＣＧＣＵ　ＡＡＧ−ｆＶａｌ、Ｊ、ｓｎ、Ｐ ｈｅ、ＡＩＬＨＩａ、Ｔｙｒ＜Ｇ＞ＴＴＡＡＣＴｒＣＧＣＣＣＡＴ丁ＡＴ変異体 クローンを選択し、二本鎖ＤＮＡを調製し、ＨｐａｌおよびＨｉｎｄｌ［［で切 断し、ついでそのフラグメントを、Ｈｐａｌ−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメント（Ｉ ＧＦ−Ｉ配列）を予、！６除去したｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＣＦ−１（例４ ）中にクローニングするとｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／）　＋）Ｌスト： ／Ｈ２Ａ、１が得られた。

例１０ ブラスミ）’ｐＭｐＧＨ（４６）／ヒト転写因子５ｐｔ−１ａｃＺ融合蛋白質の 製造 プラスミドＳｐ　１−５１６Ｃ（Ｓｐ　ｌのＣ−末端５１６アミノ酸部分をコー ドする）は、ｃＤＮＡクローンｐＳｐｌからのＨｉｎｃＩ［−Ｈ１ｎｄＩＩＩフ ラグメント（Ｊ、Ｋａｄｏｎａｇａら：Ｃｅ１ｌ、５１：１０７９゜１９８７） を、Ｓｍａ　ＩおよびＨｉｎｄＩ［ＩによるＰＵＣ１１８切断体中にクローニン グして作成した。ｐＳｐ　１−５１６ＣのＤ　Ｎ　Ａは以下の配列を育する。

＆ｋｔ、　Ｔｈｒ、　＊　ｔ、　Ｉ　ｌｅ、　Ｔｈｒ、　Ａｓｐ、　Ｓｉｒ、　 Ｓｅｒ、　Ｓｅｒ、　Ｖｔ１．　Ｐｒｏ、　Ａｓｎ、　Ｓｅ■ ＾＋ＴＧ　ＡＣＣＡＴｉ　ＡＩＴ　ＡＣＧ　ＭＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴα：　ＧＴ Ａ　ＣＣＣＡＡＣＡＧＣＥｃｏＲｊ　５ｅａｌ／）Ｉｌｎｅｅｌ　［Ｖａｌ、Ｓ ｅｒ、＾ＩＬ＾ＩＬ　Ｔｈｒ　−−−−Ｈ１ｍｌｌｌｃ’ｒ’ｒ　ｒｒｃ’ｒ　 ｃｃＡＧＣＴ　ＡＡＣ（Ｓｐｌの５１６Ｃ−末端アミノ酎０ これをＥｃｏＲＩで消化し、クレノーで末端を充填し、ついでＨｊｎｄｌｌＩで 消化するとｍｅｔ−］ａｃＺの配列６−１１とＳｌ）　１（７）５１６Ｃ−末端 アミノ酸を：Ｉ−）’するフラグメント（プラント−Ｈｌｎｄｌｌｌ）が得られ た。

このフラグメントを、Ｈａｐ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌｌＩフラグメン１−（ＩＧＦ−１ 配列）を除去したｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−１（例４）中にクローニン グするとｐＭｐＧＨ（４８）ヒト転写因子５ｐｌ−１ａｃＺ融合蛋白質： −−−−９ｅｒ、ＩｌａｌＣＩＬＶｍｌ、＾ｓ＋＋、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ、 Ｖａｔ、Ｐｒｏ、＾ＪＪＬＳｉｒ、Ｖｍｌ−−−−　−−ＴＣＣＡＴＣＣＡＧ　 ＧＴｒ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＴＣＧ　（Ｔ＾＝戚＾ＥｍｓｅｔｐｃＨ（１− ４ｆ１９　１ｍｅＺ〕配列　Ｓｐｌノｃ末端。

５１６アミノ酸 が得られた。

ｐＭｐＧＩ（（１８８）ＭＴＧＦ−１（例１）、ｐＭｐＧＨ（１９１）Ｎ／ＩＧ Ｆ−１（例２）、ｐＭｐＧＨ（８８）ＣＡＦＮ／ＩＧＦ−１（例３）　、ｐＭｐ ＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−Ｉ　（、例４）　、ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／ＩＧ Ｆ−１（例５）　、ｐＭｐＧＨ（］　Ｉ１ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ−Ｉ　（、例６） 、ｐＭｐＧＨ（４２）ＦＡＮＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＣＦ−１（例？）、ｐＭ ｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＨＹ／ｄｅｓ　（１−３）ＩＧＦ−１（例８）　、ｐＭ ｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／　トリヒストンＨ２Ａ、１　（例９）またはｐＭ ｐＧＨ（４６）／ヒト転写因子５ｐｌ−１ａｃＺ融合蛋白質（例１０）のいずれ かを含有するｐＫＴ５２発現ベクターを、ＩａｃＩ＠宿主ＪＭＩＯＩ　（Ｊ、Ｍ ｅｓｓｉｎｇ：Ｒｅｃｏｍｂ、ＤＮＡ　Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｉ、２：４２．１９７ ９）中にトランスホーメーシ３ンした。

