JPS6356283A - ヒト又は動物細胞の不滅化法 - Google Patents
ヒト又は動物細胞の不滅化法Info
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- JPS6356283A JPS6356283A JP62200109A JP20010987A JPS6356283A JP S6356283 A JPS6356283 A JP S6356283A JP 62200109 A JP62200109 A JP 62200109A JP 20010987 A JP20010987 A JP 20010987A JP S6356283 A JPS6356283 A JP S6356283A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、不滅化した即ち永久培養可能な細ｆｄ系の製
法に関する。
法に関する。
従来の技術
通常のヒト及び動物の細胞は培養において限定さｆｔ７
を寿命を有する。細胞は一定の培加時間で増殖するか又
は細胞サイクルのＧｏ／Ｇｘ期の静止細胞のままでとど
ま９得る。細胞が増殖する際に、培養における老化の開
始は細胞の型、令、並びに供与体の種に左右される。ｎ
瘍形成細胞系は無限に培養することができるが、正常な
老化する細胞とは多くの性質において異なっている。
を寿命を有する。細胞は一定の培加時間で増殖するか又
は細胞サイクルのＧｏ／Ｇｘ期の静止細胞のままでとど
ま９得る。細胞が増殖する際に、培養における老化の開
始は細胞の型、令、並びに供与体の種に左右される。ｎ
瘍形成細胞系は無限に培養することができるが、正常な
老化する細胞とは多くの性質において異なっている。
例えば、ヒトの末梢血液〃瓢らのリンパ球は細胞サイク
ルの静止期（Ｇｏ ／ （ｈ ）にあるが、培養におい
ては、増殖期に入りかつ成熟（分化）するぶうに様々に
励起される。静止期の３９７２球は抗原、Ｂリンパ球発
育因子、あるいは７９７２球と発育因子（インターロイ
ギン：Ｉｎｔａｒｌｓｕｋｉｎ ）による刺激に工って
増殖しかつ成熟する。同様にば、Ｔリンパ球は細胞分裂
を励起する物質（分裂促進剤）又は特異的な成長因子に
工す培養において増殖しかつ成熟し得る。
ルの静止期（Ｇｏ ／ （ｈ ）にあるが、培養におい
ては、増殖期に入りかつ成熟（分化）するぶうに様々に
励起される。静止期の３９７２球は抗原、Ｂリンパ球発
育因子、あるいは７９７２球と発育因子（インターロイ
ギン：Ｉｎｔａｒｌｓｕｋｉｎ ）による刺激に工って
増殖しかつ成熟する。同様にば、Ｔリンパ球は細胞分裂
を励起する物質（分裂促進剤）又は特異的な成長因子に
工す培養において増殖しかつ成熟し得る。
正常なリンパ球の長時間培養は培地中の相応する発育因
子又は抗原の存在に左右される。更に、ヒトリンパ球は
培養においてウィルスの感染に工っでも永久増殖するよ
うに励起することができる。その際に、この細胞は正常
なリンパ球の性質のいくつかを失ない、かつ腫ｇ、形成
性リンパ球と共通している新しい性質を持つ。Ｅ−Ｂウ
ィルス（Ｅｐａｔｅｉｎ −Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ）
は培養において感染後に、Ｃ−３レセプター及びＥ−Ｂ
ウィルスレセプターが著しいヒトＢす７２球の亜族を励
起して絶えず増殖させる。その際に、リンパ球は早期の
分化工程に維持される。これに対１−て、と）Ｔ細胞白
血病／リンパ腫ウィル、１． （）（ＴＬＶ ）、型！
、ｆｉは、一定の表面成分０ＫＴ４＋マーカーによって
特徴付けられるＴ ＩＪンパ球をほぼ専ら感作する。若
干の細胞系は、ＨＴＬＶ感作後でもこの増殖に関して’
ｌ’ ＩＪンパ原２２球子に左右される。
子又は抗原の存在に左右される。更に、ヒトリンパ球は
培養においてウィルスの感染に工っでも永久増殖するよ
うに励起することができる。その際に、この細胞は正常
なリンパ球の性質のいくつかを失ない、かつ腫ｇ、形成
性リンパ球と共通している新しい性質を持つ。Ｅ−Ｂウ
ィルス（Ｅｐａｔｅｉｎ −Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ）
は培養において感染後に、Ｃ−３レセプター及びＥ−Ｂ
ウィルスレセプターが著しいヒトＢす７２球の亜族を励
起して絶えず増殖させる。その際に、リンパ球は早期の
分化工程に維持される。これに対１−て、と）Ｔ細胞白
血病／リンパ腫ウィル、１． （）（ＴＬＶ ）、型！
、ｆｉは、一定の表面成分０ＫＴ４＋マーカーによって
特徴付けられるＴ ＩＪンパ球をほぼ専ら感作する。若
干の細胞系は、ＨＴＬＶ感作後でもこの増殖に関して’
ｌ’ ＩＪンパ原２２球子に左右される。
更に、永久細胞系は細胞／細胞融合に工す得ることがで
きる。その際には、例えばリンパ球を無限に分裂性の系
の細胞（例えば骨髄腫、リンパ腫細胞、ＩＩＢ−Ｂウィ
ルス感作したリンパ様細胞）と融合し、引続いて生成し
た雑種細胞を優先的に増殖し得る工うに選択する。この
雑種細胞は出発細胞の２倍の染色体−組を有しかつ部分
的に次の細胞世代において正常な出発細胞（リンパ細胞
）の染色体を失なう。その際に例えば抗体、表面蛋白質
、分泌蛋白質の産生又は細胞の他の合成能の工うな雑種
の所望の性質が古び失なわｎ得る。永久的な細胞系を取
得する丸めのこの細胞融合法は、リンパ球及び神経細胞
にのみ適用可能である。
きる。その際には、例えばリンパ球を無限に分裂性の系
の細胞（例えば骨髄腫、リンパ腫細胞、ＩＩＢ−Ｂウィ
ルス感作したリンパ様細胞）と融合し、引続いて生成し
た雑種細胞を優先的に増殖し得る工うに選択する。この
雑種細胞は出発細胞の２倍の染色体−組を有しかつ部分
的に次の細胞世代において正常な出発細胞（リンパ細胞
）の染色体を失なう。その際に例えば抗体、表面蛋白質
、分泌蛋白質の産生又は細胞の他の合成能の工うな雑種
の所望の性質が古び失なわｎ得る。永久的な細胞系を取
得する丸めのこの細胞融合法は、リンパ球及び神経細胞
にのみ適用可能である。
ヨーロッパ公開特許第８３１０４２４３ ； ７号明細
書からは、正常細胞から、形質転換され次細胞の非増殖
性フラグメントと融合し、〃１つ培地中で選択物質なし
に培養することに１り不減化されたヒト又は動物の細胞
１に製造することが公知である。この際、非増殖性フラ
グメントとしては細胞質体も使用することができる。こ
れにエフ、任意の動物及びヒトの細胞を不滅化し、同時
に選択物質を便わないことにＬり収率全高めることがで
きる。更に、細Ｙａ／細胞−融合そ引続いて培養する際
に後からしばしば起る前記の細胞特性の変化が回避され
る。しかしながら収率及び不滅化した細胞の不滅性を更
に改良することが所望された。
書からは、正常細胞から、形質転換され次細胞の非増殖
性フラグメントと融合し、〃１つ培地中で選択物質なし
に培養することに１り不減化されたヒト又は動物の細胞
１に製造することが公知である。この際、非増殖性フラ
グメントとしては細胞質体も使用することができる。こ
れにエフ、任意の動物及びヒトの細胞を不滅化し、同時
に選択物質を便わないことにＬり収率全高めることがで
きる。更に、細Ｙａ／細胞−融合そ引続いて培養する際
に後からしばしば起る前記の細胞特性の変化が回避され
る。しかしながら収率及び不滅化した細胞の不滅性を更
に改良することが所望された。
発明が解決しょうとする問題点
本発明は、不滅化収率及び不滅化した細胞の性質を更に
改良するという課題に基いている。
改良するという課題に基いている。
問題点を解決するｍめの手段
本発明にエフこの課題は、永久培養可能な細胞の非増殖
性フラグメントとトランスフェクションしかつそれを培
地中で選択物質なしに培養することにニジヒト又は動物
細胞を不滅化する際に、永久培養可能なヒト又は動物の
細胞の細胞質から得られたＤＮＡを不滅化すべき細胞と
トランスフェクションすること１に特徴とす石該方法に
＝９解決される。
性フラグメントとトランスフェクションしかつそれを培
地中で選択物質なしに培養することにニジヒト又は動物
細胞を不滅化する際に、永久培養可能なヒト又は動物の
細胞の細胞質から得られたＤＮＡを不滅化すべき細胞と
トランスフェクションすること１に特徴とす石該方法に
＝９解決される。
本発明に工す、培養において無限に増殖可能な細胞系が
得られ、その際に細胞系の確立の一定の欠点は細胞姻合
又は化学的発癌因子並びに形質転換するウィルスによる
感作にエフ回避さ九る。本発明方法に二υ得らｎ九細胞
系にはぼその正常特性を保持し、このことは細胞の多様
な使用を可能にする。
得られ、その際に細胞系の確立の一定の欠点は細胞姻合
又は化学的発癌因子並びに形質転換するウィルスによる
感作にエフ回避さ九る。本発明方法に二υ得らｎ九細胞
系にはぼその正常特性を保持し、このことは細胞の多様
な使用を可能にする。
得られ７′ｅ細お系は細胞特異的な外因性発育因子と関
係なく成長する。
係なく成長する。
本発明方法は、リンパ球等の＝うな免疫系の細胞、結合
組繊細胞、分化した器官細胞、上皮含 細胞等を包めて任意のヒト又は動物゛細胞の不滅化に使
用することができる。
組繊細胞、分化した器官細胞、上皮含 細胞等を包めて任意のヒト又は動物゛細胞の不滅化に使
用することができる。
