JPS6361622B2 - - Google Patents
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- JPS6361622B2 JPS6361622B2 JP56054463A JP5446381A JPS6361622B2 JP S6361622 B2 JPS6361622 B2 JP S6361622B2 JP 56054463 A JP56054463 A JP 56054463A JP 5446381 A JP5446381 A JP 5446381A JP S6361622 B2 JPS6361622 B2 JP S6361622B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
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Description
本発明は生物学的試料中の核酸類の検出方法に
関する。 本発明は一般に最近生物学的研究用の重要な道
具として発達して来た螢光顕微鏡検査法に関す
る。螢光顕微鏡検査法は入射光によつて励起され
た場合螢光を発する染料で染色できる物質の微量
検出用に極めて敏感な方法である。特に本発明は
生物学上の試料中の種々の有機体の検出法に関す
る。上記有機体の検出は本発明の螢光性染料の核
酸染色性によつて可能である。 科学的文献から種々の化合物類が核酸類の選択
的着色に使われていることは明白である。フオン
ベルタランフイとビツキスはJ.Histochen.、
Cytochem.4巻、481―493（1956）にアクリジンオ
レンジが螢光顕微鏡検査による細胞室のバソフイ
リア（RNA）の同定に使用できると報告してい
る。特にアクリジンオレンジが超生体状態のバソ
フイリアの細胞室封入体の同定を可能にすること
および赤色螢光性細胞室封入体がトルイジン青法
によつて染色されまたリボ核酸酵素により主とし
てRNAより成ると示されるものに対応すること
を発見している。 ロツセルらはNature、253巻、461（1975）に
4′―６―ジアミジノ―２―フエニルインドール
（DAPI）が有用なDNA結合性をもつことが示さ
れたと報告している。特にDAPIが酵母中の核と
糸粒体DNAの両者の非常に特殊な螢光性着色剤
として使用できることを発見している。 ヒルウイグとグロツプはExperimental Cell
Research75、122―126（1972）にベンズイミダゾ
ール誘導体（ヘヒスト33258と指定）を用いて異
染色質の染色体部分および（はつかねずみにおけ
る）反復性DNAの位置を見える様にする簡単直
接の螢光性着色法を記述している。 従来の染料は螢光顕微鏡検査法、組織学および
微螢光分析法に広く使用されている様であるが、
これらは励起と放出スペクトル、量子収率および
素地螢光の点で望ましくない性質をもち、これが
別の螢光核酸染料を求める研究を促進しているの
である。したがつて可視波長で励起できて、その
遊離状態では本質的に非螢光性であるが核酸と結
合した場合強螢光性である核酸に対する特異な染
料が要望されていることは明白である。 本発明に有用な化合物類は一般に米国特許第
3833863号および同防衛公告第T88 9016号により
染料として知られている。しかし本発明の新規の
用途に関しての記述も提案も全くない。 明確にいうならば、本発明は核酸類を検出する
新規方法に関するもので、その方法は式： （式中Ｒは炭素原子１乃至４をもつアルキル基お
よびアルキル部分が炭素原子１乃至４をもつジア
ルキルアミノで置換された上記アルキル基より成
る群から選ばれたものを表わし、R1とR2は各々
炭素原子１乃至４をもつアルキル基を表わし、
関する。 本発明は一般に最近生物学的研究用の重要な道
具として発達して来た螢光顕微鏡検査法に関す
る。螢光顕微鏡検査法は入射光によつて励起され
た場合螢光を発する染料で染色できる物質の微量
検出用に極めて敏感な方法である。特に本発明は
生物学上の試料中の種々の有機体の検出法に関す
る。上記有機体の検出は本発明の螢光性染料の核
酸染色性によつて可能である。 科学的文献から種々の化合物類が核酸類の選択
的着色に使われていることは明白である。フオン
ベルタランフイとビツキスはJ.Histochen.、
Cytochem.4巻、481―493（1956）にアクリジンオ
レンジが螢光顕微鏡検査による細胞室のバソフイ
リア（RNA）の同定に使用できると報告してい
る。特にアクリジンオレンジが超生体状態のバソ
フイリアの細胞室封入体の同定を可能にすること
および赤色螢光性細胞室封入体がトルイジン青法
によつて染色されまたリボ核酸酵素により主とし
てRNAより成ると示されるものに対応すること
を発見している。 ロツセルらはNature、253巻、461（1975）に
