JPS63502004A - ペプチド製品、その製造方法及びペプチド製品の用途 - Google Patents
ペプチド製品、その製造方法及びペプチド製品の用途Info
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- JPS63502004A JPS63502004A JP62500514A JP50051486A JPS63502004A JP S63502004 A JPS63502004 A JP S63502004A JP 62500514 A JP62500514 A JP 62500514A JP 50051486 A JP50051486 A JP 50051486A JP S63502004 A JPS63502004 A JP S63502004A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ペプチド製品、その製造方法及びペプチド製品の用途本発明は、乳清の加水分解
によるペプチド製品、乳清の限外濾過及び加水分解によるその製造方法並びにミ
ルク又はミルクタンパク質の代替物としてのペプチド製品の用途に関する。
人間においては、アレルギー、即ちミルクアレルギーに関する問題が増えつつあ
り、しかもラクトースを吸収することができない人々が一部に存在している。こ
の問題は、幼児にある理由から母乳が与えられない場合においてミルク及びミル
ク製品が彼らの重要な栄養割合を占めていることから、幼児の場合にあっては特
に重大である。
例えば、酵素的加水分解、熱処理及び限外濾過の併用により、乳清から母乳代替
物を製造することが試みられてきた(米国特許第4,293,571号明細書参
照)。
その結果得られるペプチド類は1,000〜10,000ドルトンの大きさを有
する。 しかしながら、5,000〜10,000 ドルトンのペプチド類がし
ばしばアレルゲン性であることは周知である[例えば、イムノケミストリー、パ
ーガモンプレス、1967年、第4巻、第1−10頁(Immunochemi
stry、 Per、gamon Press 1967 。
土、p、1−10)参照]。
上記米国特許明細書に記載された方法は、タンパク質の変性からなり、即ち例え
ば100〜140℃で10秒〜4分間又は75〜100”Cで2〜60分間の熱
処理により行なわれる。このような強い変性では、イオウ含有アミノ酸の破壊、
アレルゲン性であることが多いメイラード(Maillard)反応生成物の形
成(ハプテン効果)のような大きなリスクを伴い、製品の味が損われてしまう[
例えば、オータニ・エッチ及び トキタ・エフ、ジャパニーズ・ジャーナル・オ
ン・ズーテクニクス・サイエンス、1982年、第53巻、第344頁(0ta
ni、H。
and Tokita、 F、s Japanese Journal of
ZootechnicsScience、1982,53.p、344L オー
タニら、ジャパニーズ・ジャーナル・オン・ズーテクニクス・サイエンス、19
85年、第56巻、第987頁、及びマツダ・チーら、ジャーナル・オン・フー
ド・サイエンス。
1985年、第50巻、第618頁(Matsuda、 T、 etal、、
Journal of Food 5cience、1985. 50yP、6
18)参照]。
分子量6,000ドルトン以下のペプチドからなる乳清基質ペプチド製品が得ら
れるならば、これはアレルギー者のために食物製品及び刺激物中の一成分として
組込みうろことが、ここに発見されたのである。製品は、幼児の母乳代替物、ア
レルギー症にかかり易い人、ラクトース吸収不良性の人のための刺激物、胃/腸
手術をうけた患者のための流動食、及び運動選手、特に重量挙げ、やり投げ、ボ
ディービルの選手のためのタンパク質源として使用される。これは氷タンパク質
飲料のような刺激物にも使用される。
このように、本発明の製品は、分子量6,000ドルトン以下のペプチド類から
なり、かつメイラード反応生成物及びラクトースのようなアレルゲン性物質を含
まないことを特徴とする
特に好ましいペプチド製品は、遊離アミノ酸類及び塩類のような小分子が勿論望
ましくはない下痢をそれらの浸透作用の故に引き起こし易いことから、分子量2
,000〜6,000トルトン、特L:、2,000〜2,500ドルトンのペ
プチド類から実質上なることを特徴とする。
本発明は更に本ペプチドの製造方法にも関し、この方法は、
a) 所望であれば予め乳清の濃縮後に約20,000ドルトン膜により実質上