培養体を１３　、ｅのＭ　ｉ　ｎ　Ａ培地中、３７℃、５５％Ｃ０２、ｐＨ７， ０で、グルコースを供給しながら、八６００が１５になるまで増殖させた。つい で、培養体を１ｇのＩ　ＰＴＧで５時間誘導した。封入体の形成は、位相差顕微 鏡でモニタリングした。細胞を遠心分離によって収穫し、２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、 ５０ｍＭ−ＮａＣＬ、　ｐＨ８，５中に４０％で懸濁し、９０００ｐｓｉでホモ ジナイズした。ホモジネートを水で１０％に希釈し、封入体を遠心分離によって 収穫した。封入体を２００ｍＭ−Ｔｒ　ｉ　ｓ、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．２％リ ゾチーム、ｐＨ８、Ｏに懸濁して洗浄し、２０℃で３時間インキユベートシ、遠 心分離によって集め、湿潤ベレットを２０”Ｃで保存した。

例４．６．７および８のプラスミドでトランスフェクションした培養体からの封 入体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）を図１に示す 。それぞれの融合蛋白質の卓越したバンドが認められる。ＳＤ　Ｓ　Ｐ　Ａ、　 Ｇ　Ｅ後にインデューサーＩ　ＰＴＧの不存在下（Ｕ　）および存在下（？）に 増殖させた細胞からの分解物を、例９および１０について、図２に例示する。誘 導されたバ：７ドは矢印で示す。

例１２ ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／　ＩＧＦ−Ｉ　（例４）でトラ二ノスフエクションし た大腸菌からの封入体中で生成した融合蛋白質（例１１）の切断および純粋なＩ ＧＦ−１の単離 例４において特定した構築体蛋白質を含有する湿潤ペーストを可溶化し、蛋白質 をＡｓｎ／Ｇａｙ結合で切断し、生成したＩＣＦ−１をフォールディングさせ、 先行技術を熟知した者にはよく知られた方法を用いて精製した。これらは、８Ｍ 尿素、５０ｍＭグリシン、１０ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＥ、ｐＨ９，１中 への封入体の可溶化；５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５上８Ｍ尿素１５０ｍＭグリシン ｐＨ９，２中への脱塩；２．５Ｍ　ＮＨ。

ＯＨ／ＨＣＬおよび２．５ｍＬｉＬｉＯＨの添加による４５℃、ｐＨ９，１にお ける４時間の切断：前述したと同様の脱塩：２１〜４尿素中ｐＨ８，２５°にお ける１、２５ｍＭＢＭＥ１０．１ｍＭ酸化Ｂ　Ｍ　Ｅによる蛋白質濃度１゜２５ ＋ｎｇ／ｍｌでの１６時間の酸化；０．１％ＴＦＡおよびプロパン−１−オール 勾配を用いたＣ４ＨＰＬＣ：　ｐ）Ｉ４．８で酢酸アンモニウム勾配を用いたＭ ｏｎｏＳ上イオン交換クロマトグラフィー；０．１３％ＨＦＢＡ中でのＣ、、Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃおよびアセトニトリル勾配での溶出、ついで０．１Ｍ酢酸中への最終 的脱塩を包含する。ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ｒＧＦ−ｘ構築体から誘導された ■ＧＦ−Ｉのこの方法での切断および精製により、ラットし６筋芽細胞における 蛋白質合成の刺激（Ｇ、Ｌ、Ｆｒａｎｃ　ｉ　ｓら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２３ ３：２０７゜１９８６＞ならびに）ＧＦ−Ｔラジオイム／アッセイで市販の絹換 えＩＧＦ−１（Ｋａｂｉ）と同等の効力を示す物質か生成した（図３参照）。

例１３ 構築体蛋白質ＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ−１の生物活性 例１１により封入体とし′Ｃ増殖した例６の生成物は、ＩＧＦ−１の完全な生物 活性を発揮させるために切断を必要としなかった。

