JPS6371180A - Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 - Google Patents
Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子Info
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- JPS6371180A JPS6371180A JP61215878A JP21587886A JPS6371180A JP S6371180 A JPS6371180 A JP S6371180A JP 61215878 A JP61215878 A JP 61215878A JP 21587886 A JP21587886 A JP 21587886A JP S6371180 A JPS6371180 A JP S6371180A
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- amino acid
- dna
- acid oxidase
- gene
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はトリボノブシス・ノ々リアビリス（Ｔｒｌｇｏ
ｎｏｐａｉａ ｖｍｒｉａｂｉｌｉｇ）由来であシ、セ
ファロスポリンＣを酸化することのできるＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うＤＮＡ断片およびこのＤＮ
Ａ断片で形質転換されたＤ＝ニアミノオキシタ９−ゼ産
生能を有する新規な大腸菌に関する。
ｎｏｐａｉａ ｖｍｒｉａｂｉｌｉｇ）由来であシ、セ
ファロスポリンＣを酸化することのできるＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うＤＮＡ断片およびこのＤＮ
Ａ断片で形質転換されたＤ＝ニアミノオキシタ９−ゼ産
生能を有する新規な大腸菌に関する。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸の酸化的脱
アミン反応を触媒する酵素である。この酵素はＤＬ−ア
ミノ酸ラセミ混合体からのＬ−アミノ酸分離、Ｄ−アミ
ノ酸からのケト酸の調製、あるいはアミノ酸の分析に応
用され、産業的に有用な％質をもつことが知られている
。この中で酵母トリゴノプシス・バリアビリスが生産す
るＤ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸を酸化す
るのみならず、抗生物質の一種であるセファロスポリン
Ｃを酸化して７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペ
ンタンアミド）セファロスポラン酸を生成させることで
注目されている。またこの化合物は同時に生成するＨ２
Ｏ２と反応して７−β−（４−カルがキシブタンアミド
）セファロスポラン酸を生成することが知られている。
アミン反応を触媒する酵素である。この酵素はＤＬ−ア
ミノ酸ラセミ混合体からのＬ−アミノ酸分離、Ｄ−アミ
ノ酸からのケト酸の調製、あるいはアミノ酸の分析に応
用され、産業的に有用な％質をもつことが知られている
。この中で酵母トリゴノプシス・バリアビリスが生産す
るＤ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸を酸化す
るのみならず、抗生物質の一種であるセファロスポリン
Ｃを酸化して７−β−（５−カルボキシ−５−オキソペ
ンタンアミド）セファロスポラン酸を生成させることで
注目されている。またこの化合物は同時に生成するＨ２
Ｏ２と反応して７−β−（４−カルがキシブタンアミド
）セファロスポラン酸を生成することが知られている。
これらの化合物は医薬として重要なセファロスポリン系
抗生物質合成の中間原料を提供するものであシ（たとえ
ば特公昭５Ｏ−７１５８）、さらにこれらの化合物にＨ
２Ｏ２やある種のセファロスポリ／・アシラーゼを作用
させてよシ有用な中間原料である７−アミノセファロス
ポラン酸を製造する方法が発明されている（たとえば特
公昭５４−１７０３２）。
抗生物質合成の中間原料を提供するものであシ（たとえ
ば特公昭５Ｏ−７１５８）、さらにこれらの化合物にＨ
２Ｏ２やある種のセファロスポリ／・アシラーゼを作用
させてよシ有用な中間原料である７−アミノセファロス
ポラン酸を製造する方法が発明されている（たとえば特
公昭５４−１７０３２）。
〔発明が解決しようとしている問題点〕しかしながらこ
の酵素が上記の目的のために工業的に有利に用いられる
ためには、容易にかつ安価に製造され、他の諸反応と容
易に連結されうろことが必要であるが、上記酵母菌によ
るＤ−アミノ酸オキシダーぜ生成には特定の訪導条件を
必要とし、また混在する他の種々の酵素の生成を人為的
に抑制することが困難である。このため他の諸反応と連
結させて有用物質生産をはかるには、複雑な反応調整、
あるいは該酵素の充分な程度までの分離精製が要求され
る。
の酵素が上記の目的のために工業的に有利に用いられる
ためには、容易にかつ安価に製造され、他の諸反応と容
易に連結されうろことが必要であるが、上記酵母菌によ
るＤ−アミノ酸オキシダーぜ生成には特定の訪導条件を
必要とし、また混在する他の種々の酵素の生成を人為的
に抑制することが困難である。このため他の諸反応と連
結させて有用物質生産をはかるには、複雑な反応調整、
あるいは該酵素の充分な程度までの分離精製が要求され
る。
〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は上記の問題を解決すべく鋭意研究を展開し、トリゴノ
プシス・バリアビリスから、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子を担うＤＮＡを分離し、これを大腸菌にクローニ
ングすることに成功した。さらにこのＤＮＡ断片に必要
な修飾をほどこして、これをベクターに組みこんだ組換
え体ＤＮＡを導入した大腸菌がＤ−アミノ酸オキシダー
ゼを著量に生産することを見出した。こうして本発明者
らはＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローン化によ
って、それを容易に発現させ、あるいはこの遺伝子を容
易に他の細胞に導入可能な形態に修飾することによって
、この酵素の生産や応用が飛躍的に改良されうろことを
みとめ、本発明を完成するにいたった。
は上記の問題を解決すべく鋭意研究を展開し、トリゴノ
プシス・バリアビリスから、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子を担うＤＮＡを分離し、これを大腸菌にクローニ
ングすることに成功した。さらにこのＤＮＡ断片に必要
な修飾をほどこして、これをベクターに組みこんだ組換
え体ＤＮＡを導入した大腸菌がＤ−アミノ酸オキシダー
ゼを著量に生産することを見出した。こうして本発明者
らはＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローン化によ
って、それを容易に発現させ、あるいはこの遺伝子を容
易に他の細胞に導入可能な形態に修飾することによって
、この酵素の生産や応用が飛躍的に改良されうろことを
みとめ、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明によれば、トリゴノプシス・バリアビリ
ス由来であシ、かつ第１図に示されるアミノ酸配列をコ
ードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を担うＤＮＡ
断片が提供される。
ス由来であシ、かつ第１図に示されるアミノ酸配列をコ
ードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を担うＤＮＡ
断片が提供される。
また、本発明によれば、上記ＤＮＡ Ｗ＋片を大腸菌の
宿主ベクター系で用いられるベクターに組込んだ組換え
体ＤＮＡが提供される。
宿主ベクター系で用いられるベクターに組込んだ組換え
体ＤＮＡが提供される。
更にまた本発明によれば、上記ＤＮＡ断片を組み込んだ
組換え体ＤＮＡで形質転換した新規な大腸菌が提供され
る。
組換え体ＤＮＡで形質転換した新規な大腸菌が提供され
る。
本発明にかかるＤＮＡおよび組換え体微生物は、大略下
記の工１によって造成することができる。
記の工１によって造成することができる。
（１）トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ ４０９５
カら全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断した後、ベク
ターに組みこみ、大腸菌に導入し、ＤＮＡライブラリー
を作成する。トリボノブシス・パリアビＩ） スＣＢ５
４０９５は寄託機関であるセントラール・ピュ−ロー・
フォーアＯシメルカルチ、レス（Ｃ＠ｎｔｒｍａｌＢｕ
ｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ） 、第２ンメ国に寄託番号４０９５号の下に寄託さ
れている酵母である。
カら全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断した後、ベク
ターに組みこみ、大腸菌に導入し、ＤＮＡライブラリー
を作成する。トリボノブシス・パリアビＩ） スＣＢ５
４０９５は寄託機関であるセントラール・ピュ−ロー・
フォーアＯシメルカルチ、レス（Ｃ＠ｎｔｒｍａｌＢｕ
ｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ） 、第２ンメ国に寄託番号４０９５号の下に寄託さ
れている酵母である。
（２）トリゴノプシス・パリアビリスＣＢ８４０９５か
らセファロスポリンＣを酸化する能力をもりＤ−アぽノ
酸オキシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミノ酸
配列を決定する。
らセファロスポリンＣを酸化する能力をもりＤ−アぽノ
酸オキシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミノ酸
配列を決定する。
（３） 得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ
基末端アミノ酸配列の一部分について、これよシ推定さ
れる遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもつオリがヌクレオチド
の混合物を合成し、これをＤＮＡ ７°ローブと称する
。
基末端アミノ酸配列の一部分について、これよシ推定さ
れる遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもつオリがヌクレオチド
の混合物を合成し、これをＤＮＡ ７°ローブと称する
。
（４） ＤＮＡグローブをｓ２Ｐでラベルし、前記（
１）で得られたＤＮＡライブラリーと；口二一・ハイツ
