JPS6368082A - ２型制限酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、■型制限酵素及びその製造法に係り、特に
二本鎖デオキシリボ核酸（二本鎖ＤＮ△）の分子内の塩
基配列 ５′・・・Ｇ＋Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３−３−・・
・Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ＋Ｇ・・・５−（但し、式中Ａは
アデノシンを、Ｇはグアノシンを、王はチミジンを、Ｃ
はシチジンをそれぞれ示す。以下、同様でおる。）を認
識し矢印の位置でこれを切断する■型制限酵素θｃｅｉ
ｎ■及びこれを製造する方法に関する。

［従来の技術］ 制限酵素は、ウィルスのＤＮＡや裸のＤＮＡとして細胞
に侵入する外来のＤＮＡを切断し排除ザるためのもので
あって菌株特異性のあるエンドヌクレアーゼでおり、特
定の塩基配列を認識するがＤＮＡを非特異的に切断する
■型、二本鎖ＤＮΔの特定の塩基配列を認識しその特定
位置で切断する■型、及び、認識する塩基配列とは異な
る位置であるがその切断位置が特定の位置であって一ヒ
記■型と■型の中間の特性を示す■型とが知られている
。このうち■型制限酵素については、特異性の異なる幾
つかの制限酵素を組合わせて使用することにより、長い
ＤＮＡ分子を計画的に切断し、目的の遺伝子を含む均一
なりＮＡ断片を得ることができる。

このため、このような■型制限酵素は、組換えＤＮＡ技
術において必要な遺伝情報を持つＤＮＡ断片を取出した
り、取出したＤＮＡ断片をその遺伝情報発現の場へ活性
のある形で導入するのに使用されるほか、遺伝子の解析
にも使用される酵素であり、遺伝子操作関連技術におい
て極めて重要な酵素である。

ところで、■型制限酵素の研究分野においては、現在ま
でに認識する塩基配列及び切断位置に特異性を有する数
多くのものが単離され、その酵素化学的性質も明らかに
されており、二本鎖ＤＮＡの分子内の塩基配列 ５′・・・Ｇ＋Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３−３′・・
・Ｃ−（、−Ｔ−Ａ−Ｇ＋Ｇ・・・５′を認識し矢印の
位置でこれを切断する■型制限酵素についても、例えば
、バチルス　アミロリクエファシェンスＨ（ｌＺｔｗｉ
／ｈｔｓ　ｔｍｙ／ρ／１ｔ）ｔｙθｆｘｉθ〃汁１〉
から得られるβｄ／ＩＨＩ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｒ，Ｊ
、、　Ｗｉｌｓｏｎ。

Ｇ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｆ、　Ｅ、、　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２５６．８２−８４（１９７７）　、及
び、Ｇｅｏｒｇｅ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｃｈｉｒｉｋｊｉ
ａｎ。

Ｊ、　　Ｇ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　７９．　２４３２
−２４３６　　（１９８２）　）や、このβｌ／Ａ−ｌ
　Ｉのアイソシゾ？　−（ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）
であってアセ１〜バクターリクエフアシエンス（ｋｅｔ
ｔｙｌｙｃｔｅｒ　／１ｔ７ｔｙθ／’／７／”／’θ
〃５）ＩＡＭ　　１８３４から得られるＡノ／゛Ｔ（特
開昭５９−１７５，８８１号公報）等が報告されている
。

しかしなから、組換えＤＮＡ技術においてその研究の対
象になるＤＮＡやそのＤＮＡの塩基配列は極めて多種多
様にわたっており、種々の特異性を有する■型制限酵素
の開発とその製造が要求されるほか、希釈に対する安定
性が高いこと、塩濃度に対する安定域が広いこと、熱安
定性が高いこと等の優れた酵素化学的性質を有し、製造
の簡便性等の点でより安価で、かつ、使い易い■型制限
酵素の開発が要請されている。