無カゼインの乳清を水で透析濾過し、
b)’ a)による乳清タンパク質残留物を1以上の工程で酵素的に加水分解す
る(各加水分解工程は、透過液中に得られたペプチド類を回収するために、約6
.000ドルトン膜による限外濾過で終結する)ことを特徴とする。
出発物質として用いられる乳清か実質上無カゼインではない場合には、それは、
複合体として存在しているであろうカゼイン残留物の除去のために、本発明の方
法の実施前に粗濾過、遠心分離又は他の処理に付されねばならない、乳清は、2
00,000ドルトン膜、即ちカットオフ(cut−off)値200,000
ドルトンの膜で精製するか、又はpH約4.6に調整しかつ沈殿剤、好ましくは
塩化カルシウムを添加して精製することが便宜上よい、望ましいカットオフ値を
もついずれかの膜が、ここで、更には明細書の記載及び請求の範囲全体にわたっ
て使用される0通常、市販膜が好ましいが、これは例えば酸及びアルカリ液によ
るクリーン・イン・プレース(clean−in place)、 CI P洗
浄、即ち所要箇所の洗浄のためにも使用される高耐性合成ポリマーから製造され
る。
このような膜は例えばDDS、デ・ダンケ・スッカーフアプリカー(D e D
anske S ukkerfabriker) 、 ロース・ブレンク(R
hona−P oulenc)及びロミコン(Romicon)から市販されて
いる。実施例で使用されている膜はDDS製である。
欧州特許出願第65663号明細書は、腸溶食摂取患者向けの食物として使用さ
れるタンパク質加水分解産物の製造方法について開示する。この方法は、好まし
くは90〜95℃での塩基性予備加水分解後、ラクトース含有率1.0重量%以
下の乳清タンパク質i濁物をアスペルギルス・ニガー(A spergillu
s niger)由来プロテアーゼで加水分解することからなる。所望であれば
、バチルス・リチェニホルミス(B acillus licheniform
is)由来の細菌プロテアーゼが使用されてもよい、懸濁物は、酵素又は酵素類
を不活性化させるため、加水分解後に典型的には90℃で加熱処理される。
かかる生成物は分子量2,000以下の物質を著しく高い割合で含有しているた
め下痢を引き起こし易い、アレルゲン性の分子量6,000以上のタンパク質も
無視しえるほどの含量である。特に、酵素を不活性化させるための熱処理はハプ
テン効果によりメイラード反応生成物を生じる。
したがって、上記加水分解産物はミルクアレルギー者及び幼児用のミルク代替物
としての使用には適さず、同様にラクトースに耐性でない人にも使用できないよ
うである。
更に、欧州特許第33694号明細書は、動物タンパク質の安定的加水分解産物
の製造方法について開示し、そこではタンパク質加水分解産物は安定化されたタ
ンパク質加水分解産物中少なくとも50%の量でミルクの限外濾過残留物等の液
体ミルク産物と混合されている。
安定化された加水分解産物は病人及び栄養失調栄養不良者の栄養摂取用であって
、ミルクアレルギー者及びラクトース吸収不良者には耐えることができない。
米国特許第4,293,571号明細書及び欧州特許出願第65663号明細書
に記載された変性熱処理及び他の処理法を省略することにより1本発明において
は低アレルゲン性でかつ無ラクトースの製品が得られる。
欧州特許出願第22019号明細書は、12%トリクロロ酢酸で沈殿しうる分画
を有していないと定義される、残留タンパク質を実質上含有しない全酵素乳清タ
ンパク質加水分解産物について開示する。少なくとも50%のペプチド類は2〜
5個のアミノ酸からなり、一方遊離アミノ酸含有率は15%以下である。好まし
くは70〜90%のペプチド類が10個以下の鎖長を有する。
この産物は、それらが腸壁から直接に吸収されかつ酵素生産を促進するように代
謝を再確立させるという観点から、特に術後療法の食物製品として使用される。
と報告されている。 アレルギー問題、ラクトース吸収不良。
幼児の栄養については何も述べられておらず、即ち本発明のペプチド製品に関し
て提案された用途は特にこれらの現象に係わるものであり、上記限定基準は低ア
レルゲン性かつ無ラクトース製品を確実に得るためには不十分である。
加水分解産物の回収は本発明の工程と類似したある箇所を含む方法によって行な
われているが、その理由はその方法が場合により限外濾過され及び/又は透析濾
過された乳清タンパク質の所望の低分子量サイズとなるまでの酵素加水分解、並
びに中間体酵素不活性化のない限外濾過による所望の加水分解産物の回収を必要
