JPS6366192A - 細胞の成長因子に親和性を示すヘパリン系少糖類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞の分割及び分化に対する活性を示すヘパ
リン型（ヘパリン又は硫酸ヘパラン型）の少糖類、その
製造並びに治療へのその応用に関する。

［従来の技術］ ヘパリンは、周知のように、硫酸ヘパラント同様に、高
度に異質のグリコサミノグルカンである。グリコサミノ
グリカンは、糖単位即ちＤ−グルコサミン構造単位−ウ
ロン酸（Ｌ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸）構造単
位の、又はその逆の交番によって形成される。この基本
構造物は、二側類単位［Ｄ−グルコサミン］−［Ｌ−イ
ズロン酸］の連鎖を有する規則的なものでも、不規則な
ものでもよく、ウロン酸り１位はＬ−イズロン酸でもＤ
−グルクロン酸でもよい。

鎖の分子量は、相当程度変化してもよく、約２０００〜
５００００であってよい。更に、イオン電荷は、同じ構
造物の単位ついて、サルフェート基の含量に従って変化
する。

この異質な性質により、含まれる連鎖に従って鎖の性状
が変化する。

周知のように、ヘパリン鎖の約局は、ＡＴｍ（アンチト
ロンビン■）結合サイＩ・を右している。これらの鎖は
血液凝固の成る因子に対して比較的特異な活性を備えて
いる。

ＡＴＩＩＩに対する結合サイトのないヘパリン鎖の約％
は、反対番乙このサイＩ・を働かせる抗凝固活性を備え
ていない。

ヘパリンに対する成る細胞成長因子の親和性も報告され
ている。この親和性は、ヘパリン−セファロース、（登
録前Ｉｓ）カラムのアフィニティクロマトグラフィによ
てって細胞成長因子を精製するために利用される。

ヘパリンに親和性を示す細胞成長因子は、分子量が約１
２０００〜２００００のアニオン性もしくはカチオン性
ポリペプチドであり、細胞生理学的において重要な役割
を果たしている。即ち、これらの因子は、細胞の分割及
び分化に対する活性を備えている。この活性は特に、成
る種の細胞、例えばフィブロブラスチン細胞、毛細血管
内皮細胞及び成る筋肉細胞に対して発現される。細胞成
長因子は、神経細胞の分化にも関与する。

この因子は、Ｆ　Ｇ　Ｆ　（’　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｉｃ　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　’　、フィブロブラ
スチン成長因子の略語）又はＥ　ＣＧ　Ｆ　（’　ｅｎ
ｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔ
ｏｒ　’　、内皮細胞成長因子の略語）とも表示される
（「生化学（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）　Ｊ　１９８４、第
６６巻、４１９〜４２８頁に掲載されたＪ、コーティ（
ＣｏｕｒＤ）、Ｙ、クールトワ（Ｃ：ｏｕｒｔｏｉｓ）
及びり、バリトー（Ｂａｒｒｉｔａｕｌｔ）の論文、並
びに、「生物化学（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ）Ｊ第
２３巻、２６号、１９８４年、６２９５〜６２９９頁に
掲載されたロイψＲ，ロブ（Ｒｏｙ　Ｒ，Ｌｏｂｂ）及
びジェームズ−Ｗ。

フェット（Ｊａｍｅｓ　Ｗ、　Ｆｅｔｔ）の論文参照）
。

本明細書において［少糖類又はグリコサミノグリカンと
いう用語は、グリコサミノグリカンの比較的長い鎖の解
重合によって得られた自然の生成物である少糖類のフラ
グメントと、合成法によって得た少糖類又は多糖類の連
鎖とを包括する。これらのフラグメント及び連鎖におい
て、還元末端及び／又は非還元末端の単位は、ヘパリン
又は硫酸ヘパランの自然の鎖に対応する？１′！位に対
して化学的に変性されていてもよい。しかしこれらの変
性された単位も、本明細書では、ｌ’ｉ　１１位又は少
糖類の単位と呼ばれている。

本発明者らは、前記の成長因子が、驚くべきことに、少
糖類の成る鎖に対してしか顕名な親和性を示さないこと
を見出した。これらの鎖の分離に関するこの親和性の研
究によって、分子−ｋｌについて同質の少糖類の部属力
く電荷の異なった多くのアニオン種の混合物であること
と、最も強アニオン性の種が細胞の分割及び分化に規則
的な作用を示し、これが薬学上の利用にとって非常に好
ましいことが見出された。

［発明の目的］ 従って、本発明の目的は、ヘパリンに固着可能な細胞成
長因子に対して顕著な親和性を示すヘパリン型又は硫酸
ヘパラン型の少糖類を提供することにある。

本発明の別の目的は、これらの少糖類の調製方法を提供
することにある。

本発明の更に別の目的は、これらの少糖類を利用して、
細胞の分割及び分化に対して活性を示す医薬品を調製す
ることにある。

［発明の概要］ 本発明による少糖類は、基本的に、鎖によって形成され
た生成物であり、ヘパリンを認識するカチオン性又はア
ニオン性の細胞因子に対して特異的な親和性を示し、第
１図に示したＲＭＮスペクトルの特徴を表わす強アニオ
ン性を示し、天然ヘパリンに存在するものに対応した少
くとも５つのｅｉ位の連鎖を含む生成物並びに医薬とし
て認容可能なその塩から成る。

本発明は、次式Ｉニ ー　（Ｇ−Ｈ）ｎ−Ｇ−又は−Ｈ−（Ｇ−Ｈ）ｎ　　　
　　　　（Ｉ　）で示される構造の糖類の単位の連鎖を
有する、式中、ｎは２〜６の数を表し、 Ｇ−Ｈは、（イズロン酸・２−Ｏ−サルフェートト）　
−（Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サルフェート６−Ｏ−サ
ルフェートト）の構造の二糖類の鎖状構造に対応し Ｇは、Ｌ−イズロン酸・２−サルフェ−１・の構造の単
位を表わし、 Ｈは、Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サルフェート・８−Ｏ
−サルフェートの構造の中位を表わし、 ヘパリンを認識するカチオン性又はアニオン性の細胞成
長因子に対して特異的な親和性を／１ζす、基本的に鎖
から成る生成物と、医薬として認容ＩＩｆ能なその塩を
対象とする。

これらのグリコサミノグリカンは、ＡＴｍ結合サイトを
もたないことによって、凝固のシステムに対する活性を
介在させることなく、細胞の分割及び分化の機構に対し
て活性を示すため、有利となる。

二糖類の連鎖ＧＨは、特に、次式ＴＩ＝（ここにＢ＋は
、薬理学的に認容可能な塩を与える無機もしくは有機カ
チオンを表わす）に対応している。

本発明による少糖類は、有利には、次式％式％（） （式においてＲは、水素原子を表わすか、又は、Ｇ−Ｈ
型の二糖類の単位を表わし、ここに単位Ｇは、ヘパリン
釦に対応する単位に対して必要により化学的に変性され
ており、 Ｒ′は、水素原子を表わすか、又は、Ｇ−Ｈ型の二糖類
の単位を表わし、ここに中位Ｈは、ヘパリン鎖に対応す
る単位に対して、必要により化学的に変性されており、 ここに、Ｒ及びＲ′は、変性された単位を含めた少糖類
の糖単位の全数が多くとも１４に等しくなるような意味
を有するものとする） に対応している。

上式（ＩＩＩ）の少糖類の基において、非還元末端及び
還元末端は、変更を受けない糖ｊｌｉ位、即ち１位の不
斉炭素又は４位にそれぞれ−ＯＨ）、Ｉ（を有する糖単
位によって形成される。

少糖類は、別の基のところに、Ｄ−グルコサミン酸又は
Ｌ−イズロン酸のＱｊ位と異なった基を、非還元末端及
び／又は還元末端に右している。

この単位は、特定的には、ヘパリン鎖の対応する単位に
対して変更された糖単位である。

普通に使用されるヘパリンの解重合剤即ち硝酸もしくは
ヘパリナーゼに留意して、還元末端の単位は、有利には
２．５−’ＩＩＫ水マンニＩ・−ルもしくは２．５−無
水マンノン酸の構造の２゜５−マンノ構造の単位であり
、非還元末端の単位は、α、β−エチレン不飽和ウロン
単位である。

しかし、当業者には明らかなように、前述した糖類の連
鎖の治療効果を変更しない限り、種々の有機基を合成法
によって導入することができる。

本発明の特に好ましい構成によれば、少糖類は、その重
合度、即ち、その鎖を形成する単位の数について均質で
ある。

特に右利な少糖類は、穴開類である。

この穴開類は、［Ｌ−イズロン酸・２−０−サルフェ−
１−］−［Ｄ−グルコサミン−ＮＨ−サルフェート、６
−Ｏ−サルフェートト］の３つの二糖類の構造単位の繰
返しによって形成される。

これは、式（ｍ）においてＲ，Ｒ’が共に水素原子を表
わし、ｎが３に等しい場合の生成物である。

変形として、非還元末端及び／又は還元末端の単位は、
ヘパリン中に存在する対応のＱｔ位に対して化学的に変
性されていてもよい。対応する穴開類は、Ｒ及び／又は
Ｒ′が変性された糖単位を表わす弐■によって示される
。

本発明の好ましい実施態様による穴開類は、０．５Ｎ　
　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ，６、０）によって平衡させた
アガロース−アクリルアミド４５見を含有する１　００
ｃｍＸ　２５ｃｍのカラム１−においてヘパリンの硝酸
解重合混合物のアルコール沈殿によッテ得た沈殿物６０
ｇを、０．５Ｍ　　ＮａＣｕ５００ＷＪ溶液中に装入し
、１時間１５００−の流量で溶離を行なって、ゲル濾過
系中３２文〜３６文の容積の間に溶離させたフラクショ
ンに対応するフラクション中に含まれる生成物に対応し
ている。