本発明にぶり、これらの細胞の不滅化は、永久培養可能
なヒト又は動物細胞の細胞質から得らｎる一定の種類の
ＤＮＡの導入（トランスフエククヨ／）にエフ行なう。
なヒト又は動物細胞の細胞質から得らｎる一定の種類の
ＤＮＡの導入（トランスフエククヨ／）にエフ行なう。
それ故、細胞核ＤＮＡ（ｒツムＤＮＡ ）を使うのでは
なく、核の周囲の細胞質〃蔦ら単離可能なＤＮＡを使用
する。それ故、このＤＮＡを取得するために細胞質体〃
１ら出発する。トランスフェクションされたＤＮＡ ’
！−取得するための永久培養可能なヒト及び動ｖｌＪ細
胞として腫瘍細胞又は他の方法で不滅化した非腫瘍発生
系胞例えば本発明方法により既に製造した不滅化細胞上
使用することができる。特に良好な結果ｕ、トランスフ
ェクションされたマウスＬ−細胞（Ｌ−９２９細胞、Ａ
ＴＣＣＣｃＬ １）、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ ８．６
５３細胞ＡＴＣ（、’ ＣＲＬ−Ｉ５８０）、エールリ
ヒ腹水細胞（ＥＡＺ。
なく、核の周囲の細胞質〃蔦ら単離可能なＤＮＡを使用
する。それ故、このＤＮＡを取得するために細胞質体〃
１ら出発する。トランスフェクションされたＤＮＡ ’
！−取得するための永久培養可能なヒト及び動ｖｌＪ細
胞として腫瘍細胞又は他の方法で不滅化した非腫瘍発生
系胞例えば本発明方法により既に製造した不滅化細胞上
使用することができる。特に良好な結果ｕ、トランスフ
ェクションされたマウスＬ−細胞（Ｌ−９２９細胞、Ａ
ＴＣＣＣｃＬ １）、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ ８．６
５３細胞ＡＴＣ（、’ ＣＲＬ−Ｉ５８０）、エールリ
ヒ腹水細胞（ＥＡＺ。
ＡＴＣＣＣＣＬ ７７ ）又はヒト白血病細胞（例えば
ヒーラ２２９、ｐ、Ｔｃｃ ｃＣＬ２ 、１ ）の細胞
質ρ為らのＤＮＡの使用下に得られる。腫瘍細胞系及び
不滅化した非腫瘍発生系が極めて多数存在することを鑑
みルば、それを列挙することは不可能である。しかしな
がら細胞質ＤＮＡの永久培養可能な細胞系としての適性
は、簡単にこのＤＮＡ ９単離して為つそｆ′Ｌをトラ
ンスフェクションされた正常細胞の成長特性を試験する
ことに工り確認することができる。
ヒーラ２２９、ｐ、Ｔｃｃ ｃＣＬ２ 、１ ）の細胞
質ρ為らのＤＮＡの使用下に得られる。腫瘍細胞系及び
不滅化した非腫瘍発生系が極めて多数存在することを鑑
みルば、それを列挙することは不可能である。しかしな
がら細胞質ＤＮＡの永久培養可能な細胞系としての適性
は、簡単にこのＤＮＡ ９単離して為つそｆ′Ｌをトラ
ンスフェクションされた正常細胞の成長特性を試験する
ことに工り確認することができる。
細胞質ＤＮＡの獲得は、単離した細胞質あるいは有利に
細胞質体から出発して行なう。細胞質体〃１ら出発する
際に、これｆｔまず初めに溶菌しｐつ可溶性の溶菌液ｔ
プロティナーゼと共に恒温保持する。インキュベーショ
ン混合物の可溶性分て）らＤＮＡを公知方法にエフ分離
する。好適な方法は密Ｊ勾配を介して、例えばＣＢＣｌ
（Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ａａｒａｈ ａｎ
ｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ阻０１０ｇ７″、灸、１〜５２
（１９６４））にエフ、アフィニティクロマトグラフィ
又は電気泳動分離（Ｍａｒｉａｔｉｓ 、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ 、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ％％、” Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｒｏｎｉｎｇ”、Ｃｏｎ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂ （１９８２） ） ｋ介して及び
ｒ）ＮＡ−溶剤による抽出を介して単離することである
。
細胞質体から出発して行なう。細胞質体〃１ら出発する
際に、これｆｔまず初めに溶菌しｐつ可溶性の溶菌液ｔ
プロティナーゼと共に恒温保持する。インキュベーショ
ン混合物の可溶性分て）らＤＮＡを公知方法にエフ分離
する。好適な方法は密Ｊ勾配を介して、例えばＣＢＣｌ
（Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ａａｒａｈ ａｎ
ｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ阻０１０ｇ７″、灸、１〜５２
（１９６４））にエフ、アフィニティクロマトグラフィ
又は電気泳動分離（Ｍａｒｉａｔｉｓ 、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ 、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ％％、” Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｒｏｎｉｎｇ”、Ｃｏｎ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂ （１９８２） ） ｋ介して及び
ｒ）ＮＡ−溶剤による抽出を介して単離することである
。
ＤＮＡ−溶剤で抽出し、抽出物ｉＲＮアーゼと恒温保持
して１つ遊陥Ｉ’）ＮＡ ’ｚ再びＤＮＡ−溶剤で抽出
れ して分離すると４＆ｚている。例えばアルコールで沈殿
することにエフ細胞質ＤＮＡを単離することができる。
して１つ遊陥Ｉ’）ＮＡ ’ｚ再びＤＮＡ−溶剤で抽出
れ して分離すると４＆ｚている。例えばアルコールで沈殿
することにエフ細胞質ＤＮＡを単離することができる。
細胞質体ではなく、既に別個に単離した細胞質から出発
する場合、明らかに初めに行なう小胞の溶菌は不要であ
る。
する場合、明らかに初めに行なう小胞の溶菌は不要であ
る。
他の優れた実施形では核ＤＮＡを除いた細胞質フラクシ
ョンからのトランスフェクション用ＤＮＡ を使用する
。この細胞質フラクションの製造は、例えば細胞を３ミ
リモル／ｌ ＭｇＣ１２（” Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、”、
３１ ２５３〜２６２頁（１１７４年）〕の存在におけ
るナトリウムドデシルサルフエー）（ＳＤＳ）又はエチ
ルフェニルポリエチレングリコール（ＮＰ４０．Ｒｏｔ
ｈ社、四ｒイツ）で溶菌するかあるいは細胞をＮａＣ１
及びＳＯＳで溶菌しく Ｈｉｒｔ−抽出、＠Ｊ、Ｍｏｌ
。
ョンからのトランスフェクション用ＤＮＡ を使用する
。この細胞質フラクションの製造は、例えば細胞を３ミ
リモル／ｌ ＭｇＣ１２（” Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、”、
３１ ２５３〜２６２頁（１１７４年）〕の存在におけ
るナトリウムドデシルサルフエー）（ＳＤＳ）又はエチ
ルフェニルポリエチレングリコール（ＮＰ４０．Ｒｏｔ
ｈ社、四ｒイツ）で溶菌するかあるいは細胞をＮａＣ１
及びＳＯＳで溶菌しく Ｈｉｒｔ−抽出、＠Ｊ、Ｍｏｌ
。
Ｂｉｏｌ、” 、２６．３６５〜３６９頁（１９６７年
）〕かつ引続いて遠心することにより行なうことができ
る。このようにして得られた上澄みは核ＤＮＡ を含ま
ない。この上澄みから、トランスフェクション用Ｌ）Ｎ
Ａ が前記のようにして得られる。
）〕かつ引続いて遠心することにより行なうことができ
る。このようにして得られた上澄みは核ＤＮＡ を含ま
ない。この上澄みから、トランスフェクション用Ｌ）Ｎ
Ａ が前記のようにして得られる。
他の特に優れている実施形では、ミトコンドリア不含の
細胞質フラクションからのトランスフェクション用ＤＮ
Ａ を使用する。例えば、このフラクションは細胞質か
らスクロース勾配による勾配遠心を介して単離すること
ができるＯｍ胞質のミトコンドリア不含のＤＮＡフラク
ションの不滅化活性度は、細胞質体からのＤＮＡで得ら
れる活性度よりも約１０倍高いことが判明し驚異的であ
った。
細胞質フラクションからのトランスフェクション用ＤＮ
Ａ を使用する。例えば、このフラクションは細胞質か
らスクロース勾配による勾配遠心を介して単離すること
ができるＯｍ胞質のミトコンドリア不含のＤＮＡフラク
ションの不滅化活性度は、細胞質体からのＤＮＡで得ら
れる活性度よりも約１０倍高いことが判明し驚異的であ
った。
ＤＮＡ−溶剤は、ＤＮＡを含有する媒体からの抽出に好
適である場合には当業者に公知の、このために好適であ
る溶剤を使用することができる０水Ｓ液には、ＤＮＡ−
ｇ剤としては特にフェノール及ヒ／又はクロロホルム−
イソアミルアルコール混合物が抽出に好適である。
適である場合には当業者に公知の、このために好適であ
る溶剤を使用することができる０水Ｓ液には、ＤＮＡ−
ｇ剤としては特にフェノール及ヒ／又はクロロホルム−
イソアミルアルコール混合物が抽出に好適である。
不滅化すべき細胞は殊に成長もしくは分裂に対して励起
された状態で、細胞質ＤＮＡとのトランスフェクション
に使用する。この状態への変換は当業者に公知の方法、
