JPS6371173A - 細胞培養マイクロキヤリア - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、付着依存性細胞（Ａｎｃｈａｒａｇｅ　−ｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔ　０ｅｌａ　）を培養する際Ｖｃｆ！
用される細胞培養マイクロキャリアに関するものであシ
、詳しくは付着位存性動物細胞をマイクロキャリアに付
着させ、懸濁状態で高密度培養するのに好適な細胞培養
マイクロキャリアに関するものである。

〔従来の技術〕

近年、付着依存性細胞培養のための種々の培養方法が開
発され、急速に発展してきているがその一つにマイクロ
キャリア培養法がある。従来知られていたマイクロキャ
リアとして。ｙｔｏｄｅｘ（ファルーｖシフ社製）　％
　５ｕｐｅｒｂｅａｄｓ　（ＦＩＯＷ　Ｌａｂｓ社）等
架橋デキスト２ンを母体構造としたものあるいはＤＥ−
！にコ、ＤＥ−３，７（Ｗｈａｔｍａｎ社）等のセルロ
ース顆粒体を母体構造としたもの等があんしかしながら
、これらのマイクロキャリアは、天然物由来の素材であ
るため、非常に高価であシ、高付加価値の有用物質の生
産あるいは小規模の培養にしか使用されていなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、安価に製造し得る新規な細胞培養マイクロキ
ャリアを提供しよりとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

しかして斯る目的を達成する本発明の要旨は（メタ）ア
クリル酸エステルを構成単位とする水不溶性の重合体粒
子であって、該粒子は、正に荷電し得る化学的残基又は
蛋白質を表面に化学結合して成り、かつ、培養溶液中に
おける平均粒径がｊｏ〜ｓｏｏａｍ、比重がｉ、ｏｏ〜
／、！！ｉ／ａ１．であることを特徴とする細胞培養マ
イクロキャリアに存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の特徴は、マイクロキャリアを構成するマトリッ
クスが、（メタ）アクリル酸エステルより成る水不溶性
粒子にて構成されていることである。本発明のマイクロ
キャリアは、（メタ）アクリル酸エステルをモノマー成
分として懸濁重合し、水不溶性の重合体粒子を製造した
後、正に荷電し得る化学的残基又は蛋白質を化学結合に
よって導入することＫよシ得られる。

七ツマ−として用いられる（メタ）アクリル酸エステル
としては、具体的には、コーヒドロキシエチル（メタ）
アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレー
ト、ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、オク
タエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチ
レングリコール（メタ）アクリレート及びグリシジル（
メタ）アクリレート等であう、これに必要に応じて架橋
剤成分を添加することもできる。ポリエチレングリコー
ル（メタ）アクリレート及びグリシジル（メタ）アクリ
レートから構成される重合体粒子が、水不溶性であれば
、架橋剤は、必須成分ではないが、水不溶性担体かもの
（メタ）アクリル酸エステル成分の溶出も考慮し、架橋
剤を添加することが望ましい。

架橋剤成分としては、ポリエチレングリコール（メタ）
アクリレート及び／又はグリシジル（メタ）アクリレー
トと共重合するものであれば良ｈ０例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレー
ト、グリセロールジメタクリレート、グリセロールトリ
メタクリレート等が挙げられる。

架橋剤は、マイクロキャリアの構成成分の漏出を可及的
に最小に抑えるためには、添加することが好ましいが、
逆に含有率が高い場合には水不溶性の重合体粒子の膨潤
度が低下して、好ましい比重が得られない。以上のこと
から架橋剤の含有率はＯ〜３０重黛パ重上パーセントは
−〜ユｏ”＊＊パーセントであることが好ましへコーヒ
ドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレング
リコール（メタ）アクリレート及びグリシジル（メタ〕
アクリレート等は、マイクロキャリアを親水性にするた
め、好適な（メタ）アクリル酸エステルであるばかシで
はなく、安価であるのでマイクロキャリアを安価に製造
できる。

