JPS63502003A - 耐熱非苦味水溶性ペプチド生成物の製造方法、該方法により生産される生成物、並びに該生成物を含有する栄養物、飲食物及び規定食 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 耐熱非苦味水溶性ペプチド生成物の製造方法、該方法により生産される生成物、 並びに該生成物を含有する栄養物、飲食物及び規定資本発明は、乳清タンパク（ 乳漿たんばく）物質からの耐熱非苦味易水溶性ペプチド生成物の製造方法に関す る。

本発明の方法により生産されるペプチド生成物は、栄養物及び飲食物中のタンパ ク質補助物及びタンパク質代替物として並びに規定食の成分として使用すること ができる。

近年では、かかる目的のためにペプチド生成物を製造することに対し関心が高ま ってきているが、これらの生成物は中性的な味を有し、非苦味、易水溶性かつ耐 熱性でなければならない。乳清タンパク質は非常に望ましい含有率で必須アミノ 酸を含有しており、安価でかつ大量に容易に入手されることから、上記目的のた めに乳清タンパク質からペプチド生成物を製造するための方法は特に商業的な関 心を与える。

様々なこのような方法が提案されている。

米国特許第４，１０７，３３４号明細書は、タンパク質の５０％が沈降するまで 乳清タンパク質が加熱処理に付されることによる可溶性ペプチド生成物の製造方 法について開示している。ラクトアルブミンと称される沈降した乳清タンパク質 は、穏和なタンパク質分解性酵素的加水分解に付されて加水分解産物をもたらす が、この場合にタンパク質の大部分は可溶性ペプチドに分解される。

次いで加水分解産物は使用されたプロテイナーゼを不活化させるために加熱処理 される。しかしながら、ラクトアルブミンを製造しかつブロティナーゼを不活化 するための上記加熱処理の利用は、重要な硫黄アミノ酸の損失、望ましくないフ レーバーの発生、及びラクトース存在下においてアレルゲン性である場合が多い メイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反応生成物の形成を伴う〔例えば、オータニ、 エッチ及びトキツ、エフ、１９８２年、日本、ジャーナル壷オン、ズーテクニカ ル・サイエンス、第５３巻、第３４４頁（Ｏｔａｎｌ、Ｈ，ａｎｄ　Ｔｏｋｉｔ ｚ、Ｆ、１９８２．Ｊａｐａｎ、Ｊｏｕｒｎ−ａｌ　ｏｆ　Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉ ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、５３．ｐａｇｅ　３４４）及びマツダ、チー ら、１９８５年、ジャーナル・オン・フード・サイエンス、第５０巻、第６１８ 頁（Ｍａｔｓｕｄａ、Ｔ　ｅｔａｌ、　１９８５．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏ ｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、５０．ｐａｇｅ　８１８）参照〕。

米国特許第４，２９３，５７１号明細書も同様に、例えば酵素的加水分解次いで 加熱処理により乳清タンパク質からペプチド生成物を製造する方法について開示 している。限外濾過後に得られるペプチド生成物は、上記加熱処理生成物に関連 して前記と同様の欠点を生じるよう欧州特許出願第０．０６５，６６３号及び０ ．０２２，０１９号明細書は、タンパク質含有食物を消化及び／又は吸収する能 力を低下させ又は欠いた患者用の特別食において使用される予定であるアミノ酸 残基５個以下の小ペプチドから実質上なるペプチド生成物の乳清タンパク質酵素 的加水分解による製造方法に関する。

即ち、欧州特許出願第０．０６５，６６３号明細書は、アミノ酸、ジペプチド及 びトリペプチドの混合物を少なくとも５０重量％含有しかつ１０個以上のアミノ 酸を含むポリペプチドを２５重量％以下でしか含有しないペプチド生成物に関し 、一方欧州特許出願第０．０２２．０１９号明細書は、少なくとも５０％のペプ チドが２〜５個のアミノ酸残基を有し、遊離アミノ酸部分が１５％未満であるペ プチド生成物に関する。

加水分解された場合、大半のタンパク質は苦味のあるペプチドを生じる傾向を有 するが、苦味は１０個未満のアミノ酸、特に４〜８個のアミノ酸を含む短鎖ペプ チドの場合に最大となる。したがって、１０個未満のアミノ酸を有するペプチド の含有率が高いペプチド生成物は非常に苦い味を呈するであろう。疎水性アミノ 酸は苦味を呈し、様々な極性アミノ酸は塩味を呈するという事実に鑑みれば、遊 離アミノ酸含有率が高いということは味の面で同様に問題を生じるであろう。し かも遊離アミノ酸含有率が高い場合は高い容量オスモル濃度の生成物を生じてし まい、かかる生成物からの液体の吸収を妨げることになる。

上記の点から、欧州特許出願第０．０６５，６６３号及び第０．０２２，０１９ 号明細書に開示された生成物は、非常に限られた適用分野、即ち胃腸機能不全の 患者用の特別食の製造向としての用途しか有さないのである。