［発明が解決しようとする問題点］ そこで、本発明者等は、酢酸菌の生理化学的研究の一環
としである種の酢酸菌が制限酵素を生産することに着目
し、酵素化学的性質や製造の簡便性等の点で優れた特性
を有する■型制限酵素について鋭意研究を重ねた結果、
グルコノバクタ−属に属するある種の菌が二本鎖ＤＮＡ
の分子内の塩基配列 ５−・・・Ｇ＋Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３′３′・・
・Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ＋Ｇ・・・５−を認識し矢印の位
置でこれを切断する■型制限酵素（θＣｅ１ｎＩ’と命
名）を生産することを見出すと共にその精製法を確立し
、本発明に到達したものである。

従って、本発明の目的は、希釈に対する安定性、塩濃度
に対する安定域、熱安定性等の酵素化学的性質及び製造
の簡便性等の点で優れた特性を有する■型制限酵素Ｇｃ
ｅｉｎＩを提供することにあり、また、この■型制限酵
素０Ｃθｉｎ■を製造する方法を提供することにおる。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明は、グルコノバクタ−属に属する■型
制限酵素ＧＣｅｉｎ■生産菌を培養し、１ｑられた培養
物から採取された制限酵素であり、二本鎖デオキシリボ
核酸の分子内の塩基配列５′・・・Ｇ４−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ・・・３′３′・・・Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ＋Ｇ・
・・５−を認識し矢印の位置でこれを切断する■型制限
酵索ＧｃｅｉｎＩであり、また、グルコノバクタ−属に
属する■型制限酵素ＧｃｅｉｎＩ生産菌を培養し、得ら
れた菌体から上記■型制限酵素ＧＣ６）ｉｎ工を採取す
る■型制限酵素の製造法である。

本発明で使用する微生物としては、酢酸菌であるグルコ
ノバクタ−属に属する■型制限酵素０Ｃｅｉｎ■生産菌
のすべてを使用できるが、例えば、財団法人発酵研究所
の保存菌であって第三者が自由にその分譲を受けること
ができるグルコノバクタ−セリナス（１；／ｙｃｍ〃ｒ
ｗｔｔｙｒ　ｒｅｒｉｙｕｙｓ　）ＩＦＯ３２６０を挙
げることができる。なお、この菌株は、本発明者等がグ
ルコノバクタ−イー　〇　− ンダストＩ）　７　ス（６ｈｔｃｏｔｙｏｌｓｉｒｔｅ
ｒ　ｉｉｙ／１ｉｓｔｒｉｔｉｓ＞　ＩＦＯ３２６０と
して財団法人発酵研究所に菌の寄託を行ったものである
が、その復信のグルコノバクタ−属細菌のある菌株と共
に、グルコノバクタ−セリナス（１／ｖｃｔｙｉｙｔｙ
ｌｙｃｔｅｒ　ｃｅｒｉｉｙｇｓ　）と分類したもので
ある（Ｙ、　Ｙａｍａｄａ　ａｎｄ　Ｈ，Ａｋｉｔａ、
　Ｊ。

Ｇｅｎ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．．３０．１１５−１２６　
　（１９８４）　）。

本発明において、上記■型制限酵素ＧｃｅｉｎＩ生産菌
の培養は、酢酸菌の培養法として知られている公知の方
法で培養することができる。すなわち、グルコース、グ
リセロール、エタノール等の炭素源、硝酸アンモニウム
、塩化アンモニウム等の窒素源、各種リン酸塩、硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム等の無機塩及び酵母エキス
、麦芽エキス、ペプトン等の天然有機栄養物等からなる
培地を使用し、通常、振盪培養等の好気的条件下に、培
地のｐＨ５〜７、培養温度２５〜３０℃及び培養時間２
４〜４８時間の条件で、菌の増殖が定常期初期に達する
まで行う。

また、培養後得られた培養物から目的の■型制限酵素θ
Ｃθｉｎ■を分離し精製する方法としては、従来公知の
方法を採用することができ、例えば以下のような方法で
行うことができる。先ず、培養液を遠心分離して集めた
菌体を、例えばトリス（ヒドロキシメチル〉アミンメタ
ンハイドロクロライド（Ｔｒｉｓ　−ＨＣ，Ｑ　＞等の
適当な緩衝液で洗浄した後、音波処理して細胞を破砕し
、遠心分離して沈澱物を取除き、無細胞抽出液を得る。

