JPS63501570A - 免疫治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫治療方法 本発明は、各多形結晶型のイヌリンの製造および同定、イヌリンを含有する免疫 治療用製剤、ならびに不溶性もしくは粒子状形態のイヌリン製剤を投与すること による抗腫瘍療法に関する。

”イヌリン“は、線状β−Ｄ−（２→１）ポリフラクトフラノシルα−Ｄ−グル コースに属する単純、不活性なポリサッカライドであり１００個までのフラクト ース残基の枝分れのない鎖が１個の末端グルコースに結合している。したがって 末端のフラクトース−グルコース対はスクロースと同一である。他の構成要素は 含まれていない。すなわち、イヌリン製剤は様々の分子量（１６，０００まで） を有する単純な既知組成の天然ポリサッカライドである。イヌリンはキク科植物 の貯蔵型炭水化物であり、ダリアの塊茎から安価に得られる。比較的疎水性の、 ポリオキシエチレン様骨格を有し、この異例な構造とその非イオン性性質から、 再結晶によりきわめて純粋な状態に容易に製造できる。

イヌリンの分子組成はよく知られているが、その溶解度の到足値の報告は一定し ていない。たとえば、メルクインデックスには、イヌリンは６冷水にわずかに溶 解、熱水に可溶”とあるが、定量的研究（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、、１９６５，９５．４１−４７　）では、イヌリンには２種の異なる型が存 在し、水から沈殿させて得られる第一の型とエタノールから沈殿させて得られる 第二の型があり、いずれも６７℃で水によく溶けることが示されている。イヌリ ンの懸濁液を放置しておくと溶解度が低下することも知られている。水からの沈 殿で得られる型はα−イヌリンと呼ばれ、エタノールから沈殿させて得られる型 はβ−イヌリンとして知られている。しかしながら、２種の型の間のコンホーメ ーションの差は明らかにされておらず、またイヌリンの各多形を識別する方法も 確立されていない。

イヌリンの各多形を識別する方法を開発中に、第三の、これまで知られていない 多形が発見され、単離された。

以下γ−イヌリンと呼ぶ第三の多形は６７°Ｇの水にほとんど不溶であるが、α およびβ型と同様に７０〜８０℃の範囲の温度では可溶である。イヌリン結晶が 作る一連の多形は、水溶媒に対する異なる溶解速度によって特徴づけることがで きる。すなわち、２３℃で直ちに溶解する型（β２３イヌリン）から、３７℃に おいて８分のハーフタイムで溶解する型（へ、イヌリン）、３７℃でほとんど不 溶性の型（γ−イヌリン）までである。すべての型は相互に変換可能で、溶解度 が高（不安定な型は放置すると溶解度が低（安定な型に変化し、完全に溶解して 再結晶した場合にのみこの逆に進行する。最終生成物は安定なγ−イヌリンであ る。

本発明は、γ多形のイヌリンまたはイヌリン誘導体の粒子からなり、この粒子は ３０℃を越える水溶媒中において低い各所速度を示すことを特徴とする組成物を 提供するものである。

本発明において使用できる活性成分はイヌリン、丁なわちβ−Ｄ−［２−１）− ポリフラクトフラノシルα−クーグルコースのみでなく、イヌリンからたとえば その末端グルコースを除去できるインベルターゼもしくはイヌラーゼ酵素を用い てイヌリンから末端グルコースを酵素的に除去して得られるβ−Ｄ−［２−１１ ポリフラクトースを含むその誘導体も包含する。本発明の範囲内に包含される他 の誘導体には、その遊離ヒドロキシル基がたとえば公知方法によりアルキル、ア リールもしくはアシル基による化学的置換でエーテル化またはエステル化された 誘導体がある。

活性成分の分子量は約３．０００以上であることが好ましく、約８．０００以上 であることがさらに好ましい。

本発明の好ましい一態様によれば、本発明の組成物は、 （ａ）　分子量が約８，０００〜約１６．０００の範囲である、 （ｂ）　３７℃の水にほとんど下塔である、ことを特徴とするｒ−イヌリンの粒 子からなる。

とくに好ましい態様によれば、上述のようなｒ−イヌリンの径く１μｍの粒子の 安定な、きわめて純粋な懸濁物からなる組成物を提供する。このような組成物は 、以下に詳述するように、第二補体経路（ＡＰＯ）のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ 　ｖｉｔｒｏ活性化に特異的な試薬であることが明らかにされた。

分子量が小さすぎてγ型に変換しないイヌリンまたはイヌリン誘導体は、適当な 化学的修飾たとえばアルキル、アリールまたはアシル基で置換して、溶解度を低 下させしたがって不溶性の結晶の製造を容易にすることも考慮されている。

本発明はまた、たとえば市販されてイヌリンのような任意の便利な原料からγ− イヌリンを製造する方法も提供する。

広い意味では、本発明の方法は以下の各工程からなるものである。

１、痕跡の不純物を除去する ２、水（好ましくはアルカリａｐＨ）から３７°Ｃより十分低い温度で再結晶し 、微粉末粒子を懸濁状態で得る ３、懸濁物を約２５〜４５℃の範囲の温度に約１〜３日間加熱する ４、懸濁物を約４４〜５５℃の範囲の温度に約０．５〜１．５時間さらに加温す る ５、　このようにして生成した下塔性γ−イヌリンを懸濁液から単離する 以下の工程は、エンドトキシン（ＥＴ）を含マナい”注射用γ−イヌリン”製造 のための精製操作である。

１、　イヌリン粉末（たとえば市販原料）をまず、痕跡の不純物を除去する処理 に付す。これは、水に懸濁、再沈降させて洗浄し、最低限の熱を加えて（好まし くは７０°Ｃ以下）冷却して再結晶するかまたは凍結／解凍し、溶解している状 態でＤＥＡＲ−セルロースおよびスルホン化ポリスチレン寓脂のよ５なイオン交 換樹脂を通過させる。ＰＨは６．５以上に保つことが好ましい。

