JPH03155779A - オリゴヌクレオチドと酵素の結合物およびその製造方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドと酵素の結合物およびその製造方法Info
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- JPH03155779A JPH03155779A JP2239167A JP23916790A JPH03155779A JP H03155779 A JPH03155779 A JP H03155779A JP 2239167 A JP2239167 A JP 2239167A JP 23916790 A JP23916790 A JP 23916790A JP H03155779 A JPH03155779 A JP H03155779A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、ＤＮＡハイブリッド形成またはポリメラー
ゼ連鎖反応で有用なオリゴヌクレオチドと酵素の共有結
合物に関する。
ゼ連鎖反応で有用なオリゴヌクレオチドと酵素の共有結
合物に関する。
生物学的物質中に存在する特定の核酸、関連する生物体
および遺伝子の特徴について試験するための一零ｕｉＤ
Ｎ ＡまたはＲＮＡプローブ類の使用は周知である。
および遺伝子の特徴について試験するための一零ｕｉＤ
Ｎ ＡまたはＲＮＡプローブ類の使用は周知である。
このようなプローブ類が効率的でないことが見い出され
ている領域としては、食品、血液および感染体に関する
他の生物学的被検体の診断上の試験、ならびに遺伝疾患
および遺伝子の異常を伴うガンのような特定疾患の存在
の診断が挙げられる。無同位体的に標識された合成オリ
ゴヌクレオチド類は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリ
ッド形成アッセイおよび、より最近では、米国特許筒４
．６８３．１９５号および同４，６８３．２０２号明細
書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応として普通知られ
ている増幅手段に広く使用されている。
ている領域としては、食品、血液および感染体に関する
他の生物学的被検体の診断上の試験、ならびに遺伝疾患
および遺伝子の異常を伴うガンのような特定疾患の存在
の診断が挙げられる。無同位体的に標識された合成オリ
ゴヌクレオチド類は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリ
ッド形成アッセイおよび、より最近では、米国特許筒４
．６８３．１９５号および同４，６８３．２０２号明細
書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応として普通知られ
ている増幅手段に広く使用されている。
プローブまたはプライマー類の使用は、特定条件下でそ
のプローブとプライマーが相補的なヌクレオチド類を有
する核酸と水素結合を介してハイブリッドを形成しうる
ことが根本的な原理である。
のプローブとプライマーが相補的なヌクレオチド類を有
する核酸と水素結合を介してハイブリッドを形成しうる
ことが根本的な原理である。
次に、ハイブリッド形成産物は直接または適切な試薬を
使用する増幅工程後適当に検出することができる。
使用する増幅工程後適当に検出することができる。
初期のプローブは、３２Ｐ標識ヌクレオシド三リン酸の
ような放射性同位体で標識されていた。しかしながら、
それらは多くの用途に適さず、そして安全性や認可を考
慮しさらに保存中に標識が自然崩壊するため一般には避
けられている。
ような放射性同位体で標識されていた。しかしながら、
それらは多くの用途に適さず、そして安全性や認可を考
慮しさらに保存中に標識が自然崩壊するため一般には避
けられている。
ヨーロッパ特許公開第２７８２２０号及び米国特許筒４
．７８０．４０５号公報に記載されるように、前記のよ
うな短所を持たずプローブ類に適する標識を見い出すべ
く研究が続けられてきた。例えば、ヨーロッパ特許公開
第３０４９３４号公報に記載されているように、標識オ
リゴヌクレオチドに対する標識類として酵素標識が最と
も一般的に使用されるようになっできた。
．７８０．４０５号公報に記載されるように、前記のよ
うな短所を持たずプローブ類に適する標識を見い出すべ
く研究が続けられてきた。例えば、ヨーロッパ特許公開
第３０４９３４号公報に記載されているように、標識オ
リゴヌクレオチドに対する標識類として酵素標識が最と
も一般的に使用されるようになっできた。
国際出願公開第８９１０２９３２号公報は、共有結合を
形成するためのオリゴヌクレオチドに対する西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの結合方法を記載する。
形成するためのオリゴヌクレオチドに対する西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの結合方法を記載する。
この結合物の生成では、メルカプト機能化オリゴヌクレ
オチドがマレイミド機能化西洋ワサビペルオキシダーゼ
と反応されている。この方法は当該技術分野の進歩を示
すものであるが、メルカプト機能化オリゴヌクレオチド
の酸化生成物のような好ましくない副生成物を避け、な
らびに時間のかかる複雑な調製工程を避けるようなさら
なる改良が望まれている。さらに、千オール機能化オリ
ゴヌクレオチドは不安定で保存期間を制限した。最高の
効率を発揮するには、それが調製された直後にそれを使
用しなければならなかった。
オチドがマレイミド機能化西洋ワサビペルオキシダーゼ
と反応されている。この方法は当該技術分野の進歩を示
すものであるが、メルカプト機能化オリゴヌクレオチド
の酸化生成物のような好ましくない副生成物を避け、な
らびに時間のかかる複雑な調製工程を避けるようなさら
なる改良が望まれている。さらに、千オール機能化オリ
ゴヌクレオチドは不安定で保存期間を制限した。最高の
効率を発揮するには、それが調製された直後にそれを使
用しなければならなかった。
（発明が解決しようとする課題〕
従って、改良された収率と安定性を有する酵素標識オリ
ゴヌクレオチド結合物を提供しうる方法を入手すること
は非常に有益であろう。また、苛酷なオリゴヌクレオチ
ド試薬の副反応を回避可能にすることも望まれるであろ
う。
ゴヌクレオチド結合物を提供しうる方法を入手すること
は非常に有益であろう。また、苛酷なオリゴヌクレオチ
ド試薬の副反応を回避可能にすることも望まれるであろ
う。
前述した既知方法に関連する課題は、下記工程ヲ含んで
なるオリゴヌクレオチドと酵素の共有結合物を製造する
方法によって解決される。
なるオリゴヌクレオチドと酵素の共有結合物を製造する
方法によって解決される。
すなわち、
Ａ０反応性アミノ基または反応性アミノ基に転化しうる
基のいずれかを有する酵素と、縮合反応によって前記反
応性アミノ基と反応し、かつ、次式 ％式％ （上式中、Ｒ＊は前記反応性アミノ基と反応しうる基で
あり、 ＬＩＮＬ−は二価の有機部分であり、そして−ＢＬＯＣ
Ｋはメルカプト基を非求核性にするようにそのメルカプ
ト基と反応しうる化合から誘導されるものであって、そ
の後除去される基を表わす）で示されるブロックされた
メルカプト置換有機化金物とを反応させ、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−Ｎｉ１−は水素原子が反応性アミノ基か
