JPS6352890A - 第９因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
第９因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS6352890A JPS6352890A JP61198577A JP19857786A JPS6352890A JP S6352890 A JPS6352890 A JP S6352890A JP 61198577 A JP61198577 A JP 61198577A JP 19857786 A JP19857786 A JP 19857786A JP S6352890 A JPS6352890 A JP S6352890A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血液凝固第■因子モノクローナル抗体、さらに
詳しくは、ヒト血液凝固第■因子コンホメーション特異
性モノクローナル抗体に関する。
詳しくは、ヒト血液凝固第■因子コンホメーション特異
性モノクローナル抗体に関する。
血液凝固第■因子は、ビタミンに依存性凝固因子の１つ
であり、その先天性欠乏症は血友病Ｂとして知られてい
る。この血友病Ｂやその保因者の診断、後先的に第Ｘ因
子の低下する種々の疾患の臨床検査または臨床病理学上
の解明、あるいは原材料２夜からの第Ｘ因子の分離精製
法の１つである免疫吸着法には、第Ｘ因子に対する抗体
を用いることが必要である。しかしながら、通常の第Ｘ
因子に対する抗体はポリクロ−・ナル抗体または、オリ
ゴクローナル抗体であり第■因子分子上の数種以上の抗
原エピトープに対応しているため、上記の臨床検査、病
理学上の解明あるいは免疫吸着法において一定の限界を
有している。
であり、その先天性欠乏症は血友病Ｂとして知られてい
る。この血友病Ｂやその保因者の診断、後先的に第Ｘ因
子の低下する種々の疾患の臨床検査または臨床病理学上
の解明、あるいは原材料２夜からの第Ｘ因子の分離精製
法の１つである免疫吸着法には、第Ｘ因子に対する抗体
を用いることが必要である。しかしながら、通常の第Ｘ
因子に対する抗体はポリクロ−・ナル抗体または、オリ
ゴクローナル抗体であり第■因子分子上の数種以上の抗
原エピトープに対応しているため、上記の臨床検査、病
理学上の解明あるいは免疫吸着法において一定の限界を
有している。
最近、この第Ｘ因子に対してもミルスタイン等の確立し
たハイブリドーマ産生技術を用いるモノクローナル抗体
の作製例が種々報告され、その免疫・生化学的および臨
床病理学的有用性が検討されている。例えば、吉岡等は
、′臨床血液２６：２．１５３−１．５８および１５９
−１６５（１９８５）″および′鐘床病理ＸＸＸＩＶ
＋ ４，４６９−４．７４（１９８６）″において、上
記ハイブリドーマ産生技術を用いて第■因子モノクロー
ナル抗体を作製し、その免疫学的特注、それを用いたイ
ムノアッセイ、免疫吸着法等を検討している。しかしな
がら、第Ｘ因子と他のビタミンに依存性因子（第Ｘ因子
、第■因子、プロトロンビン、プロティンＣ１プロティ
ンＳ、プロティンＺ’Ｓ）とは、アミノ酸配列に顕著な
相同性を有するため、従来の第Ｘ因子モノクローナル抗
体では第Ｘ因子以外のビタミンに依存性因子ともわずか
ではあるが認識するとされている。しかも、従来の第Ｘ
因子モノクローナル抗体を用いる免疫吸着法による第Ｘ
因子の精製においては、６Ｍグアニジン、８Ｍ尿素、低
ｐＥ（（例えばｐＨ＝２）酸性液のような目的物の変性
をともなう苛酷な溶出剤を用いなければならず精製した
第Ｘ因子の生理活性の大きな損失を与儀なくされている
。
たハイブリドーマ産生技術を用いるモノクローナル抗体
の作製例が種々報告され、その免疫・生化学的および臨
床病理学的有用性が検討されている。例えば、吉岡等は
、′臨床血液２６：２．１５３−１．５８および１５９
−１６５（１９８５）″および′鐘床病理ＸＸＸＩＶ
＋ ４，４６９−４．７４（１９８６）″において、上
記ハイブリドーマ産生技術を用いて第■因子モノクロー
ナル抗体を作製し、その免疫学的特注、それを用いたイ
ムノアッセイ、免疫吸着法等を検討している。しかしな
がら、第Ｘ因子と他のビタミンに依存性因子（第Ｘ因子