例えば°ボーク・ウイード分裂促進剤（ｐｏｋｅ−ｗｅ
ｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ ）”をｍ胞含有媒体に添加する
ことにより行なう。プロティナーゼとしては、当業者に
公知のプロテナーゼ、殊にプロティナーゼＫを使用する
。ＲＮアーゼとしてはＲＮＮアーゼが潰れている。
された状態で、細胞質ＤＮＡとのトランスフェクション
に使用する。この状態への変換は当業者に公知の方法、
例えば°ボーク・ウイード分裂促進剤（ｐｏｋｅ−ｗｅ
ｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ ）”をｍ胞含有媒体に添加する
ことにより行なう。プロティナーゼとしては、当業者に
公知のプロテナーゼ、殊にプロティナーゼＫを使用する
。ＲＮアーゼとしてはＲＮＮアーゼが潰れている。
不滅化すべき正常ｍ胞としてリンパ球を使用する場合、
増殖期■のものを使用すると優れている。増殖期■とは
、分裂促進剤（例えばＩ−ク・ライ−ｒ分裂促進剤）、
抗原等を用いてリンノソ球を刺激した後で増殖が行なわ
れる時期を表わす。
増殖期■のものを使用すると優れている。増殖期■とは
、分裂促進剤（例えばＩ−ク・ライ−ｒ分裂促進剤）、
抗原等を用いてリンノソ球を刺激した後で増殖が行なわ
れる時期を表わす。
得に良好な結果は、本発明により得られた不ａ化ｔａ胞
（−次トランスフエクタント）から得られる全ＤＮＡを
他の方法工程で正常なヒト又は動物の細胞にトランスフ
ェクションしかつこのようにして特に高い収率で更に永
久培養可能である二次トランスフェクシントを獲得する
場合に得られる。第２のトランスフェクションの正常細
胞としては第１のトランスフェクションと同種の細胞か
又はそれとは異なる細ｄＹ使用する。
（−次トランスフエクタント）から得られる全ＤＮＡを
他の方法工程で正常なヒト又は動物の細胞にトランスフ
ェクションしかつこのようにして特に高い収率で更に永
久培養可能である二次トランスフェクシントを獲得する
場合に得られる。第２のトランスフェクションの正常細
胞としては第１のトランスフェクションと同種の細胞か
又はそれとは異なる細ｄＹ使用する。
細胞質体の取得にあたっては、培養における細胞が媒体
中でサイトカラシンＢ（菌類からの作用物質）により作
用を受けて、細胞表面上でくびれ込む小胞（ｌａ胞買体
）ン形成する０還心力の作用により細胞質体と残りの細
胞との間の結合が切断されかつ細胞質体を核含有親細胞
（碩質体）から密度勾配で遠心分離により単嵐すること
ができる。細胞質体を単離するこれらの方法は、例えば
Ｍ、 Ｍ、 Ｗｉｇｌｅｒ及び１．Ｂ、 Ｗａｉｎｓｔ
ｅｉｎ共著、“ア・プレパラテイデ・メソード・フォー
・オデテイニング・イニュークリエイテツド・ママリア
ン・セルズ（Ａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｍａｔｈｏ
ｄｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ５ｎｕｃｌｅａｔｅＬ
ｍａｍｍａｌｉａｎｃａｌｌｇ ）”（−Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒａａ。
中でサイトカラシンＢ（菌類からの作用物質）により作
用を受けて、細胞表面上でくびれ込む小胞（ｌａ胞買体
）ン形成する０還心力の作用により細胞質体と残りの細
胞との間の結合が切断されかつ細胞質体を核含有親細胞
（碩質体）から密度勾配で遠心分離により単嵐すること
ができる。細胞質体を単離するこれらの方法は、例えば
Ｍ、 Ｍ、 Ｗｉｇｌｅｒ及び１．Ｂ、 Ｗａｉｎｓｔ
ｅｉｎ共著、“ア・プレパラテイデ・メソード・フォー
・オデテイニング・イニュークリエイテツド・ママリア
ン・セルズ（Ａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｍａｔｈｏ
ｄｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ５ｎｕｃｌｅａｔｅＬ
ｍａｍｍａｌｉａｎｃａｌｌｇ ）”（−Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒａａ。
Ｃｏｍｍ、 ”、６６．６６９〜６７４頁（１９７５年
）〕に記載されている。引続いて、本発明方法に工り細
胞質体を溶菌し、ＤＮＡ ｉそれから単離しかつ目的細
胞に変換する。場合に工り本発明で使用するＤＮＡは、
本発明方法により得られた永久培養可能な細胞から取得
することができる。その際に細胞中に含まれる全ＤＮＡ
’ｉ当業者に公知の方法にニジ単離する。このＤＮＡ
’ｉ公知方法にニジ目的細胞に変換する。
）〕に記載されている。引続いて、本発明方法に工り細
胞質体を溶菌し、ＤＮＡ ｉそれから単離しかつ目的細
胞に変換する。場合に工り本発明で使用するＤＮＡは、
本発明方法により得られた永久培養可能な細胞から取得
することができる。その際に細胞中に含まれる全ＤＮＡ
’ｉ当業者に公知の方法にニジ単離する。このＤＮＡ
’ｉ公知方法にニジ目的細胞に変換する。
本発明の基本的特徴は、ＤＮＡ受容後に、永久増殖する
細胞が選択物質を用いずに培地中で選択作用する。この
点で本発明方法は、専ら雑種細胞の増殖について選択作
用しかつ出発細胞の増殖に対抗して選択作用すべきであ
る細胞融合法とは異なっている。培地中で選択物質に対
して敏感ではなく、それ故直ちに正常細胞との細胞融合
には使用することのできない永久成長する細胞系は多数
ある。本発明方法ではこの限定は除かれかつこれらの細
胞の原形質体から永久増殖性の細胞系を確定するのに使
用することのできるＤＮＡ ？：単離することができる
。
細胞が選択物質を用いずに培地中で選択作用する。この
点で本発明方法は、専ら雑種細胞の増殖について選択作
用しかつ出発細胞の増殖に対抗して選択作用すべきであ
る細胞融合法とは異なっている。培地中で選択物質に対
して敏感ではなく、それ故直ちに正常細胞との細胞融合
には使用することのできない永久成長する細胞系は多数
ある。本発明方法ではこの限定は除かれかつこれらの細
胞の原形質体から永久増殖性の細胞系を確定するのに使
用することのできるＤＮＡ ？：単離することができる
。
確定されにヒト及び動物の細胞系からに、細胞産生物、
例えば免疫グロブリン、血液凝固因子、りンフオカイン
、発育因子、ホルモン、酵素、表面蛋白質、糖蛋白質、
リボ蛋白質、サツカリド等を無制限の量で取得すること
ができる。
例えば免疫グロブリン、血液凝固因子、りンフオカイン
、発育因子、ホルモン、酵素、表面蛋白質、糖蛋白質、
リボ蛋白質、サツカリド等を無制限の量で取得すること
ができる。
診断及び治療の九めに、永久増殖性と） Ｂ ＩＪンパ
球からヒトモノクロナール抗体を取得することができる
。リンフ才力インをとトチリフ２球及びマクロファージ
から産生ずることができる。
球からヒトモノクロナール抗体を取得することができる
。リンフ才力インをとトチリフ２球及びマクロファージ
から産生ずることができる。
更に、永久増殖性細胞を異種遺伝子産生物の製造に使用
することができる。この際に、異種遺伝子産生物につい
ての遺伝情報が本発明に工り得られに永久増殖性細胞に
伝達され、七とで発現される。哩乳動物の細胞のｒツム
によるのではなくて細菌のＥ、コリ（Ｃ０１１）のデノ
ムに工り暗号付けされる酵素中サンチンーグアニンーホ
スホトラノスフエラーゼについての遺伝情報を永久増殖
性細胞中に導入することができ、そこで発現することを
明らかにすることができた。
することができる。この際に、異種遺伝子産生物につい
ての遺伝情報が本発明に工り得られに永久増殖性細胞に
伝達され、七とで発現される。哩乳動物の細胞のｒツム
によるのではなくて細菌のＥ、コリ（Ｃ０１１）のデノ
ムに工り暗号付けされる酵素中サンチンーグアニンーホ
スホトラノスフエラーゼについての遺伝情報を永久増殖
性細胞中に導入することができ、そこで発現することを
明らかにすることができた。
得られた細胞系は、細菌性酵素を合成し、それ故新しい
代謝活性を含有する。更に、本発明に工ｐ得られに無限
に培養可能な細胞系を突然変異試験及び毒性試験で並び
に作用物質の薬理試験に使うことができる。
代謝活性を含有する。更に、本発明に工ｐ得られに無限
に培養可能な細胞系を突然変異試験及び毒性試験で並び
に作用物質の薬理試験に使うことができる。
本発明により、比較的僅少量でしか単離し得ない一定の
分化度の細胞を不滅化しかつ大規模に培養できるはずで
ある。この工うにして、所望の細胞産物の物質代謝特性
又は合成能を有する、これらの不滅化した細胞のＩ）Ｎ
Ａ並びにＲＮＡを、所望の細胞産物についての遺伝情報
の単離に十分な量で取得することができる。本発明のこ
の適用形では、適当な操作にニジ、遺伝情報を媒介物を
用いて他の真核細胞あるいは細菌並びに真菌に伝達し〃
≧つこの九めに開発された条件下に所望の細胞産物ｔ−
製造するために発現される。所望の細胞産物を異種宿主
から任意の量で取得することができる。
分化度の細胞を不滅化しかつ大規模に培養できるはずで
ある。この工うにして、所望の細胞産物の物質代謝特性
又は合成能を有する、これらの不滅化した細胞のＩ）Ｎ
