JPS6358560B2

JPS6358560B2 -

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Publication number: JPS6358560B2
Application number: JP58024815A
Authority: JP
Priority date: 1983-02-18
Filing date: 1983-02-18
Publication date: 1988-11-16
Also published as: JPS59151894A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、グルタチオンを著量含有する酵母の
製造法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing yeast containing significant amounts of glutathione.

更に詳細には、本発明は、突然変異処理によ
り、エチオニン及び亜硫酸塩を同時に含む培地に
生育可能となつたキヤンデイダ属酵母の変異株を
好気的に培養することにより、該菌体中に著量の
グルタチオンを生成蓄積させた酵母を製造する方
法に関するものである。 More specifically, the present invention involves aerobically cultivating a mutant strain of yeast of the genus Candeida that can grow in a medium containing both ethionine and sulfite through mutation treatment. The present invention relates to a method for producing yeast that produces and accumulates a large amount of glutathione.

一般にグルタチオンは酵母及び動物の肝臓など
に広く分布しており、生体内の酸化還元系に関与
しているトリペプタイドで、肝機能回復作用や解
毒作用などの重要な役割を果す医薬上極めて有用
な物質である。 In general, glutathione is widely distributed in yeast and animal livers, and is a tripeptide that is involved in the redox system in living organisms. It is a substance.

本発明の目的は、このグルタチオンを発酵工業
的に有利に製造する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing glutathione advantageously in the fermentation industry.

近年、グルタチオンはほとんどが酵母菌体から
の抽出法により生産されており、酵母菌体中のグ
ルタチオン含量を高める方法が数多く提案され、
試みられてきている。 In recent years, most glutathione has been produced by extraction from yeast cells, and many methods have been proposed to increase the glutathione content in yeast cells.
It has been tried.

しかしながら、いずれの方法によつてもグルタ
チオンの蓄積量は限られ、工業的に特にすぐれた
方法といえるものはなかつた。 However, the amount of glutathione accumulated by any of these methods is limited, and none of these methods can be said to be particularly excellent industrially.

本発明者等は、先に、メチオニンアナログ耐性
を獲得したキヤンデイダ属酵母の変異株を培養す
ることによつて著量のグルタチオンを含有する酵
母を得ることに成功した（特公昭56−46826号）
のであるが、更に、グルタチオンの蓄積量を増大
させるために、鋭意研究を行つた結果、本発明に
おいてより蓄積量の高い酵母を製造することがで
きたのである。 The present inventors previously succeeded in obtaining a yeast containing a significant amount of glutathione by culturing a mutant strain of yeast of the genus Candeida that had acquired resistance to methionine analogs (Japanese Patent Publication No. 46826/1986).
However, as a result of extensive research in order to further increase the amount of glutathione accumulated, we were able to produce yeast with a higher accumulation amount in the present invention.

本発明者等は、菌体内のグルタチオンの含量を
高めるためには、グルタチオンの構成アミノ酸の
一つであるＬ−システインの菌体内濃度を高める
ことが必要であると考えた。そして、Ｌ−システ
インの菌体内濃度を高めるには、Ｌ−システイン
の生合成中間体である亜硫酸の菌体内濃度を高め
ると同時に、Ｌ−システインの他の生合成中間体
であるメチオニンの菌体内濃度を高める必要があ
り、そのためには、亜硫酸耐性とメチオニンアナ
ログであるエチオニン耐性を併有する変異株を取
得するのが先決であるとの想定のもとに、キヤン
デイダ属酵母の変異処理を行い、亜硫酸耐性とエ
チオニン耐性を併有する変異株を得、これを培養
した結果、著量のグルタチオンが蓄積されること
を見出し本発明を完成するに至つた。 The present inventors considered that in order to increase the content of glutathione within the bacterial cells, it is necessary to increase the intracellular concentration of L-cysteine, which is one of the constituent amino acids of glutathione. In order to increase the intracellular concentration of L-cysteine, it is necessary to increase the intracellular concentration of sulfite, which is a biosynthetic intermediate of L-cysteine, and at the same time increase the intracellular concentration of methionine, which is another biosynthetic intermediate of L-cysteine. It was necessary to increase the concentration, and in order to do so, we first carried out mutation treatment on yeast of the genus Candeida, assuming that we first had to obtain a mutant strain that had both sulfite resistance and resistance to ethionine, a methionine analogue. They obtained a mutant strain with both sulfite resistance and ethionine resistance, and as a result of culturing this strain, they found that a significant amount of glutathione was accumulated, leading to the completion of the present invention.