ついで溶液を適当なフィルター（たとえば、ｚｅｔａｐｏｒＯ１２μｍ　ＳＰｇ ｒａｄθ充填改良ナイロン６６膜）を通して濾過することにより滅菌し、エンド トキシンを完全に除去する。

２、　この溶液を６７℃より十分低い温度、好ましくは５℃で、好ましくは高Ｐ Ｈにおいて、（たとえば０．１係アンモニア浴液を用いて）好ましくはイヌリン 濃度５０■／−以上において再結晶して、可溶性イヌリン（主としてα型）の微 粉末沈殿（好ましくは径１１ｔ７ｒＬ未溝の粒子）に変換する。数日、通常は５ 〜７日後に、大部分のイヌリンは結晶化している。

６、次に懸濁液を高温度、好ましくは３０°〜４０°Ｃの範囲の温度にさらに約 １〜３日間の期間加熱する。

このとき、大部分のイヌリンの沈殿はγ型に変換される。

４、懸濁液をさらに短時間たとえば約１時間、もりと高い濃度好ましくは４５〜 ５０℃の節回に加熱して、変換を完結させ、変換しないα−イヌリンがあれば溶 解させる。

５、懸濁液を沈降させて溶解性物質を大部分除き、水に再懸濁してもよい。つい で懸濁液を標準濃度たとえば固体イヌリン６２．５１ｎｇ／−に再懸濁する。こ れは４分の１容の４％（Ｗ／ｖ）食塩溶液と混合すると５０ｒｒｙ／−の等張性 食塩溶液を生じる。濃度は屈折計によって測定できる。分散の程度は適当な操作 、たとえば密度勾配遠心分離または電子顕微鏡で調べることができる。

上述の段階１以後の全工程には、エンドトキシンを含まない材料および完全な無 菌操作を使用する。懸濁液は５℃に放置する前または後に食塩浴液で等張に調整 される。わずかな加水分解を生じるほか、この懸濁液は４５℃までは安定である 。しかしながら、これ以上は加熱しないことが好ましい。凍結／解凍後も懸濁液 は依然として安定であるが、粒子が凝集することがある。

以前の研究では、癌療法に利用できる可能性があるある種の基本的免疫原理の存 在が示唆されている。残念ながら、癌の発生／消失におけろ免疫系の役割につい ては完全に理解されるに至っておらず、かなりの論争と疑問が残っている領域で ある。多（の因子が関与していて、腫瘍に対する免疫系の細胞レベルでの機構に ついては現在でもよくわかっていない。

抗腫瘍活性が十分実証されているほとんどすべての免疫増強剤（約２０種の化合 物）の研究（Ｃｏｏｐｅｒ。

第１巻第４章、１２５〜１６６頁、１９８５　＊　Ｒａｙ。

Ｐ、に、編、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、　Ｙ、　）から、それ らは補体第二経路を活性化するかまたはマクロファージを活性化するか（明らか にその内因性ＡＰＯを介して）のいずれかであるか、あるいはその両者であるこ とが示されている。抗腫瘍活性を示すこれらの化合物の分子構造は化学的に著し く多様であるが、ＡＰＯの活性化は共通の性質であるように思われる。さらに、 　ＡＰＯの活性化に著しい特異性を有する（ｊなわち、細胞毒性やその他の因子 は除外できる）２種の精製された物質が、マウスの特定の種を用い注意深くコン トロールされた実験において、有意な抗腫瘍活性を有することが明らかにされて いる。これらの２種の物質は、単離された補体成分Ｑ３ｂと単離されたコプラ毒 因子である（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｐ、Ｄ、　＆　Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、　：工ｎｔ、 　：Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３３゜６８６〜６８７．１９８４　）。この以前の 研究から、他の特異的ＡＢＣ活性化物にも抗腫瘍活性が期待できる可能性がある と結論された。

本発明の目的は、癌患者に投与した場合、補体第二経路に影響して、再現性ある 有意な延命効果または生命の質的改善をもたらす製剤を提供することにある。

本発明の他の目的は、外見上は健康な患者に生涯ある間隔で投与した場合、前癌 段階にある細胞を消失または変化させて、その後に癌を発現する機会を低下させ る製剤を提供することにある。

イヌリンは、その不溶性もしくは粒子形態で、とくに上述のようなγ−多形を投 与すると強力なＡＰＯ活性化剤であり、マウスに有意な抗腫瘍効果を有すること が確立された。

（溶解した）”注射用イヌリン″の基準は英国および米国の薬局方に収載されて いる。溶解したイヌリンおよび多分その加水分解生成物はヒトの場合、半減期１ 時間で排泄され、最終的な加水分解生成物（フラクトースおよびグルコース）は 単なる食品である。英国薬局方公定書（１９７９）には、（溶解した）イヌリン の唯一の薬理効果は高用量における浸透圧利尿であると記載されている。すなわ ち、粒子状イヌリンに効果があるとすれば、それは物理的状態に関係するという ことになる。粒子状イヌリンを大量に経静脈的にウサギに投与したが、腎嵩性ま たは抗原性は認められなかった。免疫学的相互作用についての唯一の報告は、以 前に経験した細菌レバンから誘導されたある種の骨髄腫蛋白質との交差反応で、 ＡＰＯの活性化については知られていない。使用したイヌリンの物理的形態をｙ ｎＩＩ製または特定する試みはこれまで見当らないことに留意すべきである。

本発明に至った研究においては、高純度のイヌリンを、不溶性または粒子状の形 態で投与すると、きわめて低用量でも、マウスまたはヒト血清中ｉｎ　Ｖｉｔｒ ｏで、ＡＰＣの強力な活性化剤として作用することが発見された。活性の程度は 、知られている最も強力な活性化剤と類似している。古典的補体経路には影響し ない。不溶性または粒子状イヌリンを０５７黒色マウスに腹腔内投与すると、Ｂ −１６メラノーマ細胞に対して強力な抗腫瘍作用を示し、平均生存期間を５５多 延長することも明らかにされている。

