JPS6357597A - 血清アルブミンの除去または回収法 - Google Patents
血清アルブミンの除去または回収法Info
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- JPS6357597A JPS6357597A JP20007386A JP20007386A JPS6357597A JP S6357597 A JPS6357597 A JP S6357597A JP 20007386 A JP20007386 A JP 20007386A JP 20007386 A JP20007386 A JP 20007386A JP S6357597 A JPS6357597 A JP S6357597A
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- human serum
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- bovine serum
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、細胞融合によって得られたハイプリドーマを
クローニングして樹立したハイブリドーマ株から産生さ
れた、ヒト血清アルブミンのみに対して高い特異的な反
応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体を
用いて、ヒト血清アルブミン含有物（例えば、ヒト血液
、ヒト尿など）から、抗体とヒト血清アルブミンとから
なる複合体を除去したり、また、その複合体の解離によ
り精製されたヒト血清アルブミンを回収する方法及びヒ
ト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して
高い特異的な反応性を示す、抗ヒト血清アルブミンモノ
クローナル抗体を使用して、ウシ血清アルブミン含有物
（例えば、ウシ血液、ウシ尿など）から抗体とウシ血清
アルブミンとからなる複合体を除去したり、また、その
複合体の解離により精製されたウシ血清アルブミンを回
収する方法に関するものである。
クローニングして樹立したハイブリドーマ株から産生さ
れた、ヒト血清アルブミンのみに対して高い特異的な反
応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体を
用いて、ヒト血清アルブミン含有物（例えば、ヒト血液
、ヒト尿など）から、抗体とヒト血清アルブミンとから
なる複合体を除去したり、また、その複合体の解離によ
り精製されたヒト血清アルブミンを回収する方法及びヒ
ト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して
高い特異的な反応性を示す、抗ヒト血清アルブミンモノ
クローナル抗体を使用して、ウシ血清アルブミン含有物
（例えば、ウシ血液、ウシ尿など）から抗体とウシ血清
アルブミンとからなる複合体を除去したり、また、その
複合体の解離により精製されたウシ血清アルブミンを回
収する方法に関するものである。
血清アルブミン（分子量、 ６９．０００）は血しょう
蛋白質中では量的に多い成分で、血中の脂肪酸、胆汁色
素、薬剤を結合して運搬する役目などを行なっている。
蛋白質中では量的に多い成分で、血中の脂肪酸、胆汁色
素、薬剤を結合して運搬する役目などを行なっている。
腎疾患、肝硬変症、低栄養、熱性疾患、ネフローゼなど
の代表的疾患では血清アルブミンの変動が知られている
。血清アルブミンの大量精製には、低温エタノール分画
法（画分■は約９０％の純度）が行なわれ、血清アルブ
ミン液は医療用に、ウシ血清アルブミン粉末は実験用に
市販されている。
の代表的疾患では血清アルブミンの変動が知られている
。血清アルブミンの大量精製には、低温エタノール分画
法（画分■は約９０％の純度）が行なわれ、血清アルブ
ミン液は医療用に、ウシ血清アルブミン粉末は実験用に
市販されている。
従来、ヒト血清アルブミンと反応するモノクローナル抗
体を得たという報告は次に示すようにいくつか見られる
。
体を得たという報告は次に示すようにいくつか見られる
。
（ａｌイムノロシイ・レター（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）ユ、３６５ （１９８１）、 （′ｂ）モレキュラー・イムノロシイ （Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＩｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ） 、 ２０． ５４
９ （１９８３）、（Ｃ）クリニカル・イムノロシイ
・アンド・イムツバソロシイ（ＣＩｉｎ、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、） ＋ユニ、３８
７ （１９８４） （ｄｌ特開昭６０−２５８１２８号公報これらの報告に
記載されたモノクローナル抗体は、（ａｌ、（ｂｌ、（
Ｃ）ではヒト血清アルブミン免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマ細胞との細胞融合実験を通して得られた抗体
であり、（ｄｌではヒト血清アルブミン免疫ラット牌細
胞とマウスミエローマ細胞との細胞融合実験を通して得
られた抗体である。そして、それらのモノクローナル抗
体とヒト以外の動物由来の血清アルブミンとの反応性に
ついての充分な検討はなされていない。また、それらの
モノクローナル抗体がウシ血清アルブミンに対して高い
特異的な反応性を有するという記載もなく、これら以外