苦味を消失させるための様々な方法が示されてきた。

苦味ペプチドは通常疎水性であり、このことは有機溶媒による抽出又は活性炭、 ガラス繊維もしくは他の疎水性物質への吸着によって苦味ペプチドを選択的に除 去するために利用されうる。

米国特許第４，０７５，１９５号明細書は、フェノール置換樹脂に吸着させる方 法について開示している。

しかしながら、上記方法は、ある種の必須疎水性アミノ酸の損失を伴い、かつ使 用される吸着剤が大量の有機溶媒で再生されねばならないという欠点を有してい る。

英国特許第１，３３８．９３６号明細書は、苦味ペプチドがエキソペプチダーゼ によって分解されることからなる方法について開示している。しかしながら、上 記分解の結果、上記のように望ましくない高含有率の遊離アミノ酸を有するペプ チド生成物を生じてしまう。

上記から明らかなように、乳清タンパク質の酵素的加水分解により得られる従来 のペプチド生成物は、フレーバー及び／又はアミノ酸組成に関して欠点を有する 。

したがって、乳清タンパク質の酵素的加水分解により得られかつ上記欠点を有さ ない耐熱非苦味易水溶性ペプチド生成物の製造方法を提供することが、本発明の 目的である。

驚くべきことに、カゼインが１種以上のブロティナーゼによって除去された乳清 タンパク質物質の加水分解により苦味のないペプチド生成物が形成されることが 証明された。

即ち、上記目的は下記工程： ａ）乳清タンパク質物質からカゼインを除去する、ｂ）　ａ）で得られた無カゼ イン乳清タンパク質物質を少な・くとも１種のブロティナーゼで加水分解する、 ｃ）　ｂ）で得られた加水分解産物を２０，０００ドルトン以下のカットオフ値 をもつ膜により限外濾過し、次いで炉液を回収する、 続いて、所望であれば炉液を濃縮及び／又は乾燥する、ことからなることを特徴 とする本発明の方法によって達成される。

出発物質として用いられるカゼイン含有乳清タンパク質物質は、甘味乳清もしく は酸味乳清、乳清濃縮物及びその限外ン濾過もしくは熱変性により得られる乳清 タンパク質濃縮物（ラクトアルブミン）のような乳清タンパク質（本出願におい ては、カゼイン以外に乳清中で利用可能なタンパク質として定義される）（チー ズ製造又は工業的カゼイン製造に際してのカゼイン沈降後の液相）を含有したい かなる乳清物質であってもよい。

乳清中の残余カゼイン含有量は典型的には総タンパク質含量中の（乾燥重量ベー スで）約３０％を占める。

水相中で懸濁複合物として存在するカゼインは、本発明の方法の態様において、 カゼイン粒子が留まる一方で乳清タンパク質がフィルターを通過するような孔径 を有する膜によりカゼイン粒子を消去することにより、乳清タンパク質から除去 される。

軍には、カゼインは、本発明の方法の更に好ましい態様において非加熱処理乳清 から、酸の添加と同時にＣａ　Ｃｌ　２の添加によりそのｐＨ値を実質上カゼイ ンの等電点たる４．５〜５．０に調整し、次いで混合物を少なくとも１時間３０ 〜５０℃、好ましくは４０℃に保つことによって除去され得ることが証明された 。かくして沈降したカゼインは濾過又は遠心分離によって容易に分離される。例 えばウエストファリア（Ｗｅｓｔｒａｌ　１ａ）セパレーターでの遠心分離が大 規模の場合には好ましい。酸としては例えばＨＣＩが使用される。

添加されるＣａ　Ｃ１２量は１〜２５ｇ／１００ｇの範囲であることが好ましい 。この態様において、乳清タンパク質は変性を伴う加熱処理及びこれによりカゼ インと一緒に沈降する乳清タンパク質の沈降に供されなかった、ということが重 要である。

しかも驚くべきことに、バシルス・スブチリス（Ｂａｃ−ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ ｉｌｊｓ）由来の中性のメタロプロテイナーゼ〔ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａ ｓｅ）　、ノボ・インダストリＡ／　Ｓ　（Ｎｏｖｏ　ＩｎｄｕｓｔｒｉＡ／Ｓ ）　、デンマーク〕はカゼインに対して高い活性を有するものの、天然及び熱変 性乳清タンパク質に対しては全く又は非常に弱い活性しか有さないことが判明し た。したがって、カゼインは乳清タンパク質から、カゼインをバシルス・スブチ リス由来の中性メタロブロティナーゼで加水分解することにより除去されること が、証明された。加水分解はｐＨ４〜９、好ましくはｐａ’７．５でかつ３０〜 ６０℃、好ましくは５０℃の温度で行なわれる。加水分解は、終了するまで、即 ち総タンパク質量中の４％が加水分解されるまで行なわれることが好ましい。ニ ュートラーゼ及び乳清タンパク質の使用量割合は臨界的ではないが、それは酵素 量は単にどれほど所望の程度の加水分解が迅速に達成されるかを決定するだけに しかすぎないからである。