懸濁重合は、公知の方法に従って有機希釈剤、重合開始
剤等の存在下、水中油型の懸濁重合法によフ実施される
。有機希釈剤としては、グリシジル基、水酸基等の官能
基に対して不活性であれば・特に制限はないが、通常は
、ペンタノ−〃、ヘキサノール、ヘプタツール、オクタ
ツール、シクロヘキサノール、トルエン、クロロベンゼ
ン、ジプチルエーテル、シアミルエーテル、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、シクロヘキ
サノン等が用いられる。

有機希釈剤の七ツマ−に対する添加量は、全モノマー成
分に対しへ〇〜１０．０＠ｆｊＪ倍であることが好まし
い。

また、重合開始剤としては、過酸化ベンゾイル、過酸化
ラウロイル、アゾビスイソバレロニトリル等が用いられ
、通常その使用量は、食上ツマ−に対し０，０／〜３重
量パーセントの濃度範囲・好ましくはｏ、ｏｊ〜ｉ、ｏ
！ｘパーセントの濃度範囲から選ばれる。

マイクロキャリアの粒径及び比重は、モノマー及びその
割合有機希釈剤、正に荷電しうる化学的残基、蛋白質、
重合時の回転速度、攪拌羽根等によ）大きく異なるが、
本発明においては以下の理由により、培養溶液中におけ
る平均粒径はｊ　ＯＡ−ｊ　００μ、　、比重は八〇θ
〜１．ｌ！１１／Ｃ１：、の範囲にあることが好ましい
。すなわち攪拌条件下に粒径の均質懸濁状態を達成する
ためには、マイクロキャリアの比重は、培養溶液の比重
に近いことが好ましい。このためにはマイクロキャリア
の比重は八〇〇〜／、　／　３　Ｎ／ＣＣ１特Ｋ　１．
０　／　〜／、０　？　、ｐ　／ＣＣの範囲にあること
が好ましい。更に培養溶液中において該マイクロキャリ
アの平均粒径は５ｏ−ｊｏｏμｍの範囲・好ましくは７
０〜３００μ汎の範囲にあシ・かつ、その粒径分布は、
細胞の均一な付着、増殖及び均質的懸濁状態を達成する
ためには、狭い粒径範囲にあることが好ましい。

懸濁重合終了後重合体粒子なｒ過分離し、洗浄する。

付着依存性細胞を良好にマイクロキャリア上に付着、増
殖させるためには、少なくとも表面に正に荷電した化学
的残基な有するかあるいは少なくとも表面に正に荷電し
得る化学的残基又は、蛋白質を有することが必須である
。すなわち、細胞培養には、通常牛胎児血清を数多添加
して行なわれるが、この血清成分中には細胞の付着を促
進したシ、細胞の増殖を促進する蛋白質が含有されてい
る。細胞の極めて充分な付着と増殖とを生起し得るため
には、これらの細胞付着及び増殖因子が、表面を被覆構
成することが必要である。従ってマイクロキャリアの表
面層は、上記細胞付着促進因子を効率よく々イクロキャ
リア表面上に吸着し、細胞の伸展増殖に適した官能基で
構成されなければならない。

本発明の好ましい具体例によれば、マイクロキャリアの
少なくとも表面を構成する官能基として、正に荷電し得
る化学的残基な有するものとして・アミン、アンモニウ
ム塩等、蛋白質としてコラーゲン、ゼラチン等があげら
れる。

正に荷電し得る化学的残基又は蛋白質は、重合体粒子の
官能基に、以下忙述べる化学修飾方法を適用することに
よシ導入することができる。

官能基としては、エチレングリコール（メタ）クリレー
ト、ジエチレングリコール（メタ）クリレート、ポリエ
チレングリコール（メタ）クリレートの場合は、末端水
酸基をグリシジル（メタ〕アクリレートの場合は、エポ
キシ基又はエポキシ基の加水分解によシ生成するグリセ
リル基を挙げることができる。

