JPS63501264A - タウマチン１類似体をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩと（Ｌｙｓ４６．Ａｓ　ｐ　ｌ　Ｉ　２　）タ ウマチンＩの暗号を定めるＤＮＡＪ 背量 本発明は一般に遺伝物質の操作に関し、より具体的には、天然タウマチンＩとし て認識されているポリペプチドの類似体で、ポリペプチドのアミノ末端がら１１ ３１３番目位にアスパラギン酸残基を含み、さらに４６番目の部位にリシン残基 をも含む場合もあるものを産生ずるための組換え手順に有用な特定のＤＮＡ配列 の製造に関する。

タウマチンは、アフリカ産低木Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎｉｅｌｌ ｉｉペンスの果実の仮種皮中に産生される極めて甘味なタンパク質である。この 果実は、西アフリカではパーム酒、とうもろこし、パンおよび酸っばい果実の甘 味料として古（から用いられている０重量ベースで蔗糖の約５，０００倍の甘さ があるタウマチンは、タウマチンＴ、ＩＩ、　ａ、ｂおよびＣの、少なくとも５ つの形態で産生される。イオン交換カラムがらの溶離の順番に従って名付けられ た（Ｈｉｇｇｅｎｂｏｔｈａｍ等、「食物の感覚上の性質Ｊ（Ｓｅｎｓｏｒｙ　 Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｆｏｏｄｓ）　（Ｂｉｒｃｈ等編集）、ロンドン ：Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ｐｐ、　１２９−１４９　（１９７７ ））これらのタンパク質は、約２２キロダルトンの分子量を持つ、タウマチン■ および■はほとんど同一のタンパク質であり、各々１個の修飾されてぃつ非う食 原性であり、またこれらのタンパク質とヒトの味覚受容体の間の安定した相互作 用を示唆する強い甘味反応をもたらす、したがって、タウマチンは、砂糖の代用 物９食品添加物。

甘味受容体プローブ、および味覚反応を更に解明するためのツールとして用いる ことが可能である。

このタンパク質を食品添加物および研究のツールとして利用するためには、多量 の純粋なタウマチンの供給が必要である。

タウマチン植物は、果実の繁殖を成功させるためには熱帯気候と虫媒を必要とす るため、この果実の温室栽培はかなりの困難が伴う。

Ｉｙｅｎｇａｒは、下記の表Ｉに示すタウマチンＩのアミノ酸配列を開示した（ Ｉｙｅｎｇａｒ等、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９６．１９３−２０ ４（１９７９））　。

第１表 Ｔｒ　ｐ−Ａｌａ−Ａｌ　ａ−Ａｌａ−５ｅ　ｒ−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓ 　ｐ−Ａｌａ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ａｌａ−Ｇｌ@ｙ− Ｃｙｓ　−Ｔｙ　ｒ−Ｐｈｅ　−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−５ｅ　ｒ−Ｇｌｙ−５ｅ 　ｒ　−Ｇｌｙ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｔｈ　ｒ|Ｇｌｙ− Ｐ　ｒｏ−Ｔｈ　ｒ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ　１ｕ−Ｐｈ　ｅ−５ ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｔｙ　ｒ−Ｇｌｙ−kｙｓ　− ＭｅヒーＡｓｎ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓ　ｐ −Ｘ　ｌ　ｅ　−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙ刀@− ６ｅ　ｒ−Ｔｙ　ｒ　−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔｈ　 ｒ　−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ|Ｇｌｙ− タウマチン■のアミノ酸配列は、そのヌクレオチド配列から推論されており（Ｅ ｄｅｎｓ等、蝕憇、■、　１−１２　（１９Ｂ２））　、またタウマチン■の遺 伝子はメツセンジャーＲＮＡ誘導相補的ＤＮＡ（ｃＯＮＡ）からクローンされて いる。タウマチン１およびタウマチン■のアミノ酸配列は非常に似ており、Ｅｄ ｅｎｓ等およびＩｙｅｎｇａｒ等の報告によると、それらのアミノ酸配列はわず か５つの部位において異なるにすぎないｍ　Ｉｙｅｎｇａｒ等が報告した天然の タウマチン■の配列のものと異なるタウマチン■の配列の５つのアミノ酸は、残 基４６のアスパラギンの代わりのりシン。

残基６３のセリンの代わりのアルギニン、残基６７のりシンの代わりのアルギニ ン、残基７６のアルギニンの代わりのグルタミン。

および残基１１３のアスパラギンの代わりのアスパラ卆ン酸である。さらに配列 の解析は、タウマチン■が２２残基アミノ末端延長部分および酸性６アミノ酸カ ルボキシ末端テイルを有する前駆体、プレプロタウマチンとして最初に翻訳され ることを示している。アミノ末端ペプチドがその疎水性から分泌信号であると仮 定され、またカルボキシ末端延長の区分化の役割も果たすという仮定が立てられ た。