4′―６―ジアミジノ―２―フエニルインドール
（DAPI）が有用なDNA結合性をもつことが示さ
れたと報告している。特にDAPIが酵母中の核と
糸粒体DNAの両者の非常に特殊な螢光性着色剤
として使用できることを発見している。 ヒルウイグとグロツプはExperimental Cell
Research75、122―126（1972）にベンズイミダゾ
ール誘導体（ヘヒスト33258と指定）を用いて異
染色質の染色体部分および（はつかねずみにおけ
る）反復性DNAの位置を見える様にする簡単直
接の螢光性着色法を記述している。 従来の染料は螢光顕微鏡検査法、組織学および
微螢光分析法に広く使用されている様であるが、
これらは励起と放出スペクトル、量子収率および
素地螢光の点で望ましくない性質をもち、これが
別の螢光核酸染料を求める研究を促進しているの
である。したがつて可視波長で励起できて、その
遊離状態では本質的に非螢光性であるが核酸と結
合した場合強螢光性である核酸に対する特異な染
料が要望されていることは明白である。 本発明に有用な化合物類は一般に米国特許第
3833863号および同防衛公告第T88 9016号により
染料として知られている。しかし本発明の新規の
用途に関しての記述も提案も全くない。 明確にいうならば、本発明は核酸類を検出する
新規方法に関するもので、その方法は式： （式中Ｒは炭素原子１乃至４をもつアルキル基お
よびアルキル部分が炭素原子１乃至４をもつジア
ルキルアミノで置換された上記アルキル基より成
る群から選ばれたものを表わし、R1とR2は各々
炭素原子１乃至４をもつアルキル基を表わし、
【式】はベンゾチアゾール核、キノリン
核、ピリジン核、およびアルキル部分が炭素原子
１乃至４をもつジアルキルアミノで置換された置
換ピリジン核より成る群から選ばれた複素環核を
表わしかつＸは陰イオンを表わす）で示される螢
光性染料で生物学的試料中の核酸を染色すること
を特徴とする。 本発明の方法に使用する染料類は水溶液中では
本質的に非螢光性であるが、染料が２糸状DNA
に結合した場合は著しい増強を示す。これらの染
料のあるものは１糸状DNAに結合した場合には
この増強を示さないが、殆んどの染料はRNAと
結合した場合螢光の著しい増加が明らかにみられ
る。遊離状態では螢光はないので、過剰の試薬を
分離又は除去する必要なく多量の染料が使用でき
る。この性質は染料吸収がわるい様な用途の場合
に重要である。更にいくつかの染料の高螢光量子
収率により、必要ならば少量の染料が使用でき
る。 下記染料が本発明の用途用に製造され試験され
た：
１乃至４をもつジアルキルアミノで置換された置
換ピリジン核より成る群から選ばれた複素環核を
表わしかつＸは陰イオンを表わす）で示される螢
光性染料で生物学的試料中の核酸を染色すること
を特徴とする。 本発明の方法に使用する染料類は水溶液中では
本質的に非螢光性であるが、染料が２糸状DNA
に結合した場合は著しい増強を示す。これらの染
料のあるものは１糸状DNAに結合した場合には
この増強を示さないが、殆んどの染料はRNAと
結合した場合螢光の著しい増加が明らかにみられ
る。遊離状態では螢光はないので、過剰の試薬を
分離又は除去する必要なく多量の染料が使用でき
る。この性質は染料吸収がわるい様な用途の場合
に重要である。更にいくつかの染料の高螢光量子
収率により、必要ならば少量の染料が使用でき
る。 下記染料が本発明の用途用に製造され試験され
た：
【表】
【表】
リジニウムよう化物
【表】
ジニウムよう化物
上記染料類の励起波長とえられる螢光放射を測
定するため照射した。次いでDNAとRNAの試料
を各染料で染色した。試料を適当波長で照射し螢
光増強を観察した。結果を表に示している。
上記染料類の励起波長とえられる螢光放射を測
定するため照射した。次いでDNAとRNAの試料
を各染料で染色した。試料を適当波長で照射し螢
光増強を観察した。結果を表に示している。
【表】
【表】
上記データはすべてパーキン―エルマー
MPF43―Ａ螢光分光光度計を用い10ミリモルり
ん酸塩緩衝塩溶液（PBS）PH7.3、３ml中0.1μM
染料を使用してえたものである。 螢光増強を示す比率は子牛胸線型 DNAお
よび酵母型RNAのミリリツトル当り100μｇを
含む染料溶液の螢光強度の何も含まぬ染料溶液に
対する比率をとつたものである。 相対螢光は子牛胸線型 DNAのミリリツト
ル当り100μｇを含む染料溶液の螢光強度と同量
のDNAを含む染料溶液の強度との比率から簡
単にえられる。データは異なる波長における機器
応答について補正していない。 実施例 １ 染料溶液（0.9％塩溶液中に２mg/ml）5μを
新しい全血（EDTA）100μ中に加えた。混合
液を振とうし螢光顕微鏡（540nmブロードーバン
ド励起フイルター、590nmロングパス放射フイル