、第■因子、プロトロンビン、プロティンＣ１プロティ
ンＳ、プロティンＺ’Ｓ）とは、アミノ酸配列に顕著な
相同性を有するため、従来の第Ｘ因子モノクローナル抗
体では第Ｘ因子以外のビタミンに依存性因子ともわずか
ではあるが認識するとされている。しかも、従来の第Ｘ
因子モノクローナル抗体を用いる免疫吸着法による第Ｘ
因子の精製においては、６Ｍグアニジン、８Ｍ尿素、低
ｐＥ（（例えばｐＨ＝２）酸性液のような目的物の変性
をともなう苛酷な溶出剤を用いなければならず精製した
第Ｘ因子の生理活性の大きな損失を与儀なくされている
。
また、第Ｘ因子は、上述の如くビタミンに依存性、たん
白質の１つであり、Ｃａ″をはじめ、例えばＳ ｒ ＋
＋、Ｍｎ＋＋、ＣＯ＋＋、Ｍｇ ＋＋等の金属イオンと
結合し、多かれ少かれコンホメーションの変化即ち、立
体構造上の変化を生じる。特表昭６１−５００２２６号
は、このコンホメーション特Ｊｉ！１ Ｋ因子モノクロ
ーナル抗体を開示しておシ、特に金属イオンと結合した
第Ｘ因子のみを認識するコンホメーション特異性第Ｘ因
子モノクローナル抗体を免疫吸着法における第Ｘ因子吸
着剤として用いたとき、前述の如き苛酷な非特異的な溶
出条件を用いなくて済むので極めて有利であるとしてい
る。即ち、このコンホメーション特異性モノクローナル
抗体を免疫吸着体として用い、金属イオン存在下で第Ｘ
因子を吸着させ、次いで、吸着させた第Ｘ因子からその
結合している金属イオンを例えばＥＤＴＡの如き金属キ
レート剤によシ除去している。そうすれば、第Ｘ因子は
金属イオンと結合している時とは異なるコンホメーショ
ンをとることにナリ、吸着体に対し非特異性となり第Ｘ
因子が容易にかつ活性を損なわないで精製取得できると
している。しかしながら、このコンホメーション特異性
モノクローナル抗体は、特表昭６１−５００２２６号公
報明細書も明記している如く、Ｃａ什以外の金属イオン
によシコンホメーションの変化された第Ｘ因子をも認識
するものであり、もしそのようなＣａ＋＋以外の金属イ
オン特にＭｎ、ｃｏ のような重金属イオンを用いて
免疫吸着体を調製した場合、あるいは何らかの理由で重
金属イオンが精製系に混入している場合には、吸着処理
後の金属キレート剤の使用による金属イオンの除去処理
を行っても、望ましくない金属イオンすべての除去を完
全に行うことは困難である。精製した第Ｘ因子に痕跡量
であれそのような重金属が残存することは治療剤おるい
はアッセイその池いかなる目的であれ好ましいことでは
ない。
白質の１つであり、Ｃａ″をはじめ、例えばＳ ｒ ＋
＋、Ｍｎ＋＋、ＣＯ＋＋、Ｍｇ ＋＋等の金属イオンと
結合し、多かれ少かれコンホメーションの変化即ち、立
体構造上の変化を生じる。特表昭６１−５００２２６号
は、このコンホメーション特Ｊｉ！１ Ｋ因子モノクロ
ーナル抗体を開示しておシ、特に金属イオンと結合した
第Ｘ因子のみを認識するコンホメーション特異性第Ｘ因
子モノクローナル抗体を免疫吸着法における第Ｘ因子吸
着剤として用いたとき、前述の如き苛酷な非特異的な溶
出条件を用いなくて済むので極めて有利であるとしてい
る。即ち、このコンホメーション特異性モノクローナル
抗体を免疫吸着体として用い、金属イオン存在下で第Ｘ
因子を吸着させ、次いで、吸着させた第Ｘ因子からその
結合している金属イオンを例えばＥＤＴＡの如き金属キ
レート剤によシ除去している。そうすれば、第Ｘ因子は
金属イオンと結合している時とは異なるコンホメーショ
ンをとることにナリ、吸着体に対し非特異性となり第Ｘ
因子が容易にかつ活性を損なわないで精製取得できると
している。しかしながら、このコンホメーション特異性
モノクローナル抗体は、特表昭６１−５００２２６号公
報明細書も明記している如く、Ｃａ什以外の金属イオン
によシコンホメーションの変化された第Ｘ因子をも認識
するものであり、もしそのようなＣａ＋＋以外の金属イ
オン特にＭｎ、ｃｏ のような重金属イオンを用いて
免疫吸着体を調製した場合、あるいは何らかの理由で重
金属イオンが精製系に混入している場合には、吸着処理
後の金属キレート剤の使用による金属イオンの除去処理
を行っても、望ましくない金属イオンすべての除去を完
全に行うことは困難である。精製した第Ｘ因子に痕跡量
であれそのような重金属が残存することは治療剤おるい
はアッセイその池いかなる目的であれ好ましいことでは