ら除去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生
成する工程、 Ｂ、中間体Ａから−ｎＬＯｃＫを除去して、次式％式％ で示される試薬を生成する工程、 Ｃ３次式 一＃−ｏ−ｙは、水酸基が末端ホスフェートの３′１１ または５′末端でそれから除去されたオリゴヌクレオチ
ド鎖を表わす）で示される活性化オリゴヌクレオチド誘
導体を供給する工程、ならびにり、工程Ｃで供給された
前記活性化オリゴヌクレオチド誘導体と工程Ｂで生成さ
れた試薬を反応させて、次式 （上式中、−ＬＩＮＫ、−は、１個以上のオキシ、チオ
、イミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イミ
ノカルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン基
で中断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わし
、そして （上式中、Ｘ −Ｎ１１ 、−ＬＩＮＫ、 −、−ＬＩ
ＮＫｚ−およで示される結合物を生成する工程。
基のいずれかを有する酵素と、縮合反応によって前記反
応性アミノ基と反応し、かつ、次式 ％式％ （上式中、Ｒ＊は前記反応性アミノ基と反応しうる基で
あり、 ＬＩＮＬ−は二価の有機部分であり、そして−ＢＬＯＣ
Ｋはメルカプト基を非求核性にするようにそのメルカプ
ト基と反応しうる化合から誘導されるものであって、そ
の後除去される基を表わす）で示されるブロックされた
メルカプト置換有機化金物とを反応させ、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−Ｎｉ１−は水素原子が反応性アミノ基か
ら除去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生
成する工程、 Ｂ、中間体Ａから−ｎＬＯｃＫを除去して、次式％式％ で示される試薬を生成する工程、 Ｃ３次式 一＃−ｏ−ｙは、水酸基が末端ホスフェートの３′１１ または５′末端でそれから除去されたオリゴヌクレオチ
ド鎖を表わす）で示される活性化オリゴヌクレオチド誘
導体を供給する工程、ならびにり、工程Ｃで供給された
前記活性化オリゴヌクレオチド誘導体と工程Ｂで生成さ
れた試薬を反応させて、次式 （上式中、−ＬＩＮＫ、−は、１個以上のオキシ、チオ
、イミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イミ
ノカルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン基
で中断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わし
、そして （上式中、Ｘ −Ｎ１１ 、−ＬＩＮＫ、 −、−ＬＩ
ＮＫｚ−およで示される結合物を生成する工程。
以下、本発明を具体的に説明する。
発明明書において使用する場合、「誘導化メルカプト」
の語は、ブロックされた（すなわち、保護された）メル
カプｌ−ｇを称する。このメルカプト基は、本明りＩｌ
書で開示されるような有機スペーサー鎖によって得られ
る試薬の酵素部分から一定の間隔を保たれる。
の語は、ブロックされた（すなわち、保護された）メル
カプｌ−ｇを称する。このメルカプト基は、本明りＩｌ
書で開示されるような有機スペーサー鎖によって得られ
る試薬の酵素部分から一定の間隔を保たれる。
「ブロックされた」メルカプト基とは、「ブロッキング
」基が存在する限り化学反応から保護されるものを称す
る。このような「ブロッキング」基はその後除去または
開裂されてメルカプト基の反応を可能にする。
」基が存在する限り化学反応から保護されるものを称す
る。このような「ブロッキング」基はその後除去または
開裂されてメルカプト基の反応を可能にする。
この発明によって提供される共有結合物は、次の一般式
で示される。
で示される。
り
上式中、Ｘ−Ｎｉ１−は、反応性アミノ基または反応性
アミノ基に転化しうる基のいずれかであって、その反応
性アミノ基から水素原子が除去された酵素を表わす。「
反応性アミノ基」とは、利用可能で適当な試薬（後述）
と容易に反応するアミノ基を意味する。
アミノ基に転化しうる基のいずれかであって、その反応
性アミノ基から水素原子が除去された酵素を表わす。「
反応性アミノ基」とは、利用可能で適当な試薬（後述）
と容易に反応するアミノ基を意味する。
もともと反応性アミノ基を有するる酵素がこの発明の実
施に際して利用することができ、限定されるものでない
が、これらの酵素としてはペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。最初の４種
の酵素が好ましく、そのうちペルオキシダーゼが最とも
好ましいものである。
施に際して利用することができ、限定されるものでない
が、これらの酵素としてはペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。最初の４種
の酵素が好ましく、そのうちペルオキシダーゼが最とも
好ましいものである。
搬た別に、酵素は何等かの方法で化学的に変性して反応
性アミノ基を供給してもよい。しかしながら、この方法
は、酵素が適切な検出可能性を維持しそしてその活性を
持続しうるためには、その酵素部分が適当な基質との反
応性を持続するような方法で行われねばならない。
性アミノ基を供給してもよい。しかしながら、この方法
は、酵素が適切な検出可能性を維持しそしてその活性を
持続しうるためには、その酵素部分が適当な基質との反
応性を持続するような方法で行われねばならない。
酵素は、その反応性アミノ基と反応しうるメルカプト置
換有機化合物から誘導された二価の有機部分を表わす−
ＬＩＮＫ、 −３−を介して結合物中のす に連結される。従って、メルカプ）を換有機化合物は、
活性化カルボキシル基、酸無水物基活性化エステル基ま
たは酸ハロゲン化基１個以上を有する。−ＬＩＮＬ 一
部分は、１個以上のカルボニル、オキシまたは後に−Ｌ
ＩＮＫｚ−を定義するために使用するような他の非炭化
水素部分によって中断されていてもよい鎖中に二価の脂
肪族基（直鎖または飽和炭素環）、芳香族基（例、フェ
ニレン）または複素環式基を有するいずれか適当な二価
の有機部分を表わす、一般に、−ＬＩＮＫ、−は２８〜
２０００の範囲内にある分子量を有する。好ましくは、
ＬＩＮＫ＋ −は、メルカプト置換酸無水物、例えばＳ
−メルク・ブト無水コハク酸から誘導される。
換有機化合物から誘導された二価の有機部分を表わす−
ＬＩＮＫ、 −３−を介して結合物中のす に連結される。従って、メルカプ）を換有機化合物は、
活性化カルボキシル基、酸無水物基活性化エステル基ま
たは酸ハロゲン化基１個以上を有する。−ＬＩＮＬ 一
部分は、１個以上のカルボニル、オキシまたは後に−Ｌ
ＩＮＫｚ−を定義するために使用するような他の非炭化
水素部分によって中断されていてもよい鎖中に二価の脂
肪族基（直鎖または飽和炭素環）、芳香族基（例、フェ
ニレン）または複素環式基を有するいずれか適当な二価
の有機部分を表わす、一般に、−ＬＩＮＫ、−は２８〜
２０００の範囲内にある分子量を有する。好ましくは、
ＬＩＮＫ＋ −は、メルカプト置換酸無水物、例えばＳ
−メルク・ブト無水コハク酸から誘導される。
さらに本発明の結合物を特定すると、−ＬＩＮＫ、−は
、オキシ、チオ、イミノ、カルボニルイミノ（−ＣＯＮ