カゼイン分解生成物は限外濾過又は遠心分離によって除去される。乳清タンパク 質が加熱処理により沈降した場合には、カゼイン分解生成物はそれらを通過させ る孔径を有する膜での限外ン濾過により又は遠心分離による上澄として除去され る。乳清タンパク質が穏和な又は非加熱処理にのみ供され、したがって天然タン パク質のまま実質上存在する場合には、カゼインは２０，０００以下のカットオ フ値を有する膜での限外か過によって除去される。

カゼインが乳清タンパク質から除去された後、これは好ましくは、２０，０００ 以下のカットオフ値を有する限外濾過膜での濾過によって例えば５％のタンパク 質含量となるまで濃縮される。これによって、好ましくは０．１％以下のラクト ース含量を達成するまでラクトースを分離し、かつ無うク、ドースで低い容量オ スモル濃度のペプチド生成物を得るために望ましい利用可能な塩を得ることがで きる。。

得られた無カゼイン乳清タンパク質物質の本法の工程ｂ）による加水分解は、何 らかのブロティナーゼを用いて行なわれる。加水分解は、例えば継続的又は同時 的に、より多くの異なるブロティナーゼで、かつ場合によりより多くの中間限外 ｉ濾過工程で行なわれてもよい。下記ブロティナーゼを用いることが好ましい： コロラーゼＰ　Ｐ　（Ｃｏｒｏｌａｓｅ　ＰＰ）　（豚パンクレアブロティナー ゼーローム（ＲｈｏｒＡ）　−ドイツ連邦共和国〕ローザイムＰ　４１　（Ｒｈ ｏｚｙ＋ａｅ　Ｐ４１）　（アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｏｒｙｚａｅ）プロテイナーゼージエネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒｅ）　− Ｕ、Ｓ、　Ａ）プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）　［ストレプトマイセス・グリセ ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）プロテイナーゼーシグマ （Ｓｉｇｍａ）） アルカラーゼ２．４Ｌ（Ａｌｃａｌａｓｅ　２．４Ｌ）　（バシルス・リチェニ ホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｉｅｈｅｎｉｆ’ｏｒｍｉｓ）プロテイナーゼ ーノボ・インダストリＡ／Ｓ−デンマーク〕又は トリプシン（ノボ争インダストリＡ／Ｓ−デンマーク）使用される酵素及び乳清 タンパク質の量の割合は臨界的でなく、即ちそのことはタンパク質生成物の組成 又は収率に実質上影響を与えないで、望ましい加水分解度に達するまでに要する 時間に関して重要な事項であるだけだからである。

加水分解はｐＨ値約７．５及び温度約５０℃で行なわれることが好ましい。加水 分解は、好ましくは得られるペプチド生成物中の望ましいペプチド大きさ分布及 び望ましい収率に応じて８〜１８％の範囲の加水分解度に達するまで続けられる 。加水分解度は例えばｐＨスタット法により測定される〔アドラーーニッセン、 ジエイ拳ジェイ・ケム・チク・バイオチクノロ、第３２巻、第１３８−１５６頁 （Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ、Ｊ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、Ｂｉｏｔ−ｅｃｈ ｎｏｌＪｏｌ、３２．ｐａｇｅ　１３８〜１５Ｇ　）参照〕。

本法の工程Ｃ）による限外濾過は、２０．０００ドルトン以下のカットオフ値を 有する膜を介して上記のように行なわれ、その結果膜に堆積した非加水分解又は 不十分に加水分解された乳清タンパク質から無カゼイン乳清タンパク質物質の加 水分解により生じたペプチドを分離することができる。無カゼイン乳清タンパク 質物質の加水分解に際して用いられるプロテイナーゼも上記限外濾過によって捕 捉される。

本発明の方法によれば、任意的に利用される膜は限外濾過膜として使用されるが 、但しそれらは既定のカットオフ値を有していなければならない。一般的に市販 され、高耐性合成ポリマーから作製され、かつ例えば酸又は塩基でその場で洗浄 された膜を利用することが好ましい。

かかる限外濾過膜は、中でも、ＤＤＳ−ＲＯ−デビジョン（ＤＤＳ−ＲＯ−Ｄｉ ｖｉｓｉｏｎ）　、デンマーク、ロータ・ブーラン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎ ｃ　）　、フランス、ロミコン（Ｒｏａ＋１ｃｏｎ）、フランス及びアルファラ バール（Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ）　、スウェーデンから特に市販されている。Ｄ ＤＳ−ＲＯ−デビジョンのＧＲ６１ＰＰ膜は例えばオフカット値２０．０００の 膜として使用される。

