JPS6355918B2 - - Google Patents
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- JPS6355918B2 JPS6355918B2 JP61274247A JP27424786A JPS6355918B2 JP S6355918 B2 JPS6355918 B2 JP S6355918B2 JP 61274247 A JP61274247 A JP 61274247A JP 27424786 A JP27424786 A JP 27424786A JP S6355918 B2 JPS6355918 B2 JP S6355918B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は水溶性の安定化されたペルオキシダー
ゼ（POD）、その製法及び過酸化水素の測定への
その使用に関する。 従来の技術 ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）は、診断薬
にしばしば使用される酵素である。特にこのペル
オキシダーゼは、オキシダーゼ触媒反応で生じた
過酸化水素を測定するのに使用される。この場合
色素成分が酸化結合して着色生成物を作り、この
量から測定すべき酵素又は基質の量を帰納的に求
めることができる。 PODは緩衝液中で十分に安定である。すなわ
ちその活性は数日貯蔵した場合にも下がらないか
又は極く僅かに低下するにすぎない。しかしこの
PODは例えばEDTAのような清浄剤及び／又は
錯化剤を含む、臨床化学で常用の試薬組成物内で
は不安定である。通常室温で６日間貯蔵した場合
その活性の＞90％が失われる。POD−活性がこ
の種の試薬を数日貯蔵した後もなお十分に存在す
ることを保証するには、通常ペルオキシダーゼを
数倍の過剰量で使用する。 しかしこの種の高いPOD−濃度の本質的な欠
点は、これによつて試薬の著しい欠乏が生じるこ
とである。これは酵素を含みかつ可視光線を吸収
するヘム基に帰因し、測定結果を不正確にする。 西ドイツ国特許第2919622号明細書から清浄剤
を含有する溶液に安定で水溶性の酵素誘導体を製
造する方法は公知である。この場合酵素をアルデ
ヒド基含有多糖類誘導体と反応させる。この方法
で改変された他の酵素と異なり（これは同様にし
て安定化可能である）、こうして改変されたペル
オキシダーゼは清浄剤及び／又は錯化剤を含む溶
液内では十分には改良された安定性を示さない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、その活性が清浄剤及び／又は
錯化剤を含む水溶液中で長期間に渡つて維持され
る水溶液のペルオキシダーゼ誘導体を提供するこ
とにある。 問題点を解決するための手段 この課題は本発明によれば、ペルオキシダーゼ
を過ヨウ素酸又はその塩で酸化し、炭素原子数１
〜８のアルキレン基１個又はそれ以上を介して多
糖類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン及びポリ酸無水物の群から選択される水溶
性ポリマーに結合することによつて得られる水溶
性のペルオキシダーセ誘導体によつて解決され
る。 この種の改変されたPOD−誘導体が、本質的
な酵素の特性を失うことなく、清浄剤及び／又は
錯化剤を含む溶液中で十分な貯蔵安定性を示すこ
とは予測することができなかつた。 ペルオキシダーゼの酸化は当業者の熟知する条
件下に過ヨウ素酸又はその塩、特にアルカリ塩を
用いて行う。これは例えばペルオキシダーゼ−抗
体複合体を製造する枠内で記載されている〔E.