リダイゼーシｌンを行なわせ、ＤＮＡプローブと相補性
を示した大腸菌のコロニーを選択・分離する。
１）で得られたＤＮＡライブラリーと；口二一・ハイツ
リダイゼーシｌンを行なわせ、ＤＮＡプローブと相補性
を示した大腸菌のコロニーを選択・分離する。
（５）選択された大腸菌の菌株からプラスミド鳳をとυ
だし、ベクターに組みこまれたトリ９ノグシスψパリア
ビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡの塩基配列を決定す
る。
だし、ベクターに組みこまれたトリ９ノグシスψパリア
ビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡの塩基配列を決定す
る。
（６）決定されたＤＮＡ塩基配列中にＤ−アミノ酸オキ
７ダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取υ枠を見出し、これをふくむＤＮＡ断
片に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現
のためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体ＤＮＡ
を造成する。
７ダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取υ枠を見出し、これをふくむＤＮＡ断
片に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現
のためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体ＤＮＡ
を造成する。
（７）発現用の組換え体ＤＮＡを宿主たる大腸菌に導入
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生ずる新規な大腸菌
を造成する。
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生ずる新規な大腸菌
を造成する。
上記の工程中でＤＮＡの取扱いに必要な一般的な操作は
当業者ならば容易に行うことができるものであり、たと
えばモレキーラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ） （ティー・マニアティス（Ｔ、
Ｍａｎｉａｔｉｍ ）ら、コールトスプリングツ１−バ
ーラデラトリー（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社（１９８２） ］のよう
な実験操作書にしたがえば、容易に実施できる。使用さ
れる酵素・試薬類もすべて市販の製品が使用可能で６Ｄ
、特にことわらないかぎシ製品で指定されている使用条
件にしたがえば完全に目的を達成することができる。上
記工程（２）において、トリゴノプシス・パリアビリス
からのＤ−アミノ酸オキ７ダーゼの精製は公知であシ（
たとえば文献：スワジェセル（３ｚｖａｊｃｅｒ）う（
１９８５）バイオテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ） ７ 、１−７
）、また蛋白質のアミノ酸配列の決定も公知である〔た
とえば文献：ハンカビラ−（ＨｕｎｋａｐＨｌｅｒ ）
ら（１９８３）サイエンス（５ａｌｅｎＣｓ ） 、
２１９ｙ ６５０−６５９ ） ａ上記工程（３）にお
いて指定された塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物の合成には、市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作
手順にしたがって実施することができる。上記工程（５
）におけるＤＮＡ塩基配列の決定法も公知の方法を用い
ることができる〔たとえば文献：サンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）ら（１９７７） ｆ ｏ シーデインダスオプナ７
Ｎナルアカデミープイエンスユーエスエー（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｌ−ＵＳＡ）。
当業者ならば容易に行うことができるものであり、たと
えばモレキーラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ） （ティー・マニアティス（Ｔ、
Ｍａｎｉａｔｉｍ ）ら、コールトスプリングツ１−バ
ーラデラトリー（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社（１９８２） ］のよう
な実験操作書にしたがえば、容易に実施できる。使用さ
れる酵素・試薬類もすべて市販の製品が使用可能で６Ｄ
、特にことわらないかぎシ製品で指定されている使用条
件にしたがえば完全に目的を達成することができる。上
記工程（２）において、トリゴノプシス・パリアビリス
からのＤ−アミノ酸オキ７ダーゼの精製は公知であシ（
たとえば文献：スワジェセル（３ｚｖａｊｃｅｒ）う（
１９８５）バイオテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ） ７ 、１−７
）、また蛋白質のアミノ酸配列の決定も公知である〔た
とえば文献：ハンカビラ−（ＨｕｎｋａｐＨｌｅｒ ）
ら（１９８３）サイエンス（５ａｌｅｎＣｓ ） 、
２１９ｙ ６５０−６５９ ） ａ上記工程（３）にお