突然変異処理により、エチオニンおよび亜硫酸
塩を同時に含む培地に生育可能となつたキヤンデ
イダ属酵母の変異株を好気的に培養して、該菌体
中に著量のグルタチオンを生成蓄積せしめること
を特徴とするグルタチオン高含有酵母の製造法で
ある。 A mutant strain of yeast of the genus Candeida that can grow in a medium containing both ethionine and sulfite through mutation treatment is aerobically cultured to produce and accumulate a significant amount of glutathione in the bacterial cells. This is a method for producing yeast with high glutathione content.

本発明に使用する亜硫酸耐性とエチオニン耐性
を併有する変異株によるグルタチオンの蓄積はき
わめてすぐれており、亜硫酸単独耐性変異株又は
エチオニン単独耐性変異株のグルタチオン蓄積量
に比較しても顕著にすぐれたものである。 The accumulation of glutathione by the mutant strain having both sulfite and ethionine resistance used in the present invention is extremely excellent, and is significantly superior to the amount of glutathione accumulated by the mutant strain resistant to sulfite alone or the mutant strain resistant to ethionine alone. It is.

また亜硫酸はバクテリアに対し強い抗菌活性を
有することから、亜硫酸耐性を併有する変異株を
用いることによつて、培地中の亜硫酸濃度を高し
て培養を雑菌の汚染から防ぐことができるのであ
る。 Furthermore, since sulfite has strong antibacterial activity against bacteria, by using a mutant strain that also has sulfite resistance, it is possible to increase the sulfite concentration in the culture medium and prevent the culture from being contaminated by bacteria.

本発明のエチオニン及び亜硫酸塩を同時に含む
培地に生育可能となつたキヤンデイダ属変異株は
キヤンデイダ・ウチリスの周知株及び本発明者等
が先に発明したメチオニンアナログ耐性変異株
（特公昭56−46826）、例えばキヤンデイダ・ウチ
リスER061、FBRM−ＰNo.3510等を紫外線、Ｘ
線、ニトロリグニジン等により突然変異処理し変
異させた菌を、エチオニン及び亜硫酸塩をそれぞ
れ最低阻止濃度以上に含んだ培地で培養し、生育
した菌を分離し、合成培地で生育のよい菌を選択
することにより得られる。この際使用されるエチ
オニンはＤ型、Ｌ型、DL−型のいずれでもよく、
また亜硫酸塩としては亜硫酸ナトリウム、亜硫酸
カリウム、亜硫酸等が用いられる。 The mutant strains of the genus Candeida that can grow in a medium containing both ethionine and sulfite according to the present invention are the well-known strains of Candeida utilis and the methionine analog resistant mutant strain (Japanese Patent Publication No. 56-46826) that was previously invented by the present inventors. , for example, Candeida uchiris ER061, FBRM-P No. 3510, etc.
Bacteria that have been mutated by mutagenic treatment with rays, nitrolignidine, etc. are cultured in a medium containing ethionine and sulfite at a minimum inhibitory concentration or higher, the grown bacteria are separated, and bacteria that grow well are selected on a synthetic medium. It can be obtained by The ethionine used at this time may be D-type, L-type, or DL-type,
Further, as the sulfite, sodium sulfite, potassium sulfite, sulfite, etc. are used.

本発明において得られた高グルタチオン含有変
異株の一例としてはキヤンデイダ・ウチルス
IAM4264を変異処理するとにより得られたキヤ
ンデイダ・ウチルスKJS−0571株があり本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−
6907として寄託されている。 An example of the high glutathione-containing mutant strain obtained in the present invention is Candeida uchilus.
The strain KJS-0571 was obtained by mutationally treating IAM4264.
6907.

本発明で用いる亜硫酸耐性とエチオニン耐性を
併有するキヤンデイダ属酵母の変異株は菌学的性
質において同じ性質を示しており、次に示され
る。 The mutant strains of yeast of the genus Candeida, which are used in the present invention and have both sulfite resistance and ethionine resistance, exhibit the same mycological properties, as shown below.

１エチオニン及び亜硫酸塩を含む培地で生育す
る。1 Grows in a medium containing ethionine and sulfite.

２一般培地でよく生育し、著量のグルタチオン
を生成蓄積することができる。2. It grows well in general media and can produce and accumulate a significant amount of glutathione.

３ YM寒天培地上で全縁、半レンズ状隆起、表
面滑らかで鈍い光沢、クリーム色で軟質のコロ
ニーを形成する。3 Forms cream-colored, soft colonies with full edges, semi-lenticular ridges, smooth and dull luster on YM agar medium.

４グルコースーイーストエキスーペプトン水中
で混濁、沈澱あり、菌膜と菌環の形成は認めら
れない。4. Glucose-yeast extract-peptone Cloudy and precipitated in water, and no bacterial membrane or bacterial ring formation was observed.

５ダルモー平板状で仮性菌糸を形成する。5. Forms pseudohyphae in a plate-like shape.