カットオフ値約６，０００の限外ン濾過膜を使用することが特に好ましい。

限外か過により得られるン戸液は次いで、本発明によるペプチド生成物を得るた めに、所望であれば濃縮され及び／又は乾燥される。

本発明の方法により製造されるペプチド生成物は、３重量％水溶液中で非苦味で あって、中性味を有し、１００℃で１０分間加熱された後もｐＨ４〜５で十分に 溶解性である。本発明のペプチド生成物は、６未満のアミノ酸からなるペプチド を最大含有率で１５％含有する。

低含有率の遊離アミノ酸及び小ペプチドであることから、それらは更に低い容量 オスモル濃度を有する。

それらの性質によって、ペプチド生成物は規定食における使用に適しており、し かもアミノ酸源として又は栄養物及び飲食物中のタンパク質代替物として、例え ばソーセージ、パイ、アイスクリーム、チョコレート及びレール、ソーダ水等の 炭酸飲料中における競技者用の易代謝性タンパク質補助物としても通常適してい る。

特別な関心は、工程Ｃ）においてカットオフ値６．０００の膜を介する限外か過 に供することにより、本発明の方法によって製造されるペプチド生成物に注がれ ている。上記ペプチド生成物は、牛乳に対しアレルギー性の人のための栄養物及 び飲食物中においてタンパク質代替物として使用されうる。上記ペプチド生成物 は、牛乳清タンパク質又は牛カゼインに対する市販抗体〔ファルマシア（Ｐｈａ ｒｉａｃｉａ）、スウェーデン及びダコ・バッゾ（Ｄａｋｏ　ｐａｔｔｓ）　、 デンマーク〕を用いた免疫電気泳動又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ ）によって抗体結合を示さない。同様に、それらは牛乳清タンパク質又はカゼイ ンに対するネズミ抗体で感作されたマウスにおいて受動的皮膚アナフィラキシ− 反応を誘発しない。

同様に、それらは牛乳に対するアレルギー症が臨床的に十分確認された子供にお いて刺激−消去試験によるアレルギー反応を誘発しない。

本発明の方法は下記例によって詳細に説明されている。

例１ バシルス・リチェニホルミスブロティナーゼ（アルカラーゼ２．４Ｌ、ノボ参イ ンダストリＡ／Ｓ、デンマーク）での加水分解による新鮮なチーズ乳清からのペ プチド生成物の製造 Ｃａ　Ｃ１・２Ｈ２０２０ｇを新鮮チーズ乳清２００．１！に加え、チーズ乳清 を２Ｎ　ＨＣＩでｐＨ４，６に調整した。°次いでチーズ乳清を撹拌下４０℃で ６０分間及び撹拌せずに４０℃で６０分間装いた。この処理によりカゼインを沈 降させ、注意深く取り出された透明乳清を更に無菌布での濾過により清澄化させ た。こうして得られた乳清は実際上カゼインを含有せず、タンパク質含有ｆｆ１ ０．５２％であったが、一方力ゼインの等電点沈降の前におけるチーズ乳清はケ ルタール法で測定したところタンパク質含有量０．７９％であった。無カゼイン 乳清を次いで濃縮し、ＤＤＳ−ＲＯ−デビジョン、デンマークのＬＡＢ２０限外 濾過モジュールの使用によるＧＲ６１ＰＰ膜上での限外濾過及び透析濾過によっ てラクトースを除去した。得られた無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮 物（タンパク質含有量５重量％の１５Ｒ）を５０℃に加温し、４．ＯＮ　ＮａＯ ＨでｐＨ７，５に調整した。次いで加水分解をアルカラーゼ２．４Ｌ　（５，０ ｍｇ）の添加により開始し、加水分解を加水分解度１２％となるまで続けたが、 これは４、ＯＮ　ＮａＯＨでの継続的滴定によりｐＨ値を７．５に一定化しなか らｐＨスタット法に従い測定されたものである。得られたペプチドをそれを通過 させるＧＲ６１Ｐ　Ｐ膜上での限外濾過により非加水分解乳清タンパク質及びプ ロティナーゼから分離した。このようにして限外濾過から得られたペプチド含有 浸透液を凍結乾燥及び脱イオン水への再懸濁によって濃縮した。ペプチド生成物 中におけるペプチド収率は乳清タンパク質濃縮物中のタンパク質含有量の７２％ であった。ペプチド生成物１０％溶液は、１００℃で１０分間加熱した場合であ っても、　ｐＨ４，０〜５．０で完全に可溶性であることが証明された。ペプチ ド生成物３％溶液は中性味を有する。ペプチド生成物中のペプチド分子量分布に 関するバイオゲルＰ−６（Ｂｉｏｇｅｔ　Ｐ−６、バイオラッド−ラプス（Ｂｉ ｏｒａｄ−Ｌａｂｓ）　、フランス膜上でのゲル濾過によるカラムクロマトグラ フィー試験によって、ペプチドの約１７重量％が６０００以上の分子量を有し、 ペプチドの１５重量％が４０００〜６０００の分子量を有し、ペプチドの５９重 量％が１０００〜４０００の分子量を有し、ペプチドの９重量％が１０００以下 の分子量を有することが判明した。