したがって本発明は、さらに別の態様において、活性成分として３０℃以上の水 性メジウムにおける溶解速度が低いことを特徴とするγ−多形型のイヌリンまた はイヌリン誘導体の粒子を言有する補体第二経路の活性化または抗腫瘍処置のた めの免疫治療製剤を提供するものである。

さらに別の態様においては、本発明は、先に広い意味で定義された免疫治療組成 物の、ヒトもしくは動物の生体内における補体第二経路の活性化またはヒトもし くは動物の生体における抗腫瘍処置のための使用を包含する。

活性成分は上に特徴を述べたγ−イヌリンであることが好ましい。

上述の免疫治療製剤の投与は、便利な任意の方法により、たとえば、腹腔内、皮 下、静脈内または腫瘍内注射によって行われる。

現在知られている３種のイヌリンの多形、α、βおよびγ型のうち、本発明にお いては、分子最少なくとも８，０００、さラニ好マシ＜は’２０００〜１２，０ ００の実質的に純粋なｒ−イヌリンを、注射用製剤に処方して使用する。イヌリ ンがＡＰＯを活性化する能力およびその抗腫瘍作用はその不溶性と相関し、γ型 が最も不溶性、すなわち最も活性であることから、γ型が好ましい。溶解型イヌ リンおよび３７°Ｃで実質的に溶解できる多形型はこれらの活性を妨害するので 、イヌリンの懸濁液はαおよびβ多形型を含まないことが好ましい。

注射用γ−イヌリンは、溶解したイヌリンおよびエンドトキシンを実質的に含ま ない（カブトガニ変形細胞分解物アッセイで０．１ｎｇ／−以下）食塩水１−あ たり、純粋な、不溶性イヌリン粒子３０〜６０ｍｇ、好ましくは５０■からなる 滅菌、乳状懸濁液として処方されることが好ましい。このような製剤は有意では あるがきわめて低い固有のパイロジエン作用を有する。

しかし英国薬局方（１９８０）の１０η／時での用量でのパイロジエン試験はパ スする。痕跡の蛋白質、脂質、核酸および荷電ポリサンカライドも含まないこと 、またイヌリン以外の可溶性物質もしくはイヌリン加水分解物を含まないことが 期待される。懸濁液はたとえば０９Ｃ〜＋４５℃の範囲の温度で安定であり、水 懸濁液としては２〜８℃で保存するのが好ましい。この懸濁液は緩徐にしか沈降 しない。フェニル水銀硝酸塩（英国局方、１９８０）のような防腐剤をたとえば ２０μｇ／ゴ、懸濁液に加えてもｉｎ　ｖｉｙ□もしくは１ｎＶｉｔｒＯの活性 は低下しない。懸濁液の取扱いおよび注射は簡単であるが、凍結または４５℃を 越えて加熱することは避けるべきである。粒子は径１μ未満の卵形に調製するこ とができ、凝集する傾向はない。したがって微小血管を遮断することはない。

本発明の活性成分の製造および利用については、さらに以下の実施例で詳細に説 明する。この記述中、温度はすべて摂氏で表示し、また略号は本技術分野におけ る通常の意味で用いられている。精製の試薬、生成物およびプレバレージョンは 、本明細書に記載の方法または本技術分野において公知の他の方法で精製するａ 、　イヌリン（９０％”７ｗ、　５１ｇ１ａ、　ＳＴ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ。

ダリア塊茎からの製品）を無菌処理した：最終溶液を膜濾過により滅菌した。乾 燥重量は２６°Ｃにおける屈折率によった。風乾したプレバレージョンは約１０ ％（ｗ／ｗ）の水を含み、モノマーを含まないフラクトースのポリマーであった （フェーリング溶液との反応および上昇ペーパークロマトグラフィーの移動性に よる。

ついで２　Ｍ　）　ＩＪフルオロ酢酸中で短時間煮沸したのち、ＡｇＮ０３（Ｔ ｒｅｖｅｌｙａｎ、　ｙｒ、　Ｅ、ほか（１９５０）　Ｎａｔｕｒｅ。

ｘ、ａｎｄ、　１６６、　ｐｐ、　４４４〜４４５　）およびレゾルシノール（ Ｐｈｅｌｐａ、　Ｏ，？、（１９６５＞　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　９５　Ｔｐ ｐ、　４１〜４７）スプレーを使用〕。主成分および微量成分であるフラクトー スおよびグルコースそれ−ｔ’ｔｔの含量は全プレバレージョンについて、加水 分解後クロロホルム：酢酸：水（６：（５：１）および水飽和フェノールでクコ マドグラフィーに付し確認した。他の還元糖は検出されなかった（＜１％）。全 プレバレージョンがＮおよびＳを含まず、ＣおよびＨ含量および旋光度は期待値 に一致した。

ｂ、　イヌリン１．粗イヌリンを脱イオン水中ｏ、１％（ｖ／ｖ）アンモニアと （４０ｍＪ／、９イヌリン）２３°Ｃで２回攪拌した。約８０％が不溶であった 。

Ｃ１イヌリンＴ１．０．１％アンモニアに溶解したイヌリンＩ　Ｃ５ｍｌ／ｇイ ヌリン、６９°Ｃ）にクロマトグラフィー用に調製した（Ｈｉｍｍｅｌｈｏｃｈ 、　ｓ、　Ｒ，（，１９７１）ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎＺｙｍｏ’ｌ ｏｇ７　（Ｊａｃｋｏｂｙ、　Ｗ、　Ｂ、編）、　Ｖｏｌ。

２２　＋　ｐｐ　２７３　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｅｅ、　Ｎｅｗ　ＹＯ ｒｋ）　１％（７ｗ）ＤＥＡＥセ／ｌ／　ｏ　−ス（Ｂ：ａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄ ａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ。