ポリペプチドのタウマチン類の研究に多大な労力が注がれ。

またタウマチンの微生物的産生のための遺伝物質の操作のために多くの努力が為 されてきた。上記のＥｄｅｎｓ等の文献は、プレプロタウマチン■の天然配列を 持つポリペプチドが微生物を用の配列暗号を開示し、また微生物における形質転 換に用いるためのＤＮＡ配列を備えるクローニングベヒクルをも開示している。

天然源からのタウマチンｌを暗号付ける遺伝子の分離（例えば、ゲノムクローニ ングあるいはｃＤＮＡクローニングによる）に関する報告が無いが、　Ｉｙｅｎ ｇａｒ等によって確認されたタウマチン■ポリペプチドの微生物による合成する ために研究がなされている０本明細書に参照することによってその開示を本明細 書の一部とする１９８３年１０月１１日出願の共有且つ係属中の米国特許出願第 ５４０．６３４号において、　Ｉｙｅｎｇａｒ等が明らかにしたタウマチンＩの アミノ酸配列の暗号を持つ製造された遺伝子の合成方法が、　ＤＮＡ微生物形質 転換ベクター、フュージョン遺伝子、形質転換された微生物、製造された遺伝子 を発現させる手順およびそれによって産生されたポリペプチド産物を入手する手 順とともに開示されている。この方法に固有の製造遺伝子は、酵母宿主細胞にお ける発現に「望ましい」幾つかのコドンを備えている。

米国特許出願第５４０，６３４号においては、プライマーによる突然変異生成お よびフラグメント切り出しならびに再連結技術によって、タウマチン■の暗号配 列をＩｙｅｎｇａｒ等のタウマチンＩ配列の暗号を決定する製造遺伝子に構成す る手順も開示されている。２個のプライマーを用いた突然変異生成手順１回で、 ３つのアミノ酸の変更（Ａｓｎ４６をＬｙＳ４６に、　Ｓｅｒ＆３をＡｒｇ＆ｆ ｆに。

そしてＬｙＳ６？をＡｒｇ６’７に）が得られる。残基番号７６におけるアルギ ニンからグルタミンへの変更は、別の突然変異生成手順にバラギンからアスパラ ギン酸への変更をおこなう別の突然変異配列の紅娃およびＥｃｏＲＩの二本鎖を 置換することによって行うことが出来る。残基１１３における変更は、やはり試 験管内突然変異生成手順を必要とする。米国特許出願第５４０，６３４号もタウ マチン類似体の製造を示唆している。

２里■！ｈ 本発明は　（ＡｓｐＨｆｆ）タウマチンＩあるいは（１ｙｓ４６．　Ａｓｐ１１ ！〕タウマチン■のアミノ酸配列、すなわちポリペプチドのアミノ末端から１１ ３１３番目位でアスパラギンの代わりにアスパラギン酸塩アミノ酸残基、また場 合によっては４６番目の部位でアスパラギンの代わりにリシンアミノ酸残基にな ることを除いては、Ｉｙｅｎｇａｒ等によって報告された天然タウマチンＩのア ミノ酸残基の連続配列を有するポリペプチドの選択された宿主微生物内の合成を 行うことができる製造遺伝子を提供する。望ましい形態の製造遺伝子においては 、塩基配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ｃｏｌｉ）＋普通酵母（Ｓａ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）といった使用予定の宿主微生 物内でのコドンの選択的発現特性に基づいて、同じアミノ酸を特定する１個ある いはそれ以上のコドンを有する。製造遺伝子のその他の望ましい形態には、（１ ）一つのコドンが合成されたポリペプチドにおいて追加的なアミノ酸（例えば、 最初のメチオニン残基）を特定し、前述のアミノ酸が大腸菌微生物および／ある いは酵母微生物内での直接発現を促進するもの、あるいは（２）ポリペプチドの 適切な終結を行うために、製造遺伝子の終端に少な（と１個の終結コドン転子を 含むＤＮＡ配列をウィルスベクターあるいは環状プラスミドＤＮＡベクターに挿 入して、ハイブリッドベクターを形成する、ハイブリッドベクターは細菌（例え ば大腸菌）あるいは酵母細胞（例えば普通酵母）のような宿主微生物を形質転換 するのに用いられる。ベクターにも適切なプロモーター／ｉｌ１節ＤＮＡ配形質 転換された微生物はその後、適切な栄養状態の下で増殖され１本発明のポリペプ チド産物を発現する。

本発明のその他の態様および利点は、下記の詳細な説明を考慮すれば明らかにな るであろう。

良坦左畿里 本明細書においてＤＮＡ配列あるいは遺伝子に用いられるｒ製造された」という 用語は、ヌクレオチド塩基の集合によって完全に化学的および酵素的に合成され た産物が、あるいはこのようにして合成された産物の生物学的複製によって誘導 された産物を意味する。このように、この用語は、はじめがら生物的起源の出発 材料が関与するｃＤＮ八法へしくはゲノムクローニング法によって「合成されだ Ｊ産物は含まない。

