JPS63500962A - 酵素ラベルを使用することによる免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素ラベルを使用することによる免疫学的測定方法本発明は、固相として測定容 器の底部もしくは壁を用いる蛍光測定または光度測定の免疫学的測定方法に関す る。

従来技術において、固体表面上にあらかじめ位置した抗原もしくは抗体上の抗体 または抗原の固定化並びにトレーサーで２ベルされた抗体もしくは抗原の使用を ペースとした方法が公知である。その様な方法とは、例えばＲＩＡ（放射線免疫 学的測定法）及び５Ｐ−ＦＩＡ（同相蛍光免疫学的測定法）であり、後者の方法 は本発明中で取〕扱うべきものである。これらの方法全てにおいて、免疫学的反 応が起る固体表面と反応溶液は、反応溶液中に存在する過剰のトレーナ−が固相 上に固定されている抗体屯しくけ抗原中に存在するトレーナ−のシグナルをカバ ーしないように、トレーサーのシグナルを測定する前に互いに分離しなければな らない。核当するシグナルは、例えば放射線活性（ＲＩＡ）、蛍光（ＦＩＡ）あ るいは酵素活性（ＲＩＡ）でさえｔＤりうる。

概して固層の洗浄を包含する反応溶液から固相を分離すること＆ｉ現在手作業ま たはその自を化が困難である操作を要する。

本発明の方法によって、抗体及び抗原の両方を測定することができる。本発明の 基本となるアイディアは、光度測定及び蛍光測定の両方に適用できる。両方の場 合において、反応溶液よシ重い分離液を使用し、一方で容器の底部もしくは壁忙 抗原もしくは抗体が固定された後の反応容器中に該分離液を入れ、他方で測定す べき抗体もしくは抗原及びトレーナ−でラベルされた抗体あるいは抗原を互いに 反応させる。

光度測定方法において、分離液は、好ましくは２層として加え、底部層として存 在すべき層のみ、トレーナ−として使用される８素基質を含有し、その色は、酵 素によって変化する。関連物質は、例えば酵素としてアルカリもしくは酸ホスフ ァターゼ、基質としてパラニトロフェニルホスフェート、並びに着色した最終生 成物としてパラニトロフェノールである。蛍光測定方法において、励起光もしく は発光光（またはその両方）を強力に吸収し、かつトレーナ−として使用される 酵素基質を含有し該基質は酵素によりて蛍光、を発する物質が最も適当な分離液 である。

本発明の蛍光測定の具体例及び光度測定の具・体例を、以下に添付した図面によ って説明する。ここではいわゆる競合方法を記載するが、他の方法も使用してよ い。

図面の簡単な説明 第１図は測定容器を示し、該容器の内表面は抗原（１）で榎われでいて、それは また灰石容器として作用する。測定容器中にサンプルを加え、該サンプルは測定 すべき抗体（２）ヲ含み、更ＧＣ＃素でラベルされた、対応する抗体（５）を含 む。免役学的反応中、ラベルされた抗体及びラベルされていない抗体は反応溶液 に存在している割合に比例して免疫学的結合によりＳｊ定容器の底部及び壁に存 在する抗原に付着している。

第２図において、例えは酵素によって蛍光を発するような酵素トレーサーの基質 （５）を更に含有する、検液よシも重い分離液（４）を第１図で示した６３定容 ６中に添加する。

これに関連する可能な酵素は、例えばアルカリ及び酸ホスファターゼであってよ く、並びに該基質は、メチルウンベリフェリルホスフェートで、それＫよシ蛍光 物質としてメチルウンベリフェロンを放出する。分離液は、検・液と置き代わシ 、免疫学的結合によシ付着している分子のみがそこに残留する。適当な分ＦＢ１ ．１は、例えば２０ないし６０％のシｌＩ糖浴叡でちる。

蛍光は、−？為ベットの底の上部に存在する蛍−ｊ′ｆ：、層中に適当な色の励 起光（６）を向けることにより、並びに該蛍光層から放射されたｇｌ光（７）の 輩を測定することＫより下方から測定される。蛍光が強い程、サンプル中で測定 されるべき抗体の存在が少ない。というのは多量の酵素で２ベルされた抗体を付 着したからである。分離液の上部に存在する蛍光物質は測定中に観察されない、 というのは分離液は、光学シャッターとして作用するからである。

蛍光の励起波長及び発光波長での分離液の吸収ファクターは、キュベツトの底地 もしくは檗と直接接触している層中で蛍光剤の測定に対する実質上の妨害を形成 しないが、分離層全体を通して測定されるとさ、分離液の全体の厚さを通して励 起光もしくは発光光（またけその両方）の接近を実質上妨げる、そのような高光 学密度を形成するように選択される・ メチルウンベリフェロンの蛍光を測定するとき、分離液中で、例えばクロム酸カ リもしくはメチルオレンジ（またはその混合物）を着色剤として使用することが 可能である。

更に第５図及び第４図に示した具体例中、抗原（１）は、測定容器中の隔壁上に 固定されていて、抗体（２）及び配索ラベルされた抗体（３）が容器中に添加さ れる。免疫学的反応後、該容器中底部の近くに投薬端（８）を通して、サンプル を攪拌せずに、基質を有さす、かつサンプル層よシも重い無色の単離された分離 液（９）を先ず添加し、その後好ましくは中間にある投薬端を除去せずに、５７ 素によりて着色され光学測的しうる物質に変換されるような無色の基質０υを付 加的に含有する、更に重い無色の分離液ＯＱを添加する。着色された物質の吸収 は、妥直に通過する光のビーム０ｚによって測定される。

酵素としては、例えはアルカリもしくは酸ホスファターゼを使用することができ 、並びに基質としてはパラニトロフェニルホスフェートを使用することができ、 この場合において、パラニトロフェニルは、着色された化合物として遊離される 。

第３図及び第４図に示した具体例は、また同一の分離液の添加最終段階において 好ましくは投薬端に近接するＴｈ部ダクト開口部から液体ダクト中に、分離液中 に基質を６加するよう圧して実旅してもよい。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．試験すべき検液並びに対応する酵素ラベルされた抗体を、透明な窓を備え、 その窓の内表面に測定すべき抗体の抗原（１）が固定されている測定容器中に添 加する、酵素トレーサーを用いることによる免疫学的測定方法において、免疫反 応後、検液よりも重い分離液（４，１０）を測定容器中に添加し、該分離液は酵 素により蛍光測定または光度測定可能となるような物質に交換しうる酵素の基質 （５，１１）を含有してなり、そして分離層中に存在している検出しうる化合物 の量を蛍光測定的または光度測定的に測定することを特徴とする免疫学的測定方 法。
2. ２．免疫反応後、酵素により蛍光測定的に検出しうるようになる基質を含有する 分離液（４）を添加して、励起光（６）は分離層中を通過し、かつ発光光（７） は、測定窓を通して分離層外を通過するよりにして、検出しうる化合物の量を蛍 光測定的に測定することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．励起波長もしくは発光波長において強く吸収する分離液（４）を添加するこ とを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．免疫反応後、酵素により光度測定できるようになる基質（１１）を含有する 分離液（１０）を添加して、該測定しうる化合物の量を垂直に通過する測定ビー ム（１２）により測定することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．分離液（１０）前に、まず検液よりも重く、かつ酵素基質（１１）を含まな い単離した分離液（９）を添加することを特徴とする請求の範囲第４項記載の方 法。
6. ６．本来の分離液（１０）よりも軽い単離した分離液（９）を添加することを特 徴とする請求の範囲第５項記載の方法。