の文献でもウシ血清アルブミンに対するモノクローナ抗
体の作成例は見当たらない。
Ｌｅｔｔｅｒｓ）ユ、３６５ （１９８１）、 （′ｂ）モレキュラー・イムノロシイ （Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＩｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ） 、 ２０． ５４
９ （１９８３）、（Ｃ）クリニカル・イムノロシイ
・アンド・イムツバソロシイ（ＣＩｉｎ、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、） ＋ユニ、３８
７ （１９８４） （ｄｌ特開昭６０−２５８１２８号公報これらの報告に
記載されたモノクローナル抗体は、（ａｌ、（ｂｌ、（
Ｃ）ではヒト血清アルブミン免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマ細胞との細胞融合実験を通して得られた抗体
であり、（ｄｌではヒト血清アルブミン免疫ラット牌細
胞とマウスミエローマ細胞との細胞融合実験を通して得
られた抗体である。そして、それらのモノクローナル抗
体とヒト以外の動物由来の血清アルブミンとの反応性に
ついての充分な検討はなされていない。また、それらの
モノクローナル抗体がウシ血清アルブミンに対して高い
特異的な反応性を有するという記載もなく、これら以外
の文献でもウシ血清アルブミンに対するモノクローナ抗
体の作成例は見当たらない。
ところで、これらのモノクローナル抗体が物質の精製や
アルブミンの測定に利用できるためには、血清アルブミ
ンに対してのみ高い特異的な反応性を有していなければ
ならない。例えば、モノクローナル抗体を用いて血液、
尿などから血清アルブミンなどの特定の物質を回収し精
製する場合には、血液中の血清アルブミン以外の物質と
交叉反応性を示すことは好ましくない。上記の各報告で
は、それらのモノクローナル抗体が血清アルブミン以外
の血液成分、尿成分などとどの程度反応するのかほとん
ど開示されていない。
アルブミンの測定に利用できるためには、血清アルブミ
ンに対してのみ高い特異的な反応性を有していなければ
ならない。例えば、モノクローナル抗体を用いて血液、
尿などから血清アルブミンなどの特定の物質を回収し精
製する場合には、血液中の血清アルブミン以外の物質と
交叉反応性を示すことは好ましくない。上記の各報告で
は、それらのモノクローナル抗体が血清アルブミン以外
の血液成分、尿成分などとどの程度反応するのかほとん
ど開示されていない。
特開昭６０−２５８１２８号公報の記載によれば、「ヒ
ト血清アルブミンに対して比較的高い特異性を有するラ
ット製の抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体が、
ウシ血清アルブミンとも、また卵白アルブミンとも反応
性を示さないこと」が開示されている（そこで検討され
たモノクローナル抗体の特異性を第１表に示した）。
ト血清アルブミンに対して比較的高い特異性を有するラ
ット製の抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体が、
ウシ血清アルブミンとも、また卵白アルブミンとも反応
性を示さないこと」が開示されている（そこで検討され
たモノクローナル抗体の特異性を第１表に示した）。
第１表
このように、モノクローナル抗体を用いて血液、尿など
から、血清アルブミンなどの特定の物質を回収し精製す
ることに実際に使用できるほどに特異性の極めて高い（
即ち、ヒト血清アルブ′ミン、ウシ血清アルブミンなど
のアルブミンに対しては高い反応性を有しているが、そ
れら以外の多くの抗原に対してはほとんど反応性を有し
ていない）ｒ抗ヒト血清アルブミンモノクロナール抗体
」は、未だに充分に知られていなかったのである。〔発
明が解決しようとする問題点〕 これまで、医薬、診断薬、試薬などとして実用的に使用
できるｒヒト血清アルブミン及び／またはウシ血清アル
ブミンに対する高い特異的な反応性を有するモノクロー
ナル抗体（Ｉ！ｐち、抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体）をヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブ
ミン含有物と接触反応させた後に、その反応の結果得ら
れた抗体と血清アルブミンとからなる複合体ｊとを分離
することによって、血清アルブミンを含有する物質から
ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンを容易に
除去したり、回収したりする方法は知られていなかった
。
から、血清アルブミンなどの特定の物質を回収し精製す
ることに実際に使用できるほどに特異性の極めて高い（
即ち、ヒト血清アルブ′ミン、ウシ血清アルブミンなど
のアルブミンに対しては高い反応性を有しているが、そ
れら以外の多くの抗原に対してはほとんど反応性を有し
ていない）ｒ抗ヒト血清アルブミンモノクロナール抗体
」は、未だに充分に知られていなかったのである。〔発
明が解決しようとする問題点〕 これまで、医薬、診断薬、試薬などとして実用的に使用
できるｒヒト血清アルブミン及び／またはウシ血清アル
ブミンに対する高い特異的な反応性を有するモノクロー
ナル抗体（Ｉ！ｐち、抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体）をヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブ
ミン含有物と接触反応させた後に、その反応の結果得ら
