JPS6367662B2 - - Google Patents

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JPS6367662B2
JPS6367662B2 JP247681A JP247681A JPS6367662B2 JP S6367662 B2 JPS6367662 B2 JP S6367662B2 JP 247681 A JP247681 A JP 247681A JP 247681 A JP247681 A JP 247681A JP S6367662 B2 JPS6367662 B2 JP S6367662B2
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JP
Japan
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reaction
column
boric acid
sugars
sample
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JP247681A
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JPS57116256A (en
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Yasuo Ishida
Hirohisa Mikami
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Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
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Publication date
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/62Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74Optical detectors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は糖類の分析法に関する。更に詳しく
は、この発明は、糖類を含有する試料を液体クロ
マトグラフイーに付し、このカラム溶離液にモノ
エタノールアミン添加のホウ酸水溶液又はタウリ
ン添加のホウ酸緩衝液の反応試薬を加え、加熱反
応を行つた後冷却し、紫外線をあててその吸光度
を測定することにより糖類を定性または定量分析
することを特徴とする糖類の紫外線吸収分析法に
関する。
従来、液体クロマトグラフでの糖類の検出は示
差屈折計を用いて行われてきた。しかしこの示差
屈折計では傾斜溶離法を採用することができない
ので、生体試料のように多成分の糖類を含む試料
の分析が容易でなかつた。つまり、液体クロマト
グラフにおいて、溶媒の組成を連続的に変化させ
ることによつて糖類を溶離させても、通常各溶媒
の屈析率に大きな差があるから、溶媒の組成の変
化による屈折率の差が大きく影響して糖類の分析
はほとんど不可能であつた。更に示差屈折計はも
ともと感度が低く、微量の糖類の検出は難しいと
されてきた。
また、糖類に特定の反応試薬を反応させてそれ
自体蛍光を発しない糖類に蛍光を発生させ、その
蛍光光度を検出して糖類を分析する方法及び装置
の発明は知られている(特開昭55−70739号)。こ
こにおいて、この発明の発明者らはさらに研究を
重ね、糖類に特定の反応試薬を反応させそれ自体
実質的に紫外線を吸収しない糖類が強く紫外線を
吸収することを見出し、その糖類の分析を具体的
に行い得る方法を提供するものである。
この発明によれば、上記蛍光光度測定の場合と
比べて、高感度でかつ良好な直線性で糖類の分析
が可能であり、さらに従来広く使用されている紫
外線吸光光度計を流用することができるという利
点を有する。
この発明の方法を実施する分析装置の主要な構
成上の特徴の一つは、カラム溶離液と反応試薬と
の混合液が反応液流路を介して、加熱槽、次いで
冷却槽へ移動するよう構成されたことにあり、そ
れによつて反応を行わせて紫外線吸光光度分析を
可能にすると共に、液体クロマトグラフに傾斜溶
離法を採用することができるので、生体中の糖類
のごとき多成分の糖類を一度に高精度で分析でき
る。
この発明の方法を実施する分析装置のもう一つ
の構成上の特徴は、カラム溶離液と反応試薬の供
給から反応液の排出まで試料液の流れが、連続的
で且つ一過式であることにあり、これによつて高
速分析が可能になると共に完全自動化に好適とな
つている。
この発明に係る分析法で分析できる糖類として
は、例えばグルコース、マンノース、ガラクトー
ス、果糖、ラムノース、グルコサミン、グルクロ
ン酸等の単糖、マルトース、ラクトース、マルト
トリオース等のオリゴ多糖が挙げられ、あらゆる
還元糖に応用することができる。特に生体試料の
ように、これらの糖類を多成分含んでいるものの