ＮＹ）を懸濁し、濾液を凍結し、ついで放置しく２６°Ｃ１４８時間）、濾塊を 洗浄しく５℃、０．１％アンモニアついで乾燥アセトン）、風乾した（収率６５ 〜７０％）。

イヌリン■が本明細書に記載したプレバレージョンの出発点であった。加水分解 後フェノール−水クロマトグラフィーで溶出させ、フェノール硫酸法（Ｄｕｂｏ ｉｓ。

Ｍ、ほか（１９５６）　、　Ａｎａｌｙｓｔ、　Ｏｈｅｍ、、　’ｌ　８　、３ ５Ｑ〜６５６）で定量すると、フラクトース：グルコース比は２０〜８０：１で 、記載の分子量範囲に対するグルコース末端に一致した。灰分、Ｐおよび０．Ｄ 。

（２６ＯｎＩｎ）は存在しなかった（粗イヌリンはそれぞれ、０．６％”７ｗ、 　０．０８％ｗ／ｗ　および痕跡を含有した）。アセトン洗液は脂質を含まなか った。イヌリンＩＩ（１０％ンｖｌ　ｐＨ６−７＋　２０℃）をＮ／１００ＨＣ Ｊで滴定してもカルボキシル基は検出されなかった。

０．１％アンモニアから結晶化したのち、灰分、Ｎを認めないことは陰イオン基 を含まないことを示し、ＳおよびＰを認めないことはイオン化夾雑物が検出され ないことを示唆した。０．Ｄ、走査（６２，５η／−）では、カラメル化を避け る限り、７００〜２４０　ｎｍにピークを認めない。水からの結晶化に際しては 、高い濃度、ＰＨ％低い温度およびイオン強度、ならびにコロイド接種により、 粒子は小さく、結晶化は速くなる。

ｄ、ＥＴを言まない注射用γ−イヌリン、十分な分子が分子量８，０００以上を 示せば、最初のα、βおよびγ含量の異なる製品を使用できる。金属装置はアル カリ洗浄剤（Ｄｅｃｏｎ　９０　ｒ　５％ｙ／ｖ；　５ｅｌｂ７．５ｙｄｎｅｙ ）に予め浸漬する。ガラス装置も加熱しく３時間、１９５°Ｃ）、ついでオープ ンに弱い部品を装着して、オートクレーブ処理した（ｙｅｉｎｂｅｒｇ、　１９ ８１　）　ｏ　水はＭｉｌｌｌ−ＲＯＲｅｖｅｒｓｅ　Ｏｓｍｏｓｉｓで脱イオ ン化し、ついでＭｉｎｉ−Ｑ濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　５ｙｄｎｅｙ）で仕 上げをすると、ＥＴを含まない（カブトガニ法）。水または溶液はＥＴ除去のた め、滅菌０．２　μｍ　Ｚｅｔａｐｏｒ　ｓｐグレード負荷−改良ナイロン６６ 膜（ＡＭＦ　ｃｕｎｏ、　Ｍｅｒｉｄｅｎ、　Ｃ！０ＮＮ）を通した濾過の付加 的処理を行い、オートクレーブで処理すべきである。

粗イヌリンを攪拌下に溶解しく４０９，８００ｍ１０．１％アンモニア、７５℃ ）、熱時濾過しくＷｈａｔｍａｎ厘４２濾紙）、凍結しく一１５°Ｃ）ついで１ −の０Ｈ（Ｊ３とともに放置した（３７℃、３〜４日間）。沈殿を２回洗浄しく ８０〇−水、２６℃）、径７α、深さ２儂の洗浄ＤＫＡＥ−セルロース床を通し 、５〜６％”／ｖ、　＜　４０　’Ｃで徐々に濾過した。濾液（アンモニア０． １％とする、７０℃）を同様のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　スルホン酸樹脂（ＣＧ　− １２０、ＢＤＨ，ＰＯＯｌｅ、　７７−Ｆ：：＝７型に調整）を通して濾過し、 さらにアンモニアと再び加熱しく０．１％、７０°０）、ついで濾過した（Ｚｅ ｔａｐｏｒ）。

滅菌された、ＥＴを含まない溶液（ｐＨ９〜１０．５％Ｗ／ｖ）を攪拌した（５ °０．５〜７日間）。結晶が太きすぎる場合は、アンモニアを増やして（０，２ ％）再溶解し、わずかに白濁する点まで短時間加熱し、核を接種し、ついで再攪 拌した（５°０．３〜５間、ついで３７°Ｃ，２〜４日間）。粒子（９０〜９９ ％γ−イヌリン）を遠心分離しく６０分、４，０００ｇ）、振盪して再懸濁しく ４０〇−水、５０°Ｃ）、ついで加熱して（１時間、５０℃）、２回洗浄した（ ５°Ｃ）。収率は４０〜５０％であるが、出発原料の分子量により変動する。６ ２．５■／−の最終懸濁液について、溶解性物質（＜０．２％Ｗ／ｖ）、粒子サ イズ（以下参照）、不溶性（く１■／　ｍｅ　＋　３７°０．２４時間でＯ，Ｄ 、　、。０の〈１０係低下）、ＥＴ含量（カブトガニ法、”Ｅ−ｔｏｘａｔｅ” Ｓｉｇｍａ）および２３．３７°Ｃでの無菌性を試験した。

これを２〜８℃で保存した（１８日間３７℃に保存しても全く溶解しない、屈折 率による）。凍結したり、４５℃を越えて加熱してはならない。凍結しなければ 凝集は生じない。非希釈懸濁液はほとんど沈降せず、容易に再懸濁した。注射用 γ−イヌリンは、多用量充填を可能にするため２０μｇ／−のフェニル水銀硝酸 塩、ＰＭＮ［Ｆｌｕｋａ、　ＢｕＣＭ、　９Ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、再結晶しく 英国薬局方、１９８０）、ｚｅｔａｐｏｒ濾過〕を含有する０、８％ＮａｃＪ　 １−につき、微粉化、不溶性γ−イヌリン５０りを含む、滅菌された、ＢＴを含 まない（＜６βｇＩＴ／＋＋ｖ）懸濁液である。γ−イヌリン（５０＋ｖ／丁ｄ ）はＰＭＮの抗菌作用により影響を受けなかった。この懸濁液は５°Ｃで少なく とも２２力月間安定である。