アミノ酸を示すために本明細書においては下記の略号を用いる。アラニンはＡｌ ａ　、アルギニンはＡｒｇ　、アスパラギンはＡｓｎ、アスパラギン酸はＡｓｎ 、システィンはＣｙｓ　、グルタミンはＧｉｎ　％グルタミン酸はＧｌｕ　、グ リシンはｃｒｙ　、ヒスチジンは１（ｉｓ−、イソロイシンはＩｌｅ　、ロイシ ンはＬｅｕ　、リシンはＬｙｓ　。

メチオニンはＭｅｔ　、フェニルアラニンはＰｈｅ　、プロリンはＰｒ。

チド塩基に用いる。アデニンにはＡ、グアニンにはＧ、チミンにはＴ、ウラシル にはＵ、シトシンにはＣである。

本発明が容易に理解できるように、下記の第１表に、　ＤＮＡの選択可能なトリ プレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）ヌクレオチド塩基コドン６４個とアミノ酸２０個、 およびこれらに特定される翻訳終止（「停止Ｊ）機能の関連を表している。

箪ス底 １番目の制止　２番目の部位　３番目の部位Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ｔ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｃ Ｔ゛ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓ　Ｌｏｐ　Ｓ　Ｌｏｐ　＾Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　Ｔｒ ｐ　ＧＬｅｕ　Ｐｒｏ　ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｃ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇ １１ｅ　−Ｔｈｒ　＾ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｌ１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃ ＾ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ Ｖａｌ　＾Ｉａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ 実施例１ この実施例では１分離された植物タウマチン■、植物タウマチン■、および共同 所有の米国特許出願第５４０，６３４号の方法に従って産生された組換え体酵母 産生りウマチン■の試料各１ｍｇを還元し、カルボキシメチル処理を行ってスル フヒドリル基すべてを不可逆的にブロックした。試料を全タンパク質−５Ｈの１ ０倍モル過剰のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて窒素下３７℃で２時間に わたって、９Ｍ尿素、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．Ｉ　Ｍ　Ｆリス塩ａ、 　ｐＨ８，０中で還元した。２時間後、タンパク質スルヒドリル基を暗所で３０ 分間にわたって、過剰なヨード酢酸を用いて定量的に標識付けした。過剰β−メ ルカプトエタノールを加えて反応液を冷却し、修飾タンパク質を蒸留水に対して 透析した後に凍結乾燥させ９次にトリプシンで消化した。試料各１ｍｇを５０１ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，０−８，４）　１　ｍＩｌに溶解し、　ＴＰＣ Ｋトリプシン２５−４０μｇを用いて消化した。各混合液を３７℃で１２時間に わたってインキュベートした。トリプシンは、ポリペプチド鎖のりシンおよびア ルギニンアミノ酸残基のカルボキシ末端側で鎖を切断するように作用する。各ア リコート１００μｇを除去して凍結乾燥させた。

次に、乾燥した各アリコートを、容量にして１００の割合のピリジン、容量にし て８の割合の酢酸および８９２の割合の水からなる電気泳動緩衝液１０ｐｌ中に 溶解した。試料を薄層クロマトを一晩風乾させ９次に容量にして１００の割合の ブタノール、容量にして１５の割合の酢酸および容量にして３８の割合の水から なるクロマトグラフィー緩衝液で展開させた。上昇クロマトグラフィーを室温で ４時間行い１次にプレートを風乾させた。

プレートが乾燥した後、１０■のフルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ ）を１　ｖａｎのピリジンおよび１００ｍ　Ｒのアセトンに溶解したフルオレサ ミン溶液をプレートに噴霧した。この溶液はポリペプチドの第一級アミンと反応 して強い蛍光を発する、植物タウマチン■および植物タウマチン■のトリプシン 消化物の二次元画Ｎ電気泳動マツプおよびクロマトグラフィーマツプは、予想ど おり幾つかのペプチドの部位に違いがあった。これらの違いをアミノ酸配列分析 した結果、２つのタンパク質の間のアミノ酸残基の違いに対応することを確認し た。予想に反して、植物タウマチン■および組換え体酵母産生タウマチンＩのト リプシン消化物の二次元マツプは異なることが明らかになった。一般に、植物タ ウマチンＩおよび組換え体タウマチンＩからの、殆どのトリプシンペプチドの相 対的二次元部位は重ねることができた。２つのタンパク質のペプチドマツプを比 較すると、ペプチドの電気泳動移動度に大きな差異が見られた。各クロマトグラ ムからの特異的なペプチドをＩＮＨＣＬで溶離して凍結乾燥させ３次にＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４７０Ａタンパク質シーケンサ−を用い て配列を決定した。下記の配列が推論された。