次に、この無細胞抽出液をストレプトマイシン硫酸塩で
処理し、ざらに硫酸アンモニウムを使用して分画した後
、ヘパリンセファロースＣＬ−６８１ジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ＞セファロースＣＬ−６Ｂ１セファデッ
クスＧ−２００等のアフィニティークロマト法、イオン
交換クロマト法、ゲル濾過法等の方法を組合わせて本発
明の■型制限酵素θＣθｉｎ工の精製を行う。

このようにして製造される本発明の■型制限酵素Ｇｃθ
ｉｎＩは、二本鎖ＤＮＡの分子内の塩基配列 ５−・・・ＧＪ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３−３′・
・・Ｃ−（、−Ｔ−Ａ−Ｇ４−Ｇ・・・５−を認識し矢
印の位置でこれを切断する■型制限酵素であって、バチ
ルス　アミロリクエファシェンスＨ（１ｔｙｒｉ／／ｙ
ｓ　ｔｙｉｙ１０／１ｙｔｔｅｆｔｙｃｉｅｊ汁りから
得られるβ、ｙ相Ｉやアセトバクター　リクエファシエ
ンス（／ＩＣθｔｏｌｔｗｔθｒ　／１ｙｔｔθｌｙＣ
／”θｊＳ）ＩＡＭ”＋８３４から得られるＡノ／″■
のアイソシゾマー（ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）であり
、希釈に対する安定性、塩濃度に対する安定域、熱安定
性等の酵素化学的性質や製造の簡便性等の点で上記βｉ
相■やＡ１１Ｉよりも優れた特性を発揮する。

［実施例］ 以下、本発明を実施例及び試験例に基いて、詳細に説明
する。

（１）実施例（■型制限酵素ＧｃｅｉｎＩの製造）グル
コノバクタ−セリナス（１／ｙｃｍｏｌｔｗｔｅｒＣθ
ｒｉｍｓ＞　ＩＦＯ３２６０をポテトエキス２０重量％
、酵母エキス１．５重量％、グリセロール１．５重量％
、グルコース０．５重量％、ペプトン１．５重最％、寒
天２．０重量％及び炭酸カルシウム０．７重量％からな
る傾斜培地５ｍｌに接種して３０’Ｃで４８時間培養し
た。次に、得られた培養物をグリセロール１．５重量％
、グルコース０．５重量％、ペプトン０．５重量％、酵
母エキス０．５重量％及び麦芽エキス０．１重量％から
なるｐＨ６，８の栄養培地１０ρに添加し、ロータリー
シェーカーで振盪しなから３０’Ｃでさらに４８時間培
養し、定常期初期の菌体を遠心分離器で集めた。

得られた菌体３２ｇを１０ｍ）ｌのＴｒｉｓ　−１−］
ＣＡ（ＤＨ７，５＞及び１０ｍＨの２−メルカプトエタ
ノールの存在下に１８０Ｗ及び１℃で６分間音波処理し
て菌体を破砕し、遠心分離した後その上澄液にＮａＣＡ
を添加して１００ｍＭとし、最終的に１重量％となるよ
うにストレプトマイシンを添加して除核酸し、３０分間
静置した後、遠心分離して沈澱物を取除きその上澄液を
得た（精製段階１）。

このようにして得られた上澄液に３５重組％溶液になる
まで攪拌しなから硫酸アンモニウムを添加し、さらに析
出した沈澱物を遠心分離して除き、その上澄液に６０重
量％溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、−夜
装置した。この−夜静置後、遠心分離した沈澱物に緩衝
液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ７，５＞
、７ｍＭの塩化マグネシウム及び７ｍＭの２−メルカプ
トエタノール）を加えて溶解し一夜透析したく精製段階
２）。