Ｈ−） 、イミノカルボニル（−ＮＨＣＯ−）、イミノ
カルボニルオキシ（−ＮＨＣＯＯ−） 、ホスフェート
またはウレイレン（−ＮＨＣＯＮＨ−”） 基１ 個以
上によって中断または停止されていてもよい二価の炭化
水素鎖を表わす。一般に、この炭化水素鎖は、２８〜２
０００の分子量を有し、そして１個以上の低級アルキル
（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは分枝鎖）または低級
ヒドロキシアルキル（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは
分枝鎖）で置換されていてもよい、好ましくは、この炭
化水素鎖は、少なくとも１個のオキシダーゼによって中
断されている。より好ましくは、それがオリゴヌクレオ
チド末端上でのアルキレンオキシ基により停止されてお
り、その逆の末端上でアルキレン基（例、メチレンまた
はエチレン）によって停止されている。
、オキシ、チオ、イミノ、カルボニルイミノ（−ＣＯＮ
Ｈ−） 、イミノカルボニル（−ＮＨＣＯ−）、イミノ
カルボニルオキシ（−ＮＨＣＯＯ−） 、ホスフェート
またはウレイレン（−ＮＨＣＯＮＨ−”） 基１ 個以
上によって中断または停止されていてもよい二価の炭化
水素鎖を表わす。一般に、この炭化水素鎖は、２８〜２
０００の分子量を有し、そして１個以上の低級アルキル
（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは分枝鎖）または低級
ヒドロキシアルキル（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは
分枝鎖）で置換されていてもよい、好ましくは、この炭
化水素鎖は、少なくとも１個のオキシダーゼによって中
断されている。より好ましくは、それがオリゴヌクレオ
チド末端上でのアルキレンオキシ基により停止されてお
り、その逆の末端上でアルキレン基（例、メチレンまた
はエチレン）によって停止されている。
１
前記結合物の構造中、−Ｐ−０−Ｙは、水酸基Ｈ
が末端ホスフェートの３′または５′末端でそれから除
去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。
去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。
好ましくは、水酸基が５′末端で除去されたものである
。従って、分析、治療または配列決定の目的でプローブ
、プライマーまたは他の酵素Ｉｎされた分子として使用
するためにいずれかのオリゴヌクレオチドを結合するこ
とができる。
。従って、分析、治療または配列決定の目的でプローブ
、プライマーまたは他の酵素Ｉｎされた分子として使用
するためにいずれかのオリゴヌクレオチドを結合するこ
とができる。
この発明の共有結合物は、次の構造を有することができ
る。
る。
上式中、Ｘ−Ｎ１１−は前記で定義したような酵素を表
わし、 Ｒ’、Ｒ”、Ｒ３，ｔ、ｉよびＲ４は、独立シテ水素、
炭素原子１〜３個のアルキル（例、メチル、エチル、ｎ
−プロピルもしくはｉ−プロピル）または炭素原子１〜
３個のヒドロキシアルキル、（例、ヒト上式中、Ｘ−１
１１１−がペルオキシダーゼに由来し、そしてＲ’、Ｒ
”、Ｒ’、Ｒ’＋ｍ、ｎおよび１ −ｐ−ｏ−ｙが直前に定義したようなものである。
わし、 Ｒ’、Ｒ”、Ｒ３，ｔ、ｉよびＲ４は、独立シテ水素、
炭素原子１〜３個のアルキル（例、メチル、エチル、ｎ
−プロピルもしくはｉ−プロピル）または炭素原子１〜
３個のヒドロキシアルキル、（例、ヒト上式中、Ｘ−１
１１１−がペルオキシダーゼに由来し、そしてＲ’、Ｒ
”、Ｒ’、Ｒ’＋ｍ、ｎおよび１ −ｐ−ｏ−ｙが直前に定義したようなものである。
１１
この発明の結合物は、所定の安定性を有する各種中間体
を経て誘導体化酵素およびオリゴヌクレオチドと連結部
分との反応を伴う一連の工程を使用して製造され、かつ
好収率で実施されるが好ましくない副生成物は与えない
。
を経て誘導体化酵素およびオリゴヌクレオチドと連結部
分との反応を伴う一連の工程を使用して製造され、かつ
好収率で実施されるが好ましくない副生成物は与えない
。
この発明の第一の工程では、反応性アミノ基（前記で定
義したような）を有する酵素がブロックされた（保護さ
れた）メルカプ）Ｉｌ！Ａ存機化合物と反応される。他
方、酵素が必要な反応性アミロキシメチル、２−ヒドロ
キシエチルおよび当業者に自明の他の基）であり、ｍは
２〜１２の正の整数であり、ｎは１〜５０の正の整数で
あり、そしてＨ 除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。
義したような）を有する酵素がブロックされた（保護さ
れた）メルカプ）Ｉｌ！Ａ存機化合物と反応される。他
方、酵素が必要な反応性アミロキシメチル、２−ヒドロ
キシエチルおよび当業者に自明の他の基）であり、ｍは
２〜１２の正の整数であり、ｎは１〜５０の正の整数で
あり、そしてＨ 除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。
より好ましくは、前記構造のＲ’、Ｒ”、ＲｓおよびＲ
４は、独立して水素、メチルまたはヒドロキシメチルで
あり、ｍは２であり、そしてｎは１〜１５である。
４は、独立して水素、メチルまたはヒドロキシメチルで
あり、ｍは２であり、そしてｎは１〜１５である。
ある結合物では、酵素がペルオキシダーゼであり、オリ
ゴヌクレオチドが配列 ５ ’ −ＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ
ＧＴＧ−３’を有し、Ｒ＋、Ｒｚ、ＲｉおよびＲ４がそ
れぞれ水素であり、ｍが２であり、そしてｎが１〜１５
である。
ゴヌクレオチドが配列 ５ ’ −ＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ
ＧＴＧ−３’を有し、Ｒ＋、Ｒｚ、ＲｉおよびＲ４がそ
れぞれ水素であり、ｍが２であり、そしてｎが１〜１５
である。
有用な結合物は次の構造を有する。
ノ基を持たない場合には、反応性アミノ基に転化するこ
とができる基をそれが有することができる。
とができる基をそれが有することができる。
メルカプト基は、この工程中で早（反応しすぎないよう
にブロックされる。この有機化合物は次の構造を有する
。
にブロックされる。この有機化合物は次の構造を有する
。
Ｒ” −ＬＩＮＫＩ −３−ＢＬＯＣに上式中、Ｒ９は
反応性アミノ基と反応しうる基である。ある例では、Ｒ
“が縮合によって有機化合物を放出する。他の例では、
それが化合物を放出することなく、アミノ基との反応に
よって活性になる部位から除去されるかも知れない（例
えば、酸無水物の開環の場合）。
反応性アミノ基と反応しうる基である。ある例では、Ｒ
“が縮合によって有機化合物を放出する。他の例では、
それが化合物を放出することなく、アミノ基との反応に
よって活性になる部位から除去されるかも知れない（例
えば、酸無水物の開環の場合）。
限定されるものでないが、Ｒ“の代表例としては、ハロ
ゲン（クロロ、ブロモもしくはヨード）、スルホネート
（例えば、ｐ−トルエンスルホネート、ｐ−ブロモベン
ゼンスルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネートも
しくはメタンスルホネート） 、−０ＣＯＲ（式中、Ｒ