ない。
精製取得した第Ｘ因子には、その活性に必要なＣａ”＋
の存在のみが望ましいことである。
の存在のみが望ましいことである。
本発明によれば、第Ｘ因子がＣａ＋＋と結合することに
よって生じたコンホメーションのみを認識し他の金属イ
オンと結合によって生じた第Ｘ因子のコンホメーション
は認識しない血液凝固第■因子コンホメーション特異性
モノクローナル抗体が提供される。
よって生じたコンホメーションのみを認識し他の金属イ
オンと結合によって生じた第Ｘ因子のコンホメーション
は認識しない血液凝固第■因子コンホメーション特異性
モノクローナル抗体が提供される。
本発明のモノクローナル抗体は、一般には前述したミル
スタイン等のハイブリドーマ産生技術、例えば、”Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６．４９５〜（１９７５）″に記載され
ているような方法によって作製できる。さらに詳しくは
、Ｍ製した第Ｘ因子で免疫したマウスの牌臓細胞とマウ
スミエローマ細胞を融合し、さらにクローニングして得
られたモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマのなか
から、その特異性を調べてＣａ＋＋によってコンホメー
ションの変化した第Ｘ因子のみに特異性を有するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、この
ハイプリドーマを人工培地中あるいは、マウス腹腔内で
増殖させることによって得ることができる。
スタイン等のハイブリドーマ産生技術、例えば、”Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６．４９５〜（１９７５）″に記載され
ているような方法によって作製できる。さらに詳しくは
、Ｍ製した第Ｘ因子で免疫したマウスの牌臓細胞とマウ
スミエローマ細胞を融合し、さらにクローニングして得
られたモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマのなか
から、その特異性を調べてＣａ＋＋によってコンホメー
ションの変化した第Ｘ因子のみに特異性を有するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、この
ハイプリドーマを人工培地中あるいは、マウス腹腔内で
増殖させることによって得ることができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
（１）策」」１土ｆ口Ｗ製−
新鮮凍結血漿を３７°Ｃで素早く溶解した後、４°Ｃに
おいてゆっくり攪拌しながら”／１０容の塩化バリウム
を滴下し、２時間放置した。
おいてゆっくり攪拌しながら”／１０容の塩化バリウム
を滴下し、２時間放置した。
４．００ Ｏｒｐｍ、５分間、４°Ｃにて遠心を行い沈
殿を回収し、Ｔｒｉ ｓ−塩酸バッファーに懸濁した。
殿を回収し、Ｔｒｉ ｓ−塩酸バッファーに懸濁した。
この溶液を２５−６５％の硫安カットを行い、得られた
沈殿を再懸濁後、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ
ィーを行った。ｐＨ＝６．０のリン酸バッファーで０→
０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配で、第Ｘ因子を含
む両分を得た。この画分全さらに通常のヘパリンセファ
ローズクロマトグラフィー・およびゲル濾過法で精製し
、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）の限界濾過器（分子量カッ
トサイズ１０．０００のメンブレン）で濃縮した。全て
の操作は４°Ｃで行った。
沈殿を再懸濁後、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ
ィーを行った。ｐＨ＝６．０のリン酸バッファーで０→
０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配で、第Ｘ因子を含
む両分を得た。この画分全さらに通常のヘパリンセファ
ローズクロマトグラフィー・およびゲル濾過法で精製し