この生成物は、トリスＨＣ見、０　、　ＯＬＭ、　ｐＨ
７，４，０，２Ｍ　　ＮａＣｕ［析液によって’ｌ’　
ｓｒされた、ＦＧＦアニオン−セファロース（登録商標
）３０−を含有する２　、　５ｃｍ＋Ｘ６　、５ｃｍの
カラムを使用し、このカラム上に、前記と同じ緩衝液６
〇−中に溶解させた前記フラクション３００１１ｇを施
し、ＩＭＮａＣｓＬに調節した緩衝液を用いて溶離し、
エタノールを用いて回収した該フラクションの少ａ類を
沈殿させてＦＧＦアニオンセファロース（登録前り上に
アフィニティクロマトグラフィによって分離したもので
ある。

別の有利な少糖類は、六組類であり、これは、特に、前
記六組類の連鎖を含む六組類である。六組類は、ヘパリ
ン中に含まれる対応する構造に対して、変性されていな
い単位によって形成されるか、又は、六組類について前
述したように、還元末端及び／又は非還元末端に、変性
された単位を＃１１えている。

本発明の別の態様によれば、六組類は、０．５Ｎ　　Ｎ
ａＣｕ緩衝液（ｐＨ２６，０）によって平衡させたアガ
ロース−アクリルアミド４５文を含有する１　００ｃｍ
Ｘ　２５ｃｍのカラム上においてヘパリンの硝酸解重合
混合物のアルコール沈殿によって得た沈殿物６０ｇを、
０．５ＭＮａＣ見　５０〇−溶液中に溶かし、１時間１
５００−の流量で溶離を行なって、ゲル濾過系２８文〜
３２文の容積の間に溶−させたフラクションに対応する
フラクション中に含まれる生成物に対応している。

この生成物は、トリス−ＨＣＣＯ２０１Ｍ、ｐＨ７，４
，０，２Ｍ　　ＮａＣｕ緩衝液によって平衡された、Ｆ
ＧＦアニオン−セファロース（登録商標）３０−を含有
する２　、　５ｃ＋＊Ｘ６　、５ｃ■のカラムを使用し
、このカラム」二に、前記と同じＷＮｉ液６〇−中に溶
解させた前記フラクション３００ｍｇを施し、ＩＭＮａ
ＣＪｊに調節した緩衝液を用いて溶離し、エタノールを
用いて回収した該フラクションの少糖類を沈殿させてＦ
ＧＦアニオンセファロース（登録ｉｆ［？ｉ）　−１−
にアフィニティクロマトグラフィーによって分離したも
のである。

別の有利な少糖類は、還元末端又は非還元末端の変えら
れた単位が化学的に変性されている十糖類によって形成
される。

これらの十糖類は、六組類を取得するための前記のゲル
濾過系においての２５！Ｌ〜２８見の溶離容積に対応す
るフラクションに含まれ、六組類のための前記の条件の
下にＦＧＦ−７ニオンーセフアロース（登録商標）によ
ってアフィニティクロマトグラフィによって分離された
ことを特徴とする。

前記のように末端が必要に応じて化学的に変性された１
２糖単位を含む鎖によって形成された少糖類も同様に生
成物として好ましい。

本発明による少糖類は、薬理学的に認容可能な塩の形と
してもよい、これには、カルシウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩及びマグネシウム塩が含まれる。

本発明は、以上に述べた少糖類の製造方法も提供する。

この方法は、所定のイオン強度をもった緩衝液を使用し
て、ヘパリン又は硫酸ヘパラン型グリコサミングリカン
調製物を、有利には支持体上に固定させたアニオン性も
しくはカチオン性成長因子と接触させ、該成長因子に対
して親和性を示さない鎖又は中庸の親和性を示す鎖を除
去し、次に、該成長因子上に固定された糖類の鎖を回収
することを特徴とする。

この構成によれば、強アニオン性の鎖を混合物から分離
することができる。

ＡＴｍに対する結合サイトを有するフラグメント又は鎖
が基本的に除去されたグリコサミノグリカン出発調製物
が使用される。この調製物は、天然のヘパリンもしくは
硫酸ヘパランの鎖の混合物、ヘパリンもしくは硫酸ヘパ
ランのこれらの鎖の解重合フラグメント又は多くとも１
４　Ｑｔ位を含むフラグメントもしくは鎖の混合物によ
って形成される。

グリコサミノグリカン調製物と細胞成長因子との接触は
、緩衝液によって平衡させたアニオン性もしくはカチオ
ン性成長因子を含有したクロマトグラフィカラム中にお
いて行わせることが好ましい。細胞成長因子は有利には
支持体に固定させる。適切な支持体は、多糖類特にアガ
ロースを主成分とするものである。この用途にとって右
利な支持体は、セファロース（登録商標名）の下に市販
されているアガロースのゲルによって形成される。分枝
を有するポリスチレンによって例えば形成された血液と
適合性のマトリックス、例えば、フランス原子力エネル
ギー委員会のフランス特許第２５３４４８６号（特許口
、１９８２年ｌＯ月１５８）、コアイ（ＣＨＯＡＹ）　
Ｓ　、　Ａ　、及びＣ，Ｎ、Ｔ、Ｓのフランス特許第２
５５３５１８号（特許口、１９８３年ＩＯ月１３日）に
記載された支持体を用いてもよい。

満足な分離は、Ｎａ０文　０．２Ｍの濃度に対応するイ
オン強度の緩衝液中において平衡させ、アニオン性又は
カチオン性の細胞成長因子をその−にに固着させた、予
め調製したマトリックス上に、グリコサミノグリカン調
製物を通過させ、次に、ＮａＣｌ　　１Ｍ〜２Ｍの濃度
に対応するイオン強度に緩衝液を調節して、カラム上に
保持された少糖類のフラクションを溶離することによっ
て行なう。

本発明の好ましい実施例によれば、細胞成長因子に対す
るアフィニティクロマＩ・グラフィの作用は、所定の特
性のグリコサミノグリカン型を所定のフラクションから
分離するために、分３’−ｆｉｔについて均質なグリコ
サミノグリカンのフラクションについて行われる。

この種のグリコサミノグリカンのフラクションは、有利
には、前記のグリコサミノグリカン調製物をゲル濾過操
作にかけることによって取得される。

ゲルカラムの塔頂に供給される混合物を適当な緩衝液を
用いた溶離によって、分子−早の関数として、順次に、
均質な少糖類のフラクションを回収する。この形式の操
作において従来から使用されたゲル、例えばアガロース
−アクリルアミド型のゲルを使用することができる。

これらのフラクションをうま〈分離するには、はぼ０．
５ＭのＮａＣ１Ｗ別液のイオン強）■に相当するイオン
強度を有する緩衝液を用いた溶離にる。

所望のグリコサミノグリカンフラクションに対応するカ
ラムからの溶出液を回収し、アルコール系溶剤、特にエ
タノールによって無機塩の添加の後に、フラクションを
沈殿させる。鎖の分子量について均質な、回収されたフ
ラクションは、イオン電荷については、対照的に、非常
に不均一である。

釦混合物（分別された後成長因子に対する親和性によっ
て分離されるか又は分別を行うことなく成長因子によっ
て直接分離される）によって形成されるグリコサミノグ
リカン調製物は、より特定的には、ヘパリンの解重合の
後、ＡＴｍに対する結合サイトを有する鎖をこのサイト
を有しない鎖から分離するために分別を行なうことによ
って取得される。

既知の解重合法は、ヘパリンに対する硝酸、ヘパリナー
ゼ、ヘパリチナーゼ又は過沃素酸塩の作用に特に基づい
ており、硝酸又は過沃素酸塩による解重合は、産業上の
利用の観点から特に有用である。使用するヘパリンは、
粗ヘパリン又は医薬グレードのヘパリンである。

使用する解重合フラクションは、ヘパリンに見られる対
応する構造に対して変性された単位を非還元末端及び還
元末端に備えていてもよい。

これは、ヘバリナーゼもしくはヘパリチナーゼを用いた
解重合又はα、β除去の場合は、α−β不飽和ウロン単
位であり、硝酸を用いた解重合の場合には、２．５−無
水マンノ構造単位である。

硝酸を用いる好ましい硝酸による解重合技法は、本出願
人のフランス特許第２５０３７１４号（特許口、１９８
１年４月１０　ＩＩ　）の対象となっている。このフラ
ンス特許の方Ｖ：によれば、所望の解重合度が達せられ
た時に全部の硝酸イオンが消費されるようなそれぞれの
濃１バに従って水性媒質中においてヘパリンと硝酸とを
反応させる。

硝酸の脱アミノ化の終了時に得られる２、５無水マンノ
ース構造の還元基は、水素化硼素ナトリウムのような還
元剤によって、２．５−無水マンニトール構造の基に還
元されるか、又は、過マンガン酸塩特に過マンガン酸カ
リウムのような酸化剤によって、２，５−無水マンノン
酸構造の基に酸化される。

ＡＴＩＩＩに対する親和性の鎖と非親和性の鎖との分別
は、有利には、無機塩の存在の下にアルコール特にエタ
ノールで分別することによって行われ、その結果として
、 一ヘパリンの１Ｏ１１２，１４，１６，１８糖中位に主
として対応する大きさのフラグメントから成るサブユニ
ット（このサブユニットは、アンチトロンビン■との結
合の五糖類単位を有し、強い抗因子Ｘａ活性と微弱な総
体的な抗凝固活性とを示す）と、 一ヘパリンの２．４．６．８、ｌＯ糖単位に主に対応す
る大きさのフラグメントからなるサブユニット（このサ
ブユニットは、総体的な抗凝固活性をほとんど示さず、
抗因子Ｘａ活性は非常にわずかである）とが生ずる。

変形例によれば、本発明によるグリコサミノグリカンは
、溶離用緩衝液のイオン強度を適切な勾配に従って変え
ることによって、第四級アンモニウムのような強塩基性
のアニオン交換体によるイオン交換によって取得される
。

０．５Ｍ＋０．１Ｍ　　ＮａＣＪｌｊｌＩｌ衝液と１〜
２Ｍ　析液ａＣ１緩衝液とのイオン強度にそれぞれ対応
するイオン強度を有する平衡−洗浄緩衝液と溶離緩衝液
とを使用することによって、所望の親和性の鎖が混合物
から満足のゆくように分離される。