θ、　γ−イヌリンの性質 注射用γ−イヌリンの電子顕微鏡写真（リンタングステン酸塩染色）は、径０． ７〜１．４μｍの卵形を示した。

分子量の測定は、ＰＢＳ上ゲルクロマトグラフィーカラムによって実施した。標 準ポリサッカライドマーカーでＢ１０ｇθＩＦ−３Ｑカラムを較正すると、γへ イヌリフ（ｒ）ピークは８，５００〜１０．ｏｏｏ（中央値約９．３０１：Ｍを 示し、これはヘキソース５２〜６５に和尚した。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０ カラムではγ−イヌリンの分子量は約９．３００であった。

ｆ、　イヌリンの溶解型、イヌリンの多形型の不安定性によって生じる問題点は 、３７℃でキュベツト中にく１η／−微粉末イヌリン懸濁液により濁度（０，Ｄ 、。

７　Ｑ　Ｑ　ｎｍ）を低下させることにより解決した。これはＩｎ　’　ｖｉｖ ｏでの溶解速度の評価になる。懸濁液をピペットで取って再懸濁し、短時間放置 したのち比色計の値を読み取る。こうすると異なるプレバレージョンの濁度曲線 は第１図に示すように一定した様式に変化することが明らかにされた。

濁度の変化は再現性を示し、明瞭で、少なくとも以下の型を確定するだめの便利 な検知手段となる（α”および１β”の命名法については、ＭＯＤＯｎａｌ（１ ，Ｅ、、Ｊ。

（１９４６）　＋　ＡａＶ、　ａａｒｂｏｈｙｄ−ｃｈｅｒｎ−＋　２＋　２５ ３〜２７７参照）。

１、　β２３イヌリン（２６℃で急速に溶解）２、　β３フイヌリン（２３℃で は徐々に、しかし６７０Ｇで急速に溶解） ３．４および５．　α３７．α３．およびα３フイヌリン（濁度がプラトーにな るまでのハーフタイムによる溶解性はそれぞれ、２〜４，８および１５分、３７ °Ｃ）６、　γ−イヌリン（３７℃でわずかなまたは検知できない溶解性） ｇ、　γ−イヌリンの毒性 １群５匹のマウスに精製γ−イヌリン２５キな３回、９日間を１クールとして投 与した（計２．５９　／ｋｇ）。

外見上の障害は認められなかったが、１０日間後に層殺したところ肝臓および膵 臓の肥大がみられた。２５確／時の静脈内投与で動物に１５〜２０分間虚脱状態 を生じたが以後完全に回復した。この投与経路でのＬＤ５　ｏはマウスで約１０ ０■／に９と算出された。

この定量は、ＥＧＴＡ／Ｍｇ２＋緩衝液に希釈したマウスまたはヒト血清中ＡＰ Ｏが、ウサギ赤血球（ＲＢＯ）を特異的に分解する既知の能力に基づくものであ る。ＡＰＯの活性化で、速やかに分解する不安定な反応性中間体を発生する。す なわちＡＰＯ活性化体は血清中のＡＰＯを分解し、以後添加したウサギＲＢＯを 分解できない。

失われた分解活性の量が活性化体の社を反映する。この定量法の詳細は、Ｃｏｏ ｐｅｒ、Ｐ、Ｄ、＆　Ｃａｒｔｅｒ、Ｍ。

（ｉ　９　８　＜５　）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　工ｍｍｕｎｏ１０ｇｙｌ　２　 ３　＋　８　＋８９５〜９０１および９０６〜９０８に８己載されているので、 本明細書に参照として導入する。

１、　工ｎ　ＶｉｔｒＯ活性化 ＥＧＴＡ／Ｍｇ”＋緩衝液中に希釈した血清の標準化部分を、段階的用量の活性 化体を加えて３７℃で３０分間インキュベートする。ついで活性化体を遠心分離 して除き、上清の標準量を、標準時間、既知数の洗浄ウサギＲＢＣとともに３７ °Ｃで再インキュベートする。活性化の量を、６４０ｎｍの光学密度で定量化し た非分解細胞の量として測定する。

２、　工ｎ　ｖｉｖｏ活性化 各時間群ごとに６〜４匹のマウスを１群とし、段階的用量のγ−イヌリンを腹腔 内に接種し、各時間後にマウスを層殺し、血液を採取し、血清をプールする。

公知の操作を用い、完全な活性な保持させるように注意を払う。これらの血清の ＥＧＴＡ／Ｍｇ２＋緩衝液への一連の希釈液の標準量を、標準時間、６７℃で基 準数の洗浄ウサギＲＢＯとインキユベートシ、同じバッチの非処置マウスから同 時にプールした血清の同様な希釈液と比較する。活性化の量を６４０　ｎｍの光 学密度で定量化した非分解細胞の量として測定する。

ｂ、抗腫瘍活性、γ−イヌリンのマウスにおける抗腫瘍活性の詳細は、Ｃｏｏｐ ｅｒ、　Ｐ、Ｄ、＆　ｃａｒｔｅｒ、　Ｍ。

（１９８６）　、　ＭＯ’１ｅｃｕｌａｒ工ｍｍｕｎｏ１０ｇｙ＋　２３　＋　 ８　＋９０３〜９０８に記載されている。この記載を参考に本明細書に導入する 。

マウス黒色腫細胞を５％ウシ胎仔血清を補給したＤＭＢＭメジウム（いずれもＧ ｉ’ｂｃｏ、　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、）中で生育させた。培養 液を７日ごとに１＝８に分割し、７５−ｃ７ｒＬ２フラスコあたり１〜１．５Ｘ １０７個の細胞を生成させ、新たに収穫したＩ　Ｘ　１０’個の細胞を０．２− ＰＢＳ中に取り、前述のようにしてマウスに腹腔内、接種した（ｃｏｏｐｅｒ、 　Ｐ、　Ｄ、＆　Ｍａｓｉｎｅｌｌｏ、　Ｇ、　Ｒ，、工ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎ ｃｅｒ。