得られた透析液４０ｄを、予め１００ｍ１（のＮａＣｆ
２を含む緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロース０
Ｌ−６Ｂが充填されたクロマトカラム（直径１．３ｃｍ
、高さ８　ｃｍ　＞に吸着させ、予め１ＱＱｍＨのＮａ
Ｃρを含む緩衝液への１０カラム分で洗浄した後、１０
０〜６００ｍＭのＮａＣｕを含有する緩衝液Ａのリニア
グラジェントで■型制限酵素θＣθｉｎ■を溶出させた
。目的の■型制限酵索θＣｅ１ｎＩハ約２５０〜３５０
ｍＭＮ　ａ　ＣＪ２２ｍ度の溶液中に溶出された（精製
段階３）。

さらに、得られた■型制限酵素θＣｅ１ｎ工を含有する
溶液を緩衝液Ａで一夜透析し、得られた透析液３０．５
ｒｒｄｌを、予め緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファ
ロースＣＬ−６Ｂが充填されたクロマトカラム（直径１
．３ｃｍ、高さ８　ｃｍ　＞に吸着させ、緩衝液Ａ’Ｉ
Ｏカラム分で洗浄した後、Ｏ〜５００ｍＨのＮａ（ｌを
含有する緩衝液へのリニアグラジェントで溶出させた。

■型制限酵素θＣθｉｎ工は約’１５０〜２５０ｍＨの
ＮａＣｕ１度の溶液中に溶出された（精製段階４）。

次に、得られた■型制限酵素θＣｅ１ｎＩ含有画分の溶
液を透析チューブにいれてポリエチレングリコール６，
０００につけて濃縮した。次に、予め’ｌｏｏｍＭのＮ
ａ（Ｊ！を含む緩衝液Ａで平衡化したセファデックスＧ
−２００が充填されたゲル濾過カラム（直径１．３ｃｍ
、高さ２５　ｃｍ　＞に酵素液を供試し、１００ｍＭの
ＮａＣｕを含む緩衝液Ａ１カラム分で■型制限酵素θｃ
　ｅｉｎＩ含有画分を溶出させた。この■型制限酵素Ｇ
ｃｅｉｎＩ含右画分の溶液を再度透析チューブにいれて
ポリエチレングリコール６．０００につけて濃縮し、緩
衝液Ｂ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ　（１）Ｈ７，５
＞、７ｍＭの塩化マグネシウム、７ｍＭの２−メルカプ
トエタノ−ル及び５０％Ｖ／Ｖグリセロール）で−夜透
析して精製した（精製段階５）。なお、以上全ての精製
段階１〜５の各操作は４℃以下の温度で行った。

このようにして得られた■型制限酵素θＣθｉｎ■を５
〜１０μｐ使用し、’１Ｑｎ１４のＴｒｉｓ−ＨＣＡ（
ｐＨ７，５＞、７ｍＭの塩化マグネシウム、７ｍＭの２
−メルカプトエタノール及び１μ７のλＤＮＡからなる
合計５０μｐの混合液を調整し、３７℃で１時間反応さ
せ、反応停止のため１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）及び１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）の液５μρを添加した。得られた反応混合物をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、λＤＮＡの切断の有無によ
り酵素活性を調べた。この■型制限酵素ＧｃｅｉｎＩの
酵素活性について、λＤＮＡ１μ７を１時間で完全に切
断する酵素量を１単位（１ｕｎｉｔ）とした。

なお、アガロースゲル電気泳動は、１重量％アガロース
、８９ｍＭのＴｒｉｓ−ｆｉｌ酸（ｐＨ８，３＞、２．
５ｎ＋ＨのＥＤＴＡ及び５００μ！？／Ｊ２のエチジウ
ムブロマイドからなる平板ゲルを用い、電気波動用緩衝
液（８９ｍＭの１ｒｉｓ−ｍＢ酸（ｐＨ８，３＞、２．
５ｍＭのＥＤＴＡ及び５０Ｃ１ｇ／、Ｃのエチジウムブ
ロマイド）によって１　ｃｍ当り５．５Ｖの定電圧で約
４時間泳動させた後、３０２ｎｍのＵＶランプの下でλ
ＤＮＡの切断を確認した。