とするからである。しかしながら、使用される酵素は必然的に、ヒトタンパク質
代謝を再確立しうる酵素、好ましくは特にトリプシン及びキモトリプシンの混合
物たるパンクレアチンである。
しかしながら、上記特許出願は本発明の製品の有効性にとって重要な分子サイズ
の利用について沈黙しており。
しかも加水分解における数種の酵素の組合わせについても記載していない。
本発明方法の好ましい態様によればJ使用される出発物質は酸沈殿カゼインから
分離された乳清である。その結果、これは、ある含有率のにカゼイン等のカゼイ
ン故に除去が困難又は不可能な苦味を呈し易い1例えばチーズ製品からの乳清の
場合よりも良い味をしている。
加水分解は様々なプロテアーゼで行なわれうるが、それらのすべては、出発物質
の品質及び製造条件に応じて。
満足すべきペプチド製品を与えることができる。加水分解はPHスタット法に従
い連続的に行なわれてもよく、加水分解度は通常の方法でNaOHの消費量に基
づき計算される。加水分解度は総ペプチド結合数に対する開裂ペプチド結合割合
%として表わされる[ジェイ・アドラーーニッソン、 ジャーナル・オン・ケミ
カル・テクノロジー・アンド・バイオテクノロジー、第32巻、第138頁、1
982年(J、 Adler −N15son : Journalof Ch
ea+1cal Technology and Biotechnology
、32゜138.1982)参照]、プロテアーゼは限外濾過前に不活性化され
ない。食品産業で許容される事実上すべてのプロテアーゼが使用可能である。特
に使用される酵素の例としては、“ローザイム41 P C(Rhozy+ms
41PC)”のようなアスペルギルス・オリザエ(AspargillusO
ryzae)由来酵素、並びに “アルカラーゼ0.6 L(Alcalase
■ 0.6L)” 及び ″コロラーゼpp(Corolase P P)”
(膵臓抽出物)のようなバチルス・リチェニホルミス由来酵素がある。10−ザ
イム41PC”は苦味ペプチドを加水分解するロイシンアミノペプチダーゼを含
有しており、このため少量の苦味物質を含有する乳清の処理のために用いられる
。加水分解は中間体限外濾過を含む1以上の工程で行なわれることが好ましい。
その結果、良好な収率及び良好な分子量分布を有するよ上記のように、最良の出
発物質は酸沈殿カゼインから分離された乳清である。チーズ製品からの乳清を用
いることもできる。後者の乳清は様々な量のカゼインを含有している。少量のカ
ゼインを含有した乳清のみが使用可能であるが、その理由はカゼインの加水分解
によって除去が困難又は不可能な苦味物質を生じるからである。
上記のように、乳清は、例えif粗濾過(200,000ドルトン)によって、
及び/又は好ましくはpH約4.6の酸添加、及び沈殿剤、好ましくはCa C
Q zの特に5〜40 g / 100 Q乳清の量での添加及び例えばデカン
トによるカゼインの除去によって、残留カゼインを含まなくなる。乳清タンパク
質含有透過液は処理すべき液体量を減少させるために濃縮される(20,000
ドルトン)、高流速はpH2,0〜2.5で得られる。濃縮物は、ラクトースを
除去し、pHを高めかつタンパク質含有率を0.5〜20%に濃縮するために、
水で透析濾過される。無ラクトース乳清タンパク質濃縮物WPCの製造は継続し
て実施されてもよい、製造は、微生物増殖を妨げるために、最も都合よくは約5
℃に冷却して又は約50℃に加熱して行なわれる。酸沈段カゼインがら分離され
た乳清又は酸及びCaCQ、で処理された乳清かカゼインを非常に低含量で含有
しているのみである場合は、出発物質の粗濾過は不要である。
■、■水 産物の ゛
乳清タンパク質濃縮物は様々なプロテアーゼで加水分解されうるが、それらのす
べては前記のように出発物質の品質及び製造条件に応じて満足すべきペプチド製
品を与えることができる。加水分解は連続して行なわれても良く、加水分解度は
N a OH消費量に基づき計算される。得られる最小の加水分解度は以下に記
載されている。
プロテアーゼは限外濾過前に不活性化されない。
IIa、2種の酵、による加水 解
最初に、5%乳清タンパク質濃縮物が“ローザイム41PC”[アスペルギルス
・オリザエーゲネンコア(Genencore) ] 1.0g/ Q基質によ
り50℃pH7,5で加水分解度9%まで加水分解される。
限外濾過は6,000ドルトン膜で行なわれる。
UF透過液中のペプチド収率は最初のタンパク質量の30〜40%である。
″ローザイム”加水分解産物の限外濾過残留物は更に、゛′アルカラーゼ■0.