例２ パンクレアブロティナーゼ〔コロラーゼＰＰ、ローム・ケミ−（ＲｈｏＩＩＣｈ ｅｍｉｅ）、ドイツ連邦共和国〕での加水分解による新鮮チーズ乳清からのペプ チド生成物の製造無カゼイン無ラクトースの乳清タンパク質濃縮物（タンパク質 含有量５重量％の１５ｇ）を例１で記載されたように新鮮チーズ乳清から製造し た。

無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物をコロラーゼＰＰ３．Ｏｇの添加 により５０℃ｐＨ８，０で加水分解に供し、加水分解を加水分解度１０％となる まで続けた。ペプチド含有浸透液をＧＲ６１ＰＰ膜上での限外ｉ濾過により調製 し、凍結乾燥ペプチド生成物を例１に記載されているようにして得た。

ペプチド生成物におけるペプチド収率は乳清タンパク質濃縮物中のタンパク質含 有量の４９％であった。ペプチド生成物はｐＨ４，５かつ１００℃で１０分間で 安定であり、３％溶液中で中性味を呈した。

例３ 豚トリプシン（ノボ・インダストリＡ／Ｓ、デンマーク）での加水分解による新 鮮チーズ乳清からのペプチド生成物の製造 無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物を例１で説明したように製造し、 例２で記載されたように加水分解に供した。ＧＲ６１ＰＰ膜上での限外か過によ り得られたペプチド生成物中のペプチド収率は、乳清タンパク質濃縮物中のタン パク質含有量の４２％であった。ペプチド生成物１０％溶液は１００℃で１０分 間加熱された後であってもｐＨ４，５で安定であった。ペプチド生成物は脱イオ ン３％溶液中で中性味を呈した。

例４ アスペルギルス・オリザエプロテイナーゼ（ローザイムＰ４１、ジェネンコア、 Ｕ、Ｓ、　Ａ、　）での加水分解による新鮮チーズ乳清からのペプチド生成物の 製造無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物（タンパク質含有量５重量％ の１５ｇ）を例１で記載されたように製造し、ローザイムＰ４１　１．５ｇの添 加により５０℃ｐＨ７，５で加水分解に供した。加水分解を加水分解度約８％と なるまで続けた。ペプチド生成物をＧＲ６１ＰＰ膜上での限外濾過により浸透液 として得たが、ペプチド生成物中のペプチド収率は乳清タンパク質濃縮物中のタ ンパク質含有量の３９％であった。ペプチド生成物は例１〜３により製造された 生成物として酸媒体中で安定であり、許容可能な中性味を呈した。

ペプチド分子量分布に関するバイオゲルＰ−６によるカラムクロマトグラフィー 試験では、ペプチドの大部分（６０％）が１５００〜２５００の分子量を有する 一方で１０％未満がそれぞれ６０００以上及び１０００以下の分子量を有するこ とが判明した。

例５ での限外か過による新鮮チーズ乳清からのペプチド生成物１００Ｋｇの製造 アルカラーゼ２．４Ｌを使用したが、その理由は例１〜４によるとこのブロティ ナーゼが最大収率を上げることを立証したためであった。

ＣａＣ１・２Ｈ２０４５００ｇを新鮮チーズ乳清４５、　０００４？に加え、チ ーズ乳清を濃ＨｃＩでｐＨ４，６に調整した。５時間放置後カゼインは４０℃で 沈降したが、しかる後ウエストファリアセパレーターでの遠心分離（６５００ｒ ｐｍ）によりそれを除去した。透明乳清（タンパク質含有量０．５６重量％）３ ５．０００ｇを回収し、濃縮し、ＧＲ６１ＰＰ膜上での限外濾過及び透析濾過に よりラクトースを除去した。

無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物を回収し、タンパク質含有量を５ 重量％に調整した。次いで乳清タンパク質濃縮物（ｐＨ７，５）３０００ｇを加 水分解度１２％となるまでアルカラーゼ２．４Ｌ　１．０１での５０℃における 加水分解に供した。

本例では、ｐＨ値はＣａ　（ＯＨ）２、Ｍｇ　（ＯＨ）　２、ＫＯＨ及びＮａＯ Ｈの混合物での連続的滴定により７．５で一定に保ったが、この混合物は塩基強 度に関する限り４．ＯＮ　ＮａＯＨに等しい。上記塩基混合物はナトリウム添加 を制限しかつ同時にペプチド製品にカルシウム、マグネシウム及びカリウムを加 える目的で使用された。加水分解終了後、加水分解産物をＧＲ６１ＰＰ膜上での 限外か過に供し、ペプチド含有浸透液を減圧下で蒸発させ、凍結乾燥した。この ようにして得られたペプチド生成物は例１で得られた生成物にほぼ相当した。