以上のようにして得られた■型制限酵素ＧθθｉｎＩは
２４時間の反応においても他の切断のパターンは変化せ
ず、他の非特異的ＤＮａｓｅ等の活性は含まれていなか
った。上記精製段階１〜５での各精製度及び全活性は第
１表に示す通りであった。

（２）試験例（■型制限酵素０ＣθｉｎＩの酵素化学的
性質の確認〉 ■ダブルダイゼッション（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔ
ｉｏｎ）テスト 既知の■型制限酵素Ｂｌ井１■とＩ）ＢＩ？３２２　Ｄ
　Ｎ　Ａとを使用し、１μ９のＥ、　ｃｏｌｉ　　（大
腸菌）プラスミド１）ＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ、１ＱＩＩ
ＩＭのＴｒｉｓ−）−Ｉ　ＣＡ（ｐＨ７，５＞、７１１
１Ｍの２−メルカプトＩＪ／　−／ｌｚ及び７１１１Ｍ
の塩化マグネシウムの混合物３０μβ中、３７℃２時間
の条件で酵素未添加、■型制限酵素Ｂみ旧■のみ添加、
精製した■型制限酵素θ０θｉｎＩのみ添加、及び、■
型制限酵素Ｂ、ｙ帽ＸとθＣｅ１ｎＩの混合添加の下に
反応させ、上記と同様のアガロースゲル電気泳動法で■
型制限酵素０Ｃθｉｎ工が認識する塩基配列と切断位置
とを調べた。結果は両酵素共に全く同じ位置でｐＢＲ３
２２ＤＮＡを認識し切断しており、このことから■型制
限酵素θｃ　ｇｉｎＩは、二本鎖デオキシリポ核酸の分
子内の塩基配列 ５′・・・Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−（、−Ｃ・・・３′３−・
・・Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ・・・５′を認識し切断す
るものであり、βみ旧■と互いにアイソシズマーの関係
にあると思われた。

■認識切断部位の決定 ｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａを■型制限酵素θｃ　ｇｉｎＩ
　テ切断し、ホスハターゼで処理して切断末端のリン酸
を取除き、〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰで切断末端を３２ｐで
標識した。これを■型制限酵素〃／ρｄＩ［Ｉで処理し
て得られたフラグメント（約３４６ベース・ペア）をマ
クサム・ギルバート法でその塩基配列を決定した。その
結果、第１図に示すように、その切口からの塩基配列は ５”７Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ・・・・・
・となることが判明した。また、第２図に示ずように末
端の塩基はＧであることが判明した。

以上の結果より、■型制限酵素θθθｉｎＩは、二本鎖
デオキシリボ核酸の分子内の塩基配列５′・・・Ｇ−）
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３′３−・・・Ｃ−Ｃ−Ｔ−
Ａ−Ｇ−）Ｇ・・・５′を認識し矢印の位置でこれを切
断することが判明した。

■各種基質ＤＮＡに対する切断部位の数基質ＤＮＡとし
てＥ、　ｃｏｌｉファージλＯＮ醇Ｅ。

ｃｏｌｉプラスミド１）ＢＲ３２２ＤＮＡ　、　Ｅ、　
ｃｏｌｉファージφｘ１７４ＲＦ　ＤＮＡ及び動物ウィ
ルスＳＶ　４０　ＤＮＡを使用し、これらの基質ＤＮＡ
に本発明の■型制限酵素θＣθｉｎ■を作用させ、この
酵素反応終了後に生成物をアガロースゲル電気泳動法で
処理して上記各基質ＤＮＡに対する本発明の■型制限酵
素０Ｃ６）ｉｎ■の作用及び基質特異性を調べた。結果
は第２表の通りでった。

■至適ｐＨ及びｐＨ安定域 １μ９のλＤＮＡ、７ｎ＋Ｈの塩化マグネシウム及び７
ｍＭの２−メルカプトエタノールに’ｌＱｍＨの酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４）、塩酸ピペラジン（ｐＨ５＞、塩酸
ヒスチジン（ｐＨ６＞　、塩酸イミダゾール（ｐｔ−１
７＞　、Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ２　（ｐＨ８＞あるいは塩酸
モノエタノールアミン（ｐＨ９＞を添加して調整した各
反応溶液５０μｐを使用し、常法により■型制限酵素θ
Ｃθｉｎ■の至適ＩＩ及びｐＨ安定域を調べた。結果は
、至適ｐＨが７．５〜９．５でおり、ＤＨ安定域は５．
５〜１０であって極めて広いことが判明した。