グリシジル基には、以下の方法によシ正に荷電しうるア
ミン等の残基な化学結合できる。

すなわち、アルキルアミン、アル中レンジアミン、トリ
アルキルアミン、トリアルカノールアミン、ポリエチレ
ンイミン等のアミンと重合体粒子を溶媒存在下（通常水
溶液、エタノール、ジオキサン等の溶媒が使用される。

）、ＪＯ℃〜還流温度の反応温度で数時間攪拌を行なえ
ば容易に化学結合させることができる。また水酸基の場
合は、ブロムシアン、カルボニルジイミダゾール等で重
合体粒子の末端官能基を活性化後、各種アミン、蛋白質
との反応によシ正江荷電しつる化学的残基又は蛋白質を
尋人できる◇また、ジアルキルアミノアルキルクロリド
、ジアルキルアミノアルキルプロミド、トリアルキルア
ミノアルキルクロリド、トリアルキルアミノアルキルプ
ロミドは、塩基性条件下重合体粒子との攪拌によジエー
テル結合を生成できる。

グリセリル基と蛋白質との反応では、グルタルアルデヒ
ドによシ両者を架橋導入することができる。あるいは蛋
白質をグルタルアルデヒドで架橋し・ゲル表面を被覆す
ることもできる。

前記反応で用いられるアミンの具体例としては例えば・
エチルアミン・ブチルアミン・ヘキシルアミン、オクチ
ルアミン等のアルキルアミン類、エチレンジアミン、テ
トラエチレンジアミン、ヘキサエチレンジアミン等のア
ルキレンジアミン類、ジエチレントリアミン、トリエチ
レンテト２ミン等ポリアルキレンポリアミン類及びポリ
エチレンイミン類、ジエチルアミン、ジブチルアミン等
の一級のジアルキルアミン類Ｎ、Ｎ−ジエチルエチレン
ジアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の３
級ドリア、ＴＩ／キルアミン類等が挙げられる。また、
後述のジアルキルアミノアルキルクロリドあるいはプロ
ミド、・トリアルキルアミンアルキルクロリドあるいは
プロミドとしては、ジエチルアミノエチルクロリド、ジ
エチルアミノエチルプロミド、ジエチルアミノエチルク
ロリド、ジメチルアミノメチルプロミド、ジエチルアミ
ノメチルクロリド、ジエチルアミノメチルプロミド、ジ
ー（ヒドロキシエチル）−アミノエチルクロリド、ビス
（ヒドロキシエチル）−アミノエチルプロミド、β−モ
ルフォリノエチルクロリド、β−モルフォリノエチルプ
ロミド、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド、
グリシジルトリメチルアンモニウムプロミド、トリメチ
ルー−９Ｊ−ジヒドロキジブｑビルアミン、トリメチル
−３−クロロ−一−ヒドロキシプロビルアミン及びそれ
らの塩酸塩等が挙げられる。

本発明の態様によれば、正に荷電し得る化学的残基又は
蛋白質の分布状態は、細胞と接触しうる表面に存在すれ
ば、それで充分足シる。

しかし製法上、水不溶性担体の内部に正に荷電し得る化
学的残基又は蛋白質が存在しても何らさしつかえない・ マイクロキャリア上の正の荷電し得る化学的残基量又は
蛋白質の含有量は、細胞の種類、化学的残基又は蛋白質
のａ類、培養時のマイクロキャリア濃度・培養条件等種
々の因子によって異なる。しかしながら、多くの場合正
に荷電し得る化学的残基のイオン交換容ｉは・乾床マイ
クロキャリアｌＩ当Ｆ）　０．　／　ｍｅｑ　〜ｊ、θ
ｍｅｑの範囲・好ましくは乾燥マイクロキャリア／ｉ当
）０．７〜コ、ｊ　ｍｅｑの範囲である。