は脂腺族（例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピルもし
くはペンチル）、芳香族（例えば、フェニルもしくはト
ルイル）または複素環（例えば、ピリジン）〕、カルボ
ン酸、アシルハライド、アミド、エステル（直鎖、分枝
鎖もしくは環状基を有する脂肪族または前記で定義した
ような芳香族）および酸無水物（例えば、アセチックベ
ンゾイック、無水コハク酸および無水フタル酸）が挙げ
られる。好ましくは、Ｒ１は酸無水物であり、最とも好
ましくは環中に原子６個までを有する脂肪族環状酸無水
物残基である。
ゲン（クロロ、ブロモもしくはヨード）、スルホネート
（例えば、ｐ−トルエンスルホネート、ｐ−ブロモベン
ゼンスルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネートも
しくはメタンスルホネート） 、−０ＣＯＲ（式中、Ｒ
は脂腺族（例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピルもし
くはペンチル）、芳香族（例えば、フェニルもしくはト
ルイル）または複素環（例えば、ピリジン）〕、カルボ
ン酸、アシルハライド、アミド、エステル（直鎖、分枝
鎖もしくは環状基を有する脂肪族または前記で定義した
ような芳香族）および酸無水物（例えば、アセチックベ
ンゾイック、無水コハク酸および無水フタル酸）が挙げ
られる。好ましくは、Ｒ１は酸無水物であり、最とも好
ましくは環中に原子６個までを有する脂肪族環状酸無水
物残基である。
前記有機化合物中の−ＬＩＮＫ＋ −基は前記で定義し
たとおりである。
たとおりである。
−ＢＬＯＣＫ基は、メルカプト基と反応することができ
、そして−ＢＬＯＣＫが何等かの方法によって除去され
てしまうまでメルカプト基を不活化することができる化
合物から誘導される。限定されるものでないが、代表的
な一〇ＬＯＣＫ部分としては、式−ＣＯＲ’で示され、
この式中Ｒ′は分子１１５〜２００を有する脂肪族（直
鎖、分枝鎖もしくは環状）、芳香族または複素環式基、
例えばメチル、エチル、フェニルまたはピリジルが挙げ
られる。他の有用な−ＢＬＯＣＫ基は、チオピリジル、
２−カルボキシ−４−二トロフェニルチオ、トリフェニ
ルメチルまたはベンゾイルである。好ましくは、−ＢＬ
ＯＣＫは、−ＣＯＲ’ （Ｒ’がメチルまたはフェニ
ル）で示される基である。
、そして−ＢＬＯＣＫが何等かの方法によって除去され
てしまうまでメルカプト基を不活化することができる化
合物から誘導される。限定されるものでないが、代表的
な一〇ＬＯＣＫ部分としては、式−ＣＯＲ’で示され、
この式中Ｒ′は分子１１５〜２００を有する脂肪族（直
鎖、分枝鎖もしくは環状）、芳香族または複素環式基、
例えばメチル、エチル、フェニルまたはピリジルが挙げ
られる。他の有用な−ＢＬＯＣＫ基は、チオピリジル、
２−カルボキシ−４−二トロフェニルチオ、トリフェニ
ルメチルまたはベンゾイルである。好ましくは、−ＢＬ
ＯＣＫは、−ＣＯＲ’ （Ｒ’がメチルまたはフェニ
ル）で示される基である。
前記有機化合物と本明細書で定義されるような酵素の反
応は、一般に、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は水素原子が除去された反応度と
時間で大気圧下にて実施される。−船釣に温度は０〜３
７℃の範囲内にあり、適するｐＨ条件は６〜９の範囲内
にある。しかしながら、これらの条件は使用される酵素
および有機化合物に応じて変動するであろう。例えば、
ｐＨおよび温度は活性を維持するように酵素に対して適
切であらねばならない。この有機化合物は水に少なくと
も部分的に溶解もしくは分散性であり、あるいは分散も
しくは酵素との反応を促進するような水混和性溶媒中に
供給される。このような溶媒は、酵素の反応性を害しな
い量で使用されねばならない。
応は、一般に、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は水素原子が除去された反応度と
時間で大気圧下にて実施される。−船釣に温度は０〜３
７℃の範囲内にあり、適するｐＨ条件は６〜９の範囲内
にある。しかしながら、これらの条件は使用される酵素
および有機化合物に応じて変動するであろう。例えば、
ｐＨおよび温度は活性を維持するように酵素に対して適
切であらねばならない。この有機化合物は水に少なくと
も部分的に溶解もしくは分散性であり、あるいは分散も
しくは酵素との反応を促進するような水混和性溶媒中に
供給される。このような溶媒は、酵素の反応性を害しな
い量で使用されねばならない。
しかしながら、得られた中間体はチオ基にブロッキング
基が結合しているので、そのままでは利用できない１次
いで、それを除去して次式％式％ （上式中、Ｘ−Ｎｉ１−および−ＬＩＮＫ＋−は前記で
定義したとおりである）で示される反応性試薬を生成す
る。ブロッキング基の除去は、一般に、ヒドロキシルア
ミンとエチレンジアミン四酢酸含有リン酸緩衝液（ｐ１
１７．４）で好ましい化合物を処理することによって行
われる。特定のブロッキング基を除去する他の条件は、
当業者にとって自明であろう。
基が結合しているので、そのままでは利用できない１次
いで、それを除去して次式％式％ （上式中、Ｘ−Ｎｉ１−および−ＬＩＮＫ＋−は前記で
定義したとおりである）で示される反応性試薬を生成す
る。ブロッキング基の除去は、一般に、ヒドロキシルア
ミンとエチレンジアミン四酢酸含有リン酸緩衝液（ｐ１
１７．４）で好ましい化合物を処理することによって行
われる。特定のブロッキング基を除去する他の条件は、
当業者にとって自明であろう。
次に、活性化オリゴヌクレオチド誘導体が反応に供され
る。この誘導体は次式 で定義したとおりである）で示される。
る。この誘導体は次式 で定義したとおりである）で示される。
この反応性オリゴヌクレオチド誘導体は、一般に次のよ
うに供給することができる。適当なアミノエチレングリ
コール試薬（所定の鎖長を有する）を、２００℃溶媒不
存在下で無水フタル酸と反応させる。次に、得られた生
成物を、２０〜２５°Ｃにて塩化メチレン中でホスフィ
ン試薬と反応させる０次に、自動化シンセサイザーと標
準的な手段を使用してコンドロールド・ポアー・ガラス
（ｃｏｎ ｔｒｏ ｌ １ｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）
に結合された適当なオリゴヌクレオチドと前記生成物を
反応させ、遊離アミノ基を有する誘導体化されたオリゴ
ヌクレオチドを生成する。この誘導体化されたオリゴヌ
クレオチドをスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
と反応させて前記式で示した活性化オリゴヌクレオチド
誘導体を生成する。
うに供給することができる。適当なアミノエチレングリ
コール試薬（所定の鎖長を有する）を、２００℃溶媒不
存在下で無水フタル酸と反応させる。次に、得られた生
成物を、２０〜２５°Ｃにて塩化メチレン中でホスフィ
ン試薬と反応させる０次に、自動化シンセサイザーと標
準的な手段を使用してコンドロールド・ポアー・ガラス
（ｃｏｎ ｔｒｏ ｌ １ｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）
に結合された適当なオリゴヌクレオチドと前記生成物を
反応させ、遊離アミノ基を有する誘導体化されたオリゴ
ヌクレオチドを生成する。この誘導体化されたオリゴヌ
クレオチドをスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