、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）の限界濾過器（分子量カッ
トサイズ１０．０００のメンブレン）で濃縮した。全て
の操作は４°Ｃで行った。
精製した第Ｘ因子は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
凝固因子の混入はなかった。
〔■〕モノクローナル抗体の調製
上記で得た精製筒■因子の５０μ．？０．０５ｎ′Ｌ４
の０． ９％生理食塩水に溶解し、アジュバントとして
ＤＩＦＣＯ社のＦＣＡＱ、１１ノを加えて油中水滴型と
したものを基礎免疫用抗原とした。
の０． ９％生理食塩水に溶解し、アジュバントとして
ＤＩＦＣＯ社のＦＣＡＱ、１１ノを加えて油中水滴型と
したものを基礎免疫用抗原とした。
また、ブースター用抗原として上記精製筒■因子５０ａ
ｙを０． ０ ５ ｍ！−の０．９％生理食塩水に溶か
して調製したものを用いた。
ｙを０． ０ ５ ｍ！−の０．９％生理食塩水に溶か
して調製したものを用いた。
ＢＡＬＢ／Ｃマウス４〜５週令＋を用い、基礎免疫用抗
原を接種後ブースター用抗原を１５日目および４５日目
の２回免疫して得たマウヌ牌臓紬胞を以下、通常の方法
、例えば“渡辺武監修「ハイブリドーマ法とモノクロー
ナル抗体」・Ｐ・２０〜Ｐ．２９（株）Ｒ ＆ Ｄプラ
ンニング社、１９８２″に記載の方法によりマウスミエ
ローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ｊ８−Ｕｌ ）と融合させ
、クローニングして第■因子特異性モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ８種を得た。各々をマウス腹
腔内で増殖させることによって各モノクローナル抗体を
得た。
原を接種後ブースター用抗原を１５日目および４５日目
の２回免疫して得たマウヌ牌臓紬胞を以下、通常の方法
、例えば“渡辺武監修「ハイブリドーマ法とモノクロー
ナル抗体」・Ｐ・２０〜Ｐ．２９（株）Ｒ ＆ Ｄプラ
ンニング社、１９８２″に記載の方法によりマウスミエ
ローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ｊ８−Ｕｌ ）と融合させ
、クローニングして第■因子特異性モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ８種を得た。各々をマウス腹
腔内で増殖させることによって各モノクローナル抗体を
得た。
（ＩＩ！”ｌ 抗原特異性測定およびイムノグロブリン
上記〔■〕で得た８種のハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体の抗原特異性を次のようにして測定した
。
上記〔■〕で得た８種のハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体の抗原特異性を次のようにして測定した
。
測定は、次の如（ ＥＬＩＳＡ法で行った。
１、抗原のコーティング
２枚のマイクロタイタープレートに５ＱｍＭトリヌー塩
酸（１）Ｈ＝７．５ ）０．ＩＭ ＮａＣｌ テ２ｐ．
９７ｍｌに調製したヒト第■因子（前記で精製したのと
同じもの）５０μｉｆ添加し、４°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。
酸（１）Ｈ＝７．５ ）０．ＩＭ ＮａＣｌ テ２ｐ．
９７ｍｌに調製したヒト第■因子（前記で精製したのと
同じもの）５０μｉｆ添加し、４°Ｃで１６時間インキ
ュベートした。
３、洗浄
２ｍＭ ＣａＣＬｑ及び２ ｒｎ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ
をそれぞれ含む、２通りの１０ｍｉｖｉト！Ｊスー塩ａ
ｃｐＨ＝７５）、Ｑ，５ＭＮａＣ工、０１％Ｔｗｅｅｎ
２ ０カらなるバッファー全調製し、１枚のマイクロ
タイタープレートは、２ｒｈ．ＭＣａＣ工２を含むバッ
ファーで、もう１枚のプレートは２ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａを含むバッファーでそれぞれ、、１回づつ洗浄した。
をそれぞれ含む、２通りの１０ｍｉｖｉト！Ｊスー塩ａ