分析に好適である。
この発明において用いられる糖類との反応試薬
としては例えばモノエタノールアミンやタウリン
のようなアルキルアミン誘導体を含む緩衝液が用
いられる。このうち、アルキルアミン誘導体とし
てはモノエタノールアミンを用い、これをホウ酸
溶液に溶解したものを用いた場合最も好ましい結
果を与える。この場合、試薬中のモノエタノール
アミンとホウ酸の濃度はそれぞれ0.5〜5.0%の範
囲であれば分析可能である。またカラム溶離液に
対する反応試薬の混合比は50〜75%の範囲が望ま
しい。反応は好ましくは140℃〜180℃で3〜5分
間行われる。反応後室温まで冷却してこれを紫外
線吸光光度計に導く。
以下図に示す実施例に基いてこの発明を詳述す
る。なお、これによつてこの発明が限定を受ける
ものではない。
第1図において、糖類の自動分析装置1は、高
速液体クロマトグラフ装置本体25と、そのカラ
ム2の溶離液管路3に延設された反応液管路9
と、この反応液管路に合流接続された反応試薬供
給管路4と、この合流接続部(混合部)5より後
段において前記反応液管路9が順に通過する加熱
槽6、冷却槽7および紫外線吸光光度計8と、反
応液管路9から更に延びる反応液排出管路10と
から主として構成されている。
前記反応試薬供給管路4は、ポンプ11及びダ
ンパー12を介設し、反応試薬としてモノエタノ
ールアミン添加のホウ酸水溶液を前記反応液管路
9に供給し、カラム溶離液と混合される。通常両
流路の合流接続部5には三方管路が用いられる。
前記加熱槽6は伝熱が良好なスズを加熱媒体と
して充填し、この加熱媒体中に熱源として電気ヒ
ータ17及び反応液管路9を挿通させている。こ
の反応液管路の挿通部13は所定長さでコイル状
に成形されている。なお、18は温度制御用感熱
体、19は内槽部、20は外槽部、21は両槽間
に充填された断熱材である。
前記冷却槽7は循環する冷却水を導入し、この
冷却水中に反応液管路9を挿通している。この反
応液管路の挿通部14も所定長さでコイル状に成
形されている。
前記紫外線吸光光度計8は、記録計16などが
付設され、また反応液排出管路10には抵抗管2
2が介設されている。
次に以上の構成からなる糖類の自動分析装置1
を用いた糖類の分析方法を説明する。
まず、予め反応試薬供給管路4のポンプ11お
よび高速液体クロマトグラフ装置本体25のポン
プ23を作動させて、モノエタノールアミン添加
のホウ酸水溶液からなる反応試薬と、カラム溶離
液とを反応液管路9に流入し、定常状態を維持す
る。次いで、本体注入部24から試料をカラム2
に注入すると試料はカラムで成分毎に分離され、
カラムから溶出して溶離液管路3を通じて反応液
管路9に入り、ここで反応試薬と混合され加熱槽
6において約5分間150℃に加熱されて反応し、
更に冷却槽7を通過することによつて室温まで冷
却される。この通過によつて試料成分(糖)は紫
外線吸収物質に変換され、紫外線吸光光度計8に
よつて濃度が検出される。
かくして糖類の分析が高感度で可能になる。更
に反応試薬にカラム溶離液を混合してから後は、
一過式に移動して排出される間に自動的に反応、
冷却、紫外線吸光光度測定などが行われるので、
完全自動化に好適である。もちろん途中において
移動を中断する個所もないので分析が高速度で行
える。
更に重要なことは、液体クロマトグラフにおい
て傾斜溶離法を採用することができるので、生体
中の糖類のごとき多成分の糖類を一度に高精度で
分析できる。
実験例 1 第1図の自動分析装置1を用いて次のような分
析結果を得た。
島津高速液体クロマトグラフLC―3A〔分析カ
ラム2は島津L.CカラムISA―07/S2504〕を用
い、移動相としてはA:0.2Mホウ酸水溶液(水
酸化カリウムにてPH8.0に調整)とB:0.45Mホ
ウ酸水溶液(水酸化カリウムにてPH=9.0に調整)
とをグラジエントプログラム:A/B、100/0
1%/分 ――――→40/6010%/分 ――――→0/100で用いた。そし
て流量は0.6ml/分で前記カラムに流した。但し
カラム温度は60℃であつた。
試料としてはA:セロビオース、B:マルトー
ス、C:ラクトース、D:ラムノース、E:リボ
ース、F:マンノース、G:フラクトース、H:
ガラクトース、I:キシロース及びJ:グルコー
スをそれぞれ0.5mg/ml含有の水溶液を30μカラ
ムに注入した。
また反応試薬として5.0%モノエタノールアミ
ン―3.0%ホウ酸水溶液を0.6ml/分の流量で用
い、反応温度は150℃で反応させた。また反応管
路部13は内径0.8mm長さ10mのものを用いた。
紫外線吸光光度計としては島津UVD―1型を
用い、さらに比較のために該紫外線吸光光度計8
と冷却槽7との間に島津FLD―1型蛍光光度計
を挿入して同時に蛍光光度を測定した〔励起光:
300〜400nl(最大360nm)、蛍光光度測定:EM―
4フイルター使用(約430nm以上透過)〕。なお両
者の感度のレンジは同一のX8とし、その測定結
果のチヤートを第2図(蛍光光度)及び第3図
(紫外線吸光光度)に示した。
その結果、紫外線吸光光度計は蛍光光度計の後