いて指定された塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物の合成には、市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作
手順にしたがって実施することができる。上記工程（５
）におけるＤＮＡ塩基配列の決定法も公知の方法を用い
ることができる〔たとえば文献：サンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）ら（１９７７） ｆ ｏ シーデインダスオプナ７
Ｎナルアカデミープイエンスユーエスエー（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｌ−ＵＳＡ）。
７４ 、５４６３−５４６７ 〕。上記工程（６）にお
いて目的の遺伝子をふくむＤＮＡＵｒ片を発現用ベクタ
ーに組みこむ際は、大腸菌中で遺伝子が発現するのに障
害となシ得るトリゴノプシス・パリアビリスＣＢ８４０
９５由来のアミノ酸非コード領域を削除する必要がある
。このような特定のＤＮＡの領域を削除するには、合成
オリゴヌクレオチドを用いて欠損変異を誘導する公知の
方法（たとえば文献：ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら（１９
８３）メンツズインエンデイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ−）、 １０１ 、４６８−５００）に
したがえばよい。
いて目的の遺伝子をふくむＤＮＡＵｒ片を発現用ベクタ
ーに組みこむ際は、大腸菌中で遺伝子が発現するのに障
害となシ得るトリゴノプシス・パリアビリスＣＢ８４０
９５由来のアミノ酸非コード領域を削除する必要がある
。このような特定のＤＮＡの領域を削除するには、合成
オリゴヌクレオチドを用いて欠損変異を誘導する公知の
方法（たとえば文献：ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら（１９
８３）メンツズインエンデイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ−）、 １０１ 、４６８−５００）に
したがえばよい。
また発現用ベクターとしては宿主内で機能するプロモー
ターやリゲゾーム結合部位をそなえたものであればいず
れでもよいが、セファロスポリンＣを基質とする場合は
、これを分解するβ−ラクタマーゼ遺伝子を保有しない
かあるいは不活化されているものも用いることが好まし
い。上記工程（７）において用Ａる宿主は、通常遺伝子
操作で用いられている大腸菌でよいが、大腸菌は本来セ
ファロスポリンＣを分解するセファロスポリナーゼを産
生ずるので、のぞましくはこの遺伝子が欠損した宿主を
造成して用いる。またＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の
簡便な検出には、０−ジアニンジンを用いる公知の方法
〔たとえば文献二へドリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ ）ら（
１９６８）アーカイプスオプバイオケミストリーアンド
バイオフィソックス（Ａｒｃｈ・Ｂ１ｏｃｈ＠ｎｎ、
Ｂｉｏｐｈｙｍ−）、 １２６ 、１５５−１６４）を
用いることができる。
ターやリゲゾーム結合部位をそなえたものであればいず
れでもよいが、セファロスポリンＣを基質とする場合は
、これを分解するβ−ラクタマーゼ遺伝子を保有しない
かあるいは不活化されているものも用いることが好まし
い。上記工程（７）において用Ａる宿主は、通常遺伝子
操作で用いられている大腸菌でよいが、大腸菌は本来セ
ファロスポリンＣを分解するセファロスポリナーゼを産
生ずるので、のぞましくはこの遺伝子が欠損した宿主を
造成して用いる。またＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の
簡便な検出には、０−ジアニンジンを用いる公知の方法
〔たとえば文献二へドリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ ）ら（
１９６８）アーカイプスオプバイオケミストリーアンド
バイオフィソックス（Ａｒｃｈ・Ｂ１ｏｃｈ＠ｎｎ、
Ｂｉｏｐｈｙｍ−）、 １２６ 、１５５−１６４）を
用いることができる。
以下、実施例によｐ本発明をよシ詳細に説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例ＩＤ−アミノ酸オキ７ダーゼ遺伝子のクロ゛−ニ
ングと大腸菌における発現 １、トリゴノプシス・バリアビリスからの全ＤＮＡの抽
出と切断 クライヤー（Ｃｒｙｓ ｒ ）らの方法〔文献：メンツ
ズインセルパイオＣＩノー（Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｌｏｌｏｇｙ）１２巻、３９−４４．アカデ
ミツク プレス（人ｃａｄｅｍｃｅＰｒｅｓｓ ）社、
１９７５）にしたがって、トリゴノプシス・バリアビリ
スＣＢ５４０９５から全ＤＮＡを抽出精製した。このＤ
ＮＡ ４０μｙをとシ、制限酵ｆｉＭｂ。
ングと大腸菌における発現 １、トリゴノプシス・バリアビリスからの全ＤＮＡの抽
出と切断 クライヤー（Ｃｒｙｓ ｒ ）らの方法〔文献：メンツ
ズインセルパイオＣＩノー（Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｌｏｌｏｇｙ）１２巻、３９−４４．アカデ
ミツク プレス（人ｃａｄｅｍｃｅＰｒｅｓｓ ）社、