前記の強アニオン性のグリコサミノグリカンの糖類の鎖
の満足な分離は、ＮａＣ文　０．４Ｍの濃度に対応する
値からＩＭの濃度に対応する値まで平衡化緩衝液のイオ
ン強度を変えることによって達せられ、この勾配は、分
離しようとするグリコサミノグリカンの形式、特に、そ
の鎖の長さに適合される。

本発明のグリコサミノグリカンの薬理学的な研究によっ
て、細胞の分割及び分化に対するこのものの性状が明ら
かにされた。

周知のように、ヘパリンに対する親和性をもっ３ま た細胞の成長因子は、特に、種々の細胞形成において見
出される種々の細胞レセプター上に固定されることによ
って作用する。

本発明者が確めたところによると、本発明によるグリコ
サミノグリカンは、これらの成長因子の活性を変更する
。

成る細胞は、　［スポーン（Ｓｐｏｒｎ）　Ｍ、Ｂ、、
トダロ（Ｔｏｄａｒｏ）　Ｇ、Ｊ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
、　Ｊ、　Ｗｅｄ、　３０３　、８７８−８８０　、　
１９８０によって定義された］オートクリン（ａｕｔｏ
ｃｒｉｎ）であり、成長因子を付加することなく細胞の
分割と分化とに対する本発明のグリコサミノグリカンの
（特に考えている細胞の分化の状態及び表現型に従って
）、変調の、即ち活性化又は禁止のポテンシャルを発現
させる。

ヒトのへそ静脈、ウシ及びマウスの内皮細胞の培養基を
用いた特別の実験モデルによって試験を行なった。これ
らの試験によって、グリコサミノグリカンを有しない対
照培養基又はアニオン性ＦＧＦに対する親和性を示さな
い基準穴糖類に対する細胞の増殖の変調が示された。

ヘパリンのフラグメントの存在下において成るステロイ
ドが新しい血管形成を禁！１ニする役割を示すことも知
られている。コルチコイドと共に投与される本発明のグ
リコサミノグリカンは、Ｊ、フォルクマン等が［サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｊ２２１．７１９　（１９８
３）に発表しているようなヒナの奨尿膜の実験モデルに
おいて、この種の作用を有利に示した。

この有用な性質にはすぐれた無ｔｉＪ性がイ・１随する
。

従って、本発明は、グリコサミノグリカンを内皮細胞の
増殖の調整剤として利用することを提案する。この調整
剤は、新しい血管形成が病的である過程においては禁止
剤として少ＩＩ（使用され、成長因子の保護が必要とさ
れるか又はｉｆｆ生が望まれる成る過程においては成長
促進剤として多＋ａに使用される。

病的な新しい血管形成過程の例としては、糖尿病の網膜
病、転移の経過、乾衝などがある。

本発明の生成物は、胚子の増殖を禁Ｉにするためにも利
用しうる。

内皮の損傷の場合又は循環性障害例えば潰瘍をひき起こ
す壊死の場合に、再生を刺激するために、本発明の生成
物を使用してもよい。創傷性もしくは先天性の損傷のた
めに、又は、後天性の変性病態特に血管性の事故例えば
梗塞の後の心臓組織の障害に対して本発明の生成物を使
用してもよい。

本発明は、前記の少くとも１種のグリコサミノグリカン
の有効量を薬理学的な基剤と共にその有効成分中に含有
する薬理学的組成物も提供する。

右利な薬理学的組成物は、有利には、前述の高アニオン
化度の穴開類、又はへ糖類、十糖類又は十二糖類、又は
その混合物を、その薬理学的に認容可能な塩の形で含有
する。

この医薬の有効成分は、グリコサミノグリカンを単独も
しくは、変形として、ヘパリンに対する親和性を示す細
胞成長因子との組合せとして含有する。別の変形として
、グリコサミノグリカンと成長因子とは、予め結合させ
ることなく、同時に使用される。

本発明のグリコサミノグリカンの別の右利な使用態様に
よれば、ステロイドとの組合せとして、グリコサミノグ
リカンを使用する。

この医薬組成物は、細胞の分割及ぶ分化に対するその性
状に留意して、主に次の療法上の指示として主に使用す
ることができる。

−特に創傷性又は先天性の障害の後の筋肉組織、血管性
の障害例えば梗塞の後の心臓Ｍ１織、並びに、特に創傷
性の障害の後の皮膚Ｍ１織の修傷の刺激。

一創傷性の障害の後の巌痕化の促進。

−糖尿病の網膜病、胚子の増殖、乾衝のように、新しい
血管の形成が病的である過程の、単独での、又はステロ
イドとの組合せによる禁止。

本発明による薬理学的組成物は、いろいろな形態で投与
することができる。

グリコサミノグリカンが単独で有効成分の構成に用いら
れる場合には、これらの薬理学的形態は、水和物であっ
てもよく、有効成分が成長因子を含む場合には無水物で
あってもよい。有効成分は、投与単位について１〜２０
０ＩＬｇ、有利には２５〜１００ＩＬｇの割合、で存在
させる。

経口投与の場合には、特にゼラチンカプセル、錠剤、ト
ローチ剤、火剤、リポソームを使用する。これらの調製
物は、有利には、■投与単位当り５０＋ｅｇ〜５ｇ、好
ましくは、ゼラチンカプセル、錠剤及び火剤の場合には
、５０〜２５０＋＊ｇを含有している。

本発明の他の投与形態は、スプレー、ポマード、クリー
ム又はエーロゾルによって形成され、有効成分の濃度は
、０．５〜１０％のオーダーである。

右利には、本発明の生成物は、無菌の溶液又は無菌とす
ることの可能な溶液中の静脈、皮膚又は筋肉を経て注射
しうる薬理学的組成物の形で投与される。

有利には、本発明による生成物は、特に外用薬として使
用する調製物において成長因子との組合せにおいて使用
される。

静脈、皮膚又は筋肉を経て注入するために使用される溶
液は、それが皮下注射に用いられる場合、好ましくは、
１０〜２５０ｍｇ／ｎＪ、好ましくは１０〜１００＋ａ
ｇ／−例えば１００ｍｇ／ｄｃｌ）グリコサミノグリカ
ン組成物を含有している。この溶液は、静脈注射される
場合又は潅流によって投り−される場合は、例えばｌ　
Ｏｍｇ　〜５００ｍｇ、特に１５０ｍｇ／−のグリコサ
ミノグリカンを含有していてもよい。

前記の医薬調製物は、右利には、いつでも使用できる状
態とした、使い捨て注射器に入れて供給してもよい。

以下に、ヒトに対して適用しうるＪ１目を例について説
明する。これは、■［１に３０〜５００ｍ１ｇを１回又
は何回かで皮下注射又は静脈注射によって患者に投与す
る場合の例である。潅流によって投り゛−可能な量を数
ｌＯ−としうることから、静脈注射によって、ｌ　Ｅ＋
約１５０ｍｇを注射する。この投ｑ−は一定の時間間隔
で不連続的に行なってもよいが、潅流によって連続的に
行なうこともできる。

この投ｊＪ−量は、予め行う分析の結果と患者の疾病の
状態と一般的な患者の健康状態との関数として、各々の
患者について調節されることは言うまでもない。

以」二に説明した医薬組成物は、患者にとって受入れ可
能な量に従って、ステロイド型の化合物を含有していて
もよい。

特に、ステロイドの量は、患者に対する投与量が１日当
り５＋＊ｇ／ｋｇを超過しないようにすることができる
。

別の組成物においては、この用量は過大である。しかし
この用量は、そのホルモン活性を失ったステロイド誘導
体の場合には高くすることができる。

本発明は、前述したグリコサミノグリカン組成物によっ
てその有効成分が形成される生物学的な薬剤にも関する
。これらの生物学的薬剤は、前記の例において説明した
技法を使用する試験において、特に、他の物質の抗腫瘍
性をＲ「究するだめの基準として使用することができる
。

本発明によるグリコサミノグリカンは、分離を可能とす
るためのアフィニティクロマトグラフィの支持体を与え
るように、常法に従って、不溶性ゲル又は慣用される他
の不溶性支持体もしくはマトリックスに固定させること
ができる。適切な支持体としては、セフアローズ（登録
商標）の下に市販されている多糖類特にアガロースと、
一般的に、アミノエチルセルロース、アミノエチルポリ
アクリルアミドもしくはアミノエチルアガロースのよう
なアミノエチル分枝を有する不溶性−親水性の支持体と
が例示される。グリコサミノグリカンは、次の反応式 に従って、シアノ水素化硼素ナトリウムの存在下に、例
えば塩基性水性媒体中において縮合により前記の支持体
上に固定される。

このようにして取得されたマトリックスは、カラム中に
仕込まれる。

前記の支持体又はマトリックス上に固定させた本発明に
よるグリコサミノグリカンを７ニオン性もしくはカチオ
ン性細胞成長因子と接触させることにより、細胞成長因
子を選択的に再保持することを可能とする手段が得られ
る。この固定されたグリコサミノグリカンは、細胞成長
因子を精製するか、もしくは、所定の媒質中のこれらの
因子の濃度を低減させるための配位子として使用するこ
とができる。

成長因子の分離は、有利には、次のようにして行なわれ
る。

一再保持すべき細胞成長因子を含有する溶液、又は粗抽
出物は、０．１〜０．６Ｍ　　ＮａＣＪｌのイオン強度
の低い緩衝液中において、ｐＨが中性まで、カラムによ
ってパーコレートされる。溶出液中に蛋白質がなくなる
まで、同じｌｓ衝析液よってカラムを洗浄する。マトリ
ックス」−に保持した細胞成長因子は、イオン強度が０
．８〜ｚＭＮａＣ０のｐ）ｌ中性の緩衝液によって直接
に、又は、０．８Ｍ〜２Ｍ　　ＮａＣＪｌの津続した勾
配のイオン強度によって溶離される。