Ishikawa著、“J.Immunoassay”第４巻、第209
頁〜第327頁（1983年）〕。この場合過ヨウ素酸又
は過ヨウ素酸塩は過剰量で使用するのが有利であ
る。特に有利なのは20〜200倍の過剰量である。
温度及びPH値は広範囲に変えることができる。し
かし弱酸（PH５〜６）中でまた冷却（0゜〜10℃）
下に反応は特に良好な収率で進行することが示さ
れている。酸化を実施した後、酸化剤を透析又は
クロマトグラフイ工程〔例えばセフアデツクス
（Sephadex） Ｇ−25で〕により除去することが
有利である。 もう１つの工程で、この酸化した酵素を水溶性
のポリマーに結合する。このポリマーとの結合は
自体公知の方法で行う。すなわち酸化したPOD
を水溶液中で溶解したポリマーと特定の条件下に
反応させる（例えば欧州特許第0069379号明細書
参照）。 ポリマーとして適当なものは水溶性多糖類、ポ
リエチレングリコール、ポリビニルピロリドン又
はポリ酸無水物である。優れた多糖類はデキスト
ランである。しかし極めて良好な効果は他の水溶
性多糖類、特に可溶性殿粉でも得られらる。例え
ばエピハロゲンヒドリン〔例えばフイコル
（Ficoll） 〕との反応によつて得られるような
単糖類及び二糖類の高分子ポリマーも適当なもの
として挙げられる。ポリ酸無水物としてはメチル
ビニルエーテルと無水マレイン酸とからなるコポ
リマーが特に適している。 ポリマーへの酸化PODの結合は、酸化PODと
反応する反応性基（例えばアミノ基）をポリマー
が含んでいる限り、他の中間工程なしに達成する
ことができる。ポリマーが反応性基を有さない場
合には、酸化PODとの反応前に有利に活性化し、
反応性基を施す。この方法は当業者の熟知すると
ころであり、例えば欧州特許第0069379号明細書
及びJ.K.Inman著、“J.Immunol”第114巻、第
704頁（1975年）に記載されている。 多糖類を活性化するには、ブロムシアン、１−
シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩
（CDAP）又は２，４，６−トリクロル−１，３，
５−トリアジン（TCT）と反応させることが有
利である。ポリエチレングリコールを活性化する
にはTCTとの反応が特に適している。同様にし
てカルボキシル基で負荷されたポリマーをＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミドと反応させて活性化する
こともできる。 優れた実施態様では、酸化PODは、分子中に
炭素原子を１〜８個有するアルキレン基１個又は
数個を介してポリマーに結合される。このため酸
化PODを適当なアルキレンジアミンと反応させ、
次いで場合によつては活性化されているポリマー
に結合させる。アルキレンジアミンとしては特に
エチレンジアミンが有利である。アルキレンジア
ミンとの結合を安定化するためにはポリマーとの
反応前に、有利には硼水素化物又はシアン硼水素
化物での還元工程を実施し、場合によつては改変
された酵素を透析又はクロマトグラフイ工程を介
して精製することが有利である。 この結合は０℃〜室温の温度でまたPH−価６〜
10で行うことが好ましい。酵素対ポリマーのモル
比は広範囲で変えることができる（１：１〜１：
20）。しかしモル比が約１：４の場合、結合生成
物は特に高い収率で得ることができる。 本発明によるPOD誘導体の分離は結合反応の
終了後に例えばアセトンを加え、沈殿させること
により行うことができる。しかし有利には透析又
はクロマトグラフイ処理により予め精製した後
に、得られた溶液を凍結乾燥する。 PODの誘導体化は酵素の特異性及び活性にマ
イナスの影響を及ぼすことはない。むしろ本発明
によるPOD誘導体のミハエリス定数（Michaelis
konstante）（基質 過酸化水素）は誘導体化さ
れていないPODのそれよりも明らかに小さいこ
とが予想外にも観察された。この誘導体は酸化水
素を測定するために、例えば臨床化学的測定用試
薬（例えば尿酸）に有利に使用することができ
る。小さなミハエリス定数及び、清浄剤及び／又
は錯化剤を含む試薬溶液中での改良された安定性
によつて、本発明によるPOD−誘導体の含有量
は、誘導体化されていないPODを使用する場合
よりも著しく少なくてよい。 実施例 次に実施例に基づき本発明を詳述する。 例 １ デキストランへの活性化ペルオキシダーゼの結
合 (a) PODの活性化 西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ（E.