封入体を溶解し、脱塩し、例１２の場合のように酸化した。再フォールディング 混合物を０，１％ＴＦＡに調整し、ＨｃｌでｐＨ２，１とし、濾過し、ＣＩ８カ ラム上にポンプで送った。溶出はアセトニトリル勾配で実施した。主蛋白質ピー クはさらに、０１８カラム上０．１３％ＨＦＢＡ中アセｌ−−＋−リル勾配、ｍ ｏｎｏＳカラム上酢酸アンモニウム勾配およびＣＩＩカラム上０．１３％ＨＦＢ Ａ中プロパンー１−オール勾配を含む連続ＨＰＬＣ工程によって精製した。

精製操作により、再フォールディング混合物中の約３０％に相当する単一蛋白質 ピークが生成した。Ｎ−末端配列分析により、配列は期待されたＭｐＧＨ（１１ ）ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ−Ｉであることが確認された。ラット上６筋芽細胞におけ る、成長因子を含まない媒体中での刺激を越える蛋白質合成の刺激百分率として の生物検定（Ｇ、　Ｌ、　Ｆ　ｒ　ａ　ｎ　ｃ　ｉ　ｓら：Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、２３３：２０７，１９８６）では、組換えヒトＩＧＦ−１（Ｋａｂｉ）での結 果以上の効力が認められた（図３参照）、ＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ”　ＩＧＦ −Ｉｔ！、ＩＧＦ−Ｉ　ＲＩＡで弱い交差反応を示すのみである（図４参照）。