草じ１表 植物タウマチンＩ ＮＨｚ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ− Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃ０Ｏg 組換え体タウマチン■ ＮＨｔ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｎ　−Ｖａ　１−　Ｐｒｏ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓ 　ｎ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−’Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ|ＣＯＯＨ 大施拠」 この実施例では、実施例１の方法に基づいて、還元およびカルボキシメチル処理 した植物タウマチン１．植物タウマチン■、および組換え体酵母産生タウマチン Ｉのトリプシン消化物の試料各５０　ｎｇを＋ＡＩｔｅにＣ−１８ゲルカラムを 用いて逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。アセトニト リルを増加勾配（３−５０χ）で用いて、トリプシンフラグメントを６０分間に わたって溶離した。６０分後、アセトニトリル勾配を５分間のあいだに５０％か ら１００％に上げてから、カラムを１００％のアセトニトリルで１０分間洗い２ 次に濃度を０％アセトニトリルに下げた。全てのタウマチン試料のプロフィルに おいて、約１５の大きいピークが確認された。植物タウマチン■と植物タウマチ ン■の溶離プロフィルは非常によく似ていたが、但しこの２つのアミノ酸残基の 既知の差異に起因する小さい差異があった。植物タウマチンＩおよび組換え体酵 母産生タウマチンＩも非常に似ていたが、ただ１つの例外があった。３２％のア セトニトリルでス１超（１− この実施例では、実施例２において植物タウマチン■がら（３２％のアセトニト リルで）１５番目の大きいピークに溶離したトリプシンペプチドを、　Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４７０Ａタンパク質シーケンサ−を用い て分析し、そのアミノ酸配列を決定した。スピン真空乾燥した１５番目のトリプ シンペプチドの試料３μｇを、１００％トリフルオロ酢酸３５μｌに再懸濁した 。植物タウマチンＩ、および２９．９％のアセトニトリルで溶離した組換え体酵 母産生タウマチンＩフラクションのペプチド配列を分析した結果、実施例２の第 ３表に示した配列が確認された。

植物タウマチン■から分離されたトリプシンペプチドは、１つの例外を除いて、 　Ｉｙｅｎｇａｒ等が発表した、アミノ酸残基１０７から出発してアミノ酸残基 １１９まで続く植物タウマチンＩの配列の１２番目のトリプシンペプチドに一致 する。植物タウマチントリプシンペプチドの７番目の部位におけるアミノ酸残基 はアスパラギンｆｉｌ　（Ａｓｐ）であったが、一方＋　Ｉｙｅｎｇａｒ等が確 認したのはアスパラギン（Ａｓｎ）であった。

尖施炎」 この実施例では、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌ　Ｃｏ、が販売している植 物タウマチンＩと、別の未確認の植物タウマチン類似体を実施例２の技法に基づ いて消化し、逆相高性能液体クロマトグラフィーっでいた。このフラグメントは タウマチンＩポリペプチドの３０番目から４９番目までのアミノ酸残基まで延び るものであった。

タウマチンＩポリペプチドにおいては、４６番目の残基はアスパラギンであるの に対し、類位体のそれはりシンであることが分かった。１１３番目の部位のアミ ノ酸残基はいずれのポリペプチドもアスパラギン酸であることが確認された。

実施例５ この実施例では、プラスミドｐＩＮＧ５４を下記の３つのプラスミドから構成し た。　ｐｌＮＧｌ−この構造はＪｏｈｎｓｔｏｎ等ｒ　Ｇｅｎｅ、　３４、１３ ７−１４５　（１９８５）に記載されている。　ｐＵｃ８　−　これはＭｅｓｓ ｉｎｇ　ａｎｄ　Ｖｉｅｒａ、　Ｇｅｎｅ、　１９．２６９−２７６　（１９８ ２）に記載されており、また市販されている。ｐｌＮＧ３０１−　１ｙｅｎｇａ ｒ等の配列に基づ＜ｉウマチンＩの完全な配列を備えるプラスミドで、その構成 は共有の米国特許出願第５４０，６３４号の実施例５に記載されている。この構 成においては、ρｌＮＣｌプラスミドをＸｍｎ　Ｉ制限酵素で消化し、２つのＢ ａｍＨ１制限部位を有する第１のフラグメントおよびユニークなＮｄｅ　Ｉ制限 部位を有する第２のフラグメントを得た。次に第２のフラグメントを制限酵素」 旺！で切断して、アンピシリン耐性遺伝子およびノ１０部位を持つ第３のフラグ メントをつくり、それを除去した。次に、制限酵素」【１およびＸｍｎ　Ｔを用 いてｐＵｃ８からアンピシリン耐性フラグメントを分離したが、このアンピシリ ン耐性フラグメントは除去されたｐｌＮＣＩフラグメントに似ているが、」■■ 部位が欠けているものである。