6L” [バチルス・リチェニホルミスーノボ(N OV O) 10 、5
m Q / (を基質(最初の加水分解時の開始容量)により50℃PH7,5
で加水分解される。加水分解は12%まで続けられる。UF透過液中のペプチド
収率は最初のタンパク質量の40〜45%である。総数率は70〜80%である
。
連続加水分解は全収率を高める。中間体限外濾過は最初の加水分解で生成したペ
プチドを回収するために利用されるが、そうでなければ得られる生成物のより高
い浸透圧によって更に遊離アミノ酸にまで加水分解されてしまうであろう。
nb、2種の酵 による併合加水 解
有利には2種の酵素が一工程で使用されるが、これは収率を改善しかつ中間体回
収を回避するため乳清タンパク質濃縮物は、“コロラーゼPP”[膵臓抽出物−
ローム(Rohm) ] (乳清タンパク質濃縮物聴につき5.0g)により5
0@CpH8,0で加水分解度10%まで加水分解されてもよい、しかしながら
、そのためには苦味ペプチドの生成を避ける上で無カゼイン乳清タンパク質濃縮
物を必要とする。UF透過液中で50〜60%のペプチド収率が得られる。
11d、”アルカラーゼ0.6L”による加水5%乳清タンパク質濃縮物は“ア
ルカラーゼ0.6L”(1、0m Q / Q基質)により50℃ pH7,5
で加水分解度18%まで加水分解される。UF透過液中のペプチド収率は約80
%である。しかしながら、この方法は、カゼインが苦味ペプチドを生成すること
から、実質上無カゼインの乳清タンパク質の場合でのみ利用可能である。
■、ペプチドの回収
低アレルゲン性ペプチドは限外濾過及び/又は透析濾過により加水分解産物から
回収されるが、濾過中の付着物がフィルターの透過性を低下させることがらそれ
らの併用が通常好ましい。
本発明の方法により製造されるペプチド類は、前記のような様々な食物製品及び
刺激物に使用される。母乳代替物は、回収UF透過液中のタンパク質含有率を
3.0%に調整し、塩、ビタミン、サッカロース、デンプン及び脂肪を加えるこ
とにより製造され、次いで混合物が乳化され、濃縮され、滅菌され、霧状乾燥さ
れて、使用時に希釈される最終製品が得られる。 自体公知の方法で、使用準備
の整った液体濃縮物又は製品を製造することもできる。
本発明は下記実施例で更に詳細に説明される。
実施例 1
酸゛ カゼインから された ゛に基づく母負■聚産
酸沈段カゼインから分離されたタンパク質含有率0.5%の無カゼイン乳清50
,000Ω を“GR30PP”膜(200,000ドルトン)の粗濾過により
予め処理する。次いで乳清タンパク質を濃縮し、”GR61PP”膜(20,0
00ドルトン)で透析濾過する。得られる残留物はラクトースを含有していない
。しかる後、残留物を熱カバー装備タンクに供給し、50℃の一定温度に保つ。
乳清タンパク質濃縮物のpHを加水分解で使用したpHメーター/滴定機ユニッ
トで8.0に調整し、一定pH約8.0に保つ、加水分鮮度測定のためにN a
OH消費を利用する。タンクは更に高性能スター5−を装備している、乳清タ
ンパク質濃縮物が50℃ pH8,0で平衡化された場合には、′コロラーゼP
P”1.23kgが加えられ、しかも加水分解は4.ON NaOH約40Qが
消費されるまで(加水分解度10%)進行する。これには約4時間かかる。次い
で加水分解産物を“GR81PP”膜(6,000ドルトン)で限外濾過/透析
濾過し、低アレルゲン性透過液を得る。透過液中のタンパク質含有率を280α