れた抗体と血清アルブミンとからなる複合体ｊとを分離
することによって、血清アルブミンを含有する物質から
ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンを容易に
除去したり、回収したりする方法は知られていなかった
。
本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒト血清アルブミンで免疫したマウスのリン
パ球とマウスミエローマ細胞との細胞融合によって得ら
れたハイブリドーマ株のモノクローナル抗体が、ヒト血
清アルブミンのみに対して１、またはヒト及びウシ血清
アルブミンのみに対して特異的に極めて高い反応性を示
すので、これらのモノクローナル抗体を用いてヒト血清
アルブミンまたはウシ血清アルブミンの回収または除去
ができることを見い出し、本発明を完成した。
した結果、ヒト血清アルブミンで免疫したマウスのリン
パ球とマウスミエローマ細胞との細胞融合によって得ら
れたハイブリドーマ株のモノクローナル抗体が、ヒト血
清アルブミンのみに対して１、またはヒト及びウシ血清
アルブミンのみに対して特異的に極めて高い反応性を示
すので、これらのモノクローナル抗体を用いてヒト血清
アルブミンまたはウシ血清アルブミンの回収または除去
ができることを見い出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、ヒト血清アルブミンのみに対して高い
特異的な反応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体をヒト血清アルブミン含有物と接触反応させた
後に、抗体とヒト血清アルブミンとからなる複合体を分
離することを特徴とするヒト血清アルブミンの除去また
は回収法に関するものである。また、本発明は、ヒト血
清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して高い
特異的な反応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体をウシ血清アルブミン含有物と接触反応させた
後に、抗体とウシ血清アルブミンとからなる複合体を分
離することを特徴とするウシ血清アルブミンの除去また
は回収法に関するものである。
特異的な反応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体をヒト血清アルブミン含有物と接触反応させた
後に、抗体とヒト血清アルブミンとからなる複合体を分
離することを特徴とするヒト血清アルブミンの除去また
は回収法に関するものである。また、本発明は、ヒト血
清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して高い
特異的な反応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体をウシ血清アルブミン含有物と接触反応させた
後に、抗体とウシ血清アルブミンとからなる複合体を分
離することを特徴とするウシ血清アルブミンの除去また
は回収法に関するものである。
以下、本発明について、さらに詳しく説明する。
本発明で使用する「抗ヒト血清アルブミンモノクローナ
ル抗体」を製造する方法における「ハイブリドーマの作
製」は、従来公知の方法、例えば、ネイチャーの方法に
準じて行うことができ、すでに本発明者らが特許出願し
ている方法（昭和６１年８月１３日出願）でも行うこと
ができる。そのようなハイブリドーマの作製の好ましい
方法として、本発明者らが特許出願している方法の概略
を以下順次説明する。
ル抗体」を製造する方法における「ハイブリドーマの作
製」は、従来公知の方法、例えば、ネイチャーの方法に
準じて行うことができ、すでに本発明者らが特許出願し
ている方法（昭和６１年８月１３日出願）でも行うこと
ができる。そのようなハイブリドーマの作製の好ましい
方法として、本発明者らが特許出願している方法の概略
を以下順次説明する。
〔参考例〕
１）免疫動物リンパ球の調製
マウスへの免疫は、生理食塩水に溶解したヒト血清アル
ブミンを敗退間隔でアジュバントなどを用いて数回投与
することで行う。免疫から４日後に肺臓を摘出し、はぐ
してリンパ球を得た。
ブミンを敗退間隔でアジュバントなどを用いて数回投与
することで行う。免疫から４日後に肺臓を摘出し、はぐ
してリンパ球を得た。
１ｉ）１［１胞融合
細胞融合は、免疫されたマウスのリンパ球と、マウスミ
エローマ細胞との細胞数を５＝１の割合で、ｌｌｌＰＭ
１１６４０ （リンパ球培養用培地成分）を用いて良
く混合し、遠心分離した後のベレット（細胞塊）に、Ｐ
ＥＧ （、平均分子量： １０００〜６０００のポリエ
チレングリコール）の溶液（３０〜６０重量％）を数分
かけて添加しつつよく混ぜることによって行なうた。
エローマ細胞との細胞数を５＝１の割合で、ｌｌｌＰＭ
１１６４０ （リンパ球培養用培地成分）を用いて良
く混合し、遠心分離した後のベレット（細胞塊）に、Ｐ
ＥＧ （、平均分子量： １０００〜６０００のポリエ
チレングリコール）の溶液（３０〜６０重量％）を数分
かけて添加しつつよく混ぜることによって行なうた。
ｉｉｉ ）ハイブリドーマの選択
ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作を行った後の
細胞をＨＡＴ培地（ハイブリドーマ以外は増殖できない
培地）で培養して行なった。
細胞をＨＡＴ培地（ハイブリドーマ以外は増殖できない
培地）で培養して行なった。
ｉｖ）抗体産生ハイブリドーマの選択とその株化ＨＡＴ
培地での選択を行って得られたハイブリドーマが、ヒト