Ａ並びにＲＮＡを、所望の細胞産物についての遺伝情報
の単離に十分な量で取得することができる。本発明のこ
の適用形では、適当な操作にニジ、遺伝情報を媒介物を
用いて他の真核細胞あるいは細菌並びに真菌に伝達し〃
≧つこの九めに開発された条件下に所望の細胞産物ｔ−
製造するために発現される。所望の細胞産物を異種宿主
から任意の量で取得することができる。
実施例
次に本発明を実施例に工り詳説する。
例 １
末梢血液刀瓢らのヒトリンパ球の不滅化材料：
サイトカラシンＢ （Ｓｉｇｍａ ） 、す／フォプレ
プ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒａｐ ； ＮｙａｇａａｒｃＬ、
０８１０在）、イスコプズ（Ｉｅａｏｖｅ’ａ ） Ｄ
Ｍ’ＥＭ （ｌ５ａｏｖａ’ｅｍｏｄｉｆｉｚｉａｒｔ
ａａ Ｄｕｌｂａａｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅａ
ｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ ； Ｂｏａｈｒｌｎｇａｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）、胎生小生血清（５ｅｂｉＯ）、
ＤＥＡＥ−デギストラン（ｐｈａｒｔｏａｃｌａ ）、
フィニル（Ｆｌｃｏｌｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） 、
ポリエチレングリコール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ ）方法： １、末梢血液からのヒト１７７２球の単離成人供与者の
末梢血液を公知方法でヘパリン処理しかつ６ミリモルク
エン酸、１００ｆリモルデキストロース、７０ミリモル
Ｎａ（Ｊ、３Ｑきリモルクエン酸Ｎ！Ｌ（ｐＨ６，１）
中で６倍に稀釈した、リンパ球を他の核含有細胞（顆粒
白血球、単核白血球等）で１らリンフオプレゾ（Ｍｅｔ
ｒｉｇＯａｔ ）勾配（Ｎａｙｇａａｒｄ、０１１１０
）中、４００）ｌで、３５分間遠心することにエリ分
離しｔｃ （Ａ、 Ｂｏｙｕｍ著、” Ａ Ｏｎｅ −
ｓｔａｇ、ｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ １ｓｏｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓａｎＬ ”
Ｌ７ｍｐｈＯＱ７ｔθ５ｆｒｏｆｆｌ ｈｕｍａｎ ｂ
ｌｏｏｃ！”、” ５ｃａｎｄ 、 Ｊ、 Ｃｈｉｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、 ”、２１、補遺９７：５１〜７６（
１９６８年）〕。リンパ球をホスフェート緩衝生理食塩
水（ＰＢ８ ） （１３６ミリモルＮａＣｊ、２．７ミ
リー１： ルＫＣｊ、ｉ、５ ミリモルＫ）１２ＰＯ４
，６，５ハリモｈ ＮｆＬ２ＨＰＯ４，０，４ミリモｈ
ＭｇＳＯ４，０，７ミリモルＣａＣｊ２、ｐＨ７，４
）中で３回洗いかつイスコデズｒ）ＭＥＭ、４ミリモル
Ｌ−グルタミン、１ミリモルピルベート、１ミリ屹ルオ
ル酢醒、０．１ｔｌ／づイ／７ユリン、Ｉ Ｑ Ａｇ／
ｄ ）う／スフニリン、１５１１胎生小牛血清中、細胞
３Ｘ１０’／ｄの細胞密度、３７°Ｃ％ ５ ％ Ｃ０
２テ培堡り、友。
プ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒａｐ ； ＮｙａｇａａｒｃＬ、
０８１０在）、イスコプズ（Ｉｅａｏｖｅ’ａ ） Ｄ
Ｍ’ＥＭ （ｌ５ａｏｖａ’ｅｍｏｄｉｆｉｚｉａｒｔ
ａａ Ｄｕｌｂａａｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅａ
ｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ ； Ｂｏａｈｒｌｎｇａｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）、胎生小生血清（５ｅｂｉＯ）、
ＤＥＡＥ−デギストラン（ｐｈａｒｔｏａｃｌａ ）、
フィニル（Ｆｌｃｏｌｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） 、
ポリエチレングリコール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ ）方法： １、末梢血液からのヒト１７７２球の単離成人供与者の
末梢血液を公知方法でヘパリン処理しかつ６ミリモルク
エン酸、１００ｆリモルデキストロース、７０ミリモル
Ｎａ（Ｊ、３Ｑきリモルクエン酸Ｎ！Ｌ（ｐＨ６，１）
中で６倍に稀釈した、リンパ球を他の核含有細胞（顆粒
白血球、単核白血球等）で１らリンフオプレゾ（Ｍｅｔ
ｒｉｇＯａｔ ）勾配（Ｎａｙｇａａｒｄ、０１１１０
）中、４００）ｌで、３５分間遠心することにエリ分
離しｔｃ （Ａ、 Ｂｏｙｕｍ著、” Ａ Ｏｎｅ −
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Ｌ７ｍｐｈＯＱ７ｔθ５ｆｒｏｆｆｌ ｈｕｍａｎ ｂ
ｌｏｏｃ！”、” ５ｃａｎｄ 、 Ｊ、 Ｃｈｉｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、 ”、２１、補遺９７：５１〜７６（
１９６８年）〕。リンパ球をホスフェート緩衝生理食塩
水（ＰＢ８ ） （１３６ミリモルＮａＣｊ、２．７ミ
リー１： ルＫＣｊ、ｉ、５ ミリモルＫ）１２ＰＯ４
，６，５ハリモｈ ＮｆＬ２ＨＰＯ４，０，４ミリモｈ
ＭｇＳＯ４，０，７ミリモルＣａＣｊ２、ｐＨ７，４
）中で３回洗いかつイスコデズｒ）ＭＥＭ、４ミリモル
Ｌ−グルタミン、１ミリモルピルベート、１ミリ屹ルオ
ル酢醒、０．１ｔｌ／づイ／７ユリン、Ｉ Ｑ Ａｇ／
ｄ ）う／スフニリン、１５１１胎生小牛血清中、細胞
３Ｘ１０’／ｄの細胞密度、３７°Ｃ％ ５ ％ Ｃ０
２テ培堡り、友。
２、不滅化ＤＮＡの単離
不滅化用ＤＮＡ ？！−マウスＬ９２９−細胞の細胞質
体から取得する。サイトカラシンＢとの恒温保持に二る
、トラ／スフエクショ：ｙＩ！Ｉｌ胞の細胞質体の誘導
及び単離は文献に記載さ詐ている（ Ｋ、 Ａ１．１１
に繕ｅｔｓ 、 １． Ｖａｇｉｙｌ’ｅｖ。
体から取得する。サイトカラシンＢとの恒温保持に二る
、トラ／スフエクショ：ｙＩ！Ｉｌ胞の細胞質体の誘導
及び単離は文献に記載さ詐ている（ Ｋ、 Ａ１．１１
に繕ｅｔｓ 、 １． Ｖａｇｉｙｌ’ｅｖ。
１、 ＲＯｖａｎａｋｉｉ共著、” ＥｆｆｌＢＯｔ
０ｆｃｙｔｏｃｈａ１．ａａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａ
ｕｒｆａｃａ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙｏｆ ｎｅｏｐｌ
ａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
″、′″Ｂｕ１１． Ｂｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｍ６１（
Ｌ、 ’ ９５．８４〜８７（１９８４） ； Ｍ、
Ｍ、 ｗｉｇｘａｒ 、 工、Ｂ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ
、 ｐ詑ｐａｌ”ａ ｔ ｉ ７６共著％ Ａ
捗→−如−ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｌｎｌｎｇ
ｅｎｕｃＬｓａｔｓａ ｍａｔｏｍａｌｉａｎ ａｅｌ
ｌｇ ”、’ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
０ｆｃｙｔｏｃｈａ１．ａａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａ
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ａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
″、′″Ｂｕ１１． Ｂｘｐ、 Ｂｉｏｌ、 Ｍ６１（
Ｌ、 ’ ９５．８４〜８７（１９８４） ； Ｍ、
Ｍ、 ｗｉｇｘａｒ 、 工、Ｂ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ
、 ｐ詑ｐａｌ”ａ ｔ ｉ ７６共著％ Ａ
捗→−如−ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｌｎｌｎｇ
ｅｎｕｃＬｓａｔｓａ ｍａｔｏｍａｌｉａｎ ａｅｌ
ｌｇ ”、’ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐ’ｎｙｓ、 Ｒｅａ、 Ｃ０ｍｍ、 ”、６６
．６６９〜６７４（１９７５））。次の工うに実施する
と優れている： 指数的に成長するＬ９２９−細胞をトリプシン処理し、
血清不含のＤＭＬ′Ｍ中で洗いかつ細胞１０６個／フの
密度でサイトカラシ／Ｂ （５Ｑμｇ／ｙＪ ）と３７
℃で恒温保持する。９０秒で細胞質体が生成し、これは