次に、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、　ｐｕｃｓアンピシリン耐性フラ性遺 伝子と、第１および第２のｐｌＮＧ１フラグメントの非連続部分とを有するフラ グメントを得た。プラスミドｐｌＮＧ３０１を制限酵素ハｍＨＩおよびＮｄｅ　 Ｉで切断し、　Ｉｙｅｎｇａｒ等の配列に基づく（Ａｓｎ”’）タウマチンＩの 配列暗号を持つフラグメントを得た。そして、　ｐｌＮＧ３０１匣１／Ｎ声ｌフ ラグメントを、ｐＪＨＬ５７からのＢａｍ）Ｉ　１　／Ｎｄｅ　Ｉフラグメント に連結させて、タウマチン遺伝子を備えたプラスミドｐｌＮＧ５４を形成した。

大路皿」 この実施例では、　Ｉｙｅｎｇａｒ等の配列に基づ＜　［Ａｓｎ１ｌ”）タウマ チン■の遺伝子暗号を特定部位の突然変異生成によって、　〔ＡＳｐ１１３）タ ウマチンＩＢｆＩ体の暗号に変えた。ヌクレオチド配列が（５°−ＧＡＧＡＧＡ ＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＡＡＣ−３”）である突然変異生成プライマーを化学的に 合成し、トリエチルアミン重炭酸塩の１０１溶液中で５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５ ０カラムに通した。次に、突然変異生成プライマーを含むフラクションを、２種 の緩衝液を用いてＨＰＬＣＣ１８カラムにかけたが、前述の２種の緩衝溶液は、 　１０　ｍＭ　トリエチルアミン（緩衝液Ａ）と、いま一つは１０ＰａＦＩトリ エチルアミンと５０％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）である。突然変異生成プライ マーフラグメントは、４４％の潤度の緩衝ｉＢで溶離した。

ピークフラクションを集めて乾燥させ、８０％酢酸溶液２００μβ中に、２３℃ で３０分間にわたって再懸濁した。フラクションをスピン真空乾燥させて、　２ ００μｌの水に再懸濁し、２度目のスピン真空乾燥を行った後、５０μｌの水に 再懸濁した０次に、この同時に、実施例５に記載したプラスミドｐＩＮＧ５４を 制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで消化し８次に４種類のデオキシリボヌクレオチド三りん酸 （ｄＮＴＰ）が全て存在するもとで、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いてプラン ト末端にし、さらに制限酵素り蛯！で消化して、　〔ＡｓｎＩＩりタウマチンの 暗号を持つ約６３０塩基対のフラグメントを得た。次にこのフラグメントを、制 限酵素Ｐｓｔ　Ｉで処理済の市販されているファージＭ１３　ｍｐｌｏ　（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ＋　Ｊ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎハ鉦肚封■、　Ｖｏｌ、　１０１ 　ｐＰ、　２０−７８　（１９８３）に記載されている〕複製型分子に連結させ 、　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでプラント末端処理した後、制限酵素ＢａｍＨＩ で切断した。タウマチン遺伝子の望みの挿入部を含むＡ１３フアージは、’Ｍ１ ３　ｍｐｌｏ−タウマチンＪと名付けた。

突然変異生成ブライマーフラグメントを分離した後。

Ａ１３　ｍｐｌｏ−タウマチンＤＮＡ　１８ｇの溶液１μｉと、２μβのキナー ゼ処理したプライマー混合液とを、　７０　ｍＭ　）リス塩酸、ｐＨ７，５，Ｔ ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｔ＋　ｓｏｏ　ｍＭ　ＮａＣ１および９μｌのＨｇＯがら成る １０％重合緩衝液１μｌと共に混合した。この溶液を６５℃まで１５分間加熱し た時点で、加熱ブロックのエレメントの電源を切り、試験管を入れたままで放置 して室温まで冷却した。

０、Ｉ　Ｍ　ＤＴＴ　１　／ｊ　１２．２５　ｍＭ　ｄＮＴＰｌ　／ｊ　ｊ２お よびＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｉｖ　Ｆｒａｇ ｍｅｎｔ）　２単位を１０μｌの水に加えて、２３℃で３０分間インキュベート してプライマーの延長を行った。　１００　ｍＭ＾ＴＰＩμβおよびＴ４リガー ゼ０．５μｌを加え、混合液を１５℃で６時間インキュベートした。大腸菌株７ １．１８細、胞（Ｇｒｏｎｅｎｂｒｏｎ、　ＢｏＭｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ ｔ、、　Ｖｏｌ、１４８、　ｐＰ、　２４３−２５０　（１９７６）　、　ＪＭ ＩＯＩ　（ＡＴＣＣＮｏ、　３３８７６）のようない験室マニュアル（α■μ四 刀狂」■ｍ壮ＪＬコＬ以康ガ旦遵ｖＬ１但巨１１）ｌＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２）に基づいて、″ｐ標識づけを 行った突然変異生成プライマーをプローブとして用いてプラークハイブリッド法 （ｐｌａｑｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。