〔発明の効果〕

本発明のマイクロキャリアは、付着依存性細胞を懸濁状
態で高密度培養を行なうことができる。しかも安価に製
造し得るため工業的規模で大量培養が可能である。これ
によシ種々のワクチン、酵素、蛋白質等の生理活性蛋白
質を大量にしかも安価に製造することが可能となる。

〔実施例〕

以下実施例によシ、本発明の詳細な説明するが、本発明
は、その要旨を越えなり限９、以下の実施例によって限
定されるものではない。

実施例−７ マイクロキャリアは、以下に述べる方法にょシ製造され
た。

３００ｍ１のすつロフラスコに温度計、冷却管、馬導入
管、攪押板を取シ付けた。この中へ塩化カルシウムｍ：
水塩３０１，３％ポリビニルアルコール水溶液、！Ｏｍ
ｌ　ｓイオン交換水１３ｍ１を入れ攪拌した。反応は歯
雰囲気下で行なった。

この中へ／−へキサノールＪ　０１１．シクロヘキサノ
ール３０ｇ、ｌ−オクタツールｉｊｇ、ポリエチレング
リコ〜ルメタクリレート（商品名Ｐトリ３０日本油脂ｍ
）ｉｓｉ・グリシジルメタクリレ−）　Ａ、０　、ｐ　
、グリシジルメタクリレー）　／、００　Ｎ　、重合開
始剤としてアゾビスイソバレロニトリル（ｖ−６ｊ％商
品名）−〇θ■を溶解した有機溶液をフラスコ内へ加え
た。

徐々に昇温し、７０℃で５時間重合反応を行なった。反
応終了後ポリマーをグツフナ漏斗上にあけ、メタノール
で洗浄した。ポリマーを再度フラスコへ戻し、この中へ
メタノールを加え沸騰させ約−０分間ポリマーを攪拌洗
浄した。この操作を６回縁シ返した。さらにポリマーを
ブツ７す漏斗上で水洗した。再度ポリマーをフラスコに
戻し、約９０℃で約３０分間攪拌し洗浄した。仁の操作
を再度行なった。この後Ｏ０θコＷ／Ｖエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム溶液で洗浄した。再度熱水溶液中で
攪拌、洗浄し丸。

得られたポリマーは無色透明球状体粒子であった。重合
収率はｆｆ４Ｉ％であった。このポリマーを標準ふるい
を用いてコ１０μｍ〜コＳＯμｍに粒径な揃えた。以下
これをポリマーｌと呼ぶ。

上記ポリマーｌを用いて更に以下の反応を行なった。ポ
リマー／　　ＪＯｖｔｌ（メスシリンダーで静置した時
の体積）をｌ、ダージオキサンで充分に洗浄し置換した
。これを３００ｒＩＩｌのフラスコ内ニ入れ、／、４Ｚ
−ジオキサンＪＯｍｌを加えた。

この中へヘキサメチレンジアミンＪ、Ａ、９のジオキサ
ン溶液ｊｕｌを滴下し、７０℃でｑ時間反応を行なった
。反応終了後ポリマーを水で充分に洗浄した。さらに１
０％硫酸水溶液でポリマーを洗浄し、フラスコ内にポリ
マーを戻し１０％硫酸水溶液ｊｏｔｎｌを入れた。りＯ
″ＧＫＧＫ加温間攪拌を行ない残存するエポキシ基を加
水分解した。反応終了後ポリマーを充分に洗浄した。

これをマイクロキャリアー／（ＭＯ−／）と呼ぶ。マイ
クロキャリアーｌの元素分析値は以下の通夛であった。

ＭＯ−／元素分析値 ＯＨＮ ！Ｉコ、６３％　　ｇ、コ？％　　コ、ｑａ係元素分析
値よ）官能基量は０．９４　ｍｅｑ／ｆ−Ｒでめった。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｄｕｌ　ｂｅｃｏ粉末）中におけるマイ
クロキャリアー／の膨潤度は／　ｔ、　／　Ｒ１／ｆ−
タｅ１、平均粒径は１７０μｍ、比重は八ｏ３ｔ７ｃｒ
、であった。