成長因子は、直接に、生物学的環境から、又は、予め精
製操作に付した調製物から由来させることができる。

本発明のその他の特徴及び利点は、種々のグリコサミノ
グリカンの調製及び薬理学的な試験の成果についての以
下の詳細な説明によって一層明らかとなろう。

実１ Ａ　解」Ｌ合 ナトリウム塩型の注射可能なヘパリン５００ｇを温度１
８℃（濃度約１１容１４％）で、純水４５００−中に溶
解させた。

得られた溶液を強くかき混ぜ、濃Ｊｌｌ酸を添加して、
ｐＨを２．５に降下させた。木３００ｄ中に溶解させた
亜硝酸ナトリウム１５ｇを添加した（最終的に０．０４
３Ｍとする適量）。反応のｐＨを濃塩酸の添加によって
２．５に調節し、溶液の全容積は、ヘパリンの濃度がｌ
Ｏ容量％となるように、５０００−とした。４５分間反
応を行わせた。この時間が経過した後、反応溶液中に残
留する硝酸イオンの不在をアミド化沃化カリ含浸指示紙
によって確認した（ＮＯ２−イオンの存在で青−菫色に
発色する）。

硝酸イオンが検出された場合、指示紙上の反応がなくな
ってイオンが全く消失するまで反応を継続した。３〜４
分おきに検査を行なった。

検査の結果が陰性になったら、反応は終了したものとし
た。濃ソーダによって溶液の濃度をＩＯに高めた後、水
素化ホウ素ナトリウム５ｇを添加した。

１５時間溶液をかき混ぜないで保持した。

未反応の水素化ホウ素ナトリウムは、濃塩酸によってｐ
Ｈを３．０に低下させることによって分解した。１５分
間溶液をかき混ぜ状態に保持した後、濃ソーダによって
ｐＨを７．０に１１ｆ調節した。

反応生成物を回収するために、エタノール１０文を添加
し、４８時間放置し、混合物を傾瀉し、上澄み液を除去
した。

Ｂ　外画 沈殿物を、純水９文中に再溶解させた（ヘパリン出発物
質の重量基準で濃度５容埴％）。ｎ１化ナトリウム１０
０ｇを添加し、ｇ１１１酸によって、溶液のｐＨを３．
８に降下させた。純水によって容積を正確に１０１に調
節し、エタノール１０文を強くかき混ぜつつ添加した。

４８時間放置し、１鐙み液をサイホン作用によって除去
し、５ＮソーダによってＰ■を７．０に調節した。エタ
ノール１９文を添加し、更に４８時間放置した。Ｉ：ｍ
み液をサイホン作用によって分離し、沈殿物を回収し、
エタノールで洗浄し、破砕し、真空乾燥した。

これによって少糖類の混合物１２０ｇが得られた。

Ｃゲル−７濾過 得られた混合物６０ｇを０．５Ｍ　　ＮａＣｌ３００−
に溶解させ、ウルトロゲル（旧ｔｒｏｇｅｌ）ＡｃＡ２
０２　（登録商標）のカラムの塔頂に施した。０．５Ｍ
ＮａＣ文緩衝液によって、１時間１５００ｗＪの流量で
カラムを溶離処理した。

溶出液のＵＶ吸収２１４ｎｍが連続的に記録された。第
２図に示した溶離プロフィルが得られた。７フラクシヨ
ンを分離し、エタノール２容積によって沈殿させた。

これらのフラクションの特性は次の通りであった。

穴開類のフラクションのイオン交換の溶離プロフィルを
第３図に示す。この第３図において、保持時間は横ｆ４
１１に、溶出液中の生成物の量は縦軸に、それぞれプロ
ットされている。この測定には、ＮａＣ１勾配が０．５
〜１．５Ｍ、流量１％ｔ／分の、ファルマシア社製のカ
ラムモノ−Ｑ　（ｕ録商標）を使用した。波長２１０ｎ
ｍにおける吸収によって検出を行なった。この溶離プロ
フィルのチェックによって、フラクションの異質性が示
された。

ロイ（Ｒｏｙ）Ｒ、ロッゾ（Ｌｏｂｂ）及びジェームズ
（Ｊａｍｅｓ）　争Ｗ　、フｘ−／ト（Ｆｅｔｔ）　、
生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２３巻、２６号
、１９８４、ｐ６２９５〜６２９９の技法に従って、ウ
シの脳奨からアニオン性ＦＧＦを調製した。

セファロース４Ｂ（登録商標）３ｏＷＪ上にアニオン性
ＦＧＦ４５＋ｗｇを、Ｐ、Ｍ、カトリカサ（Ｃｕａｔｒ
ｅｃａｓａｓ）　、　Ｍ　、ウイルチｊ−／り（Ｗｉ　
１ｃｈｅｋ）及びＣ，Ｂ、アンフィンセン（Ａｎｆｉｎ
ｓｅｉ）、［ブロク、ナシゴナル、アカデミーサイエン
ス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）Ｊ　、　Ｕ、Ｓ、６
１　（１９６８）、６３６の技法に従って固定させた。

このようにして取得したＦＧＦ−セファロース（登録商
標）をカラム（２、５ｃｍＸ　６　、５ｃｍ）に装入し
、トリスＨＣす０．０１Ｍ　　ｐＨ７，４，０，２ＭＮ
ａＣ文緩衝液（以ド緩衝液Ｉと呼ぶ）中において平衡化
させた。

緩衝液ｌ６０−中に溶解させた穴開類フラクション３０
０ｍｇを、ＦＧＦセファロース（登録商標）のカラムに
施し、このＦＧＦセファロースを、１時間６０−の流量
で、緩衝液ｌ６００−で洗沖した。ＩＭＮａＣｕに調節
した緩衝液■によってカラムを最終的に溶離処理した。

少糖類物質を含有する溶出液１８Ｔａｌを回収し、純エ
タノノール１０８−を添加して沈殿させた。第４図に示
したイオン交換の溶離プロフィルを右する穴開類０．１
５＋ｅｇをこのようにして回収した。この生成物は、以
下の説明において、ＩＣ１６９６と呼ばれている。

第１図の穴開類のｕＣのＲＭＮ　（核磁気共鳴吸収）ス
ペクトルの特性を以下に示す。なお、６つの構成単位を
示すために、次の記号ＧＩ　Ｈ□Ｇ　２　　Ｈ２Ｇ　３
　　Ａ　Ｍ　３が用いられている。

この生成物の重水中温液中においてスペクトルを測定し
た（２５ＭＨ２）、シフトを測定するための基準：３−
（）リメチルシリル）プロピオン酪ナトリウムのＴＳＴ
塩。

ｐｐｍ　　標識　　　属性　　　　　　　　より−４１
）１′内な１＃］二８ｏ、５　５　　Ｈｔ＋■２のＣ−
２Ｎ−サルフェートグルコサミンノ、（のＣ−２８３，
３９ＡＭ　３（７）Ｃ−１無水マンニド−）ＬＪ、１．
＋（ＴＡ−１８８，９１１Ｈｌ　＋Ｈ２ａ−９ゲルコサ
ミントサル７　ｘ　　ｌ・−６−サ）Ｉ／フェート１７
）Ｃ−８ ７０，７１３ＡＭ３のｃ−ｅ　　　無水マンニトーノｔ
、ｅ−サＪＬ／　７　ｘ−ト基（７）Ｃ−Ｃ７７，８１
７ＡＭ　３１７）Ｃ−３無水マンニトールノ、％ｔ１−
３８２．０　１９　　ＡＭ　３　（７）Ｃ−５無水マン
ニトール基（Ｃ−５８５，８２１ＡＭｔ　（７）Ｃ−２
無水マンニトール）ｐｆ−２８７，５２３ＡＭ　ｓ　（
７）Ｃ−４無水マンニトールノ＾ｍ−４９８，６ ９９，２２７Ｈｌ　４２　（７）Ｃ−１グルコサミ７−
Ｎ−サＪｌｚ７．−１−基（７）Ｃ−１１０２，８ ｔｏｔ、ａ 本ヘパリンについてのこの分野においての匁１に対する
もの丈膚目１−ヱ 注射可能なヘパリンの別のロフトを使用して、実施例１
と同様に操作した。

少糖類混合物１１５ｇが最終的番こ得られた。実施例１
と同様の条件の下に、ゲル−濾過によって、この混合物
６０ｇを処理した。

回収したフラクションの特性を次表に示す。

フラクション２（中間圏〜六糖類）３００ｍｇをＦＧＦ
セファロース（登録商標）上のアフィニティクロマトグ
ラフィにかけた。生成物ＩＣ１９６７０，１１ｍｇが最
終的に得られた。

穴開類フラクション３００ｍｇをＦＧＦ−セファロース
（登録商標）上の７フイニテイクロマトグラフイにかけ
た。第４図に示したものに対応するイオン交換勾配の溶
離プロフィルを有する生成物０．２２＋＊ｇがこのよう
にして得られた。

実［ 穴開類のフラクション３の１．５ｇを、０．４ＭＮａＣ
９，緩衝液によって平衡させたセファロース（登録商標
）のアニオン交換カラム（１７０１Ｎ！、２．５Ｘ３５
ｃｍ）に施した。

溶出液中の少糖類物質が消失するまで、０．６Ｍ緩衝液
によってカラムを洗浄した（洗浄量、３．５ｕ）。洗浄
の際に回収された、吸着されなかった少糖類は、アニオ
ンＦＧＦに対する親和力のない生成物に対応するもので
あった（以下Ｐ３８ＥＸＨ１３と呼ばレル）。

次にカラムをＩＭＮａＣＪｌ緩衝液によって溶出処理し
、少糖類を含有する溶出液１２０＠ｌを回収し、エタノ
ール７２０−を添加することによって沈殿させた。

このようにして、第５図に示したものに対応するイオン
交換クロマトグラフィ溶離プロフィルを有する生成物８
０ｔａｇが得られた。

支廠Ａ−」 −ＦＧＦカチオンーセファロース（登録商標）上の７フ
イニテイクロマトグラフイによる強アニオン性六糖類の
分離方法 ウシの脳奨のカチオン性ＦＧＦの調製とこのカチオン性
ＦＧＦのセファロース（登録商標）」−の固定とを、ア
ニオン性ＦＧＦについて前述した技法と同様の技法に従
って行なった。