ｃｐＨ＝７５）、Ｑ，５ＭＮａＣ工、０１％Ｔｗｅｅｎ
２ ０カらなるバッファー全調製し、１枚のマイクロ
タイタープレートは、２ｒｈ．ＭＣａＣ工２を含むバッ
ファーで、もう１枚のプレートは２ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａを含むバッファーでそれぞれ、、１回づつ洗浄した。
３、ブロッキング
１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ）リス−塩酸（
１）Ｈ＝７．５ ’） ０．１．Ｍ ＮａＣ工溶液全調
製し、その２００μノを各プレートに添加し、２５°Ｃ
で２時間インキユベートシた。
１）Ｈ＝７．５ ’） ０．１．Ｍ ＮａＣ工溶液全調
製し、その２００μノを各プレートに添加し、２５°Ｃ
で２時間インキユベートシた。
４、ハイブリドーマ上清添加
ハイブリドーマ上清４０μｍを各プレー１−の列毎に添
加し、４°Ｃで１６時間インキュベートした。
加し、４°Ｃで１６時間インキュベートした。
５、第２抗体及び発色
各プレートにペルオキシダーゼを結合した抗マウスエｇ
Ｇウサギ抗体５０μ２を添加し、２５°Ｃで２時間イン
キュベートした。その後０−フエニルジアミン溶ａｔ１
ｏｏμ’ 添加１，、２５°Ｃで３０分反応させ、４９
２ｎｍの波長での吸光度を測定した。
Ｇウサギ抗体５０μ２を添加し、２５°Ｃで２時間イン
キュベートした。その後０−フエニルジアミン溶ａｔ１
ｏｏμ’ 添加１，、２５°Ｃで３０分反応させ、４９
２ｎｍの波長での吸光度を測定した。
結果は、第１表のとおりであシ、いずれも第■因子特異
性であるが、その中でクローン五３〜ノ・に８はＣａ＋
＋との結合によって生じるコンフォメーションのみに特
異的であることが判る。
性であるが、その中でクローン五３〜ノ・に８はＣａ＋
＋との結合によって生じるコンフォメーションのみに特
異的であることが判る。
なお、イムノグロブリン・サブクラスの同定をマウスの
α、ｒ１１ｒ２α、７２８％７３、μ、に、λ鎖に対す
る１２５工でラベルした各抗血清を用いてＲＩＡ法によ
り各ハイプリドーマ培養上清について測定した。
α、ｒ１１ｒ２α、７２８％７３、μ、に、λ鎖に対す
る１２５工でラベルした各抗血清を用いてＲＩＡ法によ
り各ハイプリドーマ培養上清について測定した。
第１表
注：
〔■〕モノクローナル抗体の第Ｘ因子の凝固活第■因子
の凝固活性に対する影響をみるために次の実験を行った
。
の凝固活性に対する影響をみるために次の実験を行った
。
精製した第Ｘ因子とクローン應１〜黒８のハイブリドー
マから得たモノクローナル抗体をモル比で１＝２０で混
合し、ＣａＣ工２を最終的に５ｍＭになる様に加え、水
中で１０分間反応させた。この混合物５０μｍに２５ｍ
ＭＣａＣ工２■ １００μｍと７クチン（Ａｃｔｊ−ｎ ；米国一デイド
社製）１００μ見、市販の第■因子欠乏血漿５０μＬを
加え、凝固時間を測定した。結果は第２表のとおりでち
ゃ、阻害活性を％で表示している。即ち、０％は凝固時
間の延長がない時いずれも阻害活性を示しておシ、特に
黒１〜７は８４〜９９％と強い阻害活性を示した。
マから得たモノクローナル抗体をモル比で１＝２０で混
合し、ＣａＣ工２を最終的に５ｍＭになる様に加え、水
中で１０分間反応させた。この混合物５０μｍに２５ｍ
ＭＣａＣ工２■ １００μｍと７クチン（Ａｃｔｊ−ｎ ；米国一デイド
社製）１００μ見、市販の第■因子欠乏血漿５０μＬを
加え、凝固時間を測定した。結果は第２表のとおりでち
ゃ、阻害活性を％で表示している。即ち、０％は凝固時
間の延長がない時いずれも阻害活性を示しておシ、特に
黒１〜７は８４〜９９％と強い阻害活性を示した。
第２表
前記〔■〕作製した各モノクローナル抗体の抗原特異性
を次のようにしてさらに確認した。
を次のようにしてさらに確認した。
実験は前記と同様にＥＬＩＳＡ法で行った。
確認する抗原として、プロトロンビン第Ｘ因子、プロテ
ィンＣ１プロテインＳおよびウシ血清アルブミンを用い
た。各精製した抗原を５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ＝７
．４）０．ＩＭＮａＣ，ｌで５μｇ／ｙｎ４に調製し、
マイクロタイクープレートに４°０１６時間コーティン