と反応させて前記式で示した活性化オリゴヌクレオチド
誘導体を生成する。
最後に、前記活性化オリゴヌクレオチド誘導体をブロッ
クされていない酵素試薬と反応させて目的の結合物を生
成する。この反応の反応条件は、リン酸緩衝溶液（ｐＨ
７、４）中４°Ｃで１５時間が一般的であるが、これら
の条件は種々の試薬について変動してもよい。
クされていない酵素試薬と反応させて目的の結合物を生
成する。この反応の反応条件は、リン酸緩衝溶液（ｐＨ
７、４）中４°Ｃで１５時間が一般的であるが、これら
の条件は種々の試薬について変動してもよい。
ある実施７３Ｍ様では、オリゴヌクレオチドと酵素との
共有結合物の製造方法は次の工程を含んでなる。
共有結合物の製造方法は次の工程を含んでなる。
Ａ１反応性アミノ基を有する酵素をＳ−アセチルメルカ
プト無水コハク酸と反応させて、次式す（これらの基は
前記で定義したとおりである）〕で示される中間体を生
成する工程、 Ｂ、工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−Ｎ１１−およびＲ’ は前記で定義した
とおりである）で示される反応性メルカプト置換中間体
を生成する工程、 Ｃ０次式 〔上式中、Ｘ−Ｎ１１−は、水素原子が除去された反応
アミノ基を有する酵素を表わし、そしてＲ１は水素、炭
素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１〜３個のヒ
ドロキシアルキルを表わ（上式中、−Ｐ−０−Ｙは、水
酸基が末端ホスフＨ エートからその５′末端で除去されたオリゴヌクレオチ
ド鎖を表わし、Ｒｚ、ＲａおよびＲ４は、独立して水素
、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１〜３個
のヒドロキシアルキルであり、ｍは２〜１２の正の整数
であり、そしてｎは１〜５０の正の整数である）で示さ
れる機能化オリゴヌクレオチド反応体を供給する工程、 Ｄ、工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに 巳、工程りで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−８１１−、Ｒ’、Ｒ”、Ｒり、Ｒ’、ｍ
、ｎお１ よび−Ｐ−０−Ｙは前記で定義したとおりである）１１ で示される結合物を生成する工程。
プト無水コハク酸と反応させて、次式す（これらの基は
前記で定義したとおりである）〕で示される中間体を生
成する工程、 Ｂ、工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 ％式％ （上式中、Ｘ−Ｎ１１−およびＲ’ は前記で定義した
とおりである）で示される反応性メルカプト置換中間体
を生成する工程、 Ｃ０次式 〔上式中、Ｘ−Ｎ１１−は、水素原子が除去された反応
アミノ基を有する酵素を表わし、そしてＲ１は水素、炭
素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１〜３個のヒ
ドロキシアルキルを表わ（上式中、−Ｐ−０−Ｙは、水
酸基が末端ホスフＨ エートからその５′末端で除去されたオリゴヌクレオチ
ド鎖を表わし、Ｒｚ、ＲａおよびＲ４は、独立して水素
、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１〜３個
のヒドロキシアルキルであり、ｍは２〜１２の正の整数
であり、そしてｎは１〜５０の正の整数である）で示さ
れる機能化オリゴヌクレオチド反応体を供給する工程、 Ｄ、工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに 巳、工程りで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−８１１−、Ｒ’、Ｒ”、Ｒり、Ｒ’、ｍ
、ｎお１ よび−Ｐ−０−Ｙは前記で定義したとおりである）１１ で示される結合物を生成する工程。
この態様では、最とも好ましくは、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’お
よびＲ４が水素であり、ｍが２であり、口が１〜１５テ
アリ、Ｘ−旧１−がペルオキシダーゼから誘導される。
よびＲ４が水素であり、ｍが２であり、口が１〜１５テ
アリ、Ｘ−旧１−がペルオキシダーゼから誘導される。
一本鎖オリゴヌクレオチドに共有結合した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを有する結合物は、本例によって製造さ
れた。
ルオキシダーゼを有する結合物は、本例によって製造さ
れた。
礼−料
本例で使用したオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｔ。
ＧおよびＣが４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド
三リン酸組成を表わす場合に下記５ ’ −ＧＡＧＴＧ
ＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧ−３’示す配列
を有していて、その５′水酸基を介して−ＬＩＮＫ！−
に結合した。
三リン酸組成を表わす場合に下記５ ’ −ＧＡＧＴＧ
ＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧ−３’示す配列
を有していて、その５′水酸基を介して−ＬＩＮＫ！−
に結合した。
各種の材料および装置は次のように入手した。
ビオサーチ８７００ ＯＮＡシンセサイザー（Ｂｉｏｓ
ｅａｒｃｈ８７００ ＤＮＡ ５ｙｎＬｈｅｓｉｚｅｒ
’） はＭｉｌｌｉｇｅｎ／ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈか
ら、コンドロールド・ポアー・ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌ−ｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）支持体はＢｉｏｓｅ
ａｒｃｈから、スペクトロポアーＳｐｅｃｔｒｏ Ｐｏ
ｒ−商標−）２透析バツグはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｉｎｄ、（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、 （：
ａｌｉｆｏｒｎｉａ）から、撹拌セルコンセントレータ
−はＡｎ＋１ｃｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ＋ Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ）から、ＰＤ−１０およびＮＡＰ−１０
カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ、 Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から、そしてＤＥＡＲ−アガロースカラムは
−ａ ｔｅｒｓから入手した。
ｅａｒｃｈ８７００ ＤＮＡ ５ｙｎＬｈｅｓｉｚｅｒ
’） はＭｉｌｌｉｇｅｎ／ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈか
ら、コンドロールド・ポアー・ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌ−ｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）支持体はＢｉｏｓｅ
ａｒｃｈから、スペクトロポアーＳｐｅｃｔｒｏ Ｐｏ
ｒ−商標−）２透析バツグはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｉｎｄ、（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、 （：
ａｌｉｆｏｒｎｉａ）から、撹拌セルコンセントレータ
−はＡｎ＋１ｃｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ＋ Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ）から、ＰＤ−１０およびＮＡＰ−１０
カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ、 Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から、そしてＤＥＡＲ−アガロースカラムは
−ａ ｔｅｒｓから入手した。
１１１
４℃で炭酸ナトリウム溶液（１３，４ｍ、０．１モル濃
度、ｐＨ９，５）で西洋ワサビペルオキシダーゼ（１０
０■、乾燥重量）を溶解し、次いで乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド中Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸
溶液（１７，４■／−の３００ｍ）と４℃以下で１時間
反応させた。脱イオン蒸留水で１０分間予め湿潤したス
ペクトロポア２透析バツグ中にこの混合物をピペットで
移した０次に、反応混合物容量の５０倍を使用するリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）中にバッグを入れ、そして約
４時間４°Ｃでゆっくり撹拌した。アミコンコンセント
レータ−（Ａｍｉｃｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）
を使用して前記溶液を目的中間体２０〜３０■／ｄにな
るまで濃縮した。
度、ｐＨ９，５）で西洋ワサビペルオキシダーゼ（１０
０■、乾燥重量）を溶解し、次いで乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド中Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸
溶液（１７，４■／−の３００ｍ）と４℃以下で１時間
反応させた。脱イオン蒸留水で１０分間予め湿潤したス
ペクトロポア２透析バツグ中にこの混合物をピペットで
移した０次に、反応混合物容量の５０倍を使用するリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）中にバッグを入れ、そして約
４時間４°Ｃでゆっくり撹拌した。アミコンコンセント
レータ−（Ａｍｉｃｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）
を使用して前記溶液を目的中間体２０〜３０■／ｄにな
るまで濃縮した。
この中間体（ｐＨ７，４のリン酸緩衝溶液ＩＩｄ中４１
．８５■含有溶液１．３４ｄ）を、リン酸緩衝液（０，
１モル濃度、ｐＨ７，４）中ヒドロキシルアミン（１，
２ｍ、 ０．２５モル濃度）およびエチレンジアミン四
酢酸（０，００１０１モル濃含有溶液と２０〜２５°Ｃ
で２時間反応させた。得られた生成物を、ＰＤ−１０カ
ラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）を使
用するクロマトグラフィーによって精製した。
．８５■含有溶液１．３４ｄ）を、リン酸緩衝液（０，
１モル濃度、ｐＨ７，４）中ヒドロキシルアミン（１，
２ｍ、 ０．２５モル濃度）およびエチレンジアミン四
酢酸（０，００１０１モル濃含有溶液と２０〜２５°Ｃ
で２時間反応させた。得られた生成物を、ＰＤ−１０カ
ラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）を使
用するクロマトグラフィーによって精製した。
次に生成物（約５４■）は、下記第３部でそのまま使用
した。
した。
第２部： 第１ゴヌクレオチド株 のアミノトリ
エチレングリコール（１００ｇ ）と無水フタル酸（１
００ｇ ）を−緒に混合し、窒素下で撹拌しながら手際
よ＜２０５℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。結
果物である生成物は油状物として得られるが徐々に固形
化した。この物質を酢酸エチル（２５０，ｄ）から再結
晶して白色結晶生成物１１８ｇを得た。構造はＮＭＲス
ペクトルで確認した。
エチレングリコール（１００ｇ ）と無水フタル酸（１
００ｇ ）を−緒に混合し、窒素下で撹拌しながら手際
よ＜２０５℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。結
果物である生成物は油状物として得られるが徐々に固形
化した。この物質を酢酸エチル（２５０，ｄ）から再結
晶して白色結晶生成物１１８ｇを得た。構造はＮＭＲス
ペクトルで確認した。
この生成物（５ｇ）を塩化メチレン（５０ｄに溶解し、
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３当量、９．３
ｍｅ）、次いでクロロ−２−シアノエトキシ−Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルアミノホスフィン（１，１当量、４．６
５ｇ）を加え、混合物を２０〜２５°Ｃで３０分間撹拌
した。反応混合物を酢酸エチル（５０戚、２度）で抽出
し、水（５０ｍ）で２度洗浄し、次いでロータリーエバ
ポレーターを使用して濃縮して油状物（８，１ｇ）を得
た。この物質はＮＭＲおよびマススペクトル分析による
と９５％の純度であった。それは、次の工程でそのまま
使用した。
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３当量、９．３
ｍｅ）、次いでクロロ−２−シアノエトキシ−Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルアミノホスフィン（１，１当量、４．６
５ｇ）を加え、混合物を２０〜２５°Ｃで３０分間撹拌
した。反応混合物を酢酸エチル（５０戚、２度）で抽出
し、水（５０ｍ）で２度洗浄し、次いでロータリーエバ
ポレーターを使用して濃縮して油状物（８，１ｇ）を得
た。この物質はＮＭＲおよびマススペクトル分析による
と９５％の純度であった。それは、次の工程でそのまま
使用した。
この生成物（アセトニトリル７０−中４ｇｉ液５００１
１１）を、自動シンセサイザー、コンドロールド・ポア
ー・ガラスおよび前述と同様な手段を使用してアセトニ
トリル中前述のオリゴヌクレオチド（１マイクロモル濃
度）と反応させた。水酸化アンモニウムによる加水分解
からなる最終工程でコンドロールド・ポアー・ガラスか
らオリゴヌクレオチドを採取し、アミンを脱ブロツク化
してアミノ誘導体化オリゴヌクレオチド試薬を生成した
。
１１）を、自動シンセサイザー、コンドロールド・ポア