ＦＧＦカチオン−セファロース（登録商標）ｌＯｗＪを
含有するカラム（１、６ｃｍＸ５ｃｍ）’　（セファｏ
−スＩＪ当’Ｊカチオン性ＦＧＦｌ　、５ｍｇ）を、緩
衝液■によって平衡させた。

緩衝液Ｉ２０−中に溶解させた穴開類１００ｍｇ（実施
例１に従って取得）を、カラムに施した。カラムを緩衝
液Ｉ　２００−によって洗浄し、２Ｍ　　ＮａＣ１によ
って調節した緩衝液工によって溶出処理した。

少糖類物質を含有する溶出液ｌＯ−を回収し、純エタノ
ール５０−を添加して沈殿させた。

第４図に示したものに対応するイオン交換溶離プロフィ
ルを有する穴開類０．０５０腸ｇが、このようにして回
収された。

支廠Ｕ −木発明による少糖類を含有する解重合混合物の調製の
変形 ゛　・　のノ　ヒによるＩ　　の 純水２００ｗＪ中にヘパリンｌＯｇを溶解させた。

最終モル値を０．２５Ｍとするに足る量（１０，７ｇ）
のメタ過沃素酸ナトリウムを添加し、５Ｎ　　ＨＣＩに
よって溶液のｐＨを３．０に降下させた。

次に溶液を４８時間暗所で２５°Ｃで放置した。

５ＮソーダによってｐＨを７とし、純エタノール３００
ｗＪを添加した。生成した沈殿物を回収し、破砕し、エ
タノール及びアセトンで洗浄した後、６０℃で真空乾燥
した。

沈殿物を、１ｗＪ中に水素化ホウ素ナトリウム２ｍｇを
含有する０、２Ｎソーダ１２０−中に再溶解させた。周
囲温度で１５時間溶液を撹拌した。

５Ｎ　　ＨＣ文によってｐＨを４に調節した後、５Ｎソ
ーダによって更にｐＨを７に調節した。次に純エタノー
ル２００−を添加した。

生成した沈殿物を遠心分離し、破砕し、エタノール及び
アセトンで洗浄し、６０℃で真空乾燥した。

このようにして、少糖類混合物６．４ｇが得られた。こ
の混合物を、実施例１の条件の下に、ウルトロゲルＡｃ
Ａ２０２　（登録商標）上のゲル−濾過工程にかけた。

ヘパリナーゼ　　ヘパリ　　−ゼ ヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼをフラボバクテリウム
ｅへパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｈｅｐ
ａｒｉｎｕｍ）カラ抽出し、Ｐ、ｈピング（ＨＯＶＩＮ
ＧＨ）及びＡ、リンカ−（Ｌ　ＩＮＫＥＲ）、Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗａ、第４５巻、２２号、１９７０年
、ｐ６１７０−６１７５に記載された技法に従って精製
した。

一ヘバリナーゼによる ヘパリン１０ｇを、０．１Ｍ、ｐＨ７，０の酢酸塩と０
　、０１Ｍｃ７）ＣａｃＪｌｊ２との緩衝液５００−中
に溶解させた。

この溶液を、３０℃の麦芽エキス浴中に加え、純ヘパリ
ナーゼ２．５ｍｇを添加した。

２４時間３０℃でインキュベートした。純エタノール１
２００−を添加した。

生成した沈殿物を遠心分離によって回収し、エタノール
によって洗浄し、６０℃で真空乾燥した。

少糖類混合物７．１ｇが取得され、このものは、実施例
１の条件の下に、最終的に、ウルトロゲルＡｃＡ２０２
　（登録商標）上でゲル−濾過にかけられた。

−へパリチナーゼによる　１丁− ヘパリンｌｏｇを、Ｏ、ＩＭ、　ｐｌ＋７　、０の酢酸
塩及び０．０１ＭＣａＣ見２の緩衝液５０〇−中に溶解
させた。

この溶液を４０℃の麦芽エキス浴に加え、純ヘパリチナ
ーゼ５ｍｇを加えた。１０時間４０℃でインキュベート
した後、純ヘパリチナーゼ３■ｇを加えた。更に６時間
インキュベートし、更に３■ｇのへパリチナーゼを加え
た。この最後の添加後１０時間しぞから、エタノール１
２００−を加えて、反応生成物を沈殿させた。

生成した沈殿物を遠心分離によって回収し、エタノール
で洗浄し、６０℃で真空乾燥した。

少糖類混合物６．８ｇが取得され、このものは、実施例
１の条件の下に、ウルトロゲルＡｃＡ２０２（登録商標
）上において最終的にゲル濾過にかけられた。

丈ｊｉＪＬＷ −ＦＧＦ−セファロース（登録商標）上のアフィニティ
クロマトグラフィによるアニオン性ＦＧＦに対する親和
性の高いへ糖類の調製実施例１Ｄに記載したようにして
、クロマトグラフィカラムを調製した。

実施例１のようにして得たへ糖類のフラクション３００
−を、ＦＧＦ−セファロース（登録商標）のカラムに施
した。このカラムを、１時間６０−の流量で、緩衝液ｌ
６００−で洗浄した。

１ＭＮａｃ見に調節した緩衝液Ｉによってカラムを最終
的に溶離処理した。

少糖類物質を含有する溶出液２０−を回収し、純エタノ
ール１２０−を添加することによって沈殿させた。第６
図に示したイオン交換溶離プロフィルを有するへ糖類の
混合物０．２６ｇを回収した。

得られたへ糖類混合物に対する２５ＭＨｚの重水中１３
ＣＲＭＮスペクトルを第７図に示す。

丈膚Ｉ（−１ 実施例ＩＤに記載したようにしてクロマＩ・グラフィカ
ラムを作成した。

緩衝液ｌ６０−中に溶解させた、実施例１のようにして
得た十糖類フラクション３００＋ｅｇを、ＦＧＦ−セフ
ァロース（登録商標）のカラムに施し、このカラムを１
時間６０−の流量で緩衝液ｌ６００−によって洗浄した
。１ＭＮａＣ９，に調製した緩衝液Ｉによってカラムを
最終的に溶―処理した。

少糖類物質を含有する溶出液２６−を、純エタノール１
６０−の添加によって回収した。第８図に示したイオン
交換溶離プロフィルをイ１する１−糖類混合物０．３８
ｍｇがこのようにして回収された。

得られた十糖類混合物についての２５ＭＩＩｚの利水中
”ＣＲＭＮスペクトルを第９図に示す。

裏溝」〔一旦一 ゲルー濾過王程Ｃを行なわないことを除いて、実施例１
と同様に操作した。

前出の表に示した二糖類、四糖類、穴開類、へ糖類、十
糖類、ｍ：糖類及び十四糖類を含有する混合物について
、ＦＧＦセファロース（登録商標）」−のアフィニティ
クロマトグラフィを行なった。

このクロブトグラフィ処理によって、ＦＧＦに対する親
和性を備えた混合物の鎖を分離することができた。

実Ｕ 実施例１によるヘパリンの最初の解重合の際の水素化ホ
ウ素ナトリウムによる還元工程を行なわないことを除い
て、実施例３に記載した技法に従って、穴開類１２０ｍ
ｇを調製した。

この穴開類１２０ｍｇを、０．５Ｍ　　ＮａＣ１１００
ｍ／中に溶解させた（炉温させたマトリックスｌ−当リ
アミノエチル、Ｊ、（約８にモルを含有する）、セファ
ロース（登録商標）−アミノエチル５０Ｗ＆ｌとシアン
水素化ホウ素すＩ・リウム５０ｍｇとを添加した。溶液
のｐＨを５Ｎソーダによって１１に調節し、１０時間周
囲温度に、緩和な撹拌下で、保持した。

次にマトリックスをブッフナーン戸≧１−１−で７濾過
し、０．５Ｍ　　ｐＨ７ＮａＣＪＬ溶液１ｇ、、１Ｏ−
３Ｎ塩酸１１Ｌ及びＬＭ、ｐＨ１０，０のＮａＣｕ５０
０−にてこの順序で洗浄し、最後に蒸留水１１にて洗浄
した。

マトリックス５−を取出し、２ＮＪＩＪ酸中にて１００
℃３時間加水分解した。加水分解生成物中のウロン酸の
量によって、最終的に得られたマＩ・リックスがセファ
ロース（登録商標）ｌｄ当りノ（役結合六糖類２ｍｇを
含有していることが小された。

直径２．５ｃｍ、高さ８０履のカラムに、セファロース
（登録商標）−穴開類マＩ・リックス４〇−を装入した
。

トリスＨＣ文、０．０２Ｍ、ｐＨ７，０，０，３ＭＮａ
Ｃ文緩衝液（緩衝液Ｉ）によってカラムを平衡化させた
。

（Ｒ、Ｒ、ロブ（Ｌｏｂｂ）及びＪ　、Ｗ、フェット（
Ｆｅｔｔ）、［生化学（ＢｉｏｃｈｅｍＳｔｒｙ）Ｊ　
、第２３巻、２６号、１９８４、Ｐ６２９５〜６２９９
の技法に従って調製した）ウシの脳奨のアニオン性ＦＧ
Ｆ２ＩＩ１ｇを、緩衝液１１０−中に溶解させ、カラ１
１を経てパーコレートさせ、次にこのカラムを同じ緩衝
液Ｉ　　１２０−にて洗浄した。

次に、緩衝液■　２００−とトリス−ＨＣ文０．０２Ｍ
、ｐＨ７，０，２ＭＮａＣｕ緩衝液２００−との漸進的
な混合によって得られる直線的な勾配によって、カラム
を溶離処理した。

アニオン性ＦＧＦのピークは、約０．７Ｍのイオン強度
でカラムから現出され、収率９５％で回収された。

支施箸」」 実施例１によるヘパリンの最初の解重合の際に四水素化
ホウ酸塩で還元する工程を行なわないことを除いて、実
施例７と同様の技υ、に従って、十糖類１０＋ｇを調製
した。