■至適温度及び温度安定性 １μりのλＤＮＡ、１０ｍＨのＴｒｉｓ−ＨＣＡ（ｐｌ
−（７，５＞、７ｍＭの塩化マグネシウム及び７ｍＭの
２−メルカプトエタノールからなる標準反応系の反応溶
液５０μｐを使用し、常法により、■型制限酵素θＣθ
ｉｎ■の至適温度及び温度安定性を調べた。結果は、至
適温度が３５〜４０℃で、５分間保温による温度安定性
は５０’Ｃまでであり、極めて安定であることが判明し
た。

■塩要求性及び至適塩濃度 上記標準反応系の反応溶液に濃度を変えてＮａＣ，Ｒを
添加し、常法により■型制限酵素θＣθｉｎ■の塩要求
性及び至適塩濃度を調べた。

結果は、至適塩濃度がＯ〜１５０１′ＩＩＭＮａＣｆ２
であり、塩濃度Ｏでも■型制限酵素０Ｃθｉｎ■は反応
するので塩要求性は特に認められず、使い易い酵素であ
ることが判明した。

■希釈に対する安定性 上記標準反応系に加える酵素量（３７℃、１０分間の反
応で１μ７のλＤＮＡを完全に切断する酵素量）を１１
５にし、６０〜１２０分間反応させて安定性を調べた。

結果は全て反応系でλＤＮＡを完全に切断しており、希
釈に対して極めて安定で、おることが判明した。

■二価の金属塩に対する要求性 標準反応系の金属塩塩化マグネシウムを、塩化カルシウ
ム、塩化マンガン、塩化第二銅、及び塩化コバルトに代
え、１ｍ）ＩのＥＤＴＡを加えた反応系で反応させ、他
の二価の金属塩に対する要求性を調べた。結果は塩化マ
ンカン存在下でのみ多少反応した。

■分子量 ゲル濾過法で分子量を測定した。結果は、２５゜ＯＯＯ
±５．○ＯＯであった。

■既知の■型制限酵素Ａノ／゛工及びβＩ／Ｈ工との比
較 上記の酵素化学的性質を既知の■型制限酵素Ａノ／′■
及びＢｙ’＠Ｉと比較すると、第３表に示す通りである
。

−２０　＝ ［発明の効果コ 本発明によれば、希釈に対する安定性、至適塩温度幅、
熱安定性等の酵素化学的性質が優れていて製造が比較的
簡便であると共に、二本鎖デオキシリボ核酸の分子内の
塩基配列 ５−・・・Ｇ＋Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ・・・３′３′・・
・Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ４−Ｇ・・・５′を認識し矢印の
位置でこれを切断する■型制限酵素θＣθｉｎ工及びそ
の製造法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の■型制限酵素ＧｃｅｉｎＩで処理した
ｐＢＲ３２２ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図、第２
図は本発明の■剪制限酵素θｃｅｉｎＩで処理したｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡのＰＥｌ−セルロース溝層クロマトグラ
フィー図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコノバクター属に属するII型制限酵素Ｇｃｅ
   ｉｎ I 生産菌を培養し、得られた培養物から採取され
   た制限酵素であり、二本鎖デオキシリボ核酸の分子内の
   塩基配列 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、式中Ａはアデノシンを、Ｇはグアノシンを、Ｔ
   はチミジンを、Ｃはシチジンをそれぞれ示す。）を認識
   し矢印の位置でこれを切断するII型制限酵素Ｇｃｅｉｎ
   I 。
2. （２）グルコノバクター属に属するII型制限酵素Ｇｃｅ
   ｉｎ I 生産菌を培養し、得られた培養物から上記II型
   制限酵素Ｇｃｅｉｎ I を採取することを特徴とするII
   型制限酵素の製造法。