次に６２℃（融解温度よりも６℃高い温度）で洗浄して、フィルターから余分な プローブ分子を取り除いた。オートラジオグラフィーによって、１２個の確実な ハイブリッド形成プラークが確認された。確実なブレークのうちの１つを選択し て１０５倍に希釈した後、１１あたり１５ｇのトリプトン、ｌｏｇの酵母エキス および５ｇのＮａＣ１を含んだＴＹＥプレート上に再び置いた。更にハイブリダ イゼーションを行い、配列確認のために２つの確実なプラークを選択した。いず れのプラークも（Ａｓｐ　１１３　〕タウマチン１類似体の突然変異遺伝子暗号 の望みの配列を呈した。そこでファージの１つを’Ｍ１３　ｍｐｌＯ−タウマチ ン−０４と名付けた。

実施例７ この実施例では、実施例６に記載したファージＭ１３　ｍｐｌｏ−タウマチン− 〇を、制限酵素匡媛■および紅組■で消化し、　ｐｌＮＧ５２をＥｃｏＲＩおよ びＨｉｎｄｌｌ＋で消化して得られた長いフラグメントに連結したが、このｐｌ ＮＧ５２は、　Ｉｙｅｎｇａｒ等の配列に基づくタウマチンＩの完全な配列およ び短くなったＰＧにプロモーターを含み、その構成は、共有且つ係属中の米国特 許出願第５４０．６３４号の実施例１０ならびに係属中の米国特許出願第７９７ ．４７７号（代理人の事件整理番号第Ａ２６１２−１１０４８５番）の「短縮ホ スホグリセリンｐＫＳ−５−２と名付けた。

つぎに、　ｐＭＳ−５−２プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｈｏ　Ｉで消化し、 ８５０塩基対のタウマチン暗号配列を、Ｂａｎ）ＩＩおよびＸｈｏ　Ｅで消化し たｐＩＮＧ５８に連結した。前述のｐｌＮＧ５８は、　ＰＧＫターミネータ−配 列を含むプラスミドであり、その構成は共存の米国特許出願第５４０．６３４号 の実施例１０に説明されている。得られたプラスミドは　（Ａｓｐ１１２）タウ マチンＩのための配列および短縮ＰＧＭプロモーターおよびＰＧＫターミネータ −を有するもので。

ｐｌＮＧ４０７と名付けた。

去忘炎」 この実施例では、　Ｉｙｅｎｇａｒ等の配列に基づ＜　（Ａｓｎ”３）タウマチ ンＩの遺伝子暗号を製造遺伝子配列を挿入することによって変え、アミノ末端か ら４６番目のアミノ酸残基においてアスパラギンの替わりにリシンの暗号付けを 行った。アスパラギンの代わりに、リシンの暗号を持つヌクレオチド配列（ＣＡ ＡＧＧＧＴＧＧＴＡＡ）を有する１２塩基対プローブを化学的に合成して、さら に両端に活性Ｋｐｎ　ＩおよびＢｇｌ　１１　制限部位がある２０塩基対の相補 的フラグメントを合成した（ＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＧ）。

プラスミドｐＩＮＧ５２をｂ堕−■およびｑｎ制限酵素およびＴ４１Ｊガーゼで 処理し、１２塩基対ならびに２０塩基対鎖から成る２０塩基対の２本鎖オリゴマ ー（ｏｌｉｇｏｍａｒ）を、タウマチン暗号領域に挿入して、プラスミドｐＩＮ Ｇ１４１を作った。　ｐｌＮＧ５２クローンとはｌ塩基対が異なるｐＩＮＧ１４ １クローンは、コロニーハイブリッド法（ｃｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉｏｎ）を用いてＷｉ認した。１２塩基配列は。

た。

ス」Ｕ汁Ｊ この実施例では＊　（Ｌｙｓ”　）タウマチン！類似体および（ＡＳｐＩｌｌ） タウマチン■類似体の暗号を持つ遺伝子の突然変異の組換え操作を行って、アミ ノ末端から４６番目のアミノ酸残基がリシンであり且つアミノ末端から１１３１ ３番目ミノ酸残基がアスパラギン酸である（Ｌｙｓ”、　Ａｓｐ１１３　、）タ ウマチン■類似体の暗号を持つ遺伝子を形成した。上記の実施例８に記載した（ ｌ　ｙ　ｓ　Ａ　６　）タウマチンＩ類憤体の配列の暗号を持つプラスミドｐＩ ＮＧ１４１を、ＥｃｏＲＩおよび肛ｎｄｌｌｌで消化し、タウマチン暗号配列を 、部位８９のグルタミン酸残基と部位１３７のリシン残基の間で開裂させた。ま た同時に、実施例６に記載され且つ〔Ａｓｐ１１３〕タウマチン■類似体の暗号 を持つファーシト１３　ｍｐ　１０−タウマチン−〇を、制限酵素ＥｃｏＲＩお よびＨｉｎｄＩ［［で消化し、その配列の対応部位を分離した。次に７４　ＤＮ Ａ　リガーゼを用いて、Ｍ−１３ｍｐ　１０−タウマチン−Ｄ　フラグメントを 、　ｐＩＮＧ１４１配列をＥｃｏＲＩおよび肛ｎｄｌｌ＋で消化して得た長いフ ラグメントの中に連結し＋　（Ｌｙｓ”＋　Ａｓｐ”’　）タウマチン■類似体 の暗号を持つプラスミドｐＭＳ−６を形成した。配列が（ＧＡＧＡＧＡＡ虹匡Ａ ＴＴＧＧＡＡＣ）であるプローブを用いるコロニーハイブリッド法の手順によっ て、　ｐＫＳ−６プラスミドを精製した。