グした。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング
、洗浄、モノクローナル抗体添加、第２抗体の添加及び
発色の手順は、前記〔■〕と同じである。
ィンＣ１プロテインＳおよびウシ血清アルブミンを用い
た。各精製した抗原を５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ＝７
．４）０．ＩＭＮａＣ，ｌで５μｇ／ｙｎ４に調製し、
マイクロタイクープレートに４°０１６時間コーティン
グした。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング
、洗浄、モノクローナル抗体添加、第２抗体の添加及び
発色の手順は、前記〔■〕と同じである。
結果を第３表に示した。
全てのクローンは、第Ｘ因子のみに反応し、他の各凝固
因子及びウシ血清アルブミンとは反応しなかった。
因子及びウシ血清アルブミンとは反応しなかった。
第３−１表
モノクローナル抗体の他の凝固因子との反応（ＣａＳ在
下）第３−２表 モノクローナル抗体の他の凝固因子との反応性（Ｃ虻擁
し）の測定 実験は、前記〔■〕と同様にＥＬ工ＳＡ法で行った。
下）第３−２表 モノクローナル抗体の他の凝固因子との反応性（Ｃ虻擁
し）の測定 実験は、前記〔■〕と同様にＥＬ工ＳＡ法で行った。
前記〔Ｉ〕で精製した第Ｘ因子をマイクロタイｊ’ −
７’レ一ト９列にコーティングした。
７’レ一ト９列にコーティングした。
ＭｇＣｌ２ 、ＭｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＮｄＣ工２、
Ｌａｃ１２、ＺｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｃ
ａＣｌ２（８度は全て２ｍＭ）をそれぞれ含む９通りの
１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ＝７．５）、０．５Ｍ、Ｎ
ａＣ工、０１％ＴＷｅｅｎ２０からなるバッファーを調
製し、マイクロタイタープレートの各列を上記９挿類の
金属イオンを含むバッファーでそれぞれ４回づつ洗浄し
た。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング、モ
ノクローナル抗体の添加、第２抗体の添加及び発色の手
順は、前記ＣｌＩＤと同じである。
Ｌａｃ１２、ＺｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＣａＣｌ２、Ｃ
ａＣｌ２（８度は全て２ｍＭ）をそれぞれ含む９通りの
１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ＝７．５）、０．５Ｍ、Ｎ
ａＣ工、０１％ＴＷｅｅｎ２０からなるバッファーを調
製し、マイクロタイタープレートの各列を上記９挿類の
金属イオンを含むバッファーでそれぞれ４回づつ洗浄し
た。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング、モ
ノクローナル抗体の添加、第２抗体の添加及び発色の手
順は、前記ＣｌＩＤと同じである。
結果を第４表に示した。
第４表
第４表から明らかなように、本発明によるクローンｒｉ
ａ４．５．６．８のモノクローナル抗体は、Ｃａ イ
オンによって生じた第■因子コンフォメーションのみを
特異的に認識し、それ以外の金属イオンによって生じた
第Ｘ因子のコンフォメーションは認識しない事がわかる
。
ａ４．５．６．８のモノクローナル抗体は、Ｃａ イ
オンによって生じた第■因子コンフォメーションのみを
特異的に認識し、それ以外の金属イオンによって生じた
第Ｘ因子のコンフォメーションは認識しない事がわかる
。
なお、クローン遥２はポジティブコントロー ル で
あ る 。
あ る 。
以上の如く、本発明のモノクローナル抗体は、Ｃａ＋＋
によって生じる第Ｘ因子のコンフォメーションのみを識
別する。この時、モノクローナル抗体に対し、どの程度
の量のｍ１φのＣａ＋＋が必要であるかを調べた。
によって生じる第Ｘ因子のコンフォメーションのみを識
別する。この時、モノクローナル抗体に対し、どの程度
の量のｍ１φのＣａ＋＋が必要であるかを調べた。