L.1.11.1.7）５ｇをアセテート緩衝液（30ｍモ
ル／、PH5.5）250mlに溶かし、NaIO4（0.2モ
ル／）37.5mlを加え、室温で40分間インキユ
ベートする。引続きエチレングリコール37.5ml
（１モル／）を加え、更に室温で20分間イン
キユベートする。その後反応混合物をセフアデ
ツクスＧ−25カラムを介して精製する（溶離
剤：酢酸ナトリウム緩衝剤、PH5.5、10ｍモ
ル／）。 (b) エチレンジアミンとの反応 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液
（PH9.8）１モル／で溶離液のPH−値を9.5に
調整する。引続きエチレンジアミン溶液（PH
9.5）11.25ml（１モル／）を加える。次いで
22℃で１時間インキユベートし、その際上記の
炭酸塩／重炭酸塩緩衝液でPHを9.5に保つ（PH
スタツト）。 バツチをTRA（トリエタノールアミン）緩衝
液（PH7.0）１モル／でPH8.0に調整する。引
続きシアノ−硼水素化ナトリウム750mgを加え、
22℃で15分間インキユベートし、その際PH−値
をTRA−緩衝液でPH8.0に保つ（PH−スタツ
ト）。その後反応混合物をセフアデツクス−Ｇ
−25−カラムを介して精製する〔溶離剤：燐酸
塩緩衝液（PH7.0）10ｍモル／。〕 (c) デキストランへの結合 (b)で得られた酸化PODをCDAP−BF4−活性
デキストランT40に、J.J.Marshall著、
“Preservation of Enzymes by Conjugation
with Dextran”、American Chemical
Society Symposium Series、123（1980年）、
第125頁〜第140頁に記載されかつJ.Kohn及び
M.Wilchek著“the Use of Cyanogen
Bromide and other novel Cyanylating
Agents for the Activation of
Polysaccharide Resins、”“Appl.Biochem.
Biotech.”第９巻（1984年）、第285頁〜第305
頁により改変された方法で結合する。POD−
比活性15〜18U／mgが得られる。 例 ２ フイコル（Ficoll）へのペルオキシダーゼの結
合 例１に記載したようにしてペルオキシダーゼを
誘導体化し、デキストランT40の代りにフイコル
と反応させる。収量25〜30ｇとしてPOD−比活
性14〜17U／mgの凍結乾燥体が得られる。 例 ３ アミノデキストランへの結合 例１(b)により製造した反応混合物にアミノデキ
ストラン〔J.K.Inman著、“J.Immunol.”第114
巻、第704頁（1975年）により製造〕（分子量〜
40000）25ｇを加え、室温及びPH9.3で２時間イン
キユベートする。次いで例1bに記載したように
してPH8.0で硼水素化ナトリウム750mgで還元し、
例１に記載したようにして精製する。POD−活
性９〜14U／mgの凍結乾燥物25〜30ｇが得られ
る。 例 ４ デキストランへの天然PODの結合 西洋ワサビ−ペルオキシダーゼを例1cに記載し
たようにして直接CDAP−BF4−活性デキストラ
ンT40に結合する。 例 ５ 種々のPOD−誘導体の安定性比較：
ゼ（POD）、その製法及び過酸化水素の測定への
その使用に関する。 従来の技術 ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）は、診断薬
にしばしば使用される酵素である。特にこのペル
オキシダーゼは、オキシダーゼ触媒反応で生じた
過酸化水素を測定するのに使用される。この場合
色素成分が酸化結合して着色生成物を作り、この
量から測定すべき酵素又は基質の量を帰納的に求
めることができる。 PODは緩衝液中で十分に安定である。すなわ
ちその活性は数日貯蔵した場合にも下がらないか
又は極く僅かに低下するにすぎない。しかしこの
PODは例えばEDTAのような清浄剤及び／又は
錯化剤を含む、臨床化学で常用の試薬組成物内で
は不安定である。通常室温で６日間貯蔵した場合
その活性の＞90％が失われる。POD−活性がこ
の種の試薬を数日貯蔵した後もなお十分に存在す