mで継続して測定する。透過液中のタンパク質含有率は2.5〜3.0%である
。低アレルゲン性ペプチド125kgが得られるが、これは完全母乳代替物1,
000kgに相当する。
実施例 2
チーズ製品からの 清に基づく低アレルゲン性ベプチェ■災盗
タンパク質含有率約0.65%のチーズ製品からの乳清19,200αを前記の
ように実施例1と同じく粗濾過するか又は酸及びCa CQ 、で処理する。カ
ゼイン粒子が除去されたもののにカゼインを含む乳清からなる透過液を別のタン
クに供給し、実施例1と同様に濃縮/透析濾過する。残留物は無ラクトース乳清
タンパク質濃縮物である。乳清タンパク質濃縮物を PH7,5で50℃に調整
し、10−ザイム41PC”2.5kgを加える。
加水分解は4.ON NaOH約18Q(加水分解度9%)が消費されるまで続
けられるが、これには約2時間かかる。加水分解産物を実施例1で述べたように
限外濾過/透析濾過する。透過液中のペプチド収率は約35%である。残留物を
pH7,5及び50℃に調整し、パアルカラーゼ0.6L” 1.250を加え
る。加水分解は4.0NNaOH約15Q(残留物の加水分解度12%)が消費
されるまで続けられるが、それには約2時間かかる。′アルカラーゼ0.6L”
加水分解産物を実施例1と同様に濾過/透析濾過する。UF透過液中のペプチド
収率は、乳清タンパク質濃縮物量の約35%である。2種の酵素による加水分解
後における全UF透過液中のタンパク質含有率は1.0%以下となり、したがっ
てUF透過液はそれが母乳代替物の製造のための使用に適合する以前において4
〜5倍に濃縮されている。低アレルゲン性ペプチド90kgが得られるが、これ
は完全母乳代替物760−に相当する。
実施例 3
タンパク質含有率0.85%のチーズ製品からの乳清60.000 Qを、pH
を4.6に下げかつCaCQ2で沈殿させることにより、予め処理する。沈殿カ
ゼインをデカントにより除去し、タンパク質含有率0.70%の液体を透析濾過
して、ラクトース含有率を最大0.1%に下げ、しかる後タンパク質含有率を5
%に諷整する。
この残留物を70℃で1o分間加熱処理してレンネットを不活性化し、次いで“
ローザイム”及び″アルカラーゼ2.4L”をそれぞれE/S 2及び1.36
%に相当する量で同時に加える。加水分解を pH7,5かつ55℃で行ない、
pHを加水分解中PHスタットで7.5に保つ。
約17%の加水分解度が約4時間後に得られ、しかる後混合物をカットオフ値6
,000の膜で限外濾過する。
タンパク質含有率約3.5%の透過成約4,500 Qを得る。これをこの分野
での調整法に従い炭水化物、ビタミン、脂肪及び無機質の添加により処理して低
アレルゲン性無ラクトース製品を得るが、更にこれを滅菌及び/又はスプレー乾
燥により処理してもよい。
2つのタンクを用いる場合には、操作は、加水分解が1つのタンクで行なわれ、
同時に乳清タンパク質の限外濾過/透析濾過が他のタンクで行なわれるように、
連続して実施される。実施例1に記載された方法は、酵素消費量及び装置の必要
性といった点で、実施例2に記載された方法よりも著しく安価である。他方、出
発物質として用いられる、場合により濃縮された乳清の品質に関する要求(即ち
、価格)は実施例2の場合で低く、シかも実施例2における収率は実施例1の場
合よりも高い。更に高い収率は、実施例1に相当する方法の“アルカラーゼ0.