血清アルブミンに対する抗体を産生じているか否かの検
定は、ＥＬＩＳＡ （酵素免疫測定法）に準じて行っ
た。即ち、ヒト血清アルブミンを固定化したＥＬＩＳＡ
プレートに、ハイブリドーマ培養上清を加えて静置する
。そして、これらの洗浄したウェルにペルオキシダーゼ
で標識した抗体を分注して静置する。これらのウェルを
洗浄し、基質溶液を加えて酵素活性を測定する。酵素活
性が認められたウェル中のハイブリドーマが抗ヒト血清
アルブミン抗体産生ハイブリドーマである。
培地での選択を行って得られたハイブリドーマが、ヒト
血清アルブミンに対する抗体を産生じているか否かの検
定は、ＥＬＩＳＡ （酵素免疫測定法）に準じて行っ
た。即ち、ヒト血清アルブミンを固定化したＥＬＩＳＡ
プレートに、ハイブリドーマ培養上清を加えて静置する
。そして、これらの洗浄したウェルにペルオキシダーゼ
で標識した抗体を分注して静置する。これらのウェルを
洗浄し、基質溶液を加えて酵素活性を測定する。酵素活
性が認められたウェル中のハイブリドーマが抗ヒト血清
アルブミン抗体産生ハイブリドーマである。
これらのハイブリドーマは、常法にてクローニングし、
「ヒト血清アルブミン１またはｒヒト及びウシ血清アル
ブミン」のみに対して特異性が高く、且つ抗体価の高い
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を５株選択し
た（抗体の種類、及び抗体と抗原との反応性を第２表に
示す）。
「ヒト血清アルブミン１またはｒヒト及びウシ血清アル
ブミン」のみに対して特異性が高く、且つ抗体価の高い
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を５株選択し
た（抗体の種類、及び抗体と抗原との反応性を第２表に
示す）。
第２表
抗原の 抗体の種類（全てＧ＋／に）４＋＞
３＋＞２＋＞十＞±〉− ■）モノクローナル抗体の生産 ＋１ｓＡ−１株及びｌｌ５Ａ−４株のフラスコ内培養、
またはマウス腹腔内培養で、モノクローナル抗体を生産
した。フラスコ内培養では、ＲＰＭ１１６４０培地で、
細胞濃度が上限に達するまで培養した。モノクローナル
抗体は培養土清中に含まれる（その抗体と抗原との反応
性の結果を第３表に示す）。
３＋＞２＋＞十＞±〉− ■）モノクローナル抗体の生産 ＋１ｓＡ−１株及びｌｌ５Ａ−４株のフラスコ内培養、
またはマウス腹腔内培養で、モノクローナル抗体を生産
した。フラスコ内培養では、ＲＰＭ１１６４０培地で、
細胞濃度が上限に達するまで培養した。モノクローナル
抗体は培養土清中に含まれる（その抗体と抗原との反応
性の結果を第３表に示す）。
一方、マウス腹腔内での培養では、ブリスタンをマウス
腹腔内に投与し、２週間後、同腹腔内に５Ｘ１０６個の
ハイブリドーマ株細胞（Ｈ５八−１株、またはｌｌ５Ａ
−４株）を投与して、２週間でハイブリドーマ株細胞を
高密度に増殖させることができた（その抗体と抗原との
反応性の結果を第３表に示す）。第３表に示したように
、Ｈ５Ａ−１株、ｌｌ５Ａ−４株が産生じたモノクロー
ナル抗体と抗原との反応性は、各法のフラスコ内培養及
びマウス腹腔内培養のいずれにおいても、第３表に示し
た場合と同じであった。このようにして得たＣヒト血清
アルブミンのみＪ、または「ヒト及びウシ血清アルブミ
ンのみ−に対して高い特異的な反応性を示すモノクロー
ナル抗体（各遍ＩＩｓ＾−１株、ｌｌ５Ａ−４株の抗体
）は、蛋白質精製に通用されている塩析法、イオン交換
法、アフィニティー法などの方法を用いて精製し、その
精製純度は、いずれのモノクローナル抗体も、ＳＤＳポ
リアクリルアミドによるスラブゲル電気泳動法で高純度
であることが確認できた。
腹腔内に投与し、２週間後、同腹腔内に５Ｘ１０６個の
ハイブリドーマ株細胞（Ｈ５八−１株、またはｌｌ５Ａ
−４株）を投与して、２週間でハイブリドーマ株細胞を
高密度に増殖させることができた（その抗体と抗原との
反応性の結果を第３表に示す）。第３表に示したように
、Ｈ５Ａ−１株、ｌｌ５Ａ−４株が産生じたモノクロー
ナル抗体と抗原との反応性は、各法のフラスコ内培養及
びマウス腹腔内培養のいずれにおいても、第３表に示し
た場合と同じであった。このようにして得たＣヒト血清
アルブミンのみＪ、または「ヒト及びウシ血清アルブミ
ンのみ−に対して高い特異的な反応性を示すモノクロー
ナル抗体（各遍ＩＩｓ＾−１株、ｌｌ５Ａ−４株の抗体
）は、蛋白質精製に通用されている塩析法、イオン交換
法、アフィニティー法などの方法を用いて精製し、その
精製純度は、いずれのモノクローナル抗体も、ＳＤＳポ
リアクリルアミドによるスラブゲル電気泳動法で高純度
であることが確認できた。
本発明では、これらの抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体（Ｉ（ＳＡ−１株、及びｌｌ５Ａ−４株の抗体
）を固相担体に結合して得た抗体結合担体と血清アルブ
ミン含有物（ウシまたはヒトの血液、尿など）とを接触
反応させた後に、抗体結合担体と血清アルブミンとから
なる複合体を濾過、遠心、またはカラムなどを用いて分
離することによって、血清アルブミンを除去したり、ま
たは血清アルブミンを回収したりすることが好ましい。
ナル抗体（Ｉ（ＳＡ−１株、及びｌｌ５Ａ−４株の抗体
）を固相担体に結合して得た抗体結合担体と血清アルブ
ミン含有物（ウシまたはヒトの血液、尿など）とを接触
反応させた後に、抗体結合担体と血清アルブミンとから
なる複合体を濾過、遠心、またはカラムなどを用いて分
離することによって、血清アルブミンを除去したり、ま
たは血清アルブミンを回収したりすることが好ましい。
本発明において用いるｒ抗体を結合する担体」としては