１９７５）にしたがって、トリゴノプシス・バリアビリ
スＣＢ５４０９５から全ＤＮＡを抽出精製した。このＤ
ＮＡ ４０μｙをとシ、制限酵ｆｉＭｂ。
！４単位と３７０，１５分間反応させた。反応液全等量
のフェノール・クロロホルム（１：１）で抽出し、ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させた後、０．１倍濃度のＴＥ緩
’ＡＨＣ１０ｍＭ）リス−塩酸（ＦＪ（８、０） ｅ
ｌ ｒｎＮＬ ＥＤＴＡ ）にとかした。得られたＤＮ
Ａ溶液の全量を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し
、６〜９ ｋｂの大きさに相当するＤＮＡをふくむ部分
を切出して、電気溶出法によりグルからＤＮＡ断片を溶
出させた。ついで溶出液を当量のフェノールおよびフェ
ノール・クロロホルムで順次抽出し、得られ穴水層にエ
タノールを添加してＤＮＡを沈殿させた後、０．１倍濃
度のＴＥ緩衝液２０μｔにとかした。
のフェノール・クロロホルム（１：１）で抽出し、ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させた後、０．１倍濃度のＴＥ緩
’ＡＨＣ１０ｍＭ）リス−塩酸（ＦＪ（８、０） ｅ
ｌ ｒｎＮＬ ＥＤＴＡ ）にとかした。得られたＤＮ
Ａ溶液の全量を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し
、６〜９ ｋｂの大きさに相当するＤＮＡをふくむ部分
を切出して、電気溶出法によりグルからＤＮＡ断片を溶
出させた。ついで溶出液を当量のフェノールおよびフェ
ノール・クロロホルムで順次抽出し、得られ穴水層にエ
タノールを添加してＤＮＡを沈殿させた後、０．１倍濃
度のＴＥ緩衝液２０μｔにとかした。
２、 ベクターＤＮＡの開裂
ベクターｐＵｃ＋ε ３０μｙをＢａｎ ＨＩで完全に
開裂させ、得られたＤＮＡ断片を０．１倍濃度のＴＩ緩
衝液２０μｔにとかした。
開裂させ、得られたＤＮＡ断片を０．１倍濃度のＴＩ緩
衝液２０μｔにとかした。
３、 ベクターへのＤＮＡ断片の挿入
上記工程ｌで得られた溶液と上記工程２で得られた溶液
を３：１の割合に混合し、Ｔ４・ＤＮＡ ＩＪｆ−・ゼ
を１５℃で６時間反応させ、ベクターとトリボノブシス
−パリアビリスＣＢＳ ４０９５のＤＮＡ断片を結合さ
せた。
を３：１の割合に混合し、Ｔ４・ＤＮＡ ＩＪｆ−・ゼ
を１５℃で６時間反応させ、ベクターとトリボノブシス
−パリアビリスＣＢＳ ４０９５のＤＮＡ断片を結合さ
せた。
４、トリゴノプシス・バリアビリスのＤＮＡライブラリ
ーの作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Ｅａｃｈ
ｅｒｌｃｈｌａ ｃｏｌｔ）ＭＣ１０６１（米国シカゴ
大字マルコム カサ〆パン（Ｍａｌｃｏｍ Ｃａａａ
ｄａｂａｎ）博士ヨシ入手。本菌の性質はジャーナル
オツ モレキュラー バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、） 、 １３８ 。
ーの作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Ｅａｃｈ
ｅｒｌｃｈｌａ ｃｏｌｔ）ＭＣ１０６１（米国シカゴ
大字マルコム カサ〆パン（Ｍａｌｃｏｍ Ｃａａａ
ｄａｂａｎ）博士ヨシ入手。本菌の性質はジャーナル
オツ モレキュラー バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、） 、 １３８ 。
１７９−２０７．１９８０に記載されている）をＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンで処理し
た後、セファロスポリンＣに対する感受性が増大したコ
ロニーを選択した。これらの中からセファロスポリナー
ゼ活性をほとんど示さない株を選択分離し、その−株を
エシェリヒア・コリＭＢ ６５と命名して宿主として用
いた。なお本変異株エシェリヒア・コ１７ ＭＢ ６５
は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第８
９００号として寄託されている。つぎに上記工程３で得
られた組換え体ＤＮＡを形質転換によりエシェリヒア・
コリＭＢ６５に導入し、アンピシリン５０μル値をふく
むＬ−プロス寒天培地上で生育してきたコロニーを集め
て、これをトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ ４０
９５のＤＮＡライブラリーと称した。
チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンで処理し
た後、セファロスポリンＣに対する感受性が増大したコ
ロニーを選択した。これらの中からセファロスポリナー
ゼ活性をほとんど示さない株を選択分離し、その−株を
エシェリヒア・コリＭＢ ６５と命名して宿主として用
いた。なお本変異株エシェリヒア・コ１７ ＭＢ ６５
は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第８
９００号として寄託されている。つぎに上記工程３で得
られた組換え体ＤＮＡを形質転換によりエシェリヒア・
コリＭＢ６５に導入し、アンピシリン５０μル値をふく
むＬ−プロス寒天培地上で生育してきたコロニーを集め
て、これをトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ ４０