ター、倍率400倍）下に検査のため湿スライドを
す早くつくつた。末梢血液白血球（PBLs）の核
は認められ暗い背景に対し強いオレンジ色に染色
された。また中位強度に染色された小板が認めら
れた。赤血球およびPBLsの細胞室の着色は見ら
れなかつた。 実施例 ２ 染料溶液（0.9％塩溶液中に２mg/ml）20μ
をE.コリの懸濁液（108―109細胞／ml）２mlに加
えた。混合液を撹拌し実施例１に記載のとおり湿
スライドをつくり検査した。細菌は黒い背景に対
して輝いたオレンジ色棒として認められた。 実施例 ３ E.コリの懸濁液（〜109細胞／ml）２ml中に染
料No.25溶液（２mg/ml）20μを加えた。実施例
１に記載のとおりスライドを検べた処、黒い背景
に対して輝いた赤色棒として細菌が認められた。 実施例 ４ フアージ懸濁液（PICM、５×109pfu／ml；
T6、４×108pfu／ml；２×1010pfu／ml）100μ
中に染料溶液（0.9％塩溶液中1.6mg/ml、0.3μｍ
フイルターをとおし無菌過した）10μを加え
た。混合液を振とうし湿スライドをつくつた。こ
のスライドを実施例１のとおり螢光顕微鏡で検べ
た。PICMおよびT6が黒い背景に対してオレン
ジ色光の小点として見られた。 実施例 ５ 50μMりん酸塩PH6.8緩衝液中のDNAと染料
の貯蔵溶液を最終容量２ml中に最終濃度１−
100nmDNAベースペアズおよび1μM染料となる
様混合し。溶液の螢光をパーキン―エルマー
MPF43A上で測定した。励起は555nm（4nmバン
ドパス）であつた。放射は605nm（4nmバンドパ
ス）であつた。この範囲にわたり螢光対DNA濃
度の線曲線がえられた。 実施例 ６ 5μの新しい全血（EDTA）に染料No.28溶液
（0.9％塩溶液中に50μｇ/ml、0.3μmフイルターを
とおし無菌過した）0.5mlを加えた。混合液を
振とうし螢光顕微鏡（450−490nmブロードバン
ド励起、530nmロングパス放射フイルター、倍率
400×）の下で検査のため湿スライドをつくつた。
末梢血液白血球の核は明るいオレンジに染まり、
細胞核細網は黄色に染まり、原形質と膜は緑色に
染まつた。小板はオレンジ色に染まつた。赤血球
と細網赤血球は後者の細網が黄―オレンジ色に強
く染まり赤血球の膜が緑色に弱く染まるので容易
に区別できる。 実施例 ７ 染料No.33溶液を使つて実施例６の方法を反復し
た。末梢血液白血球の核と細胞核細網は強く黄色
に染まり、原形質と膜は強い緑黄色に染まつた。
赤血球と細網赤血球は強く染まつた黄色細網赤血
球細網と緑黄色に染まつた赤血球膜により容易に
区別できる。 上記実施例から本発明の用途を示す染料類は生
物学的試料中の顕微鏡的有機体の殆んど限りない
種類のものの検査に利用できることは明白であ
る。ミクロ螢光細胞学における明白な用途以外に
これらの染料は尿および水試料の高濃度細菌につ
いての検査のため流動細胞螢光分析装置に使用で
きる。これらの染料はプラスミド、細網赤血球、
白血球および小板を螢光的に染めるので、全血も
また分析して成分状態を知ることができる。
MPF43―Ａ螢光分光光度計を用い10ミリモルり
ん酸塩緩衝塩溶液（PBS）PH7.3、３ml中0.1μM
染料を使用してえたものである。 螢光増強を示す比率は子牛胸線型 DNAお
よび酵母型RNAのミリリツトル当り100μｇを
含む染料溶液の螢光強度の何も含まぬ染料溶液に
対する比率をとつたものである。 相対螢光は子牛胸線型 DNAのミリリツト
ル当り100μｇを含む染料溶液の螢光強度と同量
のDNAを含む染料溶液の強度との比率から簡
単にえられる。データは異なる波長における機器
応答について補正していない。 実施例 １ 染料溶液（0.9％塩溶液中に２mg/ml）5μを
新しい全血（EDTA）100μ中に加えた。混合
液を振とうし螢光顕微鏡（540nmブロードーバン
ド励起フイルター、590nmロングパス放射フイル
ター、倍率400倍）下に検査のため湿スライドを
す早くつくつた。末梢血液白血球（PBLs）の核
は認められ暗い背景に対し強いオレンジ色に染色
された。また中位強度に染色された小板が認めら
れた。赤血球およびPBLsの細胞室の着色は見ら
れなかつた。 実施例 ２ 染料溶液（0.9％塩溶液中に２mg/ml）20μ
をE.コリの懸濁液（108―109細胞／ml）２mlに加
えた。混合液を撹拌し実施例１に記載のとおり湿
スライドをつくり検査した。細菌は黒い背景に対
して輝いたオレンジ色棒として認められた。 実施例 ３ E.コリの懸濁液（〜109細胞／ml）２ml中に染
料No.25溶液（２mg/ml）20μを加えた。実施例
１に記載のとおりスライドを検べた処、黒い背景
に対して輝いた赤色棒として細菌が認められた。 実施例 ４ フアージ懸濁液（PICM、５×109pfu／ml；