、架橋剤を用いれば、鉱物、樹脂、糖、蛋白質などの不
溶性物質を使用できるが、例えば、多糖のセファロース
（ファルマシア裂）を用いることが好ましい。固定化し
たモノクローナル抗体を用いた血清アルブミンの除去ま
たは回収は、バッチで、またはこれらを充填したカラム
などで連続的に行うことができる。
、架橋剤を用いれば、鉱物、樹脂、糖、蛋白質などの不
溶性物質を使用できるが、例えば、多糖のセファロース
（ファルマシア裂）を用いることが好ましい。固定化し
たモノクローナル抗体を用いた血清アルブミンの除去ま
たは回収は、バッチで、またはこれらを充填したカラム
などで連続的に行うことができる。
血清アルブミンと固相坦体上のモノクローナル抗体との
結合はＰＢＳ （リンｒｉ緩衝液）、トリス−塩酸緩衝
液などを用いて１、中性付近で行うことが好ましい。血
清アルブミンの除去は、固相担体上の抗体と血清アルブ
ミンとからなる複合体を濾過、遠心またはカラムなどを
用いて除去することによって行うことができる。血清ア
ルブミンの回収は、この複合体を入れた溶液の、ｐＨを
低くしたり （ｐＨ２〜４）、ｐｌ＋を高くしたり （
ｐＨ１０〜１２）してモノクローナル抗体と血清アルブ
ミンとを解離させ、さらに濾過、遠心またはカラムなど
を用いて分離することによって行う。血清アルブミンは
濾過やカラムでは素通り部分に、遠心分離では上清中に
含まれている。
結合はＰＢＳ （リンｒｉ緩衝液）、トリス−塩酸緩衝
液などを用いて１、中性付近で行うことが好ましい。血
清アルブミンの除去は、固相担体上の抗体と血清アルブ
ミンとからなる複合体を濾過、遠心またはカラムなどを
用いて除去することによって行うことができる。血清ア
ルブミンの回収は、この複合体を入れた溶液の、ｐＨを
低くしたり （ｐＨ２〜４）、ｐｌ＋を高くしたり （
ｐＨ１０〜１２）してモノクローナル抗体と血清アルブ
ミンとを解離させ、さらに濾過、遠心またはカラムなど
を用いて分離することによって行う。血清アルブミンは
濾過やカラムでは素通り部分に、遠心分離では上清中に
含まれている。
さらに、複合体を入れた溶液のイオン強度を高めること
によって、複合体をより一層解離しやすくすることがで
きる。
によって、複合体をより一層解離しやすくすることがで
きる。
一方、血清アルブミンを回収して後に残ったモノクロー
ナル抗体が結合したセファロースは、再使用することが
できる。
ナル抗体が結合したセファロースは、再使用することが
できる。
以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明を例示するためのものであって、
本発明の範囲を限定するものではない。
らの実施例は、本発明を例示するためのものであって、
本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
マウス腹水から得たＵＳＡ−１株のモノクローナル抗体
２０ｎ＋ｇと固相担体であるＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア製）１ｍβとをカンプリング緩衝
液（０，ＩＭ ＮａＨＣＯｓ、０．５Ｍ Ｎａ Ｃ１，
ｐＨ８，３）中で室温で２時間、回転振とうして反応さ
せた。
２０ｎ＋ｇと固相担体であるＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア製）１ｍβとをカンプリング緩衝
液（０，ＩＭ ＮａＨＣＯｓ、０．５Ｍ Ｎａ Ｃ１，
ｐＨ８，３）中で室温で２時間、回転振とうして反応さ
せた。
次に、ブロッキング緩衝液（０，２Ｍグリシン、ｐｉｔ
８．０）で室温下２時間処理後、吸着緩衝液（５０ｍＭ
トリス−塩酸、０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃｌ 、 ｐＨ８
，０） Ｔニブロッキング緩衝液を洗浄除去し、モノク
ローナル抗体固定化担体を作製した。
８．０）で室温下２時間処理後、吸着緩衝液（５０ｍＭ
トリス−塩酸、０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃｌ 、 ｐＨ８
，０） Ｔニブロッキング緩衝液を洗浄除去し、モノク
ローナル抗体固定化担体を作製した。
前述のようにして作製したモノクローナル抗体固定化担
体をカラムに充填しくベッドボリューム１ｍＪ）、この
カラムに吸着緩衝液を流して平衡化し、このカラムにウ
シ血清５０μｌと吸着緩衝液１ ｍ ｌとを混合した溶
液を流しく１５ｍ Ｉｌ／ｈｒ）、吸着緩衝液で２８０
ｎｍの吸光度が認められなくなるまで洗って、素通り溶
液を１ｍｆづつ分画した（これらの両分は血清アルブミ
ンを殆ど含んでいなかった）。次いで、モノクローナル
抗体固定化担体と血清アルブミンとからなる複合体から
血清アルブミンを解離して分取するために、同カラムに
溶出液（０，２Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯ３、ＰＨ１１，
０）を２８０ｎ＋ｗの吸光度が認められなくなるまで流
して、吸着溶出溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの両
分には血清アルブミンのみが含まれていた）。
体をカラムに充填しくベッドボリューム１ｍＪ）、この
カラムに吸着緩衝液を流して平衡化し、このカラムにウ
シ血清５０μｌと吸着緩衝液１ ｍ ｌとを混合した溶
液を流しく１５ｍ Ｉｌ／ｈｒ）、吸着緩衝液で２８０
ｎｍの吸光度が認められなくなるまで洗って、素通り溶
液を１ｍｆづつ分画した（これらの両分は血清アルブミ
ンを殆ど含んでいなかった）。次いで、モノクローナル
抗体固定化担体と血清アルブミンとからなる複合体から