６酢酸ソーダ寒天斜面、麦芽エキス寒天斜面、
V8ジユース寒天斜面、コーンミール寒天斜面
の培養で子嚢胞子の形成は認められない。6 Sodium acetate agar slope, malt extract agar slope,
No ascospore formation was observed in culture on V8 youth agar slants and cornmeal agar slants.

７グルコース、シユークロース、ラフイノース
を発酵し、ガラクトース、マルトース、トレハ
ロース、ラクトースを発酵しない。7 Fermentes glucose, sucrose, and raffinose, but does not ferment galactose, maltose, trehalose, and lactose.

８グルコース、シユークロース、マルトース、
セロビオース、トレハロース、ラフイノース、
メレジトース、キシロース、エタノール、マン
ニトール、乳酸、クエン酸、KNO₃を同化す
る。8 glucose, sucrose, maltose,
cellobiose, trehalose, raffinose,
Assimilates melezitose, xylose, ethanol, mannitol, lactic acid, citric acid, KNO ₃ .

９ビタミンフリー培地での生育良好。9 Good growth on vitamin-free medium.

本発明を実施するには、前述の方法で得られた
変異株を、菌体内グルタチオンの生成、蓄積を増
大せしめる物質を何んら添加することなく、炭素
源、窒素源及び無機塩等を含む培地で好気的に培
養すればよい。 In order to carry out the present invention, the mutant strain obtained by the above-mentioned method is prepared by adding a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, etc., without adding any substance that increases the production and accumulation of glutathione in the bacterial cell. It may be cultured aerobically in a medium.

この際の培養形式としては、バツチ培養、或は
連続培養の何れでもよい。 The culture format at this time may be either batch culture or continuous culture.

本発明の酵母を培養する際の炭素源としては、
ブドウ糖、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫
酸、パルプ廃液等が用いられ、またその窒素源と
しては、アンモニア、硫安、尿素、硝酸塩などが
使用される。さらに無機塩としては、燐酸、カリ
ウム、マグネシウム源として、過リン酸石灰、燐
安、塩化カリ、燐酸カリ、苛性カリ、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム等が用いられ、さらに
微量の亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩
も使用される。ビタミン、アミノ酸、核酸関連物
質等は特に必要としないが、勿論これらを添加し
たりコーンステイープリカー、酵母エキス、ペプ
トン等を加えても差支えない。培養温度は酵母の
生育可能温度であれば良く、例えば40℃以下、特
に30℃以下で行われ、PHは3.5〜8.0、特に4.0〜
6.0が望ましい。 Carbon sources for culturing the yeast of the present invention include:
Glucose, sucrose, acetic acid, ethanol, molasses, sulfite, pulp waste liquid, etc. are used, and as the nitrogen source, ammonia, ammonium sulfate, urea, nitrate, etc. are used. Furthermore, as inorganic salts, lime superphosphate, ammonium phosphate, potassium chloride, potassium phosphate, caustic potassium, magnesium sulfate, magnesium chloride, etc. are used as sources of phosphoric acid, potassium, and magnesium, and trace amounts of zinc, copper, manganese, and iron are used. Inorganic salts such as ions are also used. Vitamins, amino acids, nucleic acid-related substances, etc. are not particularly required, but of course they may be added, or cornstarch liquor, yeast extract, peptone, etc. may be added. The culture temperature may be any temperature that allows yeast to grow, for example, below 40°C, especially below 30°C, and the pH is 3.5 to 8.0, especially 4.0 to
6.0 is preferred.

次に実施例をあげて説明する。 Next, an example will be given and explained.

なおグルタチオンの定量は、菌体抽出液につい
てグリオキサラーゼ法（「メソツド・イン・エン
ザイモロジー」第１巻第540ページ、アカデミツ
クプレス社、1955年版）で行つた。 The quantification of glutathione was carried out using the glyoxalase method (Method in Enzymology, Vol. 1, p. 540, Academic Press, 1955 edition) using the bacterial cell extract.

また本発明の有用性は、以下の実施例に示す
が、これによつて本発明が制限されるものではな
い。 Further, the usefulness of the present invention is shown in the following examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１キヤンデイダ・ウチルスIAM4264の突然変異
でエチオニンおよび亜硫酸塩含有培地に生育可能
となつたキヤンデイダ・ウチルスKJS−0571株、
FERMP−6907をグルコース２％、イーストエキ
ス２％、ペプトン１％からなる培地でフラスコ種
母培養し、これを300容発酵槽に１％植菌した。Example 1 Candeida uchilus strain KJS-0571, which became able to grow in an ethionine and sulfite-containing medium by mutation of Candeida uchilus IAM4264,
FERMP-6907 was cultured in a flask seed medium containing 2% glucose, 2% yeast extract, and 1% peptone, and 1% of this was inoculated into a 300-volume fermenter.