９５のＤＮＡライブラリーと称した。
５、 Ｄ−アミノ酸オキ７ダーゼのアミノ基末端アミ
ノ酸配列の決定 トリボノブシス・バイアビスＣＢ８４０９５から＠述の
スワジェセル（Ｓｚｗａｊｅ＠ｒ ）らの方法にしたが
ってＤ−アミノ酸オキシダーゼを精製した。精製した酵
素蛋白質のアミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方法に
より解析し、アミノ基末端から４１番目までのアミノ酸
配列を決定した。得られたＮ−末端アミノ酸配列を次式
にて表わす。
ノ酸配列の決定 トリボノブシス・バイアビスＣＢ８４０９５から＠述の
スワジェセル（Ｓｚｗａｊｅ＠ｒ ）らの方法にしたが
ってＤ−アミノ酸オキシダーゼを精製した。精製した酵
素蛋白質のアミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方法に
より解析し、アミノ基末端から４１番目までのアミノ酸
配列を決定した。得られたＮ−末端アミノ酸配列を次式
にて表わす。
Ａｉｍ−Ｌ７１１−１１＠−Ｖａｌ−Ｖｍｌ−１１ｅ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｉｍ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙａ−Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｃ１ｕ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−人５ｐ−Ｌｓｕ−８
ｓｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−注：下線部はゾロープ
合成に用いられた配列を示す。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｉｍ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙａ−Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｃ１ｕ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−人５ｐ−Ｌｓｕ−８
ｓｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−注：下線部はゾロープ
合成に用いられた配列を示す。
６、 ＤＮＡプローブの合成
上記工程５で得られたアミノ酸配列中から前記式中に下
線で示される２個所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴ９ヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物を
つくシ、これらをＤＮＡプローブＤＡＯ−１とＤＡＯ−
２およびＤＡＯ−３とＤＡＯ−４と称した。オリがヌク
レオチドの合成はすべてアプライド ノ９イオシステム
（ＡｐｐＨｅｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍ ）社のＤＮＡ ７
ンセサイデー（Ｓｙｎｔｈｅｓｌｚｅｒ）モデル３ＲＯ
−Ａを用いて行なったＯ （城下未白） ７、 ＤＮＡライブラリーからＤ−アミノ酸アキシダ
ーゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたＤＮＡプローブを各々イングリア
（Ｉｎｇｌｉｍ ）らの方法〔文献：ヌクレイツクアシ
ッドリサーチ（Ｎｕｃｌｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒａｍ、
） 、旦。
線で示される２個所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴ９ヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物を
つくシ、これらをＤＮＡプローブＤＡＯ−１とＤＡＯ−
２およびＤＡＯ−３とＤＡＯ−４と称した。オリがヌク
レオチドの合成はすべてアプライド ノ９イオシステム
（ＡｐｐＨｅｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍ ）社のＤＮＡ ７
ンセサイデー（Ｓｙｎｔｈｅｓｌｚｅｒ）モデル３ＲＯ
−Ａを用いて行なったＯ （城下未白） ７、 ＤＮＡライブラリーからＤ−アミノ酸アキシダ
ーゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたＤＮＡプローブを各々イングリア
（Ｉｎｇｌｉｍ ）らの方法〔文献：ヌクレイツクアシ
ッドリサーチ（Ｎｕｃｌｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒａｍ、
） 、旦。
１６２７−１６４２．１９８２：ｌにしたがってＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰを用いて
ラベルした。つぎにＤＮＡライブラリーである前記工程
４で得られた大腸菌をアンピシリン５０μ９／Ｒｔをふ
くむＬ−プロス寒天培地上でコロニーとして生育させ、
こｆｌ−全レプリカ法によってワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ） ５４１ （ｐ紙へうつし、リゾチーム溶菌し、
アルカリでＤＮＡ変性させ、塩酸による中和処理を行な