本例における製造プラントの広い空隙容積によると、ペプチド生成物中のペプチ ドの収率は乳清タンパク質濃縮物のタンパク質量の５７％であった。

無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物を例１で記載されたようにチーズ 乳清から製造し、例１で記載されたアルカラーゼ２．４Ｌ、例２で記載されたコ ロラーゼＰＰ又は例４で記載されたローザイムＰ４１による加水分解に供した。

例１〜４とは逆に、本例で得られたペプチドをカットオフ値６０００の膜（ＧＲ ８１Ｐ　Ｐ膜、ＤＤＳ−ＲＯ−デビジョン、デンマーク）での限外濾過により非 加水分解乳清タンパク質及びブロティナーゼから分離した。得られたペプチド生 成物はいずれも免疫電気泳動又はＥＬ　Ｉ　ＳＡによると抗体結合性を示さず、 しかもいずれのペプチド生成物も感作マウスにおいて受動的皮膚アナフィラキシ −反応を誘導しなかった。第１表はペプチド収率、チーズ乳清タンパク質重量％ 及び上記３種のペプチド生成物中におけるペプチドの分子量割合について示す。

第　１　表 使用されたプロティナ　ベブチ　ペプチドの分子量−ゼ　ド収率　３ｐＯＯ−８ ０００１０００−３０００＜１００００アルカラーゼ２．４Ｌ　４４％　２０％ 　６４％　１６％コロラーゼＰＰ　３８％　３３％　４７％　２０％ローザイム Ｐ４１　３９％　１８％　７６％　６％第１表から明らかなように、３種のペプ チド生成物のペプチド収率は例１〜４の収率と比較すると低かった。

低収率は、ＧＲ８１ＰＰ膜が６０００以上の分子量をもつペプチドに対して不透 過性であって約４０００以上の分子量をもつペプチドに対しては若干透過性であ るという事実に起因していた。

無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物を例１で記載されたように製造し た。乳清濃縮物をアルカラーゼ２．４Ｌ、コロラーゼＰＰ及びローザイムＰ４１ の組合せでの加水分解に供し、各々の加水分解を上記２種のブロティナーゼと同 時に行なった。各加水分解は、利用されるプロティナーゼ組合せに応じ１２〜１ ７％の加水分解度に相当する操作が実質上終了するまで続けられた。

ペプチド生成物を例６で記載したようにＧＲ−８１ＰＰ膜での限外か過によって 得た。アルカラーゼ２．４Ｌ（乳清タンパク質６．５ｍｇ／　Ｋ　ｇ　）及びロ ーザイムＰ４１（乳清タンパク質２０ｇ／Ｋｇ）の組合せは、ペプチド生成物中 のペプチドの高収率（７４重量％）及びペプチド生成物中のペプチドの好ましい 分子量分布といういずれの面からみても特に適当なペプチド生成物を生じること が証明されており、分子量分布の面ではペプチドの大部分（約７０％）が１５０ ０〜３０００の分子量を有し、１５％未満が１０００以下の分子量を有していた 。

アルカラーゼ２，４Ｌ及びローザイムＰ４１は、例７におけるこの組合せが最も 適当なペプチド生成物を生じたことから好ましいものであった。

タンパク質含有量５重量％の無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物４０ ００ｇを例５で記載されたように製造した。乳清タンパク質濃縮物を５０℃に加 熱し、Ｍ　ｇ　（ＯＨ）　２、Ｃａ　（ＯＩＴ（）　２、ＫＯＨ及びＮａＯＨか らなる塩基混合物でｐＨ７，５に調整した。加水分解を水２０．ｉｌｌでスラリ ー化されたアルカラーゼ２．４Ｌ１３００ｍＩ及びローザイムＰ４１　４．ＯＫ ｇの添加によって開始した。ｐＨ値を例５で記載された塩基混合物によって一定 に保ち、加水分解を加水分解度１６〜１７％となるまで続けた。次いでペプチド をＧＲ８１ＰＰ膜（膜面積３５ｍ２）での限外濾過により非加水分解乳清タンパ ク質及びブロティナーゼから分離した。ペプチド生成物中のペプチド収率は乳清 タンパク質濃縮物のタンパク質含有量の約６０％であって、ペプチド生成物は例 ７により製造された対応生成物と同等であった。得られたペプチド生成物を臨床 的に牛乳に対するアレルギー症が十分に確認された０〜７オの子供１゜人に毎日 ペプチド補助物（１日１０ｇ）として２が月の実験期間にわたり投与したが、関 与した子供はアレルギー反応症状を全く示さなかった。