この十糖類１０ｍｇを蒸留水２０１ｇに溶解させた。（
ｌ−中にアミノエチル基ＢｐＬモルを含有する）セファ
ロース（登録商標）−７ミノエチル５−とシアノ水素化
ホウ素すトリウム５ｍｇとを添加した。５Ｎソーダによ
って懸濁体のｐＨを１１に調節し、１週間周囲温度に緩
和な撹拌ドに保持した。

次にセファロース（登録商標）のマｉ・リックスをブッ
フナー７戸用」二において７濾過し、０．５Ｍ、　ｐＨ
７（７）Ｎ　ａ　Ｃｌ溶液１００−１１０−３ＮｆｌＪ
酸１００−及び２Ｍ　　ＮａＣｕ１００−によッテコの
順序で洗浄し、最後に蒸留水２００−によって洗浄した
。

マトリックスｌ−を取出して２ＮＪ１！酸５ｗＪ中にて
３時間加水分解した。加水分解生成物中ウロン酸の量か
ら、取得されたマトリックスが共役結合された十糖類を
セファロース（登録商標）ｌ−中に１．８＋ｗｇ含有し
ていることが示された。

直径ｌｅａ、高さ５ｃｍのカラム中に、セファロース（
登録商標）−十糖類４−を装入した。トリス−ＨＣ文　
０．０２Ｍ　　ｐＨ７，００，６ＭＮａＣ９，緩衝液（
緩衝液■）によってカラムを平衡化させた。実施例１に
示した技法と同一の技法によって調製したウシ脳奨カチ
オン性ＦＧＦ緩衝液ＩＩを２ｄ中に０．２−ｇ溶解させ
た溶液をカラムの塔頂に施した。緩衝液１１４０−によ
ってカラムを洗浄した。最後に、トリスＨＣ文　０．０
２ＭｐＨ７，０，２Ｍ　　ＮａＣ１緩衝液によッテカラ
ムを最終的に溶離処理した。アニオン性ＦＧＦは、狭い
ピークの形で溶出された。溶出液中の検Ｉｌｌ　ｌｉは
、０．１８ｍｇであり、これは収率９０％に和島する値
であった。

欠庭血ユ」 実施例１の変形例として、解重合の工程を、過沃素酸塩
による酸化によって次のように行なった。

１／−ｆｆｌ　　　　によるヘパリン　のコデックス（
Ｃｏｄｅｘ）投薬量中滴定値１５７ｕＩ／ｍｇ、イン（
Ｙｉｎ）等の抗因子Ｘａの投薬Ｉ１１中滴定値ｔ５５ｕ
／ｍｇのナトリウム用形のブロク筋肉にｆＥ入可能なヘ
パリン１０ｇを４°Ｃの純水２５〇−中に溶解させた。

濃塩酸によって溶液のｐｌ＋を５．０に調節した。４°
Ｃの純水２５〇−中メタ過沃素酸ナトリウム（ＮａＩＯ
４，分子ｊ、１２１３　、８９　）１０ｇ溶液を、緩和
な撹拌のドに添加した。濃塩酸を添加して溶液のｐｉを
５．０に調節した。

＋４℃の低温の暗室中に２４　ｎ！ｒ間溶油溶液置した
。

２／−゛　−′　　　　の　、ノ二 ３つの透析管Ｎ０ＪＡＸ４０（登録商標）（多孔率、３
−４０００Ｄａ）中に反応溶液を分配し、純水流に対し
て１５時間透析にかけた。

３／−１友１媒亘車り邂皿治 透析によって得た溶液７８０−にｌＯＮソータ１６ｓｔ
／を添加し、（１８〜２１’Ｏ程度の）周囲温度で３時
間全体を撹拌した。

必要ならば、この工程に続いて還元上程を次のように行
なう。

水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４，分子量３７．８
３）５００＋ｗｇを次に添加し、得られた溶液を４時間
周囲温度で再び撹拌する。次に濃塩酸でｐＨを４にする
。１５時間撹拌した後に濃ソーダでｐＨを７に調節する
。

得られた溶液８２０ｗＪに、ＮａＣｕ１６．４ｇとエタ
ノール１２７０ｓ／とをこの順序で添加する。

全体を３時間静置した後２５０　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０
分間遠心分離にかける。

沈殿物を回収し、純２０〇−中に懸濁させ、ウルトラ−
タラ（登録商標）によって破砕し、焙焼ブフナーか斗に
よるか過によって最終的に回収する。

次に沈殿物を５時間４０℃で真空乾燥した６次の性状の
中間体８．９ｇがこのようにして回収された。

コデックスの量　　８ｕｌ／ｍｇ ＡＰＴＴの量　　　７ｕｌ／ｍｇ 抗Ｘａのｉｔ　　　　　８ｕ／ｍｇ 得られた鎖混合物を実施例１に記載したようにしてゲル
１濾過にかけた。

支凰孤」」 一毒性 ＩＣ１６９６，１７０１，１７０２を、静脈注射及び皮
下注射によって１５１１間マウスに投り−０したところ
、毒性は全く認められなかった。２つのケースにおいて
、ＬＤ、は、２ｇ／ｋｇよりも高い値を示した。

■ Ａ、モデルの説明 細胞ＬＥＩＩ（マウスの肺の内皮細胞）を、融合の％ま
で、子ウシの血清１０％の存在下に、２４ピツトの板に
おいて培養した。

これらの細胞を血清のみ０，２％中に４８時間保持し、
静置した。

次に、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）又は試験さ
れる少糖類フラグメント又はこれらの両方（ＦＧＦ十被
験生成物）を媒質に添加した。

次に培養物を２４時間保持し、トリチウム標識チミジン
を実験終了前４時間目に添加した。

実現された放射能を次にカウントした。各々の測定を３
回ずつ行なった。

Ｂ６級速 結果は、次の各図に示されている。

第１Ｏ図−アニオン性ＦＧＦのみの存在においての用！
ｊコニ−答曲線 刺激の高原は、５ｎｇ／−の用量について１２６、ＯＯ
Ｏｃｐｍのところにある。以下の各図においてアニオン
性ＦＧＦのみの存在において最大の刺激は、破線によっ
て示されている。

曲線Δ□Δはグリコサミノグリカンのみが用いられた場
合に得られる結果を、また曲線・□・はグリコサミノグ
リカンを７ニオン性ＦＧＦと共に使用した場合に得られ
る結果をそれぞれ示している。

第１１図は、穴開類ＩＣ１６９６のみを、又はアニオン
性ＦＧＦ　（５ｎｇ／ｄ）をも存在させた場合の用量一
応答曲線であ□る。

ＩＣ１６９６が培養物の媒質ｌ−当り０．０８〜５０Ｉ
Ｌｇの用量依存活性を示すことが確められる。

アニオン性ＦＧＦとの関係において、１０ＩＬｇ／ｌｓ
ｇから、ＦＧＦのみの活性に比較して活性が高くなるこ
とも確められる。

実験条件及び細胞系において、ＩＣ１６９６は、アニオ
ン性ＦＧＦの活性を強化する。

第１２図−穴開類ＩＣ１６９７のみを、又はアニオン性
ＦＧＦも存在（５ｎｇ／　ｗｌ　）させたときの用量一
応答曲線。

単独で使用されたＩＣ１６９７は、０．０４〜５０ＩＬ
ｇ／−の範囲の用量依存活性を示す。

モデルの実験条件においてアニオン性ＦＧＦと共に使用
した場合のＩＣ１６９７は、０．４１Ｌｇ／−から確実
に強化作用を発揮する。

第１３図−アニオン性ＦＧＦに対する活性を示さない比
較生成物の存在下で、六糖類Ｐ３８ＥＸＨ１３を単独で
か又はアニオン性ＦＧＦ（５ｎｇ／　ｍｌ　）と共に用
いた場合の用量一応答曲線。

比較用として用いたフラグメントは、単独で用いた場合
、顕著な活性を示さなかった。

結論として、この実験モデル（血清なしに静置した細胞
）の場合の、ＦＧＦに対して親和性を示す少糖類の効果
は、刺激効果（糸状体生成効果）である。

ウシの大動脈内皮細胞を、子ウシの血清１０％を含む変
性イーグル培地において、（３５■四方当り細胞２０，
０００個の）低密度で培養した。

細胞を４日間培地に保持し、Ｊ、０日及びＪ＋２日に、
濃度ａ　、　６ｕｇ／　ｉｌ文の塩基性ＦＧＦ溶液１０
ＩＬ愛を添加した。

更にＪ、０日に種々の濃度の被検少糖類を培香物に添加
した（ただし、成るＪｉ’％養物に香物添加しなかった
）。４日後に、クールテ粒子−カウンターを用いて細胞
の数をカウントした。

被検生成物を受けなかったＪン〜香物との比較による細
胞の増殖の抑制率（ｊ′１分率）によって結果を表わし
た。またヘパリンについての試験も比較として行なった
。

この結果は次の通りであった。

この結果は、ＤＥ５０、即ち、ＦＧＦを含有しない細胞
において得られる細胞の増殖を５０％抑制するために必
要な生成物の１１１として表わした。

被検生成物　　　　　　　　ＤＥ５０ ＩＣ１６９６１，ｓ−ｇ／ｍ１ ＩＣ１７０１１，８ｕ、ｇ／ＷＪ ＩＣ１７０２４０ｕ、ｇ／ａ／ ヘパリン　　　　　　　１．ＩＬｇ／ｍ／比較のため、
硝酸による解東合の後にゲル濾過及びイオン交換クロマ
トグラフィを行なうことによって得た通常の四糖類及び
＝ユ糖類の活性にっいても試験した。ＦＧＦに対する親
和性をもたないこれらの生成物が使用されたモデルにお
いて全く抑制作用を示さないことが確められた。