培地としては、グルコース３％、硫安0.8％、
リン酸一カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.03
％、硫酸第一鉄10ppm、硫酸亜鉛3ppm、硫酸銅
1ppm、硫酸マンガン10ppmを用いバツチ培養を
行つた。培養条件としては槽内液量200、培養
温度30℃、通気量150pm、撹拌数200rpm、PH
4.5にて行つた。24時間培養後集菌したところ乾
燥時換算2950ｇの菌体が得られ、菌体中のグルタ
チオン含量は4.0％（対乾燥菌体比）であつた。
この菌体を加熱抽出し、菌体残渣を遠心分離にて
除きグルタチオン抽出液を得た。この抽出液に硫
酸を0.5Nになるように添加し、亜酸化銅を加え
グルタチオンを銅塩として析出させた。グルタチ
オン銅塩を水洗した後硫化水素を通気し、硫化銅
を除き、減圧濃縮することによりグルタチオンの
結晶95.0ｇを得た。得られた結晶は高圧ろ紙電気
泳動、高速液体クロマトグラフイーよりグルタチ
オンであることが確認され、ヨード法による純度
は99.0％であつた。 As a medium, glucose 3%, ammonium sulfate 0.8%,
Monopotassium phosphate 0.2%, magnesium sulfate 0.03
%, ferrous sulfate 10ppm, zinc sulfate 3ppm, copper sulfate
Batch culture was performed using 1 ppm and 10 ppm of manganese sulfate. The culture conditions are: tank liquid volume 200, culture temperature 30℃, ventilation rate 150pm, stirring number 200rpm, PH
I went with 4.5. After 24 hours of culture, the cells were collected, and 2950 g of dry cells were obtained, and the glutathione content in the cells was 4.0% (ratio to dry cells).
The cells were heated and extracted, and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a glutathione extract. Sulfuric acid was added to this extract to a concentration of 0.5N, and cuprous oxide was added to precipitate glutathione as a copper salt. After washing the glutathione copper salt with water, hydrogen sulfide was bubbled through to remove the copper sulfide, and the mixture was concentrated under reduced pressure to obtain 95.0 g of glutathione crystals. The obtained crystals were confirmed to be glutathione by high pressure filter paper electrophoresis and high performance liquid chromatography, and the purity by the iodine method was 99.0%.

実施例２突然変異株キヤンデイダ・ウチルスKJS−0571
株、FERMP−6907を実施例１と同様にフラスコ
種母培養し30発酵槽に５％植菌した。Example 2 Mutant strain Candeida uchilus KJS-0571
The strain FERMP-6907 was cultured in flasks in the same manner as in Example 1, and 30 fermenters were inoculated at 5%.

培地としては次の組成のものを用いた。亜硫酸
パルプ廃液（資化性糖として３％）にリン酸−ア
ンモニウム0.15％、塩化カリウム0.06％を添加す
る。培養はドラフトチユーブ付発酵槽で槽内液量
10、培養温度30℃、通気量10pm、撹拌数
700rpmで行い、アンモニアを注加してPHコント
ロール及び、培養の窒素源とした。培養32時間後
に遠心分離にて菌体を集菌したところ菌体165ｇ
（乾燥時換算）が得られ、菌体中のグルタチオン
含量は3.8％（対乾燥菌体比）であつた。 A medium with the following composition was used. Add 0.15% ammonium phosphate and 0.06% potassium chloride to sulfite pulp waste liquid (3% as assimilated sugar). Culture is carried out in a fermenter with a draft tube, reducing the amount of liquid in the tank.
10.Culture temperature 30℃, aeration rate 10pm, stirring number
The temperature was 700 rpm, and ammonia was added to control the pH and serve as a nitrogen source for the culture. After 32 hours of culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation and yielded 165 g of bacterial cells.
(calculated when dry) was obtained, and the glutathione content in the bacterial cells was 3.8% (ratio to dry bacterial cells).

比較例１実施例１と全く同様に親株のキヤンデイダ・ウ
チリスIAM4264株を培養して比較した結果3050
ｇの乾燥菌体を得た。この乾燥菌体中のグルタチ
オン含量は0.52％（対乾燥菌体比）であつた。実
施例１と全く同様の処理により8.1ｇのグルタチ
オンを得た。Comparative Example 1 The parent strain Candeida utilis strain IAM4264 was cultured in exactly the same manner as in Example 1, and the comparison result was 3050
g of dried bacterial cells were obtained. The glutathione content in the dried bacterial cells was 0.52% (ratio to dry bacterial cells). 8.1 g of glutathione was obtained by the same treatment as in Example 1.

Claims

[Claims]

1. By aerobically cultivating a mutant strain of yeast of the genus Candeida that can grow in a medium containing both ethionine and sulfite through mutation treatment, it is possible to produce and accumulate a significant amount of glutathione in the bacterial cells. Characteristic method for producing yeast with high glutathione content.