った後、ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２とハイブリダイゼ
ーシヨンさせた。ハイブリダイゼーシヨンは６倍濃度の
ＳＳＣ（０，１５ＭＮａＣＬ、 ０．０１５ Ｍクエン
酸ナトリウム、 ｐＨ７，０） 、 ０．５％ノニデッ
トＰ−４０（シグマ社、米国製）、ＤＡＯ−１あるいは
ＤＡＯ−２約２ ｘ １０ ｃｐｍ／ｒＩＬｔを用いて
、４４℃で１時間半行かい−この涛６倍漏度のＳＳＣを
用りで常温で２回、つづいて６倍濃度のｓｓｃ ６用い
て４４℃で１回ν紙を洗浄した。この後濾紙を乾燥させ
、オートラジオグラフィ（感光条件ニー８０℃、３時間
）に供した。その結果、 ＤＡＯ−１またはＤＡＯ−２
に対しハイブリダイゼータ１ン陽性のコロニーが多数見
出さｎた。そこで陽性のコロニーから４０株をとシあげ
、液体培養した後、パーンボイム（Ｂｌｒｎｂｏｉｍ）
らの方法〔文献：ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕ
ｃｌｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒａｍ、）、 ７．１５１３
−１５２３．１９７９）によりプラスミドＤＮＡを調製
した。ついでこれらのＤＮＡ ｆ：審決により変性させ
た後、ニトロセルロースフィルターにスポットして、
ＤＮＡプローブとハイプリダイゼーシ薗ンさせた。ノー
イブリダーゼーシ璽ンは６倍濃度のＳＳＣ，１００倍濃
のデンハルトＣＤ＠ｎｈａｒｄｔ）液（０，０２％フィ
コール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％
牛血清アルブミン）およびラベルしたＤＮＡプローブを
用いて、４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２の場合）
または４０℃（ＤＡＯ−３およびＤＡＯ−４の場合）で
１時間行ない、この後６倍濃度のｓｓｃ ’４用いて室
温で１回、ついで４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２
の場合）または４０℃（ＤＡＯ−３オよびＤＡＯ−４）
場合）テ１ 回洗浄した。この後フィルターをオートラ
ジオグラフィー（感光条件ニー８０℃、３時間）に供し
た結果、ＤＡＯ−１あるいはＤＡＯ−２にハイプリダイ
ゼータ１ン陽性を示すものでかつＤＡＯ−３あるいはＤ
ＡＯ−４にも陽性を示すものが６株見出された。こｎら
６株からのプラスミドＤＮＡ ｔ一種々の制限酵素で切
断し、アガロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルし
九ＤＮＡ ７’ロー゛プとサザン・ハイプリダイゼーシ
璽ン〔方法については文献：サデン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）（１９７５）ジャーナルオブモレキュラーバイオロノ
ー（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、） 、 ９８．５０３−
５１７）を行なった。その結果、ＥｅｏＲＩ切断で虫取
する約０．６ｋｂ ノＤＮＡ Ｑ 片Ｋ ＤＡＯ−２、
！： ＤＡＯ−３またはＤＡＯ−４カ強くハイブリダイ
ゼーシ１ン湯性を示すグラスミドＤＮＡが見出さｎた。
リヌクレオチドキナーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰを用いて
ラベルした。つぎにＤＮＡライブラリーである前記工程
４で得られた大腸菌をアンピシリン５０μ９／Ｒｔをふ
くむＬ−プロス寒天培地上でコロニーとして生育させ、
こｆｌ−全レプリカ法によってワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ） ５４１ （ｐ紙へうつし、リゾチーム溶菌し、
アルカリでＤＮＡ変性させ、塩酸による中和処理を行な
った後、ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２とハイブリダイゼ
ーシヨンさせた。ハイブリダイゼーシヨンは６倍濃度の
ＳＳＣ（０，１５ＭＮａＣＬ、 ０．０１５ Ｍクエン
酸ナトリウム、 ｐＨ７，０） 、 ０．５％ノニデッ
トＰ−４０（シグマ社、米国製）、ＤＡＯ−１あるいは
ＤＡＯ−２約２ ｘ １０ ｃｐｍ／ｒＩＬｔを用いて
、４４℃で１時間半行かい−この涛６倍漏度のＳＳＣを
用りで常温で２回、つづいて６倍濃度のｓｓｃ ６用い
て４４℃で１回ν紙を洗浄した。この後濾紙を乾燥させ
、オートラジオグラフィ（感光条件ニー８０℃、３時間
）に供した。その結果、 ＤＡＯ−１またはＤＡＯ−２
に対しハイブリダイゼータ１ン陽性のコロニーが多数見
出さｎた。そこで陽性のコロニーから４０株をとシあげ
、液体培養した後、パーンボイム（Ｂｌｒｎｂｏｉｍ）
らの方法〔文献：ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕ
ｃｌｓｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒａｍ、）、 ７．１５１３
−１５２３．１９７９）によりプラスミドＤＮＡを調製
した。ついでこれらのＤＮＡ ｆ：審決により変性させ
た後、ニトロセルロースフィルターにスポットして、
ＤＮＡプローブとハイプリダイゼーシ薗ンさせた。ノー
イブリダーゼーシ璽ンは６倍濃度のＳＳＣ，１００倍濃
のデンハルトＣＤ＠ｎｈａｒｄｔ）液（０，０２％フィ