に接続したのでピークの巾は広くなつているにも
かかわらず各成分のピークの高さは紫外線吸光度
の方が高くて感度が高いことを示し、特にD:ラ
ムノース、G:フラクトース、H:ガラクトー
ス、I:キシロースは感度が高いことが分かる。
実験例 2 実験例1と同様に蛍光光度計と紫外線吸光光度
計とを直列に連結し、下記のような条件下で3つ
の糖類混合水溶液の分析を行つた。
分析条件 装 置:島津高速液体クロマトグラフLC
―3A 分析カラム:島津LCカラムPNH2―10/S2504 移 動 相:アセトニトリル70/水30 移動相流量:0.6ml/分 カラム温度:室温 蛍光光度計及び紫外線吸光光度計:島津FLD
―1及びUVD―1 但し両光度計の感度
レンジはそれぞれX2とX4。
試 料:K:グルコース、L:マルトー
ス、M:マルトトリオース 試料濃度:各約1μmol/ml 試料注入量:10μ 反応条件 反応試薬:5.0%モノエタノールアミン―
3.0%ホウ酸水溶液 反応温度:150℃ 反応管:内径0.8mm、長さ10m 反応試薬流量:0.6ml/分 蛍光光度及び紫外線吸光光度の測定結果を第4
図及び第5図に示した。この場合も紫外線吸光光
度測定の方が蛍光光度測定より明らかに感度が高
くかつその差は実施例1の場合よりも大きいこと
を示している。
実験例 3 実施例1と同様に蛍光光度計と紫外線吸光光度
計とを直列に連結し、試料としては濃度を変えた
グルコース水溶液(含有量0.4μg〜7μg)を用い
て下記条件で分析を行つた。
分析条件 装 置:島津高速液体クロマトグラフLC
―3A 分析カラム:島津LCカラムISA―07/S2504 移 動 相:0.5M―ホウ酸(水酸化カリウム
にてPH=9.5に調整) 移動相流量:0.5ml/分 カラム温度:60℃ 蛍光光度計及び紫外線吸光光度計:島津FLD
―1及びUVD―1 反応条件 反応試薬:5.0%モノエタノールアミン―
3.0%ホウ酸水溶液 反応温度:150℃ 反応管:内径0.8mm、長さ10m 反応試薬流量:0.5ml/分 蛍光光度及び紫外線吸光光度の測定結果を第6
図に示した。これから明らかなように前者の場合
は3μgから4μg付近で直線が失われ直線の勾配
が大きくなつているが、一方この発明の紫外線吸
光光度測定の方は良好な直線性が特られている。
実験例 4 試料として濃度を変えたグルコース水溶液(含
有量0.4μg〜7μg)を用いて下記条件で紫外線吸
光光度を測定し分析を行つたが、実験例3と同様
に高感度でかつ良好な直線性で分析できた。
分析条件 装 置:島津高速液体クロマトグラフLC
―3A 分析カラム:島津LCカラムISA―07/S2504 移 動 相:0.5M―ホウ酸(水酸化カリウム
にてPH=9.5に調整) 移動相流量:0.5ml/分 カラム温度:60℃ 紫外線吸光光度計:島津UVD―1 反応条件 反応試薬:5.0%タウリン―1/10M、リン
酸カリウム―1/20M、4ホウ酸ナトリウム
水溶液 反応温度:150℃ 反応管:内径0.8mm、長さ10m 反応試薬流量:0.5ml/分
【図面の簡単な説明】
第1図はこの発明の方法を実施する分析装置の
一実施例を示すフローシートであり、第2図〜第
5図は種々の条件を変化させて糖類の分析に付し
た場合のクロマトグラムであり、第6図は各種重
量のグルコース含有水溶液を分析した場合のピー
ク高さとグルコース量との直線性を示す図であ
る。 1……糖類の自動分析装置、2……高速液体ク
ロマトグラフのカラム、3……溶出液管路、4…
…反応試薬供給管路、5……混合部、6……加熱
槽、7……冷却槽、8……紫外線吸光光度計、9
……反応液管路、10……反応液排出部、11…
…ポンプ、12……ダンパー、13……反応液管
路部、14……反応液管路部、25……クロマト
グラフ装置本体。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 糖類を含有する試料を液体クロマトグラフイ
    ーに付し、このカラム溶離液にモノエタノールア
    ミン添加のホウ酸水溶液又はタウリン添加のホウ
    酸緩衝液の反応試薬を加え、加熱反応を行つた後
    冷却し、紫外線をあててその吸光度を測定するこ
    とにより糖類を定性または定量分析することを特
    徴とする糖類の分析法。
JP247681A 1981-01-10 1981-01-10 Ultraviolet absorbance analyzing method and device for saccharoid Granted JPS57116256A (en)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP4748418B2 (ja) * 2006-02-08 2011-08-17 学校法人日本医科大学 マンノース・グルコース同時測定方法
JP5685381B2 (ja) * 2009-03-13 2015-03-18 Jcrファーマ株式会社 糖類の分析方法

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