細胞表面でくび１１込んでいる。細胞質体を細胞力１ら
強力なり７局化にエリ分離する。残りの細胞を１００Ｘ
、９で１０分間遠心することにエリ沈降させる。上澄み
中の細胞質体に１２００ｘｇで１５分間遠心することに
工ρ沈降させかつ血清不含のＤＭＥＭ、 １５ ％フィ
ブル（Ｐｈａｒｍａａｉａ ）中に害Ｒ濁させる。残り
の核含有小胞から、細胞質体を血清不含のＤＭ中の２５
チフイコル２Ｆｊ、１７％フィコル’ｌ ｍｌ。
．６６９〜６７４（１９７５））。次の工うに実施する
と優れている： 指数的に成長するＬ９２９−細胞をトリプシン処理し、
血清不含のＤＭＬ′Ｍ中で洗いかつ細胞１０６個／フの
密度でサイトカラシ／Ｂ （５Ｑμｇ／ｙＪ ）と３７
℃で恒温保持する。９０秒で細胞質体が生成し、これは
細胞表面でくび１１込んでいる。細胞質体を細胞力１ら
強力なり７局化にエリ分離する。残りの細胞を１００Ｘ
、９で１０分間遠心することにエリ沈降させる。上澄み
中の細胞質体に１２００ｘｇで１５分間遠心することに
工ρ沈降させかつ血清不含のＤＭＥＭ、 １５ ％フィ
ブル（Ｐｈａｒｍａａｉａ ）中に害Ｒ濁させる。残り
の核含有小胞から、細胞質体を血清不含のＤＭ中の２５
チフイコル２Ｆｊ、１７％フィコル’ｌ ｍｌ。
１６％フイコル０．５ゴ、１５チフィコルＱ、５ｍｌ。
１２．５％タフィル２ｍｅ ｆ含む勾配（下部７））ら
上部へ）において１０００００ｘＰで６０分間３０’Ｃ
で遠心することにより分離する。１５〜１６チフイコル
領域（つ細胞質体バンドを集めかつ２回血清不含のＤ）
、（段４中、１２００）ｌで、１５分間遠心する。
上部へ）において１０００００ｘＰで６０分間３０’Ｃ
で遠心することにより分離する。１５〜１６チフイコル
領域（つ細胞質体バンドを集めかつ２回血清不含のＤ）
、（段４中、１２００）ｌで、１５分間遠心する。
ＩＩ）ＮＡの単離に当っては、細胞質体バンドを血清不
含のＤＭＥＭ ２ Ｑ Ｑ珂に再懸濁させ、５０ミリモ
ルトリス、−７，２，１０ミリモルＥＤＴＡ 。
含のＤＭＥＭ ２ Ｑ Ｑ珂に再懸濁させ、５０ミリモ
ルトリス、−７，２，１０ミリモルＥＤＴＡ 。
１．５ミリそルＭｇＣｊ ２．５ ｍｌ ｐ添加する。
細胞質体’ｔＮＰ ４０ （Ｒｏｔｈ ） ２ ｔｔｌ
ｃ）ｆＡ加ｔｌｃＬ’）ｆＪ菌し刀λつ溶菌液を１４０
００）ｌで１５分間遠心する。上澄みにプロティナーゼ
Ｋ（１００μｌ／−１Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ） ｆ加え、３７℃で２時間恒温保持しかつ
フェノールで２回抽出する。引続いて、上澄みを類アー
ゼＡ（１００μＶμ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ）と−緒に３７°Ｃで１時間恒温保持し、プ
ロティナーゼＫ（１００μｇ／ｐＪ％Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ） １に添加しかつ再度２時
間恒温保持する。ＤＮＡをそれぞれ２回フェノール及ヒ
クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）でρ
１つエーテルで１回抽出し、エタノール中で沈殿させか
つ１０ミリモルトリス、０．１ミリモルＥＤＴＡ 、
ｔｊ ７−５中に取る。収量はＤＮＡ約５μ＆／１０８
個（細胞質体）である。
ｃ）ｆＡ加ｔｌｃＬ’）ｆＪ菌し刀λつ溶菌液を１４０
００）ｌで１５分間遠心する。上澄みにプロティナーゼ
Ｋ（１００μｌ／−１Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ） ｆ加え、３７℃で２時間恒温保持しかつ
フェノールで２回抽出する。引続いて、上澄みを類アー
ゼＡ（１００μＶμ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ）と−緒に３７°Ｃで１時間恒温保持し、プ
ロティナーゼＫ（１００μｇ／ｐＪ％Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ） １に添加しかつ再度２時
間恒温保持する。ＤＮＡをそれぞれ２回フェノール及ヒ
クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）でρ
１つエーテルで１回抽出し、エタノール中で沈殿させか
つ１０ミリモルトリス、０．１ミリモルＥＤＴＡ 、
ｔｊ ７−５中に取る。収量はＤＮＡ約５μ＆／１０８
個（細胞質体）である。
６、 不滅化用ＤＮＡ ｉヒドリ／片球へ導入方法１に
エフ調製し九リンパ球（細胞２×１０８個）を当業者に
公知の条件下に“ポークライーｙ分裂促進剤” （ＰＷ
Ｍ、 Ｉ Ｑ ４ ／ｄ ）に工り成長に対して励起し
かつ２日後にそれぞれ細胞１０８個の２つの平行培養物
（Ａ、Ｂ）に分離する。培養物Ａの細胞を方法２により
得られたＬ９２９−細胞の細胞質体からのＤＮＡと恒温
保持する。培養物Ｂの細胞を培参物Ａと同様に処理する
が、但し導入すべきＤＮＡは恒温保持培地には存在して
いない。引続いて、リンパ球を” ）ＴＥＰＥＳ 緩５
生理食塩液”（ＢｅＢ５ ： ２０ミリモル１（ＥＰＩ
Ｓ、 １３７ミリモルＮｍ口、０．５ミリモルＫ（Ｊ、
３ミリモルグルコース、ｐ）１７．１）中で３回洗いか
りＤＥＡＲ−デキストラン（躍５０００００ ｓ Ｂ
ｅＢ８０．３ ”９ ／ ｍｌ ）と細胞１０６個／１
の密度で３７℃で洗５゜Ｌ９２９細胞質体からのＤＮＡ
（３μｇ）ｔ２５０ミリ−Ｅ： ルＣａ Ｃ！ ２１
００μｌに加えかつこの溶液ｔ−２倍濃０のＨ・ＢＢ（
１００Ａｌ ）に２ペット滴加する。リンパ球を細Ｅ５
Ｘ１０’個／−の密度で３７℃でこのＤＮＡ溶液と恒温
保持する。引続いて、リンパ球を１回Ｈ６ＢＢ中３７°
Ｃで洗イ、ＨａＢＳ Ｑ、５ ｒｕｔ 中ニ再懸濁しか
つ９・０秒間ポリエチレングリコール（ＭＷ ４０００
．５００１％Ｐ／ＨｍＢ８ ｍ、 −７，ｉ ）０．５
−と３７℃で９０秒間恒温保持する。５分間にわ禽って
、温いＨｓＢＳ５１１Ｌｔをピペット添加し、す／パ球
ｔ２回ＨｓＢＳ中で洗い、細胞１０７個／ｄの密度で２
４穴微量滴定皿（１１１ＬｌＺ穴１個）中のイスコゾズ
ＤＭＥＭ、４ミリモルＬ−グルタミ／、１ミリ七ルビル
ペート、１ミリモルオキサル酢酸、０．ＩＵ／−インシ
ュリン、１０μＥｉ／ＩＬｌトランスフエリン、１５俤
胎生小牛血清中に植込みかつ３７℃、５％ＣＯ２で恒温
保持する。次の２週間の間、穴１個当シ培地１００μノ
を２日月毎に新しい培地に代える。
エフ調製し九リンパ球（細胞２×１０８個）を当業者に
公知の条件下に“ポークライーｙ分裂促進剤” （ＰＷ
Ｍ、 Ｉ Ｑ ４ ／ｄ ）に工り成長に対して励起し
かつ２日後にそれぞれ細胞１０８個の２つの平行培養物
（Ａ、Ｂ）に分離する。培養物Ａの細胞を方法２により
得られたＬ９２９−細胞の細胞質体からのＤＮＡと恒温
保持する。培養物Ｂの細胞を培参物Ａと同様に処理する
が、但し導入すべきＤＮＡは恒温保持培地には存在して
いない。引続いて、リンパ球を” ）ＴＥＰＥＳ 緩５
生理食塩液”（ＢｅＢ５ ： ２０ミリモル１（ＥＰＩ
Ｓ、 １３７ミリモルＮｍ口、０．５ミリモルＫ（Ｊ、
３ミリモルグルコース、ｐ）１７．１）中で３回洗いか
りＤＥＡＲ−デキストラン（躍５０００００ ｓ Ｂ
ｅＢ８０．３ ”９ ／ ｍｌ ）と細胞１０６個／１
の密度で３７℃で洗５゜Ｌ９２９細胞質体からのＤＮＡ
（３μｇ）ｔ２５０ミリ−Ｅ： ルＣａ Ｃ！ ２１
００μｌに加えかつこの溶液ｔ−２倍濃０のＨ・ＢＢ（
１００Ａｌ ）に２ペット滴加する。リンパ球を細Ｅ５
Ｘ１０’個／−の密度で３７℃でこのＤＮＡ溶液と恒温
保持する。引続いて、リンパ球を１回Ｈ６ＢＢ中３７°
Ｃで洗イ、ＨａＢＳ Ｑ、５ ｒｕｔ 中ニ再懸濁しか
つ９・０秒間ポリエチレングリコール（ＭＷ ４０００
．５００１％Ｐ／ＨｍＢ８ ｍ、 −７，ｉ ）０．５
−と３７℃で９０秒間恒温保持する。５分間にわ禽って
、温いＨｓＢＳ５１１Ｌｔをピペット添加し、す／パ球
ｔ２回ＨｓＢＳ中で洗い、細胞１０７個／ｄの密度で２
４穴微量滴定皿（１１１ＬｌＺ穴１個）中のイスコゾズ
ＤＭＥＭ、４ミリモルＬ−グルタミ／、１ミリ七ルビル
ペート、１ミリモルオキサル酢酸、０．ＩＵ／−インシ
ュリン、１０μＥｉ／ＩＬｌトランスフエリン、１５俤
胎生小牛血清中に植込みかつ３７℃、５％ＣＯ２で恒温
保持する。次の２週間の間、穴１個当シ培地１００μノ
を２日月毎に新しい培地に代える。
５週間口に培養物′＠：３倍に稀釈する。更に、引続い
て成長する不滅化した細胞系をイスコデズＤＭＷ、ＲＰ
ＭＩ培地（それぞれ１５チ胎生小牛血清）又は血清不含
媒地（ＨＢ −１０４、ＮＥＮ −ＤｕＰｏｐｔ ；
ＤＭＥＭ −ＳＦＭ −’ｌ 、Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈａ伽）中で恒温保持する。
て成長する不滅化した細胞系をイスコデズＤＭＷ、ＲＰ
ＭＩ培地（それぞれ１５チ胎生小牛血清）又は血清不含
媒地（ＨＢ −１０４、ＮＥＮ −ＤｕＰｏｐｔ ；
ＤＭＥＭ −ＳＦＭ −’ｌ 、Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈａ伽）中で恒温保持する。
結果：