血清アルブミンを解離して分取するために、同カラムに
溶出液（０，２Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯ３、ＰＨ１１，
０）を２８０ｎ＋ｗの吸光度が認められなくなるまで流
して、吸着溶出溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの両
分には血清アルブミンのみが含まれていた）。
このような各カラム操作後、カラム素通り各両分と吸着
溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、素通り
部分の吸光度のピークは１つであり、吸着溶出部分の吸
光度のピークも１つであったが、この両ピーク部分を限
外濾過膜（分子量１万以上の物質は通過しない）で濃縮
して、モノクローナル抗体濃度を高め、この濃縮液から
２５μβとり、β−メルカプトエタノールで還元して、
ＳＤＳポリアクリルアミドを用いたスラブゲル電気泳動
実験を行った結果、モノクローナル抗体固定化カラムに
よる素通り画分と吸着溶出画分（各々のピーク部分）の
スラブゲル電気泳動の状態は第１図に示す通りであった
。
溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、素通り
部分の吸光度のピークは１つであり、吸着溶出部分の吸
光度のピークも１つであったが、この両ピーク部分を限
外濾過膜（分子量１万以上の物質は通過しない）で濃縮
して、モノクローナル抗体濃度を高め、この濃縮液から
２５μβとり、β−メルカプトエタノールで還元して、
ＳＤＳポリアクリルアミドを用いたスラブゲル電気泳動
実験を行った結果、モノクローナル抗体固定化カラムに
よる素通り画分と吸着溶出画分（各々のピーク部分）の
スラブゲル電気泳動の状態は第１図に示す通りであった
。
この結果から、■５Ａ−１株のモノクローナル抗体は、
ウシ血清中のウシ血清アルブミンと特異的に反応して、
精製されたウシ血清アルブミンだけを回収することがで
きた（また、ウシ血清アルブミンだけを除去することが
できた）。
ウシ血清中のウシ血清アルブミンと特異的に反応して、
精製されたウシ血清アルブミンだけを回収することがで
きた（また、ウシ血清アルブミンだけを除去することが
できた）。
なお、上述のようにして解離した後の抗体固定化担体を
充填したカラムを用いて再度、前述と同様の実験をして
も、同様の結果が得られ、同カラムは再使用できること
がわかった。
充填したカラムを用いて再度、前述と同様の実験をして
も、同様の結果が得られ、同カラムは再使用できること
がわかった。
実施例２
マウス腹水から得たＨＳへ一４株のモノクローナル抗体
２０ｍｇとＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマ
シアｉ！Ｊ）１ｍｚとをカップリング緩衝液（０，Ｉ
Ｍ Ｎａ ＨＣＯ３，０，５Ｍ Ｎａ Ｃ１，ｐＨ８，
３）中で室温で２時間、回転振とうして反応させた。
２０ｍｇとＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマ
シアｉ！Ｊ）１ｍｚとをカップリング緩衝液（０，Ｉ
Ｍ Ｎａ ＨＣＯ３，０，５Ｍ Ｎａ Ｃ１，ｐＨ８，
３）中で室温で２時間、回転振とうして反応させた。
次に、ブロッキング緩衝液（０，２Ｍグリシン、ｐＨ８
゜０）で室温下２時間処理後、吸着緩衝液（５０ｍＭ
トリス−塩酸、０．１５Ｍ Ｎ ａ ＣＩ ５ｐＨ８，
０） Ｔ：プロソキング緩衝液を洗浄除去し、モノクロ
ーナル抗体固定化担体を作製した。
゜０）で室温下２時間処理後、吸着緩衝液（５０ｍＭ
トリス−塩酸、０．１５Ｍ Ｎ ａ ＣＩ ５ｐＨ８，
０） Ｔ：プロソキング緩衝液を洗浄除去し、モノクロ
ーナル抗体固定化担体を作製した。
前述のようにして作製したモノクローナル抗体固定化担
体をカラムに充填しくベッドボリューム１ｍ１）、この
カラムに吸着緩衝液を流して平衡化し、このカラムにヒ
ト血清５０μｌと吸着！ｉ ｉＥ液１ｍｌとを混合した
溶液を流しく１５ｍ Ｉｔ ／ｈｒ）、吸着緩衝液で２
８ｏｎ僧の吸光度が認められなくなるまで洗って、素通
り溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの両分は血清アル
ブミンを殆ど含んでいなかった）。次いで、モノクロー
ナル抗体固定化担体と血清アルブミンとからなる複合体
から血清アルブミンを解離して分取するために、同カラ
ムに溶出液（０，２Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯ３、ｐＨ１
１，０）を２８０ｎｍの吸光度が認められな（なるまで
流して、吸着溶出溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの
両分には血清アルブミンのみが含まれていた）。
体をカラムに充填しくベッドボリューム１ｍ１）、この
カラムに吸着緩衝液を流して平衡化し、このカラムにヒ
ト血清５０μｌと吸着！ｉ ｉＥ液１ｍｌとを混合した
溶液を流しく１５ｍ Ｉｔ ／ｈｒ）、吸着緩衝液で２
８ｏｎ僧の吸光度が認められなくなるまで洗って、素通
り溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの両分は血清アル
ブミンを殆ど含んでいなかった）。次いで、モノクロー
ナル抗体固定化担体と血清アルブミンとからなる複合体
から血清アルブミンを解離して分取するために、同カラ
ムに溶出液（０，２Ｍ Ｎ ａ ２ ＣＯ３、ｐＨ１
１，０）を２８０ｎｍの吸光度が認められな（なるまで
流して、吸着溶出溶液を１ｍｌづつ分画した（これらの