実施例− ポリマーｉ　　ＪＯｒｎｌを／、４１−ジオキサンで充
分洗浄し、ジオキサンで置換した。これを３００１のフ
ラスコ内に入れ、／、！−ジオキサン３ＯＮを加えた。

この中へＮ、Ｎ−ジエチルエチレンジアミン八６０ｆの
ジオキサン溶液ｊｍｌを滴下した。以下実施例１と同様
の操作を行ないマイクロキャリアー−（ＭＯ−コ）を得
た。マイクロキャリアーコの元素分析値は次の過少であ
った。

元素分析値 ＯＥ　　　　　　　　　　　ＩＪ ｊコ、コロ％　　ｇ、ｊダチ　　コ、コア係元素分析値
より官能基量はＯｏに−ｍｅｑ／ｉ’４θ１でめった。

ＰＢＳ中における膨潤度は一／、　３ｍｌ／１−ｖｅｘ
、平均粒径はコ１０Ａｍ％比重は八〇３ｒ／ＣＣであっ
た。

実施例３ ＪＯＯｄのダツロフラスコに温度計、冷却管、Ｎ、導入
管、攪拌板を取シ付けた。この中へ塩化カルシウム２０
７７．３％ポリビニルアルコール水溶液！；Ｏｍ！、イ
オン交換水ざｊゴを入れ、攪拌した。窒素雰囲気下で反
応を行なった。この中へシクロヘキサノールフタ２、エ
チレングリコールメタクリレ−）　／　／　ｆ、グリシ
ジルメタクリレートｇ、Ｏｆ、グリセロールジメタクリ
レート１．０　？　、重合開始剤としてアゾビスイソバ
レロニトリル（ｖ−ｔ、ｊ）２ｏｏ〜を溶解した有機溶
液を加えた。

以下実施例１と同様の操作を行ない、ボリマーコを得た
。アミノ化の反応は、ヘキサメチレンジアミン−、／　
ｆを快用したこと以外は実施例／の後半と同様の操作を
行なった。得られたポリマーをマイクロキャリアー、７
（ＭＯ−３）と呼ぶ。マイクロキャリア＝３の元素分析
値は以下の通りであった。

元素分析値 ＯＨＮ ｊ／、クコ％　　　　　　　ｔ、Ｊｒ　チ　　　　　　
３．コ　／チ元素分析値よシ官能基量はへ３コｍｅｑ／
ｒ−ｆｅｌであった。ＰＨ６中における膨潤度は、１ｇ
、Ｉｍ￥ｔ−ｆｅｌ、平均粒径は／ｊＯＡｍ−比重は／
、０３ｆ／ＣＣであった。

実施例ダ ボリマー／２．ＯｆをＪＯＯｍｌのりツロフラスコ内に
入れ、この中へｊ％ゼラチン水溶液１００ｍ１を入れ、
１０℃で３時間攪拌した。

さらに溶液を３０℃に戻し、塩酸酸性とし、１３％グル
タルアルデヒド水溶液４／ｍｌをゆっくり滴下し、コダ
時間反応を行なった。灰石終了後ポリマーを充分水洗し
、ゼラチンをコートしたマイクロキャリアーダ（ＭＯ−
＋）を製造した。元素分析は次の通夛であった。