その反対に、ＩＣ１６９Ｂ及びＩＣ１７０１は、ヘパリ
ンとほぼ同じ活性を示し、ＩＣ１７０２は最も強い活性
を示した。

釆 へそ静脈の内皮細胞の１次培養物を、ジャラフ（Ｊａｎ
ｅ）の方法（Ｊ、　Ｇ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　１９
７３．５２゜２７４５）に従って調製した。融合の時（
５−７日）に、トリズシンーＥＤＴＡ混合物によって細
胞をはがした。これらの細胞は、子ウシの血清（ＳＶＦ
）２０％を添加した培地１９９中において５０００細胞
／ｄの密度で、２４ビツトのファルコン板（フィブロネ
クチンを予め５ＩＬｇ／ｃ重量被覆する）−にに注入し
た。

２４時間後に、５ＶＦＩＯ％を添加した培地１９９に培
地を交換し、グリコサミノグリカンを単独にか又は酸性
ＦＧＦ　（ＦＧＦａ）と共に添加した。４８時間後に成
長因ｆを＋ｌｆび添加した。

４日間培養した後、トリプシン−ＥＤＴＡ混合物によっ
て細胞をはがし、細胞カウンター（クールトロニクス社
のクールターカウンター、登録商標）を用いて細胞数を
カウントした。ｉｌ　４Ａ〜Ｄ図の各々の実験曲線は、
３回ずつ行なった１つの実験形式を示している。各々の
実験は、２〜３回繰返して行なった。

第１４Ａ−Ｄ図において、破線は、ＦＧＦａも少糖類も
含有せず５ＶＦｌ　０％を含有するＪｊ’ｊ養物に香物
ての基本的な増殖を表わしている。

曲線・−・−・は、ＦＧＦａのみを存在させた比較試験
の結果を表わしている。また曲線■□■□−及びム□ム
□ムは、ヘパリ ンｌ終ｇ／−及び５＃Ｌｇ／−又は少糖類１０ｇｇ／−
及び５０＃１．ｇ／−の濃瓜に組合わされたＦＧＦａの
存在下に得られた結果をそれぞれ表わしている。

木発明者らの実験条件のドでは、少糖類と組合せられて
いないＦＧＦａは、濃度ｌＯ％のＳＶＦのみに比較して
最大で細胞数の２３０％の増加をひき起こし、ＤＥ５０
は、７　ｎｇ／−である。なおりＥ５０は、ＦＧＦａ５
０〜１１００ｎ／−によって得た最大増殖に対する増殖
５０％を定めたＦ　Ｇ　Ｆ　ａ　（ｎｇ／＋＋Ｊ）の濃
度を意味する。

紋型 標準のヘパリン出発物質との比較において少糖類の効果
を点検した（ロッ）　９１４１６）。

ヘパリンは、選定された実験条件の下において、ＦＧＦ
　ａの効果を強化する。この強化作用は、ヘパリン濃度
２００　ｎｇ／−において開始され、ヘパリン濃度２５
ＩＬｇ／−において最大となる。ヘパリン濃度ｌＩＬｇ
／−は、ＦＧＦａのＤＥ５０をｌ／１０に減少させる（
第１４Ａ図）。被検少糖類が使用した実験条件に従って
種々の効果を示すことが確められた。

１　／　−Ｆ　Ｇ　Ｆ　ａが存在しない場合には、ｌ〜
ｌ１００ＩＬ／−の濃度において、少糖類は、内皮細胞
の成長を抑制する（次表参照）。

２　／　−Ｆ　Ｇ　Ｆ　ａ　ｔ７）濃度が、ＤＥ５０（
７＋＋ｇ／−）よりも高くなった場合、細胞の成長に対
する少糖類の刺激効果のあることが確められる（第１４
Ｂ−Ｄ図）。この効果のため、ヘパリンの濃度よりも少
糖類の濃度を＾“ｂ　くすることが必要となる。最も活
性の生成物は、十糖類ＩＣ１７０２であるＣＣ７０ｐ−
／ｍｌにおい−ＣＤＥ５０は３．２ｇ　ｇ、／ＷＪｋ−
ｔｉ％下ｔル）　、　穴開類ＩＣ１６９６は、細胞成長
に対する刺激効果が非常に低い。

ＦＧＦａの強化作用は、成長因子に対する少糖類の親和
性との良好な相関関係にある。

結論として、実際に行なった試験によって、少糖類の２
つの効果、即ち、血清の存在及びＦＡＦａの不在におい
ての抑制効果と、少糖類が親和性を示す成長因子の存在
においての刺激効果とが明らかにされる。これは、細胞
の成長に対するグリコサミノグリカンの調整剤としての
役割を示している。抑制効果は生体内の抗血管形成作用
を試みることを可能にする。刺激作用と成長因子との結
合は、成長因子の安定化及び強化又は組織の修傷の刺激
のために、この生成物の利用を試みることをｔｒ（能に
する。

穴開類Ｉ　Ｃ１６９６の活性を、Ｊ、フォルクマン（Ｆ
ｏｌｋＩｌａｎ）等によって適合された抗盲管形成モデ
ル［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　　ｌ　９８３
．２２１．７１９）に対して試験した。含浸ポリマーの
移植の代りに被検生成物を静脈注射した。

等張力塩化物溶液中入糖類ＩＣ１６９６溶液１０　ｍｇ
／　ｋｇ　（ステロイドと組合されていてもいなくても
よい）の２注射量をウサギに毎日静脈注射した。

ＩＣ１６９６によって処置した動物に４３いては、等張
力のｎ１化物溶質のみを受けた動物の場合に比べて実質
的に少ない面省形成が確められている。特にＩＣ１６９
６によって処置したウサギの場合には、２次的な血管形
成作用は非常に少くなる。