ることを保証するには、通常ペルオキシダーゼを
数倍の過剰量で使用する。 しかしこの種の高いPOD−濃度の本質的な欠
点は、これによつて試薬の著しい欠乏が生じるこ
とである。これは酵素を含みかつ可視光線を吸収
するヘム基に帰因し、測定結果を不正確にする。 西ドイツ国特許第2919622号明細書から清浄剤
を含有する溶液に安定で水溶性の酵素誘導体を製
造する方法は公知である。この場合酵素をアルデ
ヒド基含有多糖類誘導体と反応させる。この方法
で改変された他の酵素と異なり（これは同様にし
て安定化可能である）、こうして改変されたペル
オキシダーゼは清浄剤及び／又は錯化剤を含む溶
液内では十分には改良された安定性を示さない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、その活性が清浄剤及び／又は
錯化剤を含む水溶液中で長期間に渡つて維持され
る水溶液のペルオキシダーゼ誘導体を提供するこ
とにある。 問題点を解決するための手段 この課題は本発明によれば、ペルオキシダーゼ
を過ヨウ素酸又はその塩で酸化し、炭素原子数１
〜８のアルキレン基１個又はそれ以上を介して多
糖類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン及びポリ酸無水物の群から選択される水溶
性ポリマーに結合することによつて得られる水溶
性のペルオキシダーセ誘導体によつて解決され
る。 この種の改変されたPOD−誘導体が、本質的
な酵素の特性を失うことなく、清浄剤及び／又は
錯化剤を含む溶液中で十分な貯蔵安定性を示すこ
とは予測することができなかつた。 ペルオキシダーゼの酸化は当業者の熟知する条
件下に過ヨウ素酸又はその塩、特にアルカリ塩を
用いて行う。これは例えばペルオキシダーゼ−抗
体複合体を製造する枠内で記載されている〔E.
Ishikawa著、“J.Immunoassay”第４巻、第209
頁〜第327頁（1983年）〕。この場合過ヨウ素酸又
は過ヨウ素酸塩は過剰量で使用するのが有利であ
る。特に有利なのは20〜200倍の過剰量である。
温度及びPH値は広範囲に変えることができる。し
かし弱酸（PH５〜６）中でまた冷却（0゜〜10℃）
下に反応は特に良好な収率で進行することが示さ
れている。酸化を実施した後、酸化剤を透析又は
クロマトグラフイ工程〔例えばセフアデツクス
（Sephadex） Ｇ−25で〕により除去することが
有利である。 もう１つの工程で、この酸化した酵素を水溶性
のポリマーに結合する。このポリマーとの結合は
自体公知の方法で行う。すなわち酸化したPOD
を水溶液中で溶解したポリマーと特定の条件下に
反応させる（例えば欧州特許第0069379号明細書
参照）。 ポリマーとして適当なものは水溶性多糖類、ポ
リエチレングリコール、ポリビニルピロリドン又
はポリ酸無水物である。優れた多糖類はデキスト
ランである。しかし極めて良好な効果は他の水溶
性多糖類、特に可溶性殿粉でも得られらる。例え
ばエピハロゲンヒドリン〔例えばフイコル
（Ficoll） 〕との反応によつて得られるような
単糖類及び二糖類の高分子ポリマーも適当なもの
として挙げられる。ポリ酸無水物としてはメチル
ビニルエーテルと無水マレイン酸とからなるコポ
リマーが特に適している。 ポリマーへの酸化PODの結合は、酸化PODと
反応する反応性基（例えばアミノ基）をポリマー
が含んでいる限り、他の中間工程なしに達成する
ことができる。ポリマーが反応性基を有さない場
合には、酸化PODとの反応前に有利に活性化し、
反応性基を施す。この方法は当業者の熟知すると
ころであり、例えば欧州特許第0069379号明細書
及びJ.K.Inman著、“J.Immunol”第114巻、第
704頁（1975年）に記載されている。 多糖類を活性化するには、ブロムシアン、１−
シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩
（CDAP）又は２，４，６−トリクロル−１，３，
５−トリアジン（TCT）と反応させることが有
利である。ポリエチレングリコールを活性化する
にはTCTとの反応が特に適している。同様にし
てカルボキシル基で負荷されたポリマーをＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミドと反応させて活性化する