限外濾過及び透析濾過、強加熱処理、減圧蒸発並びにスプレードライからなる方 法によりチーズ乳清から製造される乳清タンパク質濃縮物は様々な会社から市販 されている。この場合に利用された乳清タンパク質濃縮物〔デンマーク・プロテ ィンＡ／　Ｓ　（Ｄｅｎｍａｒｋ　Ｐｒｏｔｅｌｎ　Ａ／Ｓ）、デンマーク製う クブロダン−８０（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−８０）　）はタンパク質含有量約８０ ％であって、その約３０〜４０重量％がカゼインであり、ラクトース含有量は１ ０〜１２％であった。乳清タンパク質は変性されているため、粉末を水で混合さ せた場合には不溶性であるが、逆に安定なスラリーが得られる。コントロール実 験において、アルカラーゼ２．４Ｌでのラフプロダン−８０の加水分解により（ 加水分解度−１２％）、非常に苦い味をもつペプチド生成物が得られた。

ラフプロダン−８０に含まれるカゼインをバシルス舎ズブチリスブロティナーゼ にュートラーゼ、ノボ・インダストリＡ／Ｓ、デンマーク）での加水分解により 除・去した： タンパク質含有ｆｆ１５％のラフプロダン−８０の懸濁液１０ｇを５０℃に加熱 し、４．ＯＮ　ＮａＯＨでｐＨ７，５に調整した。カゼインの加水分解をニュー トラーゼ１０ｍ、７７の添加により開始した。ｐＨ値を４．０ＮＮａＯＨでの連 続滴定により一定に維持し、加水分解を、ラフプロダン−８０中のタンパク質の すべてのペプチド結合体に対する加水分解度約４％に相当する操作が終了するま で続けた。次いでカゼイン分解産物及びラクトースをＧＲ８１ＰＰ膜での限外濾 過及び透析濾過により除去した。透析液中のペプチド収率は、ラフプロダン−８ ０中のカゼイン含有量に十分一致する値に相当する２８％であった。タンパク質 は無カゼイン無ラクトース乳清タンパク質濃縮物を構成する残留物中に残留して おり、その中で変性乳清タンパク質は水性スラリーとしてなお存在していた。こ の方法で得られた残留物を次いで例１で記載されたようにアルカラーゼ２．４Ｌ 単独での又は例７で記載されたようにローザイムＰ４１とアルカラーゼ２．４Ｌ との併用での加水分解に供した。しかる後加水分解産物を（例１と同様に）ＧＲ ６１ＰＰ膜又は（例７と同様に）ＧＲ８１ＰＰ膜で限外濾過した。こうして製造 されたペプチド生成物は、苦味の欠如、ペプチド収率及び分子量分布の面で、例 １及び例７に従い新鮮チーズ乳清から製造されたペプチド生成物と実質上同一で あった。しかしながら、例９によるペプチド生成物は、上記生成物の製造過程に おけるラフプロダン−８０の加熱処理によって生じたらしいわずかな焦げつき味 を呈した。

カゼイン及び熱変性乳清タンパク質からなるラクトアルブミンをラクトアルブミ ンの工業的製法にほぼ対応する下記方法に従い新鮮チーズ乳清１００ｇから製造 した：チーズ乳清を２Ｎ　ＨＣＩでｐＨ４，６に調整し、９０℃で３０分間加熱 した。共にラクトアルブミンを構成するカゼイン及び熱変成乳清タンパク質のス ラリーを遠心分離により回収し、タンパク質含有量が５％となるように水に再懸 濁した。コントロール実験として、ラクトアルブミンサンプルをアルカラーゼ２ ．４しての加水分解に供したところ、非常に苦味の強いペプチド生成物を生じた 。このようにして製造されたラクトアルブミン中に含まれるカゼインを例９で記 載されたようにニュートラーゼでの加水分解に供した。ニュートラーゼ加水分解 後に行なわれた限外濾過により、ラクトアルブミン中の総タンパク質量のうちペ プチド収率的３２％の浸透液が得られた。

このようにして製造された無カゼイン無ラクトースラクトアルブミンをアルカラ ーゼ２．４Ｌ単独での又はアルカラーゼ２．４ＬとローザイムＰ４１との併用で の加水分解に供し、ペプチド生成物を例９で記載されたようにして得た。得られ た苦味のないペプチド生成物は、例９に従い得られたペプチド生成物にほぼ相当 した。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１功ＰＣＴ／ＤＫ　８６１００ １２３ ２、発明の名称 耐熱非苦味水溶性ペプチド生成物の製造方法、該方法により生産される生成物、 並びに該生成物を含有する栄養物、飲食物及び規定食 ３、特許出願人 住　所　デンマーク国しドブレ、ロスビベイ　ナンバー　１９氏　名　ボウルセ ン、オツトー　メルヒオル４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内圧丁目２番３号 ５、　補正書の提出年月日 １９８７年４月２３日 ６、　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１　過 補正された請求の範囲 ５、　カゼインの加水分解がｐＨ値４〜９かつ温度３０〜６０℃で行なわれる、 請求の範囲第４項記載の方法。