両分には血清アルブミンのみが含まれていた）。
このような各カラム操作後、カラム素通り各両分と吸着
溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、素通り
部分の吸光度のピークは１つであり、吸着溶出部分の吸
光度のピークも１つであったが、この両ピーク部分を限
外濾過膜（分子量１万以上の物質は通過しない）で濃縮
して、モノクローナル抗体濃度を高め、この濃縮液から
２５μｌとり、β−メルカプトエタノールで還元して、
ＳＤＳポリアクリルアミドを用いたスラブゲル電気泳動
実験を行った結果、モノクローナル抗体固定化カラムに
よる素通り画分と吸着溶出画分（各々のピーク部分）の
スラブゲル電気泳動の状態は第２図に示す通りであった
。
溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、素通り
部分の吸光度のピークは１つであり、吸着溶出部分の吸
光度のピークも１つであったが、この両ピーク部分を限
外濾過膜（分子量１万以上の物質は通過しない）で濃縮
して、モノクローナル抗体濃度を高め、この濃縮液から
２５μｌとり、β−メルカプトエタノールで還元して、
ＳＤＳポリアクリルアミドを用いたスラブゲル電気泳動
実験を行った結果、モノクローナル抗体固定化カラムに
よる素通り画分と吸着溶出画分（各々のピーク部分）の
スラブゲル電気泳動の状態は第２図に示す通りであった
。
この結果から、ｌ５Ａ−４株のモノクローナル抗体は、
ヒト血清中のヒト血清アルブミンと特異的に反応して、
精製されたヒト血清アルブミンだけを回収することがで
きた（また、ヒト血清アルブミンだけを除去することが
できた）。
ヒト血清中のヒト血清アルブミンと特異的に反応して、
精製されたヒト血清アルブミンだけを回収することがで
きた（また、ヒト血清アルブミンだけを除去することが
できた）。
なお、上述のようにして解離した後の抗体固定化担体を
充填したカラムを用いて再度、前述と同様の実験をして
も、同様の結果が得られ、同カラムは再使用できること
がわかった。
充填したカラムを用いて再度、前述と同様の実験をして
も、同様の結果が得られ、同カラムは再使用できること
がわかった。
本発明で使用する「抗ヒト血清アルブミンモノクローナ
ル抗体Ｊが、ヒト血清アルブミンで免疫されたマウスの
リンパ球とマウスミエローマ８１［１胞との細胞融合に
よって得られたハイプリドーマ株から産生された新規な
ものであり、特に、ヒト血清アルブミンのみ、及びヒト
血清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して特
異的な反応性を有し、他の抗原に対しては実質的に反応
性を示さないので、「ヒト血清アルブミンなどを含有す
る物質から、ヒト血清アルブミンなどを容易に除去する
ことができたり、またはヒト血清アルブミンなどを含有
する物質から、ヒト血清アルブミンなどを容易に回収す
ることができるＪし、ｒウシ血清アルブミンなどを含有
する物質から、ウシ血清アルブミンなどを容易に除去す
ることができたり、またはウシ血清アルブミンなどを含
有する物質から、ウシ血清アルブミンなどを容易に回収
することができる」のである。
ル抗体Ｊが、ヒト血清アルブミンで免疫されたマウスの
リンパ球とマウスミエローマ８１［１胞との細胞融合に
よって得られたハイプリドーマ株から産生された新規な
ものであり、特に、ヒト血清アルブミンのみ、及びヒト
血清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみに対して特
異的な反応性を有し、他の抗原に対しては実質的に反応
性を示さないので、「ヒト血清アルブミンなどを含有す
る物質から、ヒト血清アルブミンなどを容易に除去する
ことができたり、またはヒト血清アルブミンなどを含有
する物質から、ヒト血清アルブミンなどを容易に回収す
ることができるＪし、ｒウシ血清アルブミンなどを含有
する物質から、ウシ血清アルブミンなどを容易に除去す
ることができたり、またはウシ血清アルブミンなどを含
有する物質から、ウシ血清アルブミンなどを容易に回収
することができる」のである。
第１図及び第２図は、モノクローナル抗体固定化ラムに
よる血清の素通り画分のピーク部分及び吸着溶出画分の
ピーク部分のスラブゲル電気泳動試験結果を示す図面で
ある。 第１図がｌ５Ａ−１株のモノクローナル抗体固定化担体
を充填したカラムを用いた時の結果であり、第２図がｌ
３Ａ−４株のモノクローナル抗体固定化担体を充填した
カラムを用いた時の結果である。 特許出願人 宇部興産株式会社 図面の浄書（内容に変更なし） 第 １ｒＸＪ 泥 ２ 図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６１−２０００７３号 ２、発明の名称 血清アルブミンの除去または回収法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ７５５ 山口県宇部市西本町１丁目１２番３２号発送日 昭和
６１年１１月２５日 ５、？ｉｉ正の対象 図面 ６、？ｉ正の内容
よる血清の素通り画分のピーク部分及び吸着溶出画分の
ピーク部分のスラブゲル電気泳動試験結果を示す図面で
ある。 第１図がｌ５Ａ−１株のモノクローナル抗体固定化担体
を充填したカラムを用いた時の結果であり、第２図がｌ
３Ａ−４株のモノクローナル抗体固定化担体を充填した
カラムを用いた時の結果である。 特許出願人 宇部興産株式会社 図面の浄書（内容に変更なし） 第 １ｒＸＪ 泥 ２ 図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６１−２０００７３号 ２、発明の名称 血清アルブミンの除去または回収法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ７５５ 山口県宇部市西本町１丁目１２番３２号発送日 昭和