培養物ＡではＤＮＡ導入して６日後にリンパ球コロニー
が認められ、これは次の５日間で大きさと細胞数が増加
しｋ（細胞５００個／コロニーまで）。これらのコロニ
ーは数個の小さなコロニーに分解し、そのうちのいくつ
刀）はＤＮＡ ４人してから約２０日以降に連続的に成
長し始め７ｔ０ＤＮＡ導入して２＋−ら３０日ミー微量
滴定皿のすべての穴でり／パ様細胞のコロニー数個が認
められ次（表１）。
が認められ、これは次の５日間で大きさと細胞数が増加
しｋ（細胞５００個／コロニーまで）。これらのコロニ
ーは数個の小さなコロニーに分解し、そのうちのいくつ
刀）はＤＮＡ ４人してから約２０日以降に連続的に成
長し始め７ｔ０ＤＮＡ導入して２＋−ら３０日ミー微量
滴定皿のすべての穴でり／パ様細胞のコロニー数個が認
められ次（表１）。
細胞はＤＮＡ導入してから５週間後に６倍に稀釈するこ
とができた。その後、細片とは７力月まで培養増殖し、
その際に細胞の老化は認められなで１つｔｏ 培養物Ｂでは見掛けＤＮＡ導入後にリンパ球の増殖及び
リンパ様細胞の連続成長コロニーは見られなで１つた。
とができた。その後、細片とは７力月まで培養増殖し、
その際に細胞の老化は認められなで１つｔｏ 培養物Ｂでは見掛けＤＮＡ導入後にリンパ球の増殖及び
リンパ様細胞の連続成長コロニーは見られなで１つた。
細胞は見掛けＤＮＡ導入後４日間で老化して、死滅した
。
。
例２
末梢血液からのヒトＢリンパ球の不滅化材料：
セファロース（５ＭＢＸ（’ＮＢｒ活性化（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ）、マウスモノクロナール抗体抗−ヒトーパ
ンーＢ−リンパ球（Ｍｉｌｅｓ ） 、ヒト血清アルブ
ミン（５ｅｒｖａ ） 方法： 末梢血液で為らのと） ＩＪンパ球の単離は例１と同様
に行なった。
ａｃｉａ ）、マウスモノクロナール抗体抗−ヒトーパ
ンーＢ−リンパ球（Ｍｉｌｅｓ ） 、ヒト血清アルブ
ミン（５ｅｒｖａ ） 方法： 末梢血液で為らのと） ＩＪンパ球の単離は例１と同様
に行なった。
１、 ヒトＢリンパ球の単離
Ｂ ＩＪンパ球の取得に当り、リンパ球調製物をアフイ
ニテイクロマトグラフイにエリ分離し次。
ニテイクロマトグラフイにエリ分離し次。
その丸めに次の方法を通用する。
マウスモノクロナール抗−ヒドーパ／−Ｂ−リンパ球抗
体ヲ０．１モルＮａＨＣＯ３，０，５モルＮａＣｊ％ｐ
）４８．５中に溶解しかつＣＮＢｒＮＢｒ活性化セファ
ロ−１６抗ＢＣ抗ｍｔ７ｐｒ’ル酩）と４℃で１晩恒温
保持する。セファロースを３回３０分間０．１モルＮａ
ＨＣＯ３，０，５モルＮａＣｊ、ｐ）１８．５中及び３
回３０分間０．１モル酢酸Ｎ＆、０．５−ｆ：ｈＮａ口
、ｐ）１４．５中で洗浄する。なお遊離している反応性
基を遮断するために、セファロースをｉＮａ口、−４，
５と２時間恒温保持する。このセファロースｔ″′ホス
フェート緩衝生理食塩液１（ＰＢＳ ） ０．２１ヒト
血清アルゾミン（ＩＳＡ ）中で２回洗浄する。Ｂ Ｉ
Ｊンパ球の単離に当って、末梢血液からのリンパ球調製
物の細胞Ｑ ＰＢＳ 。
体ヲ０．１モルＮａＨＣＯ３，０，５モルＮａＣｊ％ｐ
）４８．５中に溶解しかつＣＮＢｒＮＢｒ活性化セファ
ロ−１６抗ＢＣ抗ｍｔ７ｐｒ’ル酩）と４℃で１晩恒温
保持する。セファロースを３回３０分間０．１モルＮａ
ＨＣＯ３，０，５モルＮａＣｊ、ｐ）１８．５中及び３
回３０分間０．１モル酢酸Ｎ＆、０．５−ｆ：ｈＮａ口
、ｐ）１４．５中で洗浄する。なお遊離している反応性
基を遮断するために、セファロースをｉＮａ口、−４，
５と２時間恒温保持する。このセファロースｔ″′ホス
フェート緩衝生理食塩液１（ＰＢＳ ） ０．２１ヒト
血清アルゾミン（ＩＳＡ ）中で２回洗浄する。Ｂ Ｉ
Ｊンパ球の単離に当って、末梢血液からのリンパ球調製
物の細胞Ｑ ＰＢＳ 。
０．２ 係Ｈ８Ａ中で洗浄し、セファロースカラム上に
層状に装入し〃）つ１５分間恒温保持する。カラムに結
合しない細胞（Ｔりンパ球等）をＰＢ８５０ ｄ、 ０
．２９６ ＩＳＡ テ洗イｆｉｔｏ 結合細胞Ｃ８９７
２球）ｔ−取得する迄めに、セファロースをＰＢＳ ２
Ｎｔ、 ０．２ ％ ＩＳＡ 、 １０ ｍ９／
ｌｘｌ Ｉｇ（）と６７°Ｃで２０分間恒温保持する。
層状に装入し〃）つ１５分間恒温保持する。カラムに結
合しない細胞（Ｔりンパ球等）をＰＢ８５０ ｄ、 ０
．２９６ ＩＳＡ テ洗イｆｉｔｏ 結合細胞Ｃ８９７
２球）ｔ−取得する迄めに、セファロースをＰＢＳ ２
Ｎｔ、 ０．２ ％ ＩＳＡ 、 １０ ｍ９／
ｌｘｌ Ｉｇ（）と６７°Ｃで２０分間恒温保持する。
Ｂ ＩＪンパ球ｔ−ＰＢＳ 。
（Ｌ２ ％ ＩＳＡ ％ １０ ”５ｉ’ ／ ｔｘｌ
ＩｇＧ テ洗い出す。
ＩｇＧ テ洗い出す。
Ｂ ＩＪンパ球ｖ４製物の純度は当業者に公知の間接免
役螢光法に工り測定する。この調製物で細胞の９０チ以
上にＢリンパ球マーカーである。
役螢光法に工り測定する。この調製物で細胞の９０チ以
上にＢリンパ球マーカーである。
２、 ８９７２球の不滅化
８９７２球を１ポ一クウイード分裂促進剤（ＰＷＭ 、
１０μｍ１／Ｒ１）と恒温保持することにエタ成長に
対して励起させる。２日後に培養物ｔそｎぞれ細胞３Ｘ
１０？個の２つの平行培養物（Ａ、Ｂ）に分ける。培養
物Ａの細胞にＬ９２９、；Ｊ胞質体η為らのＤＮＡ ’
ｉ導入する（例１に記載さｎている工うに）。培養物Ｂ
の細胞も同じ工うに処理するが、ＤＮＡは加えない。そ
れぞれの培養物の細胞を細胞５Ｘ１０’個／−の密度で
２４穴微量滴定皿（穴１個当９１１１１”）中に接種す
る。
１０μｍ１／Ｒ１）と恒温保持することにエタ成長に
対して励起させる。２日後に培養物ｔそｎぞれ細胞３Ｘ
１０？個の２つの平行培養物（Ａ、Ｂ）に分ける。培養
物Ａの細胞にＬ９２９、；Ｊ胞質体η為らのＤＮＡ ’
ｉ導入する（例１に記載さｎている工うに）。培養物Ｂ
の細胞も同じ工うに処理するが、ＤＮＡは加えない。そ
れぞれの培養物の細胞を細胞５Ｘ１０’個／−の密度で
２４穴微量滴定皿（穴１個当９１１１１”）中に接種す
る。
結果：
培養ＡではＤＮＡ導入して２日後に顕微鏡でリンパ球コ
ａニーが観察され、これは続く１０日間で大きくなった
。次の１週間でコロニーは数個の小さなコロニーに分解
した。ｒ）ＮＡ導入して６週間目から、培ｍＡのすべて
の穴で細胞系に成長した連続成長のコａ＝−が観察され
次（表２）。５日目で為らは細胞を−り大き々培養容器
に移しで１つ更に増殖させ次。培地中で連続増殖してい
る１０力月後も細胞の老化は確認されなで１つ声。培養
Ｂでは見掛けＤＮＡ導入後、成長するリンパ様コロニー
は観察されなかった。細胞は老化しかつ見掛けＤＮＡ導
入して５日以内に死滅した。
ａニーが観察され、これは続く１０日間で大きくなった
。次の１週間でコロニーは数個の小さなコロニーに分解
した。ｒ）ＮＡ導入して６週間目から、培ｍＡのすべて
の穴で細胞系に成長した連続成長のコａ＝−が観察され
次（表２）。５日目で為らは細胞を−り大き々培養容器
に移しで１つ更に増殖させ次。培地中で連続増殖してい
る１０力月後も細胞の老化は確認されなで１つ声。培養
Ｂでは見掛けＤＮＡ導入後、成長するリンパ様コロニー
は観察されなかった。細胞は老化しかつ見掛けＤＮＡ導
入して５日以内に死滅した。
不滅化し九細胞’ｉ、ＢＩＪンパ球に特徴的である表面
マーカーの発現について試験し露。これｌ’！、ＢＩＪ
ンパ球膜イムノグロブリンの検出の工めに羊赤血球ロゼ
ツト法（Ｍ、Ｌ Ｋａｐｌａｎ ａｔ。
マーカーの発現について試験し露。これｌ’！、ＢＩＪ
ンパ球膜イムノグロブリンの検出の工めに羊赤血球ロゼ
ツト法（Ｍ、Ｌ Ｋａｐｌａｎ ａｔ。
ａｌ、、” Ｊ、 ＩｍｍｕｎｏＬ Ｍｅｔｈｏｄｓ
” 、 ５．１３１．１９７４）、−次抗体としてマ
ウスモノクロナール抗−ヒトーパンＢ−もしくはパンチ
−９フ２球抗体（Ｍｉｌｅａ ）及び二次抗体としてフ
ルオレセインインチオンアネート接合抗−マウス−ｘｇ
（）ｌ （Ｍｉｌｅｓ ）の使用下に並びに螢光標識し
た抗−ヒト−Ｉｇ−抗体（Ｄａｋｏ ）の使用下に螢光
法を用いて行なった。これらの方法は免疫学の標単方法
に含まれる。表３から、不滅化し次リンパ球の９０係以
上がＢりンパ球マーカーであることが明らかである。
” 、 ５．１３１．１９７４）、−次抗体としてマ
ウスモノクロナール抗−ヒトーパンＢ−もしくはパンチ
−９フ２球抗体（Ｍｉｌｅａ ）及び二次抗体としてフ
ルオレセインインチオンアネート接合抗−マウス−ｘｇ
（）ｌ （Ｍｉｌｅｓ ）の使用下に並びに螢光標識し
た抗−ヒト−Ｉｇ−抗体（Ｄａｋｏ ）の使用下に螢光
法を用いて行なった。これらの方法は免疫学の標単方法
に含まれる。表３から、不滅化し次リンパ球の９０係以
上がＢりンパ球マーカーであることが明らかである。
表 ２
表 ３
不滅化された細胞
例 ３
末梢血液からのヒトＴリンパ球の不滅化方法：
末梢血液ρ≧らのヒト１７７２球の詞製は例１に記載し
７ｃ工うに行なった。ヒトでリンパ球はアフィニティク
ロマトグラフィに１シリンパ球の全集団〃為ら例２の方
法と同様にして単離した。
７ｃ工うに行なった。ヒトでリンパ球はアフィニティク
ロマトグラフィに１シリンパ球の全集団〃為ら例２の方
法と同様にして単離した。
例２の方法とに、モノクロナールマウス抗−ヒドーパ／