６、　ラクトアルブミンが乳清タンパク質物質として使用され、しかも工程ｂ） における加水分解前にカゼイン分解産物が遠心分離により分離される、請求の範 囲第４゜項記載の方法。

７、　工程ｂ）における加水分解前に、カゼイン分解産物が約２０，０００ドル トン以下のカットオフ値を有する膜での限外か過により分離される、請求の範囲 第４項記載の方法。

８、　無カゼイン乳清タンパク質物質を加水分解に供する前に、工程ａ）におい て得られた無カゼイン乳清タンパク質物質を濃縮し、及び／又は好ましくは約２ ０．０００以下のカットオフ値を有する限外濾過膜での透析濾過によりラクトー スを特徴する請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一項に記載の方法。

９、　無カゼイン乳清タンパク質が８〜１８％の加水分鰐皮まで加水分解される 、請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに一項記載の方法。

１０、ブロティナーゼとして、豚バンクレアブロティナーゼ、アスペルギルス・ オリザエプロテイナーゼ、ストレプトミセスψグリセウスプロティナーゼ、バシ ルス・リチェニホルミスブロティナーゼ又はトリプシンを用いる、請求の範囲第 １項〜第９項のいずれか一項に記載の方法。

１１、工程Ｃ）における限外濾過が約６０００ドルトンのカットオフ値を有する 膜によって行なわれる、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか一項に記載の方 法。

１２、特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか一項に記載された方法により 製造され、しかもアミノ酸残基６個未満のペプチドの含有量が１５重量％以下で あることを特徴とする耐熱非苦味中性味ペプチド生成物。

国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．カゼイン含有乳清タンパク質物質からの耐熱非苦味易水溶性ペプチド生成物 の製造方法であって、下記工程： ａ）乳清タンパク質物質からカゼインを除去する、ｂ）ａ）で得られた無カゼイ ン乳清タンパク質物質を少なくとも１種のプロティナーゼで加水分解する、ｃ） ｂ）で得られた加水分解産物を２０，０００ドルトン以下のカットオフ値を有す る膜により限外ろ過し、次いでろ液を回収する、 続いて、所望であれば、ろ液を濃縮及び／又は乾燥する、 工程を特徴とする方法。
2. ２．カゼインが、工程ａ）における非加熱処理乳清から、カゼイン粒子が捕捉さ れる一方で乳清タンパク質がフィルターを通過するような孔径、好ましくは約０ ．２μを有するフィルターでカゼイン粒子を分離することにより除去される、請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．カゼインが、工程ａ）における非加熱処理乳清から、酸の添加及び１〜２５ ｇ／１００ｌの範囲内の量のＣａＣ１２の同時添加によりｐＨ値を４．５〜５． ０に調整し、混合物を少なくとも１時間３０〜５０℃に保持し、かくして沈降す るカゼインを分離することによって除去される、請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．カゼインが、工程ａ）における乳清タンパク質物質から、総タンパク質量の 好ましくは約４％の加水分解度に達するまでバシルス・スブチリス由来中性メタ ロプロティナーゼでカゼインを加水分解し、かつカゼイン分解産物を分離するこ とにより除去される、請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．カゼインの加水分解がｐＨ値４〜９かつ温度３０〜６０℃で行なわれる、請 求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．ラクトアルブミンが乳清タンパク質物質として使用され、しかも工程ｂ）に おける加水分解前にカゼイン分解産物が遠心分離により分離される、請求の範囲 第４項記載の方法。
7. ７．工程ｂ）における加水分解前に、カゼイン分解産物が約２０，０００ドルト ン以下のカットオフ値を有する膜での限外ろ過により分離される、請求の範囲第 ４項記載の方法。
8. ８．無カゼイン乳清タンパク質物質を加水分解に供する前に、工程ａ）において 得られた無カゼイン乳清タンパク質物質を濃縮し、及び／又は好ましくは約２０ ，０００以下のカットオフ値を有する限外ろ過膜での透析ろ過によりラクトース を分離する、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．無カゼイン乳清タンパク質が８〜１８％の加水分解度まで加水分解される、 請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．プロティナーゼとして、豚パンクレアプロティナーゼ、アスペルギルス・ オリザエプロティナーゼ、ストレプトミセス・グリセウスプロティナーゼ又はト リプシンを用いる、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか一項に記載の方法。
11. １１．工程ｃ）における限外ろ過が約６０００ドルトンのカットオフ値を有する 膜によって行なわれる、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか一項に記載の方 法。
12. １２．請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか一項に記載された方法により製造 され、しかもアミノ酸残基６個未満のペプチドの含有量が１５重量％以下である ことを特徴とする耐熱非苦味中性味ペプチド生成物。
13. １３．請求の範囲第１２項記載の生成物を含有することを特徴とする規定食、食 物製品又は飲食物。