３２．７３７〜７４４．１９８３）。すべてのプレバレージョンは腹腔的投与し た。どの用量でも動物に障害の徴候は認められなかった。各マウスの生存時間を 毎日記録し、平均生存時間の有意差は５ｔｕｄｅｎｔのｔ検定で計算した。マウ スはすべて、性、週齢が合致した０５７ＢＬ／６Ｊを用い、試験サンプルはそれ ぞれ７匹のマウス群で試検し、コントロールとしては各１４〜２１匹のマウスを 使用した。

γ−イヌリンは、マウスまたはヒト血清中２〜８μｇ　／　７！、　ｉｎ　Ｖｉ ｔｒＯで、強力なＡＰＯの活性化剤である。この活性は既知の最も強力な活性化 剤に匹敵するオーダーの活性である。

第２図の左は、ヒト血清ＡＰＯのγ−イヌリンによるｉｎ　ＶｉｔｒＯ活性化の 試験と同時に、他のよく知られた２種の活性化剤、ザイモサンとＳ　Ａ　Ｏ（Ｓ 　ｔ　ａｐｈｙＩＯＣＯ−ものである。

第２図の右は、数種の型のイヌリンについて、同じ方法を用いヒト血清のＡＢＣ 活性化能を比較したものである。マウス血清でもほとんど同じ結果が得られた。

マウスに腹腔的投与した場合、イヌリン注射２〜１６時間後に集めた血清中のｉ ｎ　ｖｉｖｏでのＡＰＯ活性化は、イヌリン５０μｇ（２，５Ｗ／ｍ）の最小用 量ですでに検知できるものであった（第３図）。この濃度は、イヌリンによるｉ ｎ　ＶｉｔｒＯＡＰＣ活性化の最小用量に匹敵する（第２図）。

古典的補体経路は影響されなかった。

ｂ、抗腫瘍活性 第４図は、第０日ｆｃ１１１６黒色腫細胞を腹腔内に接種した０５７黒色マウス のγ−イヌリン治療後における生存時間の延長を示す曲線である。マウスには、 第１日にγ−イヌリン１５μｇを腹腔的投与し、第４日に再び後接種（ｐ、１． ）を行った。

考察 γ−イヌリンがＢＩ３黒色腫細胞に対し強力な抗腫瘍作用を有することが明らか にされた。処置マウス哄１■／ｋｇの低用量で、平均生存時間に５５％の増加が 認められた。丁なわち、　ｉｎ　ＶｉｔｒＯおよびｉｎ　ＶｉＶＯでＡＰＣの活 性化を与える最低用量は、最小有効抗腫瘍用量とよく一致している。この作用は ５グ／マウス（２５０Ｔｎｇ／１Ｋｇ）という高用量でも失われない。イヌリン のもつと溶解速度の速い型でも（αおよびβ）同は妨害されてしまう。イヌリン を６０〜７０°に短時間加熱して溶解すると、そのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＰＯ活 性化およびそのｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍作用が同時に消失するが、低温度で再結晶 すると作用が再現する。この効果とその低用量と高純度の要求から活性成分が粒 子状イヌリンであることが確認される。

非特異的活性免疫療法の現在の知識から、本発明のプレバレージョンの至適投与 はできる限り腫瘍に近く行われる方が好ましいようである。すなわち、腫瘍内お よび静脈内経路、局所と全身処置の口み合わせで行われる。体腔内（腹腔内また は胸郭内）経路が、とくに滲出液に対して有用であることが期待され、数時間以 内に血中のＡＰＯの活性化に移動する。筋肉内、皮下および皮肉接種は中等度の デポ効果をもつようであり、とくに罹患リンパ節の治療にはγ−イヌリンはそこ に排出される傾向があるので有用である。これらの経路では、マウス、ネコまた はイヌでは肉芽腫の生成はみられなかった。経口的に投与するとイヌリンは多分 消化されてしまうが、遅延放出処方とすれば腸粘膜に達して有用と考えられる。

局所適用も有効と期待される。感受性の腫瘍型は不明であるが、直接イヌリンと 接触可能で、たとえば血中または血液の供給のよい腫瘍の方が感受性が高いと考 えられる。患者は免疫能力をもつから、その最も適当な補助療法として、細胞毒 物また放射線による治療と同様に注意深く評価すべきである。時期および投与量 を決定する前に、ヒトにおけるＡＰＣ活性化の最大安全度を確認すべきである。

このような活性化は、多分２４〜４８時間で正常レベルに戻ると考えられ、第二 経路の自然の再生が許す限り反復する必要があると考えられる。最初は次の用量 、すなわち成人の場合、１４日ごとに５〜５ｏ〜、約半量を静脈内もしくは皮下 に、半量を腫瘍内に投与するのが有効である（参考のために、溶解したイヌリン の通常の用量は最初、静脈内６ｇと以後数時間に７ｇである）。腎透析患者によ って耐えられるＡＰｃ活性化速度から、静脈内に投与されるγ−イヌリンの総用 量はきわめて徐々に、たとえば５７：！４／１０分で、多分、希釈剤型としてま たは微小ポンプによって投与する。

ＡＰＯの活性化の程度は注意深（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験によってモニターする必 要がある。イヌリンの投与量は、検知可能で非毒性のＡＰＣ活性化が認められる まで注意深く増量する。各種の他の免疫学的パラメーターたとえばマクロファー ジ、ＴおよびＢｉ胞の活性化および天然キラー細胞の活性も追跡することが望ま しい。

ヒトに考えられる主要な副作用は、第二経路の主としてアナフイラトキシン０３ 　ａおよびＱ５ａを介する直接、急性の活性化によるものである。ヒトの場合Ｑ ５ａがある血中レベルを越えると、結果は不可逆的と思われ、たとえば顆粒球検 子から、他の望ましくない作用を生じる。ヒトにおける溶解性イヌリンの研究に よれば、１０〜１４％のＡＢＣ活性化は臨床的に注目されるものはなく経過する ことが明らかにされているが、他の腎透析患者では透析膜による活性化生成物０ ３　ａ　ｄｅｓＡｒｇの８．５μｇ／−以上の生成により望ましくない臨床症状 を生じたと報告されている。