Ｔ−リンパ球抗体をセファロースに結合させ次点で異な
っていた。この工うにして７９７２球をセフ・アロース
に結合させかっＰＢＳ 。
Ｔ−リンパ球抗体をセファロースに結合させ次点で異な
っていた。この工うにして７９７２球をセフ・アロース
に結合させかっＰＢＳ 。
０．２ ％、ヒ） ｒｆｎ清アルブミン、１０１ｎ９
／ ｎｌ ＩｇＧにニジ洗い出すことができｆｃｏＴリ
ンパ球調製物の純度は、マウス抗−ヒトーパンＴ−リン
パ球抗体の間接免疫螢光に１り測定して９０％ｔ−上廻
っていた。
／ ｎｌ ＩｇＧにニジ洗い出すことができｆｃｏＴリ
ンパ球調製物の純度は、マウス抗−ヒトーパンＴ−リン
パ球抗体の間接免疫螢光に１り測定して９０％ｔ−上廻
っていた。
７９７２球を“ポークライード分裂促進剤”（ＰＷＭ、
１０μ９／１）との恒温保持に工す成長するように励
起した。２日後に、それぞれ細胞４Ｘ１０’個の２つの
平行培養物（Ａ、 、 Ｂ ）に分けた。培養物Ａの細
胞に例１に記載し７Ｃ１うにＬ９２９−細胞質体１ｈう
０ＤＮＡ （１４） ｋ導入した。培養物Ｂの細胞では
見掛けＤＮＡ導入を行なつ九。細胞′Ｉ＆：細胞５ｘｉ
ｏ’個／ゴの密度で２４穴微量滴定皿に接種し−ｆｃ（
穴１個当シ１帽。
１０μ９／１）との恒温保持に工す成長するように励
起した。２日後に、それぞれ細胞４Ｘ１０’個の２つの
平行培養物（Ａ、 、 Ｂ ）に分けた。培養物Ａの細
胞に例１に記載し７Ｃ１うにＬ９２９−細胞質体１ｈう
０ＤＮＡ （１４） ｋ導入した。培養物Ｂの細胞では
見掛けＤＮＡ導入を行なつ九。細胞′Ｉ＆：細胞５ｘｉ
ｏ’個／ゴの密度で２４穴微量滴定皿に接種し−ｆｃ（
穴１個当シ１帽。
結果：
培養物Ａでは、成長するリンパ球コロニー数個が観察さ
れ、これはＤＮＡ導入導入後１巨目で連続的に増殖する
リンパ球コロニーが成長し友。結果を表４に示す。細胞
は４力月まで増殖し、その際に細胞の老化は観察されな
かった。
れ、これはＤＮＡ導入導入後１巨目で連続的に増殖する
リンパ球コロニーが成長し友。結果を表４に示す。細胞
は４力月まで増殖し、その際に細胞の老化は観察されな
かった。
培養物Ｂでに見掛けＤＮＡ導入後、リンパ球の成長に観
察されなかった。細胞は次の５日間で死滅し２。
察されなかった。細胞は次の５日間で死滅し２。
培養物Ａ（Ｚ）細胞を例２と同様にその表面マーカーに
ついて調べた。培養物Ａの９０％に上廻る細胞で表面マ
ーカーが発現し、これは７９７２球の特徴である（表５
参照）。
ついて調べた。培養物Ａの９０％に上廻る細胞で表面マ
ーカーが発現し、これは７９７２球の特徴である（表５
参照）。
表 ４
表５
不滅化された細胞
例 ４
本発明にニジ不滅化したリンパ球で１らのＤＮＡの導入
に工りヒト１７７２球の不滅化 方法： 末梢血液力１らのヒトリンパ球を例１と同様にして単離
した。
に工りヒト１７７２球の不滅化 方法： 末梢血液力１らのヒトリンパ球を例１と同様にして単離
した。
不滅化用ＤＮＡ１，本発明にエフ（例１と同様にして）
不滅化したリンパ様細胞系（Ｃ−９）の細胞から取得し
た。リンパ様細胞系（Ｃ−９）は、Ｌ９２９−細胞質体
からのＤＮＡ ｔ−末梢血液のリンパ球に導入すること
に工り得られ声。Ｃ−９細胞をＰＢＳ中で洗いかつ２０
０ミリモルトリス、１００ミリモｈ ＥＤＴＡ 、
０．２ ％ ＳＤＳ 、Ｐ）１７．２中に溶菌し７ｍ．
ＲＮＡ ’ｋ ＲＮ ７ーゼＡ （ １ ０ ０４／
ｍｌ， Ｂｏｓｈｒｉｎｇｓｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）
と３７℃で２時間恒温保持し、蛋白質をプロティナーゼ
Ｋ（ １ ０ ０ Ａ９ ／ ｍＡ， Ｂｏｅ’ｎｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）と６７℃で６時間恒温
保持することに工り分解した。ＤＮＡ ｔ−フェノール
抽出及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：
１）−抽出に工り単離した。
不滅化したリンパ様細胞系（Ｃ−９）の細胞から取得し
た。リンパ様細胞系（Ｃ−９）は、Ｌ９２９−細胞質体
からのＤＮＡ ｔ−末梢血液のリンパ球に導入すること
に工り得られ声。Ｃ−９細胞をＰＢＳ中で洗いかつ２０
０ミリモルトリス、１００ミリモｈ ＥＤＴＡ 、
０．２ ％ ＳＤＳ 、Ｐ）１７．２中に溶菌し７ｍ．
ＲＮＡ ’ｋ ＲＮ ７ーゼＡ （ １ ０ ０４／
ｍｌ， Ｂｏｓｈｒｉｎｇｓｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）
と３７℃で２時間恒温保持し、蛋白質をプロティナーゼ
Ｋ（ １ ０ ０ Ａ９ ／ ｍＡ， Ｂｏｅ’ｎｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）と６７℃で６時間恒温
保持することに工り分解した。ＤＮＡ ｔ−フェノール
抽出及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：
１）−抽出に工り単離した。
ヒトＩＪンパ球の不滅化は、本発明に工９Ｃ−９細胞ρ
λらのＤＮＡの転移にエタ行なった。そのｋめに、リン
パ球を“ポークライー−分裂促進剤“（ＰＷＭ、 １０
μ、Ｖ／ｍｔ）と恒温保持に１９底長する工うに励起
した。３日後に、それぞれリンパ球５Ｘ１０’個の２つ
の平行培養物（Ａ。
λらのＤＮＡの転移にエタ行なった。そのｋめに、リン
パ球を“ポークライー−分裂促進剤“（ＰＷＭ、 １０
μ、Ｖ／ｍｔ）と恒温保持に１９底長する工うに励起
した。３日後に、それぞれリンパ球５Ｘ１０’個の２つ
の平行培養物（Ａ。
Ｂ〕に分けた。培養物Ａの細胞に（例１に記載しπ工う
に）ｃ−９？ｆａ胞で為らのＤＮＡを導入し九（１０μ
ｇ／細胞１０７）。培養物Ｂ９細胞には見掛けＤＮＡ導
入を前記の工うに行なった。
に）ｃ−９？ｆａ胞で為らのＤＮＡを導入し九（１０μ
ｇ／細胞１０７）。培養物Ｂ９細胞には見掛けＤＮＡ導
入を前記の工うに行なった。
結果：
培養物ＡではＤＮＡ導入後２５日してリンパ様細胞のコ
ロニーが成長しく表６参照）、こｎを５６日目に工り大
きな培養容器に移し迄。細胞は６力月間老化も観察され
ずに培養された。培養物Ｂの細胞は見掛けＤＮＡ導入導
入後５弘目老化が認めら九力１つ次の３日間で死滅した
。
ロニーが成長しく表６参照）、こｎを５６日目に工り大
きな培養容器に移し迄。細胞は６力月間老化も観察され
ずに培養された。培養物Ｂの細胞は見掛けＤＮＡ導入導
入後５弘目老化が認めら九力１つ次の３日間で死滅した
。
本発明にエリ培養物Ａで不滅化しｍ細胞（Ｃ−１７、二
次トランスフェクション細胞系）〃）らのＤＮＡ ｉ末
梢血液のリンパ球に導入し：ｆｃ後で再び不滅化リンパ
様細胞系を生成し７２：（Ｃ−２８、三次トランスフェ
クション細胞系）。その際に永久に分裂するリンパ様コ
ロニーのエフ高い収率が達成された（表７参照）。これ
らの結果は、本発明に工す不滅化したリンパ球からのＤ
ＮＡ ’ｉヒトＩＪンパ球に導入し九後で再び永久成長
するリンパ様細胞系が得られることを示す。
次トランスフェクション細胞系）〃）らのＤＮＡ ｉ末
梢血液のリンパ球に導入し：ｆｃ後で再び不滅化リンパ
様細胞系を生成し７２：（Ｃ−２８、三次トランスフェ
クション細胞系）。その際に永久に分裂するリンパ様コ
ロニーのエフ高い収率が達成された（表７参照）。これ
らの結果は、本発明に工す不滅化したリンパ球からのＤ
ＮＡ ’ｉヒトＩＪンパ球に導入し九後で再び永久成長
するリンパ様細胞系が得られることを示す。
その際に、Ｌ９２９−細胞質体からのＤＮＡを導入し几
場合ｘＤも高い不滅化頻度が観察されん表 ６ 二次トランスフェクションによるヒトリンパ球の不滅比
表 ７ 三次トランスフェクションによるヒトリンパ球の不滅化
例 ５ ヒト羊膜線維芽細胞の不滅化 方法： ヒト胚線維芽細胞を潤製するに当ジ、羊水を妊婦の羊腹
腔の滅菌穿刺に工り取得し友。細胞’に１００）ｌで１
０分間遠心して沈降させ、イスコプズＤＭＥＭ、 ｌ
５優胎生小牛血清、１０μＩ／ｄトランスフエリン、０
．１Ｕ／ｄインシユリン、１５ミリモルＨＥＰＥＳ中に
再ｇ濁させかつ３７°ＣＡ５１ｉ ＣＯｚで恒温保持し
た。１０日後に、１コロニー当＃）３００個エフくの細
胞を含む細胞コロニーを継代培譬した。
場合ｘＤも高い不滅化頻度が観察されん表 ６ 二次トランスフェクションによるヒトリンパ球の不滅比
表 ７ 三次トランスフェクションによるヒトリンパ球の不滅化
例 ５ ヒト羊膜線維芽細胞の不滅化 方法： ヒト胚線維芽細胞を潤製するに当ジ、羊水を妊婦の羊腹
腔の滅菌穿刺に工り取得し友。細胞’に１００）ｌで１
０分間遠心して沈降させ、イスコプズＤＭＥＭ、 ｌ
５優胎生小牛血清、１０μＩ／ｄトランスフエリン、０
．１Ｕ／ｄインシユリン、１５ミリモルＨＥＰＥＳ中に
再ｇ濁させかつ３７°ＣＡ５１ｉ ＣＯｚで恒温保持し
た。１０日後に、１コロニー当＃）３００個エフくの細
胞を含む細胞コロニーを継代培譬した。
ヒト腺維芽細肥を第３継代で、それぞれ細胞１０’個を
含有する２つの平行培養物（Ａ、Ｂ）に分ける。不滅化
用ＤＮＡは例１の方法にＬすＬ９２９−細ｆＬ！！質体
ρ為ら得られ友。培養物Ａの細胞を２回ＨｅＢ５中で洗
いたっＤＥＡＥ−デキストラン（ＭＷ５０００００％０