最後に、本明細書にその輪郭を示した本発明の精神から逸脱することなく、様々 な他の修飾および／または改変が可能であることを理解すべきである。

日ＧＵＲＥ　Ｉ ＢＣＤ ＦＩＧＵＲＥ　４ ｎ９ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．適当な発現ベクター；成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、また はそのフラグメントをコードする第一のＤＮＡ配列；および第一のＤＮＡ配列の ３′末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を包含す るプラスミド ２．適当な発現ベクターはプラスミドクローニングベクターｐＧＨＸＣ，４であ る「請求項１」記載のプラスミド ３．第一のＤＮＡ配列はメチオニンブタ成長ホルモン配列またはそのフラグメン トである「請求項１」記載のプラスミド ４．第一のＤＮＡ配列はその３′末端に切断可能な配列を包含する「請求項１」 記載のプラスミド５．第一のＤＮＡ配列は、 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれるアミノ酸配列をコードする「請求項３」記載のプラスミド ６．第一のＤＮＡ配列は、 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれるアミノ酸配列をコードする「請求項３」記載のプラスミド ７．第二のＤＮＡ配列は生物活性を有するポリペプチドをコードする「請求項１ 」記載のプラスミド８．第二のＤＮＡ配列は、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧ Ｆ−Ｉ）、ＩＧＦ−Ｉ類縁体、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）も しくはそのＩＧＦ−ＩＩ類縁体、ニワトリヒストンＨ２Ａ，Ｉ、またはヒト転写 因子Ｓｐｌ−ｌａｃＺ融合蛋白質から選ばれるポリペプチドをコードする「請求 項７」記載のプラスミド９．前述したような以下のプラスミド ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／ＩＧＦ−Ｉ ｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／Ｇ３　ＩＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮ／Ｒ３　Ｉ ＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（４６）ＶＮＦＡＨＹ／ニワトリヒストンＨ２Ａ．ＩｐＭｐ ＧＨ（４６）／ヒト転写因子Ｓｐｌ−ｌａｃＺ融合蛋白質ｐＭｐＧＨ（４２）Ｆ ＡＨＹ／ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／ＩＧＦ−Ｉ ｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｇ３　ＩＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮ／Ｒ３　Ｉ ＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＡＨＹ／ｄｃｓ（１−３）ＩＧＦ−ＩｐＭ ｐＧＨ（１１）ＶＮＧＦＡＨＹ／ＩＧＦ−ＩｐＭｐＧＨ（１１）ＶＮＦＡＨＹ／ ニワトリヒストンＨ２Ａ，１ｐＭｐＧＨ（１１）／ヒト転写因子Ｓｐｌ−ｌａｃ Ｚ融合蛋白質から選ばれるプラスミド １０．適当な発現ベクター；成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、ま たはそのフラグメントをコードする第一のＤＮＡ配列；第一のＤＮＡ配列の３′ 末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を包含するプ ラスミド；ならびに単細胞生物体を準備し；上記単細胞生物体に上記プラスミド を導入し；得られた生物体を培養し；上記ＤＮＡ配列によってコードされたポリ ペプチドを発現させ；ついで培養体から上記ポリペプチドを単離することを包含 する融合蛋白質の製造方法 １１．プラスミドはメチオニンブタ成長ホルモンまたはそのフラグメントをコー ドする第１のＤＮＡを包含する「請求項１０」記載の方法 １２．プラスミドは、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−Ｉ類 縁体、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）もしくはそのＩＧＦ−ＩＩ 類縁体、ニワトリヒストンＨ２Ａ．Ｉ、またはヒト転写因子ＳｐＩ−ＩａｃＺ融 合蛋白質から選ばれるポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を包含する「 請求項１１」記載の方法 １３．単細胞生物体は大腸菌株である「請求項１２」記載の方法 １４．ベクター中の第一と第二のＤＮＡ配列の間に切断可能な結合をコードする 配列を導入する予備工程を包含する「請求項１０」記載の方法 １５．第一のＤＮＡ配列を、成長ホルモンコード配列のサイズの短縮および／ま たは認識部位導入の突然変異に付す予備工程を包含する「請求項１０」記載の方 法１６，突然変異工程は、 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】，および 【配列があります】 から選ばれるオリゴマーヌクレオチドを用いる　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異に第 一のＤＮＡ配列を付すことを包含する「請求項１５」記載の方法 １７．成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列、またはそのフラグメント ；および生物活性を有し、第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結する第二のアミ ノ酸配列を包含する融合蛋白質 １８．第一のアミノ酸配列はメチオニンブタ成長ホルモン配列、またはそのフラ グメントである「請求項１７」記載の融合蛋白質 １９．第二のアミノ酸配列は、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、もし くはそのＩＧＦ−Ｉ類縁体、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）もし くはそのＩＧＦ−ＩＩ類縁体、ニワトリヒストンＨ２Ａ，Ｉ、またはヒト転写因 子Ｓｐｌ−ｌａｃＺ融合蛋白質から遊ばれる「請求項１８」記載の融合蛋白質 ２０．成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列、またはそのフラグメント ；および第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結し、インスリン様成長因子活性を 有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体を包含する、インスリン様成長因子 活性を示す融合蛋白質２１．第一および第二のアミノ酸配列は切断可能な結合に よって互いに連結している「請求項１７」記載の融合蛋白質 ２２．第一のアミノ酸配列は、 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれる「請求項１８」記載の融合蛋白質２３．（ａ）成長ホルモン活性を 有する第一のアミノ酸配列またはそのフラグメント；および第一のアミノ酸配列 のＣ−末端に連結し、インスリン様成長因子活性を有する第二のアミノ酸配列ま たはその類縁体を包含する、インスリン様成長因子活性を示す融合蛋白質の有効 量；ならびに（ｂ）医薬的または獣医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形 剤を含む、哺乳動物の蛋白質蓄積不全または蛋白質喪失の処置用の医薬または獣 医薬組成物２４．第一のアミノ酸配列は、 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれる「請求項２３」記載の医薬または獣医薬組成物 ２５．第二のアミノ酸配列は第一のアミノ酸配列から切断される「請求項２３」 記載の医薬または獣医薬組成物 ２６．成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列またはそのフラグメント； および第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結し、インスリン様成長因子活性を有 する第二のアミノ酸配列またはその類縁体を包含する、インスリン様成長因子活 性を示す融合蛋白質の有効量を、処置すべき対象に投与することからなる哺乳動 物における蛋白質蓄積不全の処置方法 ２７．第一のアミノ酸配列は、 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれる「請求項２６」記載の方法２８．第二のアミノ酸配列は投与前に第 一のアミノ酸配列から切断される「請求項２６」記載の方法２９．蛋白質蓄積不 全は、未熟児、成長ホルモン欠損、メマトメジン欠損、火傷、感染、他の外傷、 癌、膵嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ペツカー型ジストロフ ィー、常染色体性ジストロフィー、多発性筋炎ならびに他のミオパシーに伴うも のである「請求項２６」記載の方法 ３０．ペプチド類縁体は約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与され る「請求項２９」記載の方法３１．成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配 列またはそのフラグメント；および第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結し、イ ンスリン様成長因子活性を有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体の有効量 を処置すべき対象に投与することからなる哺乳動物における貧弱な窒素状態の処 置方法 ３２．第一のアミノ酸配列は、 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】 から選ばれる「請求項３１」記載の方法３３．第二のアミノ酸配列は第一のアミ ノ酸配列から切断される「請求項３１」記載の方法発明の詳細な説明