ＯＨＩＪ ｊコ、１７．７係　　　　　５．０７チ　　　　　コ、
タ　ッチ平均粒径はコニＯμ九、比重はへ０３２／工で
めった。

実施例Ｓ ＪＯＯｍｌのりツロフラスコ内に温度計、冷却管、Ｎ、
導入管、攪拌板を取り付けた。この中へ塩化カルシウム
−二水塩Ｃａ１１ｍ’コ＆０コｊｒ％、？チボリビニル
アルコール水溶液ｊＯｔ１．イオン交換水ｇＯｍｌを入
れ攪拌した。重合は歯雰囲気下で行なった。この中へ♀
テ〒′クタハル３０９シクロヘキサノールｊ０？、テト
ラエチレングリコールメタクリレート／７？、グリセロ
ールジメタクリレー）　３．００　ｆ　、重合開始剤と
してアゾインバレロニトリル−００〜を溶解した有機溶
剤をフラスコ内へ加えた。７０℃で３時間重合反応を行
なった。重合後の後処理は、実施例１と同様に行なった
。以下これをポリマーＪと呼ぶ。ポリマー３を用いて以
下の反応を行なった。ポリマー、７　　ＪＯｔｌ（メス
シリンダー中に静置したときの体積）をフラスコ内に入
れ、水をＪＯｍ！追加し、３℃に冷却した。この中ヘプ
ロモシアンへす３？のＤＭＦ溶液、３．０１ＬＩをゆつ
くシ滴下した。溶液のＰＲは次第に低下してゆくがｐｌ
ｌが／　０．４−　／　／、Ｊとなるようにｏ、ｊＮ−
ＮａＯＨ水溶液を滴下した。約１時間攪拌した。反応ポ
リマーを洗浄した。その後再度フラスコにポリマーを戻
しジエチルアミンを反応させ、正に荷電し得る化学的残
基な導入した。

反応終了後ポリマーを充分に洗浄し７、マイクロキャリ
アーｊ（ｎｃｊ）を得た。元素分析は次の過少であった
。

ＯＨＮ ｊ／、りＪチ　　　　　ｔ、コデチ　　　　　コ、りＪ
ｑｂ平均粒径は１７０ｔ１ｍ、比重は八Ｏｊ９／ＣＣで
あった。

実施例６ ＪＯＯｍｌのダツロフラスコに温度計、冷却管、Ｎ、導
入管、攪拌板を取シ付けた。この中へ塩化ナトリウム６
、Ｏｔ％、７％ポリビニルアルコール水溶液ｔｚｏｍｌ
、イオン交換水ｌコ０ｔｎｌを入れ攪拌した。この中へ
シクロヘキサノールｑｊ？、！−へキサノールｇＯ？、
グリシジルメタクリレート／ｌｓｆ、グリセロールジメ
タクリレートｙ、０？、重合開始剤としてアゾイソバレ
ロニトリル−ｏｏＩｎ９を溶解したＭ機溶液をフラスコ
内へ加えた。７０℃で３時間重合を行ない、水不溶性の
重合体粒子を得た。反応終了後ポリマーをプツフナ漏半
上にあけ、メタノールで洗浄した。ポリマーを再度フラ
スコへ戻し、この中へメタノールを加え、沸騰させ、ポ
リマーを攪拌し洗浄した。ポリマーをメタノールで数回
洗浄後乾燥した。重合収率は９７％であった。以下これ
をポリマーｑと呼ぶ。更に以下の反応を行なった。水で
膨潤させ、３０ｍ１としたポリマーｌを／、４１−ジオ
キサンで充分洗浄し置換した。これを３００ｍ１のフラ
スコ内に入れｉ、ｑ−ジオキサン３０ｄを加えた。この
中ヘジエチルアミンコ、０　？のジオキサン溶液を滴下
し、７４℃でグ時間反応を行なった。灰石終了後ポリマ
ーを水で充分洗浄した。更に残存するエポキシ基を加水
分解するため、上記ポリマーに１ｏｔａ硫酸水溶液を添
加し、７０℃で９時間攪拌した。