次に、　ｐＫＳ−６プラスミドをＢａｗｌ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉで消化し。

８５０塩基対のタウマチン暗号配列を、Ｂａａ）ＩＩおよび…ｏＩで消実施例１ ０ この実施例では＋　（Ａｓｐ””）タウマチン■の暗号を持つプラスミドｐｌＮ Ｇ４０７を、普通酵母菌株ＡＨ２２（ＡＴＣＣ３８６２６）内に形質転換した。

このプラスミドを持つ酵母菌株を５０（−）ロイシン培地、即ち、アミノ酸を含 まない窒素塩基、２％グルコース。

ロイシンを含まないアミノ酸すブルメント、およびプリンならびにピリミジンサ プルメントから成る合成完全培地で培養した、その理由は、グルコースを唯一の 炭素源として細胞が増殖される場合は、プラスミド内のＰＧＭプロモーターが構 成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）となるからである、プラスミドｐｌＮＧ４０ ７を持つ単一コロニー酵母形質転換体を１５ｍＡ！のＳＤ（−）ロイシンブロス に接種し、激しく振りながら３０℃で飽和するまで培養した（ＡＭ。。７い：約 ２．１）、飽和培地を溶解する前に、氷で予備冷却し、　ＰＢＳで２回洗浄した 。

１　ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ　）リス−Ｃ１，１％ＳＯ３，ｐｎ　７．２） を、上記のように調製した細胞各０．５　ｇに加え、懸濁液を１０分間煮沸して 細胞を破損させた。次に試料を１４０００　Ｘ　ｇで遠心分離し、上清から不純 物を取り除いた。続いてこれを１５％非連続ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）によって分析した０組換え体タウマチンは、タウマ チン標準試料の共泳動によって確認され、また結晶状ウシ血清アルブミンを標準 試料とするＬｏｅｉｒｙ等＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、旦３．２６５− ２７５　（１９５１）の方法なかった０次に、この物質を、共有且つ係属中の米 国特許出願第７９７．４７３号（代理人の事件整理番号第７４５０番）の「生物 学的に活性のある形態で組換え体ポリペプチドを分離する方法Ｊ（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｆｏｒ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｏ１ｙｐ ｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｆｏｒｍｓ） の再生手順で処理した。上記特許出願の開示をここに参照することによって本明 細書の一部に取り込む。材料の一部はその天然のコンフォメーシッンにうまく再 生され、濃縮すると甘味を呈することが明らかになった。

大旌炎旦 この実施例では＋　（Ｌｙｓ”＋　Ａｓｐ”’　）タウマチンＩの暗号を持つプ ラスミドｐＩＮＧ４０６を、普通酵母菌株ＡＨ２２（ＡＴＣＣ３８６２６）内に 形質転換した。このプラスミドを持つ酵母菌株をＳＤ（−）ロイシン培地、即ち 、アミノ酸を含まない窒素塩基、２％グルコース、ロイシンを含まないアミノ酸 すブルメント、およびプリンならびにピリミジンサプルメントから成る合成完全 培地で培養した。その理由は、グルコースを唯一の炭素源として細胞が増殖され る場合は、プラスミド内のＰＧＫプロモーターが構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉ ｖｅ）となるからである。プラスミドｐｌＮＧ４０７を持つ単独コロニー酵母形 質転換体を１５１１ｊ！のＳＤ（−’）ロイシンプロスに接種し、激しく振りな がら３０℃で飽和するまで培養した（ＡＭ。。ア、：約２．１）、溶解に先立っ て、飽和培地を氷で予備冷却し、　ＰＢＳで２回洗浄した。

１　ｍｌｌの溶解緩衝液（２０＋＊Ｍ　）リス−ＣＩ、１％ＳＯ５，ｐＨ７，２ ）５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いる電気泳動によ って分析した。タウマチン標準試料の共泳動によって組換え体タウマチンが確認 され、また結晶状ウシ血清アルブミンを標準試料としたｌｏｗｒｙ等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、’　１９３．２６５−２７５　（１９５１）の方法の 変法によって測定した。