こともできる。 優れた実施態様では、酸化PODは、分子中に
炭素原子を１〜８個有するアルキレン基１個又は
数個を介してポリマーに結合される。このため酸
化PODを適当なアルキレンジアミンと反応させ、
次いで場合によつては活性化されているポリマー
に結合させる。アルキレンジアミンとしては特に
エチレンジアミンが有利である。アルキレンジア
ミンとの結合を安定化するためにはポリマーとの
反応前に、有利には硼水素化物又はシアン硼水素
化物での還元工程を実施し、場合によつては改変
された酵素を透析又はクロマトグラフイ工程を介
して精製することが有利である。 この結合は０℃〜室温の温度でまたPH−価６〜
10で行うことが好ましい。酵素対ポリマーのモル
比は広範囲で変えることができる（１：１〜１：
20）。しかしモル比が約１：４の場合、結合生成
物は特に高い収率で得ることができる。 本発明によるPOD誘導体の分離は結合反応の
終了後に例えばアセトンを加え、沈殿させること
により行うことができる。しかし有利には透析又
はクロマトグラフイ処理により予め精製した後
に、得られた溶液を凍結乾燥する。 PODの誘導体化は酵素の特異性及び活性にマ
イナスの影響を及ぼすことはない。むしろ本発明
によるPOD誘導体のミハエリス定数（Michaelis
konstante）（基質 過酸化水素）は誘導体化さ
れていないPODのそれよりも明らかに小さいこ
とが予想外にも観察された。この誘導体は酸化水
素を測定するために、例えば臨床化学的測定用試
薬（例えば尿酸）に有利に使用することができ
る。小さなミハエリス定数及び、清浄剤及び／又
は錯化剤を含む試薬溶液中での改良された安定性
によつて、本発明によるPOD−誘導体の含有量
は、誘導体化されていないPODを使用する場合
よりも著しく少なくてよい。 実施例 次に実施例に基づき本発明を詳述する。 例 １ デキストランへの活性化ペルオキシダーゼの結
合 (a) PODの活性化 西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ（E.
L.1.11.1.7）５ｇをアセテート緩衝液（30ｍモ
ル／、PH5.5）250mlに溶かし、NaIO4（0.2モ
ル／）37.5mlを加え、室温で40分間インキユ
ベートする。引続きエチレングリコール37.5ml
（１モル／）を加え、更に室温で20分間イン
キユベートする。その後反応混合物をセフアデ
ツクスＧ−25カラムを介して精製する（溶離
剤：酢酸ナトリウム緩衝剤、PH5.5、10ｍモ
ル／）。 (b) エチレンジアミンとの反応 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液
（PH9.8）１モル／で溶離液のPH−値を9.5に
調整する。引続きエチレンジアミン溶液（PH
9.5）11.25ml（１モル／）を加える。次いで
22℃で１時間インキユベートし、その際上記の
炭酸塩／重炭酸塩緩衝液でPHを9.5に保つ（PH
スタツト）。 バツチをTRA（トリエタノールアミン）緩衝
液（PH7.0）１モル／でPH8.0に調整する。引
続きシアノ−硼水素化ナトリウム750mgを加え、
22℃で15分間インキユベートし、その際PH−値
をTRA−緩衝液でPH8.0に保つ（PH−スタツ
ト）。その後反応混合物をセフアデツクス−Ｇ
−25−カラムを介して精製する〔溶離剤：燐酸
塩緩衝液（PH7.0）10ｍモル／。〕 (c) デキストランへの結合 (b)で得られた酸化PODをCDAP−BF4−活性
デキストランT40に、J.J.Marshall著、
“Preservation of Enzymes by Conjugation
with Dextran”、American Chemical
Society Symposium Series、123（1980年）、
第125頁〜第140頁に記載されかつJ.Kohn及び
M.Wilchek著“the Use of Cyanogen
Bromide and other novel Cyanylating
Agents for the Activation of
Polysaccharide Resins、”“Appl.Biochem.