６１年１１月２５日 ５、？ｉｉ正の対象 図面 ６、？ｉ正の内容
Claims (6)
- （１）ヒト血清アルブミンのみに対して高い特異的な反
応性を示す抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体を
ヒト血清アルブミン含有物と接触反応させ、抗体とヒト
血清アルブミンとからなる複合体を分離することを特徴
とするヒト血清アルブミンの除去または回収法。 - （２）前記の複合体が抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体が結合した抗体結合担体とヒト血清アルブミン
とからなる特許請求の範囲第１項記載のヒト血清アルブ
ミンの除去または回収法。 - （３）前記の複合体を、ｐＨを変えることによって、抗
体結合担体とヒト血清アルブミンとに解離させることに
よって精製されたヒト血清アルブミンを回収する特許請
求の範囲第１項記載のヒト血清アルブミンの除去または
回収法。 - （４）ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンのみ
に対して高い特異的な反応性を示す抗ヒト血清アルブミ
ンモノクローナル抗体をウシ血清アルブミン含有物と接
触反応させた後に、抗体とウシ血清アルブミンとからな
る複合体を分離することを特徴とするウシ血清アルブミ
ンの除去または回収法。 - （５）前記の複合体が抗ヒト血清アルブミンモノクロー
ナル抗体を結合した抗体結合担体とウシ血清アルブミン
とからなる特許請求の範囲第４項記載のウシ血清アルブ
ミンの除去または回収法。 - （６）前記の複合体を、ｐＨを変えることによって、抗
体結合担体とウシ血清アルブミンとに解離させることに
よって精製されたウシ血清アルブミンを回収する特許請
求の範囲第４項記載のウシ血清アルブミンの除去または
回収法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20007386A JPS6357597A (ja) | 1986-08-28 | 1986-08-28 | 血清アルブミンの除去または回収法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20007386A JPS6357597A (ja) | 1986-08-28 | 1986-08-28 | 血清アルブミンの除去または回収法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6357597A true JPS6357597A (ja) | 1988-03-12 |
Family
ID=16418394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20007386A Pending JPS6357597A (ja) | 1986-08-28 | 1986-08-28 | 血清アルブミンの除去または回収法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6357597A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998040469A1 (en) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Cardiac Crc Nominees Pty. Ltd. | Haemocompatible surfaces |
| JP2005320322A (ja) * | 2004-04-08 | 2005-11-17 | Toray Ind Inc | 分画装置 |
| JP2009145329A (ja) * | 2007-11-22 | 2009-07-02 | Takara Bio Inc | アルブミン測定試薬 |
| CN102539218A (zh) * | 2010-12-10 | 2012-07-04 | 温州医学院 | 柠檬酸乙醇法在去除血清中白蛋白中的应用 |
-
1986
- 1986-08-28 JP JP20007386A patent/JPS6357597A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998040469A1 (en) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Cardiac Crc Nominees Pty. Ltd. | Haemocompatible surfaces |
| JP2005320322A (ja) * | 2004-04-08 | 2005-11-17 | Toray Ind Inc | 分画装置 |
| JP2009145329A (ja) * | 2007-11-22 | 2009-07-02 | Takara Bio Inc | アルブミン測定試薬 |
| CN102539218A (zh) * | 2010-12-10 | 2012-07-04 | 温州医学院 | 柠檬酸乙醇法在去除血清中白蛋白中的应用 |
| CN102539218B (zh) * | 2010-12-10 | 2015-07-29 | 温州医学院 | 柠檬酸乙醇法在去除血清中白蛋白中的应用 |
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