γ−イヌリンは、イヌリン粒子がその体循環を通過できる内部または外部生体表 面に適用して有用であることも考慮されている。また、外傷部または内部の分泌 物の多い表面に存在するγ−イヌリンは、白血球な活性化し、白血球はついでそ の免疫的影響を発揮するために生体内を移動すると考えられる。これらの目的に は、γ−イヌリンは局所的にもしくは皮膚に適用するか、適当な遅延放出ビーク ル中に入れて胃を通過させて腸粘膜上で遊離させるか、またはその他のビークル たとえば半割、滴剤またはエアゾルに入れ、直腸、膣、鼻腔、咽喉、眼または上 部および下部気道に挿入することができる。

γ−イヌリンは室温では安定で、通常の医薬的に許容される処方、ビークルおよ びプレバレージョン中に供給できる。すなわち、乾燥粉末剤または蒸留水、食塩 水もしくは等張性溶液中のＷ！Ａ濁液とすることができる。防腐剤を加えてもよ い。濾過して容易に滅菌でき１エントドキシ／を含まない注射用製剤とすること もできる。

γ−イヌリンは安価に利用できるので、ヒトへの適用と同様に、動物用にも適し ている。

γ−イヌリンの活性は、免疫系に対して単一、明瞭なシグナル、すなわち補体第 二経路（ＡＰＯ）の活性化を付与する。このシグナルの純粋化は望ましくない副 作用の除去に重要である。しかしながら、免疫系は著しく複雑であり、常に自然 の、刺激性実体からの多数の様々の免疫シグナルに応答している（たとえば、有 害な微生物もしくは寄生虫、癌細胞をと（に挙げることができる）。生体が多数 の各種外来性刺激に対する強力な応答を発揮するのは、このようなシグナルの相 互作用による。したがって、γ−イヌリンが他の免疫刺激シグナルとの相剰作用 によりその最も強力な効果を達成すると期待するのが自然である。

γ−イヌリンの最も重要な適用は、抗原または抗原の反応性領域（そのエピトー プ）の三次元構造を免疫学的に模倣する物質のエンハンサーまたは免疫アジュバ ントである。これらの物質はそれ自体では抗原性が弱いことが多い。これらは、 注意深く設計されたペプチド配列であり、また抗特殊型免疫グロブリンである。

後者はその誘発抗原として、最初の抗原によって誘発された免疫グロブリンの特 殊型（エピトープへの結合領域）を有する。最初の抗原にそれ自体相補的な構造 に相補性であることにより、抗特殊型はその抗原に三次元構造が類似している。

γ−イヌリンは、ワクチンのアジュバント活性を有することが明らかにされた。

この例としては、マウスに接種された抗原（ウシ血清またはキーホールリンペッ トヘモシアニン）は、それ自体よりもγ−イヌリｙとの混合物を与えた方が実質 的に多くの抗体を誘発する。マウスの群に各ゾレパレーションを注射し、平均抗 体濃度をμｇ／＋ｎｌで放射免疫定量法またはＥＬＩＳＡで測定した。ひとつの 試験では、γ−イヌリンと抗原の混合物によって誘発された抗体濃度は抗体単独 で誘発された場合の６．２倍であった＜　ｐ＜０．００１　）。一方、７０イン ドの完全アジュバント（既知の強力なアジュバントであるが、ヒトへの適用には 毒性が強丁ぎる）と乳化した抗原によって誘発された抗体は抗原単独の場合の１ ０．４倍であった（　ｐ＜０．００１　）。

γ−イヌリンと相剰的に作用すると考えられる他の免疫修飾物質は、 ａ、　インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子および、包括的にリ ンホカインまたはサイトカインとして知られている多く　０）池の確認された免 疫刺激因子： ｂ、　レバミゾ−・ルのような胸腺細胞刺激剤、または数種の胸腺刺激ホルモン 、その−例としてサイモシン；Ｃ０マクロファージ刺激剤、たとえばムラミルペ プチドまたは他の細菌成分： ｄ、エンドトキシン： θ、完全微生物 等である。

このような相剰効果の例を示せば、粗インターフェロンと粗腫瘍壊死因子の混合 物をγ−イヌリンとともに、予めＢ１（５黒色腫を接種したマウスに注射したと ころ、γ−イヌリンまたはリンホカン単独（いずれも延命効果は示さない）に比 して〉３０％の平均生存期間を示した。さらに重要なことは、γ−イヌリンとリ ンホカインで約３０％のマウスにおいて腫瘍が完全に消失したことである。この ような所見はこの系では稀である。同様な結果は胸腺細胞刺激剤スクシニルコン カナバリンＡで得られている。

ｒ−イヌリンのような免疫刺激剤は、免疫成分に関するヒトまたは動物の任意の 疾患に有効と考えられる。

癌細胞は免疫系により、生体に対して異物または非自身として認識される。マウ スのモデル癌に対する上述のγ−イヌリンの有効性、および他の免疫修飾物質と の相剰作用は、ヒトおよび動物の癌に対する適用の拡大が期待できる。

本発明の利点の範囲は次のとおりである。正常細胞が完全に悪性の細胞に変化し ていく発癌過程は、ヒトでは長年にわたって進んで行くことが知られている。

最終的な罹病には通常気づかれないこの過程で、障害された細胞は徐々（Ｃ増殖 し、いくつかの段階を経る。

この間には、増殖細胞はまだ完全には悪性ではないが、免疫系には異常または非 自身として認識されている。

このような場合に免疫刺激の増強が必要であり、そうでないと生体免疫防御によ る検知を逃れる運命になる。

したがって、発癌過程における、副作用の無視できる免疫刺激剤、たとえばγ− イヌリンによる処置は、前悪性細胞を除去し、完全な悪性増殖細胞のその後の発 現の磯会を低下させることになる。すなわち、他の免疫修飾剤を併用または併用 しないでγ−イヌリンの投与を、危険な対象（たとえば年齢４０歳以上および／ または高い危険因子をもつ人）に定期的にたとえば６年間隔で行えば、地域社会 における悪性疾患の発現率を低下させることが可能と考えられる。