反応終了後ポリマーを水洗した。これをマイクロキャリ
アー７（Ｍローフ）ト呼ぶ。マイクロキャリアー７の元
素分析値は以下の過少であった。

元素分析値（ＭＯ−７） ＯＨＮ ｊ　３．−　ｌ　チ　　　　　　７．２９　％　　　　
　　１．０６　チ平均粒径は一００μｍ、比重は八〇３
？／にであった。兄秦扮ネ小鑓Ｊり拗ノコＺ６ダ川うり
ζ−〆で消フタ・実施例り 生物試験（マイクロキャリア上の細胞の付着性、増殖性
試験）に供した細胞は、Ｂａ１ｂ１０．７Ｔ３（ヒト胎
児ｇ！維芽細胞）、ａＢｏ−ｘｌ（チャイニーズハムス
ター子宮卵巣細胞）であり、いずれも付着依存性細胞で
ある。

実施例１〜６で得られたマイクロキャリアをＰ　Ｂ　Ｂ
　（Ｄｕｌｂｅａｏ　Ｐ　Ｂ　Ｂ溶液）で充分、洗浄し
置換したマイクロキャリアをＩＯ，０ｍｌ採取した。

／／Ｊ’（：、、ｌｊ分間オートクレーブ滅菌を行なっ
たマイクロキャリアを、ｊ％牛脂児血清含有のＤＭＥ！
：Ｍ　＋Ｈａｎ？／コ培地で充分洗浄置換した。

これにトリプシンにて分散された培養細胞４！ｘ１０・
Ｃθ１１／ｄを浮遊させ、各々に加え混和後、３７℃で
２時間放置して付着させた。その間ＵＳＳ分区混和した
。

コ時間後、マイクロキャリアを沈降させ上清を廃棄し、
新しい培地を加え、洗浄をλ直行なった。最後に各々に
／！０ｙｔｌの培地を加えスピナーフラスコで３日間培
養した。

３日後にマイクロキャリアを回収してＰＢＥＩで洗浄後
１０％ホルマリンにて固定し・ギムザ染色後、観察した
。マイクロキャリア上の細胞の付着性及び増殖性は、倒
立位相差顕微鏡で観察した結果を以下の表−７に示す。

また一部は、普通光学顕微鏡で写真撮影をした結果を同
じく以下の表−７に示す。

表−／　細胞の付着性及び増殖性 付着直後　　３日間培養 ＭＯ−ｌ＋））＋＋Ｉ＋　　　十　　　　冊　　　　冊
ＭＯ−コ　　　　朴　　十　　柑　　＋　　　　＋＋＋
　　　　母ＭＯ−ｊ、＠　　　十　　＋４＋　　升　　
　　冊　　　　冊ＭＯ−１１＋　母　＋　＋＋＋　÷ ＭＯ−ｊ　　　　＋）　　　十　　升　　士　　　　什
　　　　柵ＭＯ−ｂ　　ｍ＋＋＋＋＋　　＋ｔ＋　　＋
ｔ＋＋　あまシ良くない 丑良 ■　かなシ良好 冊　非常に良好

【図面の簡単な説明】

図−７１図−一及び図−３はそれぞれ実施例１−コ及び
ｑで製造したマイクロキャリア上の（ＨＯ−に／　　細
胞の顕微鏡写真で表わした図面である。 」−２

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）（メタ）アクリル酸エステルを構成単位とする水
   不溶性の重合体粒子であつて、該粒子は正に荷電し得る
   化学的残基又は蛋白質を表面に化学結合して成り、かつ
   、培養溶液中における平均粒径が５０〜５００μｍ、比
   重が１．００〜１．１５ｇ／ｃｃであることを特徴とす
   る細胞培養マイクロキャリア。
2. （２）該マイクロキャリアの正に荷電し得る化学的残基
   の量は、乾燥マイクロキャリア１ｇ当り、０．１〜３．
   ０ｍｅｑのイオン交換容量を付与するように調節されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞
   培養マイクロキャリア。
3. （３）蛋白質がコラーゲン又はゼラチンであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞培養マイクロ
   キャリア。