T6、４×108pfu／ml；２×1010pfu／ml）100μ
中に染料溶液（0.9％塩溶液中1.6mg/ml、0.3μｍ
フイルターをとおし無菌過した）10μを加え
た。混合液を振とうし湿スライドをつくつた。こ
のスライドを実施例１のとおり螢光顕微鏡で検べ
た。PICMおよびT6が黒い背景に対してオレン
ジ色光の小点として見られた。 実施例 ５ 50μMりん酸塩PH6.8緩衝液中のDNAと染料
の貯蔵溶液を最終容量２ml中に最終濃度１−
100nmDNAベースペアズおよび1μM染料となる
様混合し。溶液の螢光をパーキン―エルマー
MPF43A上で測定した。励起は555nm（4nmバン
ドパス）であつた。放射は605nm（4nmバンドパ
ス）であつた。この範囲にわたり螢光対DNA濃
度の線曲線がえられた。 実施例 ６ 5μの新しい全血（EDTA）に染料No.28溶液
（0.9％塩溶液中に50μｇ/ml、0.3μmフイルターを
とおし無菌過した）0.5mlを加えた。混合液を
振とうし螢光顕微鏡（450−490nmブロードバン
ド励起、530nmロングパス放射フイルター、倍率
400×）の下で検査のため湿スライドをつくつた。
末梢血液白血球の核は明るいオレンジに染まり、
細胞核細網は黄色に染まり、原形質と膜は緑色に
染まつた。小板はオレンジ色に染まつた。赤血球
と細網赤血球は後者の細網が黄―オレンジ色に強
く染まり赤血球の膜が緑色に弱く染まるので容易
に区別できる。 実施例 ７ 染料No.33溶液を使つて実施例６の方法を反復し
た。末梢血液白血球の核と細胞核細網は強く黄色
に染まり、原形質と膜は強い緑黄色に染まつた。
赤血球と細網赤血球は強く染まつた黄色細網赤血
球細網と緑黄色に染まつた赤血球膜により容易に
区別できる。 上記実施例から本発明の用途を示す染料類は生
物学的試料中の顕微鏡的有機体の殆んど限りない
種類のものの検査に利用できることは明白であ
る。ミクロ螢光細胞学における明白な用途以外に
これらの染料は尿および水試料の高濃度細菌につ
いての検査のため流動細胞螢光分析装置に使用で
きる。これらの染料はプラスミド、細網赤血球、
白血球および小板を螢光的に染めるので、全血も
また分析して成分状態を知ることができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 核酸類を式： （式中Ｒは炭素原子１乃至４をもつアルキル基お
よびアルキル部分が炭素原子１乃至４をもつジア
ルキルアミノで置換された上記アルキル基より成
る群から選ばれたものを表わし、R1とR2は各々
炭素原子１乃至４をもつアルキル基を表わし、
【式】はベンゾチアゾール核、キノリン 核、ピリジン核、およびアルキル部分が炭素原子
１乃至４をもつジアルキルアミノで置換された置
換ピリジン核より成る群から選ばれた複素環核を
表わしかつＸは陰イオンを表わす）で示される螢
光性染料で染色することを特徴とする生物学的試
料中の核酸類の検出方法。 ２ 螢光性染料が１―γ―ジメチルアミノプロピ
ル―４―ｐ―ジメチルアミノ―スチリルキノリニ
ウムよう化物である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ３ 螢光性染料が３―γ―ジメチルアミノプロピ
ル―２―ｐ―ジメチルアミノ―スチリルベンゾチ
アゾリウムよう化物である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ４ 螢光性染料が１―γ―ジメチルアミノプロピ
ル―４―ｐ―ジメチルアミノスチリルピリジニウ
ムよう化物である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ５ 螢光性染料が１―メチル―２―ジメチルアミ
ノ―４―ｐジメチルアミノスチリルピリジニウム
よう化物である特許請求の範囲第１項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| US14232180A | 1980-04-21 | 1980-04-21 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JPS6361622B2 true JPS6361622B2 (ja) | 1988-11-29 |
Family
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-
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- 1981-04-21 FR FR8107928A patent/FR2480943A1/fr active Granted
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