同一のモデルを使用した最初の試験において、ＩＣ１６
９６のみは、抗血管形成作用の抑制効果を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、強アニオン性の穴開類の１３ＣのＲＭＮスペ
クトルを示す線図、第２図は、硝酸解重合混合物のゲル
−濾過に対応する溶−プロフィルを示す線図、第３図は
、イオン交換の際にゲルー濾過］二程において回収され
た穴開類フラクションの溶離プロフィルを示す線図、第
４図は、ＦＧＦ−セファロース−ににクロマトグラフィ
によって単離された穴開類のイオン交換溶離プロフィル
を示す線図、第５図は、アニオン交換力ラム１−のクロ
マトグラフィによって得た穴開類のイオン交換クロマ）
・グラフィ溶離プロフィルを示す線図、第６図は、へ糖
類混合物のイオン交換前Ｍプロフィルを示す線図、第７
図は、このへ糖類７Ｉシ合物のＩ３ＣのＲＭＮスペクト
ルを示す線図、第８図は、−１・糖類混合物のイオン交
換溶離プロフィルを示す線図、第９図は、この十糖類混
合物の１３　ＣのＲＭＮスペクトルを示す線図、第１０
〜１３図は、アニオン性ＦＧＦ、穴開類（単独でもアニ
オン性ＦＧＦと併用されてもよい）、別の穴開類（単独
でもアニオン性ＦＧＦと併用されてもよい）及びアニオ
ン性ＦＧＦに対する親和性のない比較生成物（単独でも
アニオン性ＦＧＦと併用されてもよい）についてそれぞ
れ得た被検生成物の使用１ａ　（ｎｇ）の関数としての
放射能ｃｐｓの曲線を示す線図、第１４Ａ−Ｄｅ＆、種
々の条件の下に１ｒ〜品したヒトの内皮細胞の増殖曲線
を示す線図である。 図面の浄書（ ＦＧＦａｌｎｇ／ｎｉｌ 内容に変更なし） ＩＦＧＦａ　（ｎｇ／ｍ１ｌ −「続有Ｉｌｊ丁１鼾ｔ（万代） 昭和６２年　２月　８１１ 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 １、本件の表示 昭和６２年特許願第　９２１２２号 ２、発明の名称 細胞の成長因子に親和性を示すヘパリン系少糖類３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　サ　ノ　フ　ィ ４、代理人 ５、補正命令の日刊　昭和６２年８月３０１１手系売７
市正書 昭和６２年９月　９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）鎖によって形成された生成物であり、 ヘパリンを認識するカチオン性もしくはアニオン性の細
   胞成長因子に対して特異的な親和性を示し、 第１図に示したＲＭＮスペクトルの特徴を表わす強アニ
   オン性を示し、天然ヘパリンに存在する単位に対応した
   ５つの単位の少くとも１つの連鎖を含むことを特徴とす
   る、 ヘパリン型又は硫酸ヘパラン型の少糖類、又は医薬とし
   て認容可能なその塩。 ２）基本的に鎖によって形成された生成物であり、 次式 I ： −（Ｇ−Ｈ）＿ｎ−Ｇ−又は−Ｈ−（Ｇ−Ｈ）＿ｎ（
   I ）で示される糖類の単位の連鎖を有する、 式中、ｎは２〜６の数を表し、 Ｇ−Ｈは、（イズロン酸・２−Ｏ−サルフェート）−（
   Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サルフェート６−Ｏ−サルフ
   ェート）の構造の二糖類の鎖状構造に対応し Ｇは、Ｌ−イズロン酸・２−サルフェートの構造の単位
   を表わし、 Ｈは、Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サルフェート・６−Ｏ
   −サルフェートの構造の単位を表わし、 ヘパリンを認識するカチオン又はアニオンの細胞成長因
   子に対して特異的な親和性を示すことを特徴とする、ヘ
   パリン型又は硫酸ヘパラン型の少糖類又は医薬として認
   容可能なその塩。 ３）二糖類の鎖状構造Ｇ−Ｈが次式II： ▲数式、化学式、表等があります▼II に対応し、式中、Ｂ＾＋は、生理学的に許容される塩を
   与える無機もしくは有機のカチオンを表わす特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の少糖類。 ４）次式III： Ｒ（ＧＨ）＿ｎＲ′（III） に対応し、式中、 Ｒは、水素原子を表わすか、又は、Ｇ−Ｈ型の二糖類の
   単位を表わし、ここに単位Ｇは、ヘパリン鎖に対応する
   単位に対して必要により化学的に変性されており、 Ｒ′は、水素原子を表わすか、又は、二糖類の単位Ｇ−
   Ｈを表わし、ここに単位Ｈは、ヘパリン鎖に対応する単
   位に対して必要により化学的に変性されており、 ここに、Ｒ及びＲ′は、変性された単位を含めた少糖類
   の糖単位の全数が多くとも１４に等しくなるような意味
   をもつことを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項の一
   に記載の少糖類。 ５）１位の不斉炭素又は４位にそれぞれ−ＯＨ基を有す
   る糖単位を非還元末端及び還元末端に有することを特徴
   とする特許請求の範囲第４項記載の少糖類。 ６）ヘパリン鎖の対応する単位に対して変性された形式
   の単位又は不活性の有機基を非還元末端及び／又は還元
   末端に有することを特徴とする特許請求の範囲第４項記
   載の少糖類。 ７）α，β不飽和ウロン単位を非還元末端に有し、そし
   て／又は、２，５−無水マンノ、好ましくは２，５−無
   水マンニトール又は２，５無水マンノン酸の構造単位を
   還元末端に有することを特徴とする特許請求の範囲第６
   項記載の少糖類。 ８）６個の糖単位を含む鎖によって形成され、還元末端
   又は非還元末端にある終単位が必要に応じて化学的に変
   性されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の少糖類。 ９）第１図に示したＲＭＮスペクトルに対応するヘパリ
   ン認識細胞成長因子に対して親和性を示す六糖類。 １０）０．５Ｎ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ、６．０）によ
   って平衡させたアガロース−アクリルアミド４５ｌを含
   有する１００ｃｍ×２５ｃｍのカラム上においてヘパリ
   ンの硝酸解重合混合物のアルコール沈殿によって得た沈
   殿物６０ｇを、０．５Ｍ　ＮａＣｌ５００ｍｌ溶液中に
   溶かし、１時間１５００ｍｌの流量で溶離を行なって、
   ゲルろ過系中３２ｌ〜３６ｌの容積の間に溶離させたフ
   ラクションに対応するフラクション中に含まれる生成物
   に対応することと、 この生成物が、トリス−ＨＣｌ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．
   ４、０．２Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液によって平衡されたＦＧ
   Ｆアニオンセファロース（登録商標）３０ｍｌを含有す
   る２．５ｃｍ×６．５ｃｍのカラムを使用し、このカラ
   ム上に、前記と同じ緩衝液６０ｍｌ中に溶解させた前記
   フラクション３００ｍｇを施し、１Ｍ　ＮａＣｌに調節
   した緩衝液を用いて溶離し、エタノールを用いて回収し
   た該フラクションの少糖類を沈殿させて、ＦＧＦアニオ
   ンセファロース（登録商標）上にアフィニティクロマト
   グラフィによって分離されたものである ことを特徴とする六糖類。 １１）還元末端又は非還元末端に必要に応じて化学的に
   変性された８個の糖単位を含む鎖が形成されたことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の少糖類
   。 １２）０．５Ｎ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ、６．０）によ
   って平衡させたアガロース−アクリルアミド４５ｌを含
   有する１００ｃｍ×２５ｃｍのカラム上においてヘパリ
   ンの硝酸解重合混合物のアルコール沈殿によって得た沈
   殿物６０ｇを、０．５ＭＮａＣｌ５００ｍｌ溶液中に入
   れ、１時間１５００ｍｌの流量で溶離を行なって、ゲル
   ろ過系２８ｌ〜３２ｌの容量の間に溶離させたフラクシ
   ョンに対応するフラクション中に含まれる生成物に対応
   することと、 この生成物が、トリス−ＨＣｌ０．０１Ｍ、ｐＨ７．４
   、０．２Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液によって平衡された、ＦＧ
   Ｆアニオン−セファロース（登録商標）３０ｍｌを含有
   する２．５ｃｍ×６．５ｃｍのカラムを使用し、このカ
   ラム上に、前記と同じ緩衝液６０ｍｌ中に溶解させた前
   記フラクション３００ｍｇを施し、１Ｍ　ＮａＣｌに調
   節した緩衝液を用いて溶離し、エタノールを用いて回収
   した該フラクションの少糖類を沈殿させてＦＧＦアニオ
   ンセファロース（登録商標）上にアフィニティクロマト
   グラフィによって分離されたものである ことを特徴とする八糖類。 １３）還元末端又は非還元末端に必要に応じて化学的に
   変性された１０個の糖単位を含む鎖が形成されたことを
   特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の少糖
   類。 １４）特許請求の範囲第１１項に記載したゲルろ過系中
   ２５〜２８ｌの溶離容積に対応するフラクションに含ま
   れ、特許請求の範囲第１１項に示された条件の下にＦＧ
   Ｆ−セファロース（登録商標）上のアフィニティクロマ
   トグラフィによって分離されたことを特徴とする十糖類
   。 １５）還元末端又は非還元末端に必要に応じて化学的に
   変性された１２個の糖単位を含む鎖によって形成された
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   の少糖類。 １６）所定のイオン強度の緩衝液を使用してヘパリン型
   グリコサミングリカン調製物をアニオン性もしくはカチ
   オン性成長因子と接触させ、該成長因子に対して親和性
   を示さない鎖又は中庸の親和性を示す鎖を除去し、次に
   、該成長因子上に固定された糖類の鎖を回収することを
   特徴とする特許請求の範囲第１〜１５項の一に記載の少
   糖類を製造する方法。 １７）支持体上に固定されたアニオン性成長因子を使用
   することを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の製
   造方法。 １８）出発グリコサミノグリカン調製物が、ＡＴIIIに
   対する結合サイトをもった鎖を除去した調製物であり、
   自然のヘパリンもしくは硫酸ヘパランの鎖の混合物、こ
   れらの自然のヘパリンもしくは硫酸ヘパランの鎖の解重
   合フラグメント又は多くとも１４単位を含むフラグメン
   トもしくは鎖の混合物によって形成されることを特徴と
   する特許請求の範囲第１６項又は第１７項記載の製造方
   法。 １９）多くとも１４糖単位を含む鎖の混合物が、変性さ
   れた単位、特にα−β不飽和ウロン単位を還元末端に有
   するか、又は、特に２，５−無水マンノ単位を還元末端
   に有することを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載
   の製造方法。 ２０）セファロース（登録商標）のような支持体上に好
   ましくは固定されたアニオン性又はカチオン性成長因子
   を含むクロマトグラフィーカラムの塔頂に、グリコサミ
   ノグリカン調製物を入れ、該カラムは、ＮａＣｌ　０．
   ２Ｍの濃度に対応するイオン強度の衝撃液によって平衡
   させたことと、ＮａＣｌ　１Ｍ〜２Ｍの濃度に対応する
   イオン強度に該緩衝液を調節することによって、該カラ
   ム上に保持された少糖類のフラクションを溶離すること
   とを特徴とする特許請求の範囲第１６〜１９項の一に記
   載の製造方法。 ２１）成長因子に対するアフィニティクロマトグラフィ
   の作用を、グリコサミノグリカン出発調製物のゲルろ過
   とアルコール溶剤特にエタノールによる沈殿とによって
   得られるような、分子量について均質なグリコサミノグ
   リカンフラクションに対して実現させることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１６〜２０項の一に記載の製造方法
   。 ２２）特許請求の範囲第１６項によるグリコサミノグリ
   カン出発調製物を、第４アンモニウムのような強塩基性
   アニオン交換カラムによるイオン交換クロマトグラフィ
   に付し、ＮａＣｌ緩衝液のイオン強度の０．５±０．１
   Ｍ〜１−２Ｍの変動に対応する勾配に従って溶離緩衝液
   のイオン強度を変化させ、最も強アニオンのフラクショ
   ンを回収することを特徴とする特許請求の範囲第１〜１
   ５項の一に記載の少糖類の製造方法。 ２３）グリコサミノグリカン出発調製物が、ヘパリンの
   解重合及びそれに続くアルコール分別特にエタノール分
   別によって抗トロンビン活性を示す鎖と示さない鎖とに
   分離することによって得た調製物であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１６〜２２項の一に記載の製造方法
   。 ２４）特許請求の範囲第１〜１５項のいずれか１項記載
   の少くとも一の少糖類の有効量を薬学的な基剤と組合せ
   て有効成分中に含むことを特徴とする医薬組成物。 ２５）ヘパリン認識細胞成長因子に少糖類が組合された
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２４項記載の医薬組
   成物。 ２６）ヘパリン認識細胞成長因子と別に、しかしこれと
   同時に少糖類を利用することを特徴とする特許請求の範
   囲第２４項記載の医薬組成物。 ２７）ゼラチンカプセル、錠剤、トローチ、丸剤、リポ
   ソーム又はドリンクの形態にあり、１役与単位について
   有効成分を５０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは、ゼラチンカプ
   セル、錠剤及び丸剤の場合に５０〜２５０ｍｇを含有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２４〜２６項の一
   に記載の医薬組成物。 ２８）無水物であり、カチオン性もしくはアニオン性細
   胞成長因子を含有し、この成長因子は、凍結乾燥され、
   ２〜１００μｇ、好ましくは２５〜１００μｇの割合で
   存在することを特徴とする特許請求の範囲第２４〜２７
   項の一に記載の医薬組成物。 ２９）注射用溶液であり、この溶液は、１０〜２５０ｍ
   ｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌのグリコ
   サミノグリカンを含有し、例えば皮下注射用の場合は、
   １５０ｍｇ／ｍｌのグリコサミノグリカンを含有し、静
   脈注射又は灌流用の場合は、１０〜５００ｍｇ特に１５
   ０ｍｇ／ｍｌのグリコサミノグリカンを含有することを
   特徴とする特許請求の範囲第２４〜２７項の一に記載の
   医薬組成物。 ３０）スプレー、ポマード、クリームもしくはエーロゾ
   ルとして存在し、０．５〜１０％のオーダーの濃度でグ
   ルコサミノグリカンを含有することを特徴とする特許請
   求の範囲第２４〜２６項の一に記載の医薬組成物。 ３１）特許請求の範囲第１〜１５項の一に記載の少糖類
   を含有することを特徴とする培養中の細胞の成長調整剤
   。 ３２）特許請求の範囲第１〜１５％項の一に記載の少糖
   類から作製されることを特徴とする生物学的薬剤。