実験は前記Ｃ［）と同様にしてＥ Ｌ工Ｓ Ａ、法で行
った。
った。
前記〔Ｉ〕で精製した第Ｘ因子をマイクロタイタープレ
ートの９列にコーティングした。０゜０．１，０．２，
０．４．０．６．０．８．１．０．１．５．２．ＯｍＭ
のＣａＣ１をそれぞれ含む９種のＩＱｍＭ トリス−塩
酸（Ｉ）Ｈ＝７．５）、０．５ Ｍ ＩＶｌａＣｌ、０
．１％’ｒｗｅｅｎ２０からなるバッファーを調製し、
マイクロタイタープレートの各列を上記９種類の濃度の
Ｃａ”＋イオンを含むバッファーでそれぞれ４回づつ洗
浄した。以下、ウシアルブミンによるブロッキング、モ
ノクローナル抗体の添加、第２抗体の添加及び発色の手
順は前記〔■〕と同様にして行った。
ートの９列にコーティングした。０゜０．１，０．２，
０．４．０．６．０．８．１．０．１．５．２．ＯｍＭ
のＣａＣ１をそれぞれ含む９種のＩＱｍＭ トリス−塩
酸（Ｉ）Ｈ＝７．５）、０．５ Ｍ ＩＶｌａＣｌ、０
．１％’ｒｗｅｅｎ２０からなるバッファーを調製し、
マイクロタイタープレートの各列を上記９種類の濃度の
Ｃａ”＋イオンを含むバッファーでそれぞれ４回づつ洗
浄した。以下、ウシアルブミンによるブロッキング、モ
ノクローナル抗体の添加、第２抗体の添加及び発色の手
順は前記〔■〕と同様にして行った。
結果を図−１に示した。
図−１よりり四−ン五］、２は、Ｃａ濃度に関係なく、
第Ｘ因子と結合している事がわカル。一方、りｏ −７
１Ｆｘ ５ 、６ ハＣａ＋＋ａ度の増加と伴に第Ｘ因
子への結合が増加している。又、クローン７ａ５，６の
第Ｘ因子への結合の最大量の１／２の時のＣａＣｌ２の
濃度は、０５〜ｌ、ＱｍＭであり、第■因子全コンホメ
ーション変化させるのに必要と云われている量と一致し
ていた。
第Ｘ因子と結合している事がわカル。一方、りｏ −７
１Ｆｘ ５ 、６ ハＣａ＋＋ａ度の増加と伴に第Ｘ因
子への結合が増加している。又、クローン７ａ５，６の
第Ｘ因子への結合の最大量の１／２の時のＣａＣｌ２の
濃度は、０５〜ｌ、ＱｍＭであり、第■因子全コンホメ
ーション変化させるのに必要と云われている量と一致し
ていた。
第１図は、本発明のモノクローナル抗体の特異性を示す
グラフである。 才１［１ｊｌ ［Ｃ♂“１ （ｒｎＭ）
グラフである。 才１［１ｊｌ ［Ｃ♂“１ （ｒｎＭ）
Claims (1)
- （１）血液凝固第IX因子がＣａ＾＋＾＋と結合したこと
によって生じるコンホメーシヨンのみを認識するモノク
ローナル抗体であって、他の金属イオンと結合した第I
X因子コンホメーシヨンは実質的に認識しないモノクロ
ーナル抗体。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP61198577A JPH06104071B2 (ja) | 1986-08-24 | 1986-08-24 | 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61198577A JPH06104071B2 (ja) | 1986-08-24 | 1986-08-24 | 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH06104071B2 JPH06104071B2 (ja) | 1994-12-21 |
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ID=16393489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61198577A Expired - Lifetime JPH06104071B2 (ja) | 1986-08-24 | 1986-08-24 | 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
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| JP (1) | JPH06104071B2 (ja) |
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-
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