上記の操作によって分離された組換え体（Ｌ　ｙ　ｓ　４　＆　、　Ａ　３　ｐ 　ｌ　ｌ　３　）タウマチン１は、変性しており、生物学的に不活性の形態であ り、甘くなかった０次に、この物質を、共有且つ係属中の米国特許出願第７９７ ，４７３号（代理人の事件整理番号第７４５０番）の再生手順で処理した。前述 の特許出願の開示をここに参照することによって本明細書に取り込む、物質の一 部はその天然のコンフォメーションにうまく再生され、濃縮をしなくとも甘味を 呈することがわかった。

前述の説明を考察すれば当業者には本発明の数多くの変更および改良が容易であ ろうと思われる。−例として、前述で説明した実施例は、　Ｉ）ＨＡ配列の特定 部位の突然変異誘発を行って、５’　−ＡＭＣ−３’　コドン特定アスパラギン を５’　−ＧＡＣ−３’　コドン特定アスパラギン酸に代えるものであるが、適 当なアスパラギン酸残基を５’−ＧＡＴ−３°によって暗号付ける本発明の（Ａ ｓｐ”’）タウマチンＩ遺伝子をつくることも可能である。したがって１本発明 は下記の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。

国際調丘報告 １°′１“−〜−−”＝　ＰＣＴ／ＵＳＩｉ１６１０２２６３Ａｔｔａｃｈｍａ ｎセ ＩＰＣ（４）：　Ｃｌ２Ｎ　ｌ／１６；　Ｃｌ２Ｎ　１１００；　Ｃ０７ＦＩ　 １５／１２

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．選択された宿主微生物中で〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を行うこと ができる遺伝子。
2. ２．請求の範囲第１項の遺伝子で，遺伝子が製造された遺伝子であるもの。
3. ３．請求の範囲第２項の遺伝子で，塩基配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における コドンの優先的発現特性という点から、同じアミノ酸を特定する代替コドンの中 から選択された１つあるいはそれ以上のコドンを含むもの。
4. ４．請求の範囲第２項の遺伝子で，塩基配列が普通酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドンの優先的発現特性という点から 、同じアミノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１つあるいはそれ以上 のコドンを含むもの。
5. ５．請求の範囲第１項の遺伝子で，その暗号鎖が下記のヌクレオチド塩基配列、 すなわち、 【配列があります】 から成るもの。
6. ６．選択された宿主微生物中で〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合 成を行うことができる遺伝子。
7. ７．請求の範囲第６項の遺伝子で，遺伝子が製造された遺伝子であるもの。
8. ８．請求の範囲第７項の遺伝子で，塩基配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における コドンの優先的発現特性という点から、同じアミノ酸を特定する代替コドンの中 から選択された１つあるいはそれ以上のコドンを含むもの。
9. ９．請求の範囲第７項の遺伝子で，塩基配列が普通酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドンの優先的発現特性という点から 、同じアミノ酸を特定する代替コドンの中から選択された１つあるいはそれ以上 のコドンを含むもの。
10. １０．請求の範囲第１項の遺伝子で，その暗号鎖が下記のヌクレオチド塩基配列 、すなわち、 【配列があります】 から成るもの。
11. １１．選択された宿主微生物中で〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を行うこ とができる遺伝子を含む，生物学的に機能するＤＮＡ微生物形質転換ベクター。
12. １２．選択された宿主微生物中で〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの 合成を行うことができる遺伝子を含む，生物学的に機能するＤＮＡ微生物形質転 換ベクター。
13. １３．〔Ａｓ１１３〕タウマチンＩの合成を行うことができる遺伝子を含むベク ターで形質転換された微生物。
14. １４．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を行うことができる遺 伝子を含むベクターで形質転換された微生物。
15. １５．請求の範囲第１３項ないしは第１４項の微生物で，前記微生物が大腸菌（ Ｅｃｏｌｉ）微生物であるもの。
16. １６．請求の範囲第１３項ないしは第１４項の微生物で，前記微生物が普通酵母 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物であるもの。
17. １７．〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの産生方法で，適切な栄養状態のもとで， 〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を行うことができる遺伝子を含む生物学的 に機能するＤＮＡで形質転換した微生物を増殖し、それによって，前述の微生物 が前述の遺伝子を発現して〔Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩを産生することから成 るもの。
18. １８．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの産生方法で，適切な栄養状 態のもとで，〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの合成を行うことがで きる遺伝子を含む生物学的に機能するＤＮＡで形質転換した微生物を増殖し、そ れによって，前述の微生物が前述の遺伝子を発現して〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１ ３〕タウマチンＩを産生することから成るもの。
19. １９．請求の範囲第１７項あるいは第１８項の方法で，前述の微生物が大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物であるもの。
20. ２０．請求の範囲第１７項あるいは第１８項の方法で，前述の微生物が普通酵母 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物であるもの。
21. ２１．〔Ａｓｐ１１３〕クウマチンＩの暗号を持つ遺伝子の微生物中での発現に よるポリペプチド産物。
22. ２２．〔Ｌｙｓ４６，Ａｓｐ１１３〕タウマチンＩの暗号を持つ遺伝子の微生物 中での発現によるポリペプチド産物。