6L”による完全加水分解によって得られる。 しかしながら、この方法は乳清
に関して非常に厳格であり、前記のように実質上無カゼインでなければならない
。現時点では、実施例3による方法がその簡便性及び製品の優れた品質からみて
好ましく、製品は低アレルゲン性無ラクトースでかつ良好な味を有している。
本発明の方法により製造される製品は、測定したところではアレルゲン性を示さ
ず、抗体結合も下記抗体を用いたELISA法において観察されない。
■、出願人により製造された。カゼイン又は乳清タンパク質に対する市販ウサギ
抗体
■、ミルクタンパク質に対するヒト抗体をもつ牛乳アレルギー患者からの血清
更には、それらはミルクタンパク質に対するウサギ又はマウス抗体で受身感作さ
れたマウスにおいてPCA反応を引き起こすことができず、それらは前記患者血
清を用いたイン・ビトロヒスタミン放出試験において陽性反応を引き起こすこと
ができず、かつそれらは臨床上申分明らかにされたミルクアレルギー症の幼児で
の刺激試験においてアレルギー反応を生じない。ペプチド類は至適含有率の必須
アミノ酸を有し、そのため高栄養価であり、同時に製品は無ラクトースである。
ペプチド類の1.5%水溶液は無味無臭である。10%以下の水溶液中のペプチ
ドはPH4,5で可溶化する。このPHにおいてペプチド類は10分間の沸騰に
耐える。前記のように、ペプチド類は6,000ドルトン以下の大きさを有し、
それらの大半は2,000〜2,500ドルトンの分子量を有する。それらは
全く又は非常に弱い乳化作用しか有さず、しかもそれらはほとんど気泡を発生せ
ず、気泡安定性に乏しい、したがってそれらは前記のようにミルク代替物として
使用される。
手続補正書
昭和62年ii月21日
1、事件の表示 PCT/DK861001352、発明の名称
ペプチド製品、その製造方法及びペプチド製品の用途3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
氏シ サムエルシン、エルンストーグナ−(外1名)5、補正の対象 (1)「
明細書の翻訳文」(2)「請求の範囲の翻訳文」
(3)「委 任 状」
6、補正の内容 別紙のとおり
(明細書の翻訳文及び請求の範囲
PCT/DK86100135
ktljl’M61nM#1Aeellejl16RN。PCT/DK8610
0135
Claims (10)
- 1.分子量6,000ドルトン以下のペプチド類及び場合によりアミノ酸類から なり、かつアレルゲン性物質及びラクトースを含有しないことを特徴とする、乳 清の加水分解によるペプチド製品。
- 2.分子量2,000〜6,000ドルトン、特に2,000〜2,500ドル トンのペプチド類から実質上なることを特徴とする、請求の範囲第1項記載のペ プチド製品。
- 3.a)所望であれば予め乳清の濃縮後に、約20,000ドルトンの膜により 実質上無カゼインの乳清を水で透析濾過し、 b)1以上の工程でa)からの乳清タンパク質残留物を酵素的に加水分解する( 各加水分解工程は透過液中に得られるペプチド類を回収するために、約6,00 0ドルトンの膜による限外濾過で終結せしめられる) ことを特徴とする、乳清の限外濾過及び加水分解による請求の範囲第1項又は第 2項記載の製品の製造方法。
- 4.酸沈殿カゼインからの乳清を用いることを特徴とする、請求の範囲第3項記 載の方法。
- 5.例えば200,000ドルトンの膜による粗濾過によって、又は酸の添加及 び塩化カルシウムによる沈殿によって、実質上無カゼインとされた乳清を用いる ことを特徴とする、請求の範囲第3項又は第4項記載の方法。
- 6.1又は2の工程で2種の異なる酵素により加水分解を行なうことを特徴とす る、請求の範囲第3項、第4項文は第5項記載の方法。
- 7.1種以上のプロテアーゼを用いることを特徴とする、請求の範囲第3項〜第 6項のいずれかに記載の方法。
- 8.1以上の工程で“ローザイム41PC”及び“アルカラーゼ0.6L”を用 いて加水分解を行なうことを特徴とする、請求の範囲第3項〜第7項のいずれか に記載の方法。
- 9.通常ミルクを含有する製品におけるミルク又はミルクタンパク質の代替物と して適切な濃度にある、請求の範囲第1項記載のペプチド製品の用途。
- 10.アレルギー又はアレルギー傾向及び/又はラクトース吸収不良傾向をもつ ヒトに向けられた製品としての、請求の範囲第9項記載の用途。
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