．ＩＪ９／１ｔＨｅＢ８ ） 、！：３７℃の１５分間
恒温保持した。ＣａＣｊ２１２００μノ（１２５ミリモ
ル）中のＤＮＡ（０，８ｐＨ） ｋ２倍濃縮し−２Ｈｅ
Ｂ５ （ｐＨ７，１）１２００ ａｌにピペット滴加し
かつ室温で２０分間恒温保持した。羊膜線維芽細胞１に
２回ＨｅＢ５中で洗いかつ３７℃で２時間ＤＮＡ溶液と
恒温保持し友。細胞を２回ＨｅＢｅ中で洗いかっＤＭＥ
Ｍ、 １０ ｐｇ ７ｗ ） ランス７エリン、Ｑ、
ｉＵ／ｄインシュリン、１５ミリモ％ＨＥＰＥＳ、
ｌ ５ｆｉ胎生小牛血清中で恒温保持した。培養物Ｂ（
Ｄｄ胞は前記の工うに見掛けＤＮＡ ４人に使用した。
含有する２つの平行培養物（Ａ、Ｂ）に分ける。不滅化
用ＤＮＡは例１の方法にＬすＬ９２９−細ｆＬ！！質体
ρ為ら得られ友。培養物Ａの細胞を２回ＨｅＢ５中で洗
いたっＤＥＡＥ−デキストラン（ＭＷ５０００００％０
．ＩＪ９／１ｔＨｅＢ８ ） 、！：３７℃の１５分間
恒温保持した。ＣａＣｊ２１２００μノ（１２５ミリモ
ル）中のＤＮＡ（０，８ｐＨ） ｋ２倍濃縮し−２Ｈｅ
Ｂ５ （ｐＨ７，１）１２００ ａｌにピペット滴加し
かつ室温で２０分間恒温保持した。羊膜線維芽細胞１に
２回ＨｅＢ５中で洗いかつ３７℃で２時間ＤＮＡ溶液と
恒温保持し友。細胞を２回ＨｅＢｅ中で洗いかっＤＭＥ
Ｍ、 １０ ｐｇ ７ｗ ） ランス７エリン、Ｑ、
ｉＵ／ｄインシュリン、１５ミリモ％ＨＥＰＥＳ、
ｌ ５ｆｉ胎生小牛血清中で恒温保持した。培養物Ｂ（
Ｄｄ胞は前記の工うに見掛けＤＮＡ ４人に使用した。
結果：
培養物Ａの細胞はＤＮＡ導入後９カ月間連続成長し、そ
の際に細胞老化は観察されなかった。
の際に細胞老化は観察されなかった。
対照培養物Ｂは５０〜６０日後に老化しかつ死滅した。
例 ６
キサンチン−グアニンホスホトランスフェラーゼの細菌
遺伝子を不滅化されたヒトリンパ球に導入 方法： しトリンパ球を本発明に工９例１に記載しに１５に不滅
化しかつそれぞれ細１１’ｄ３Ｘ１０’個を含む２つの
平行培養物（Ａ、Ｂ）に分けた。
遺伝子を不滅化されたヒトリンパ球に導入 方法： しトリンパ球を本発明に工９例１に記載しに１５に不滅
化しかつそれぞれ細１１’ｄ３Ｘ１０’個を含む２つの
平行培養物（Ａ、Ｂ）に分けた。
培養物Ａ＋Ｚ）細胞中に、キサンチン−グアニンホスホ
トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）ｏＭ菌遺伝子を担持ｆ、
ｂプラスミｌ’ ｐＥ３Ｖ ２ ｇｐｔ （１０４ＸＲ
，Ｃ。
トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）ｏＭ菌遺伝子を担持ｆ、
ｂプラスミｌ’ ｐＥ３Ｖ ２ ｇｐｔ （１０４ＸＲ
，Ｃ。
Ｍｕｌｌｇａｎ ＊ Ｐ、 Ｂａｒｇ、 ” ８ａｉ
ａｎａｅ”、２０９．１４２２〜１４２７．１９８０）
ｔ−導入した。
ａｎａｅ”、２０９．１４２２〜１４２７．１９８０）
ｔ−導入した。
培養物Ｂ（ＤＮＡ胞では見掛けＤＮＡ ４人を行なつ友
。
。
ＤＮＡ導入後１日間？＠脂を選択培地（ＤＭ１１ｉ１７
．２μｍ１／ｍアミノプテリン、２５０μｇ／―午サン
チン、１５μ９７ＩＬｔヒボキサンチン、１５０μＩ／
−グルタミン、１０μｇ／−チミジン、２５μ９／−ミ
コフェノール酸）中で、ｇｐ’：遺伝子を受容し〃１つ
相応する酵素を含有する細胞ｔ）８択する工うに培養し
た。ｇｐｔ遺伝子を発税しない細胞は選択培地中で死滅
した。１０日後に生存し、選択培地中で増殖しているコ
ロニーを数えた。
．２μｍ１／ｍアミノプテリン、２５０μｇ／―午サン
チン、１５μ９７ＩＬｔヒボキサンチン、１５０μＩ／
−グルタミン、１０μｇ／−チミジン、２５μ９／−ミ
コフェノール酸）中で、ｇｐ’：遺伝子を受容し〃１つ
相応する酵素を含有する細胞ｔ）８択する工うに培養し
た。ｇｐｔ遺伝子を発税しない細胞は選択培地中で死滅
した。１０日後に生存し、選択培地中で増殖しているコ
ロニーを数えた。
結果：
培養物ＡはＤＮＡ ４人して１０日後に、選択培地中で
増殖するり／パ様コロニーを含有シていた（表８）。ｇ
ｐｔ遺伝子はこれらのコロニーの細胞中に存在するはず
である。それというのもこれらの−次トランスフエクメ
／トからのＤＮＡによるトランスフェクションにニジ改
めて導入することができたからである。その際に得られ
た二次トランスフェクションのゲノム中でｇｐｔ遺伝子
はサクデンプロット分析（５ｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ
Ａｎａｌｙｓｅ ）に工ｐ検出した。
増殖するり／パ様コロニーを含有シていた（表８）。ｇ
ｐｔ遺伝子はこれらのコロニーの細胞中に存在するはず
である。それというのもこれらの−次トランスフエクメ
／トからのＤＮＡによるトランスフェクションにニジ改
めて導入することができたからである。その際に得られ
た二次トランスフェクションのゲノム中でｇｐｔ遺伝子
はサクデンプロット分析（５ｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ
Ａｎａｌｙｓｅ ）に工ｐ検出した。
培養物Ｂの細胞は見掛けＤＮＡ導入後に死滅し、その際
に成長コロニーは選択培地中で認められなたつｍｏ 表 ８ 不滅化されπヒ） １７７８球 中へのｇｐｔ遺伝子の導入
に成長コロニーは選択培地中で認められなたつｍｏ 表 ８ 不滅化されπヒ） １７７８球 中へのｇｐｔ遺伝子の導入
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト又は動物細胞を永久培養可能な細胞の非増殖性
フラグメントと融合しかつその融合細胞を培地中で選択
物質なしに培養することによりヒト又は動物細胞を不滅
化する方法において、永久培養可能なヒト又は動物細胞
の細胞質から得られたＤＮＡを不滅化すべき細胞にトラ
ンスフェクションすることを特徴とするヒト又は動物細
胞の不滅化法。 ２、永久培養可能な細胞として腫瘍細胞又は不滅化され
た非腫瘍発生性細胞を使用する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３、ＤＮＡを取得するに当り、永久培養可能な細胞の細
胞質体を溶菌し、可溶性の溶菌液をプロティナーゼと恒
温保持し、その後でＤＮＡを分離し、ＲＮアーゼと共に
恒温保持しかつ再びＤＮＡ−溶剤で抽出する特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、ＤＮＡを取得するに当り、永久培養可能な細胞の細
胞質を溶菌し、核ＤＮＡを分離し、上澄みをプロティナ
ーゼと恒温保持し、その後でＤＮＡを分離し、ＲＮアー
ゼと共に恒温 保持しかつ再びＤＮＡ−溶剤で抽出する特許請求の範囲
第１項又は第２項記載の方法。 ５、ＤＮＡを取得するに当り、永久培養可能な細胞の細
胞質を溶菌し、ミトコンドリアを含まないフラクション
を取得し、可溶性の溶菌液をプロティナーゼと恒温保持
し、その後でＤＮＡを分離し、ＲＮアーゼと共に恒温保
持しかつ再びＤＮＡ−溶剤で抽出する特許請求の範囲第
１項又は第２項記載の方法。 ６、分離するに当りフェノール及び／又はクロロホルム
−イソアミルアルコール混合物のようなＤＮＡ−溶剤で
抽出する特許請求の範囲第３項から第５項までのいずれ
か１項記載の方法。 ７、成長もしくは分裂に対して励起された状態の不滅化
すべき細胞に細胞質ＤＮＡをトランスフェクションする
特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項記
載の方法。 ８、増殖期Ｉのリンパ球を使用する特許請求の範囲第７
項記載の方法。 ９、ヒト又は動物細胞を永久培養可能な細胞の非増殖性
フラグメントと融合しかつその融合細胞を培地中で選択
物質なしに培養することによりヒト又は動物細胞を不滅
化する際に、永久培養可能なヒト又は動物細胞の細胞質
から得られたＤＮＡを不滅化すべき細胞にトランスフェ
クションして得られた不滅化細胞の全ＤＮＡを正常な不
滅化すべきヒト又は動物細胞にトランスフェクションし
（二次トランスフェクション）かつこのトランスフェク
ションした細胞を選択物質を含まない培地中で培養する
ことを特徴とするヒト又は動物細胞の不滅化法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863627326 DE3627326A1 (de) | 1986-08-12 | 1986-08-12 | Immortalisierung durch dns-uebertragung |
| DE3627326.0 | 1986-08-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6356283A true JPS6356283A (ja) | 1988-03-10 |
| JPH074237B2 JPH074237B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=6307220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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