Biotech.”第９巻（1984年）、第285頁〜第305
頁により改変された方法で結合する。POD−
比活性15〜18U／mgが得られる。 例 ２ フイコル（Ficoll）へのペルオキシダーゼの結
合 例１に記載したようにしてペルオキシダーゼを
誘導体化し、デキストランT40の代りにフイコル
と反応させる。収量25〜30ｇとしてPOD−比活
性14〜17U／mgの凍結乾燥体が得られる。 例 ３ アミノデキストランへの結合 例１(b)により製造した反応混合物にアミノデキ
ストラン〔J.K.Inman著、“J.Immunol.”第114
巻、第704頁（1975年）により製造〕（分子量〜
40000）25ｇを加え、室温及びPH9.3で２時間イン
キユベートする。次いで例1bに記載したように
してPH8.0で硼水素化ナトリウム750mgで還元し、
例１に記載したようにして精製する。POD−活
性９〜14U／mgの凍結乾燥物25〜30ｇが得られ
る。 例 ４ デキストランへの天然PODの結合 西洋ワサビ−ペルオキシダーゼを例1cに記載し
たようにして直接CDAP−BF4−活性デキストラ
ンT40に結合する。 例 ５ 種々のPOD−誘導体の安定性比較：
【表】
試薬ａの組成：燐酸カリウム−緩衝液（PH8.2）
0.1モル／ NaN3 0.1％ EDTA 0.1％ ルテンソール（Lutensol）ON50 0.5％ コール酸ナトリウム ７ｍモル／ 誘導体化されていない（天然の）POD並びに
誘導体化されていないデキストラン定着POD（例
４）の安定性は極く僅かであるが、酸化後デキス
トラン定着されたPODの安定性は明らかに改良
されていることを示す。 例 ６ PODの安定性を清浄剤及びEDTA−添加剤と
の関連において測定した。その際次の結果が得ら
れた（インキユベート時間：37℃で16時間）：
0.1モル／ NaN3 0.1％ EDTA 0.1％ ルテンソール（Lutensol）ON50 0.5％ コール酸ナトリウム ７ｍモル／ 誘導体化されていない（天然の）POD並びに
誘導体化されていないデキストラン定着POD（例
４）の安定性は極く僅かであるが、酸化後デキス
トラン定着されたPODの安定性は明らかに改良
されていることを示す。 例 ６ PODの安定性を清浄剤及びEDTA−添加剤と
の関連において測定した。その際次の結果が得ら
れた（インキユベート時間：37℃で16時間）：
【表】
に試薬混合物で実施した。
例 ７ ミハエリス定数として（基質 過酸化水素）例
５の試薬混合物でラインウイーヴアー・バーク
（Lineweaver−Burk）法により次の数値が得ら
れる：
例 ７ ミハエリス定数として（基質 過酸化水素）例
５の試薬混合物でラインウイーヴアー・バーク
（Lineweaver−Burk）法により次の数値が得ら
れる：
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼを過ヨウ素酸又はその塩で
酸化し、炭素原子数１〜８のアルキレン基１個又
はそれ以上を介して多糖類、ポリエチレングリコ
ール、ポリビニルピロリドン及びポリ酸無水物の
群から選択される水溶性ポリマーに結合すること
によつて得られる、水溶性のペルオキシダーゼ誘
導体。 ２ アルキレン基がエチレン基である、特許請求
の範囲第１項記載の化合物。 ３ ポリマーが多糖類である、特許請求の範囲第
１項又は第２項記載の化合物。 ４ ペルオキシダーゼを過ヨウ素酸又はその塩で
酸化し、酸化したペルオキシダーゼを炭素原子数
１〜８のアルキレンジアミンと反応させ、多糖
類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリ
ドン又はポリ酸無水物の群から選択される水溶性
ポリマーに結合することを特徴とする、水溶性の
ペルオキシダーゼ誘導体の製法。 ５ 活性化されたポリマーに結合させる、特許請
求の範囲第４項記載の方法。 ６ ポリマーとして多糖類を使用する、特許請求
の範囲第４項又は第５項記載の方法。 ７ アルキレンジアミンとしてエチレンジアミン
をまたポリマーとして活性化された多糖類を使用
する、特許請求の範囲第４項記載の方法。
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