ー・ガラスおよび前述と同様な手段を使用してアセトニ
トリル中前述のオリゴヌクレオチド（１マイクロモル濃
度）と反応させた。水酸化アンモニウムによる加水分解
からなる最終工程でコンドロールド・ポアー・ガラスか
らオリゴヌクレオチドを採取し、アミンを脱ブロツク化
してアミノ誘導体化オリゴヌクレオチド試薬を生成した
。
この試薬（２６０ｎ＋ｗにて００５５）を脱イオン蒸留
水（５００ｍ）に溶解し・、４℃まで冷却した。炭酸ナ
トリウム溶液（１モル濃度溶液５０ｄ、 ｐｕｓ ’）
を加えて反応混合物を緩衝化した。スルホスクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
１００Ｉ中１１．２５■）と水（１００ｍ）を加え、反
応混合物を４°Ｃで１時間回転させた。得られた生成物
を、ＮＡＰ−１０カラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液
（ｐＦ！７．４ ）を使用して精製した。
水（５００ｍ）に溶解し・、４℃まで冷却した。炭酸ナ
トリウム溶液（１モル濃度溶液５０ｄ、 ｐｕｓ ’）
を加えて反応混合物を緩衝化した。スルホスクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
１００Ｉ中１１．２５■）と水（１００ｍ）を加え、反
応混合物を４°Ｃで１時間回転させた。得られた生成物
を、ＮＡＰ−１０カラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液
（ｐＦ！７．４ ）を使用して精製した。
約５０００の生成物が得られた。
前述のように調製したメルカプト置換酵素試薬（緩衝溶
液３．５ ｄ中約５４■）に前述の活性化オリゴヌクレ
オチド誘導体〔リン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）１、５
ｄ巾約５０００）を加えた。アミコンコンセントレータ
−を使用して総量約０．５ ｍまで減少させた。この反
応混合物を４°Ｃで１５時間回転させた後、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０，０２モル濃
度、ｐＨ８）で５戚まで希釈し、そして溶離液として、
最初にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（ｐＨ８）、次に塩化ナトリウム（１モル濃度）を含有
するその緩衝液（０，０２モル濃度）を使用するＤＥＡ
Ｅ−アガロースカラムによりクロマト処理した。吸収の
比（Ａ２．。
液３．５ ｄ中約５４■）に前述の活性化オリゴヌクレ
オチド誘導体〔リン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）１、５
ｄ巾約５０００）を加えた。アミコンコンセントレータ
−を使用して総量約０．５ ｍまで減少させた。この反
応混合物を４°Ｃで１５時間回転させた後、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０，０２モル濃
度、ｐＨ８）で５戚まで希釈し、そして溶離液として、
最初にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（ｐＨ８）、次に塩化ナトリウム（１モル濃度）を含有
するその緩衝液（０，０２モル濃度）を使用するＤＥＡ
Ｅ−アガロースカラムによりクロマト処理した。吸収の
比（Ａ２．。
／Ａ４゜３）が約３．２を有する両分を合わせ、本発明
の目的とするペルオキシダーゼとオリゴヌクレオチド共
有結合物について１．５００／ｄの濃度でリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，５）中に保存した。
の目的とするペルオキシダーゼとオリゴヌクレオチド共
有結合物について１．５００／ｄの濃度でリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，５）中に保存した。
例２〜６：冬引：Ａ、 （７） ｉ 、 −１これら
の例は、例１と同様に実施して種々のオリゴヌクレオチ
ドを有する種々の結合物を調製した。これらのオリゴヌ
クレオチドは、それらの配列によると次のごとく列挙さ
れる。
の例は、例１と同様に実施して種々のオリゴヌクレオチ
ドを有する種々の結合物を調製した。これらのオリゴヌ
クレオチドは、それらの配列によると次のごとく列挙さ
れる。
例２：
５ ’ −ＵＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴ
ＧＴＣＣＡＧ＾八ＴＧＣ−３’例３： ５ ’ −ＴＡＧＴＡＧ（：ＣへＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡ
ＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣ例４： ５ ’ −ＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴ
ＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴ−３’例５： ５ ’ −ＧＡＧＡＣＣＡＴＣ八八ＴＧＡＧＧＡへ
へＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３’例６： ５ ’ −ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡ
ＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴ−３’〔発明の効果］ この発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡアッセイまたは増幅
工程で使用するための酵素標識オリゴヌクレオチド結合
物を調製する単純で迅速な手段を提供する。この発明の
方法を使用して高収率のオリゴヌクレオチドと酵素の結
合物が得られる。また、この方法で最とも重要な試薬と
解される活性化オリゴヌクレオチド誘導体が保存される
。このものは、その調製に時間がかかりそして経費がか
かるので有意である。酸化による好ましくない副反応生
成物もまた減少する。反応性アミノ基を有する酵素は、
単純で安価ｒＪ手段でチオール誘導体に転化することが
できる。試薬が副反応によって損失する場合には意味を
もたなくなるのでこの試薬は過剰に使用することができ
る。
ＧＴＣＣＡＧ＾八ＴＧＣ−３’例３： ５ ’ −ＴＡＧＴＡＧ（：ＣへＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡ
ＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣ例４： ５ ’ −ＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴ
ＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴ−３’例５： ５ ’ −ＧＡＧＡＣＣＡＴＣ八八ＴＧＡＧＧＡへ
へＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３’例６： ５ ’ −ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡ
ＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴ−３’〔発明の効果］ この発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡアッセイまたは増幅
工程で使用するための酵素標識オリゴヌクレオチド結合
物を調製する単純で迅速な手段を提供する。この発明の
方法を使用して高収率のオリゴヌクレオチドと酵素の結
合物が得られる。また、この方法で最とも重要な試薬と
解される活性化オリゴヌクレオチド誘導体が保存される
。このものは、その調製に時間がかかりそして経費がか
かるので有意である。酸化による好ましくない副反応生
成物もまた減少する。反応性アミノ基を有する酵素は、
単純で安価ｒＪ手段でチオール誘導体に転化することが
できる。試薬が副反応によって損失する場合には意味を
もたなくなるのでこの試薬は過剰に使用することができ
る。
これらの利点は、国際公開第８９１０２９３２号公報の
教示に従うチオール１換オリゴヌクレオチドの使用を避
けることによって達成される。
教示に従うチオール１換オリゴヌクレオチドの使用を避
けることによって達成される。
逆に反応性チオール基は誘導体化酵素に付加され、次い
で活性化オリゴヌクレオチド誘導体と反応される。
で活性化オリゴヌクレオチド誘導体と反応される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は、反応性アミノ基または反応性
アミノ基に転化しうる基のいずれかであってその反応性
アミノ基から水素原子が除去された酵素を表わし、 −ＬＩＮＫ＿１−は、二価の有機部分を表わし、−ＬＩ
ＮＫ＿２−は、１個以上のオキシ、チオ、イミノ、カル
ボニルイミノ、イミノカルボニル、イミノカルボニルオ
キシ、ホスフェートまたはウレイレン基で中断または停
止されていてもよい二価の炭化水素鎖を表わし、そして
▲数式、化学式、表等があります▼は、水 酸基が、末端ホスフェートの３′または５′末端でそれ
から除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）で示さ
れる酵素とオリゴヌクレオチドの共有結合物。 ２、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は、水素原子が除去された反応性
アミノ基を有する酵素を表わし、 Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３およびＲ＾４は、独立して水素
、炭素数１〜３個のアルキルまたは炭素数１〜３個のヒ
ドロキシアルキルを表わし、 ｍは、２〜１２の正の整数であり、 ｎは、１〜５０の正の整数であり、そして ▲数式、化学式、表等があります▼は、水酸基が末端ホ
スフェートの３′または５′末端でそれから除去された
オリゴヌクレオチド鎖を表わす）で示される酵素とオリ
ゴヌクレオチドの共有結合物。 ３、Ａ、反応性アミノ基または反応性アミノ基に転化し
うる基のいずれかを有する酵素と、縮合反応によって前
記反応性アミノ基と反応し、かつ、次式 Ｒ＾＊−ＬＩＮＫ＿１−Ｓ−ＢＬＯＣＫ （上式中、Ｒ＾＊は前記反応性アミノ基と反応しうる基
であり、 −ＬＩＮＫ＿１−は二価の有機部分であり、そして−Ｂ
ＬＯＣＫはメルカプト基を非求核性にするようにそのメ
ルカプト基と反応しうる化合から誘導されるものであっ
て、その後除去される基を表わす）で示されるブロック
されたメルカプト置換有機化合物とを反応させ、次式 Ｘ−ＮＨ−ＬＩＮＫ＿１−Ｓ−ＢＬＯＣＫ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は水素原子が反応性アミノ基から
除去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生成
する工程、 Ｂ、中間体Ａから−ＢＬＯＣＫを除去して、次式Ｘ−Ｎ
Ｈ−ＬＩＮＫ＿１−ＳＨ で示される試薬を生成する工程、 Ｃ、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、−ＬＩＮＫ＿２−は、１個以上のオキシ、チ
オ、イミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イ
ミノカルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン
基で中断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わ
し、そして ▲数式、化学式、表等があります▼は、水酸基が末端ホ
スフェートの３′または５′末端でそれから除去された
オリゴヌクレオチド鎖を表わす）で示される活性化オリ
ゴヌクレオチド誘導体を供給する工程、ならびにＤ、工
程Ｃで供給された前記活性化オリゴヌクレオチド誘導体
と工程Ｂで生成された試薬を反応させて、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ、−ＬＩＮＫ＿１−、−ＬＩＮＫ＿
２−および▲数式、化学式、表等があります▼は前記で
定義したとおりである） で示される結合物を生成する工程、を含んでなるオリゴ
ヌクレオチドと酵素の共有結合物の製造方法。 ４、Ａ、反応性アミノ基を有する酵素をＳ−アセチルメ
ルカプト無水コハク酸と反応させて、次式▲数式、化学
式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ−は、水素原子が除去された反応性
アミノ基を有する前記酵素を表わし、そしてＲ＾１は水
素、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１〜３
個のヒドロキシアルキルを表わす）で示される中間体を
生成する工程、 Ｂ、工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ−およびＲ＾１は前記定義のとおり
である）で示される反応性メルカプト置換中間体を生成
する工程、 Ｃ、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、▲数式、化学式、表等があります▼は、水酸
基が末端ホスフ エートからその５′末端で除去されたオリゴヌクレオチ
ド鎖を表わし、Ｒ＾２、Ｒ＾３およびＲ＾４は、独立し
て水素、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原子１
〜３個のヒドロキシアルキルであり、ｍは２〜１２の正
の整数であり、そしてｎは１〜５０の正の整数である）
で示される機能化オリゴヌクレオチド反応体を供給する
工程、 Ｄ、工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに Ｅ、工程Ｄで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｘ−ＮＨ−、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾
４、ｍ、ｎおよび▲数式、化学式、表等があります▼は
前記で定義したとおりである）で示される結合物を生成
する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドと酵素の共
有結合物の製造方法。
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