微生物、寄生虫の感染、とくに慢性的経過をたどる場合には、γ−イヌリンを他 の免疫修飾剤と併用してまたは併用しないで使用した適切な処置により、感染を 撲滅できる。他の免疫異常、たとえばアレルギーもしくはりウマチ性疾患、免疫 不全疾患、免疫系の異常が関与する神経学的または胃揚疾患にも同様に応答する ことが可能である。

以上説明した本発明が、その概念から逸脱することなく、改変および変更が可能 なことは、本発明の技術分野における熟練者には自明のとおりである。

３７°Ｃ１こ一コ゛りしす６時Ｃ（）（ミ至）巷ゴトＥ　４山至ＲＢｃＣ全イ／ ＄１こ文４７５％）ＡＰＣ溶血ｈイ６（正常血清ｌこ支↑す、３％）生？′ｉ／ −ｆ６袴Ｚ 手続補正書（自船 ｐａＴ／ＡＵ８６１００３１１ 、発明の名称 免疫治療方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所 氏　名　デ　オーストラリアン　ナショナル　ユニバージティー（名　称） ５、補正命令の日付 昭和　年　月　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．γ多形型のイヌリンまたはイヌリン誘導体の粒子からなる組成物において、 その粒子は３０℃を越える水性メジウム中への溶解速度が低いことを特徴とする 組成物 ２．粒子は３７℃を越える水性メジウム中への溶解速度が低いことを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の組成物 ３．イヌリンまたはイヌリン誘導体の分子量は３，０００以上、好ましくは８， ０００以上であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物４．（ａ） 分子量は約８，０００から約１６，０００の範囲であり、（ｂ）３７℃で水にほ とんど不溶であることを特徴とするγ−イヌリンの粒子からなる請求の範囲第１ 項に記載の組成物 ５．γ−イヌリンは径＜１μｍの粒子の安定、純粋な懸濁液の剤型である請求の 範囲第４項に記載の組成物 ６．イヌリン誘導体はβ−Ｄ−〔２−１〕ポリフラクトースまたは遊離のヒドロ キシル基がエーテル化もしくはエステル化されているイヌリンである請求の範囲 第１項に記載の組成物 ７．活性成分がγ多形型のイヌリンまたはイヌリン誘導体の粒子であり、その活 性成分は３０℃を越える水性メジウム中への溶解速度が低く、活性成分が医薬的 に許容される希釈剤または担体、および所望により医薬的に許容される防腐剤と 配合されていることを特徴とする、補体第二経路の活性化または抗腫瘍処置のた めの免疫治療用製剤 ８．活性成分はγ−イヌリンの粒子である請求の範囲第７項に記載の製剤 ９．担体または希釈剤は、滅菌された水性ビークルである請求の範囲第７項に記 載の製剤 １０．水性ビークルは等張性溶液である請求の範囲第９項に記載の製剤 １１．注射用製剤に適した剤型である請求の範囲第７項に記載の製剤 １２．経口、直腸、膣内、局所、鼻腔内または眼内投与に適した剤型である請求 の範囲第７項に記載の製剤１３．第二の活性成分として免疫修飾物質をさらに含 有する請求の範囲第７項に記載の製剤 １４．免疫修飾物質は、予防接種抗原、抗原性ペプチド配列、または抗特殊型免 疫グロブリンである請求の範囲第１３項に記載の製剤 １５．免疫修飾物質は、インターロイキンもしくはインターフェロンもしくは腫 瘍壊死因子または他のリンホカイン、または胸腺細胞刺激物質もしくは他の胸腺 刺激ホルモン、ムラミルペプチドもしくは他の微生物成分、または完全微生物、 またはエンドトキシンである請求の範囲第１３項に記載の製剤 １６．ヒトもしくは動物生体内の補体第二経路の活性化、またはヒトもしくは動 物生体における抗腫瘍処置のための請求の範囲第７項に記載の免疫治療用製剤の 使用 １７．ヒトまたは動物生体の癌の治療またはそれらにおける現実のもしくは可能 性のある前癌状態の治療のための請求の範囲第７項に記載の免疫治療用製剤の使 用 １８．ヒトまたは動物における細菌、マイコプラズマ、菌類、ウイルス、原虫類 もしくは他の微生物の感染、または寄生虫の感染の治療のための請求の範囲第７ 項に記載の免疫治療用製剤の使用 １９．ヒトまたは動物におけるアレルギー性疾患、または一次性もしくは二次性 免疫不全疾患、またはリウマチ性疾患、または神経学的疾患、または胃腸疾患、 または他の免疫系不全が関与する疾患の治療のための請求の範囲第７項に記載の 免疫治療用製剤の使用２０．ヒトまたは動物における免疫修飾物質の投与に除し ての免疫応答エンハンサーとしての請求の範囲第７項に記載の免疫治療用製剤の 使用 ２１．ヒトまたは動物における予防接種抗原、抗原性ペプチド配列または抗特殊 型免疫グロブリンの投与に際してのアジユバントとしての請求の範囲第７項に記 載の免疫治療用製剤の使用 ２２．（ａ）粗製イヌリンを水から３７℃より十分低い温度で再結晶して、懸濁 された微粉末粒子を得、（ｂ）この懸濁液を約２５〜４５℃の範囲の温度に約１ 〜３日間加熱し、（ｃ）この懸濁液をさらに約４０〜５５℃の範囲の温度に約０ ．５〜１．５時間加熱し、（ｄ）このようにし形成した不溶性γ−イヌリンを懸 濁液から単離する各工程よりなる、粗製イヌリンからγ−イヌリンを製造する方 法