コール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％
牛血清アルブミン）およびラベルしたＤＮＡプローブを
用いて、４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２の場合）
または４０℃（ＤＡＯ−３およびＤＡＯ−４の場合）で
１時間行ない、この後６倍濃度のｓｓｃ ’４用いて室
温で１回、ついで４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２
の場合）または４０℃（ＤＡＯ−３オよびＤＡＯ−４）
場合）テ１ 回洗浄した。この後フィルターをオートラ
ジオグラフィー（感光条件ニー８０℃、３時間）に供し
た結果、ＤＡＯ−１あるいはＤＡＯ−２にハイプリダイ
ゼータ１ン陽性を示すものでかつＤＡＯ−３あるいはＤ
ＡＯ−４にも陽性を示すものが６株見出された。こｎら
６株からのプラスミドＤＮＡ ｔ一種々の制限酵素で切
断し、アガロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルし
九ＤＮＡ ７’ロー゛プとサザン・ハイプリダイゼーシ
璽ン〔方法については文献：サデン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
）（１９７５）ジャーナルオブモレキュラーバイオロノ
ー（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、） 、 ９８．５０３−
５１７）を行なった。その結果、ＥｅｏＲＩ切断で虫取
する約０．６ｋｂ ノＤＮＡ Ｑ 片Ｋ ＤＡＯ−２、
！： ＤＡＯ−３またはＤＡＯ−４カ強くハイブリダイ
ゼーシ１ン湯性を示すグラスミドＤＮＡが見出さｎた。
このグラスミドｌ ｐＤＡＯＣ２−１２と命名し、Ｄ−
アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候補とした。
アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候補とした。
８゜ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの同定とＤ
ＮＡ塩基配列の決定 グラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よｆｉ ＥｅｏＲＩ切断
によシ生成する０、６ｋｂのＤＮＡ ＠片について、前
述のサンガー （Ｓａｎｇ・ｒ）らの方法に従ってＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、第２図に示さｎるよ
うに真核生物の遺伝子中に存在するイントロン様の配列
をはさんで、上記工程５で得らｎたＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼのアミノ基宋端のアミノ酸配列に完全に一致する
アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断
片がＤ−アミノ酸オキシダーゼ遠祖子の一部をふくむこ
とが明らかになった。プラスミドｐＤＡＯｃ２−１２に
ついては、制限酵素切断の結果に゛もとづいて第３図に
あられ場ｎる制限酵素開裂地図を作成した。上記の結果
にもとづいて、すでに決定された塩基配列から遺伝子読
取シ方向の下流にあたる領域についてＤＮＡ塩基配列を
決定したところ、第１図に示される３５５個のアミノ酸
よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在することが
判明した（第１図では第２図で示烙れたイントロン様配
列を削除して表示しである）。かくして！ラスミドｐＤ
ＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・バリアビリスＣＢ
５４０９５由来のＤＮＡ断片中にはＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼの構造遺伝子が完全にふくま九でいるものと推定
嘔れる。
ＮＡ塩基配列の決定 グラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よｆｉ ＥｅｏＲＩ切断
によシ生成する０、６ｋｂのＤＮＡ ＠片について、前
述のサンガー （Ｓａｎｇ・ｒ）らの方法に従ってＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、第２図に示さｎるよ
うに真核生物の遺伝子中に存在するイントロン様の配列
をはさんで、上記工程５で得らｎたＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼのアミノ基宋端のアミノ酸配列に完全に一致する
アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断
片がＤ−アミノ酸オキシダーゼ遠祖子の一部をふくむこ
とが明らかになった。プラスミドｐＤＡＯｃ２−１２に
ついては、制限酵素切断の結果に゛もとづいて第３図に
あられ場ｎる制限酵素開裂地図を作成した。上記の結果
にもとづいて、すでに決定された塩基配列から遺伝子読
取シ方向の下流にあたる領域についてＤＮＡ塩基配列を
決定したところ、第１図に示される３５５個のアミノ酸
よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在することが
判明した（第１図では第２図で示烙れたイントロン様配
列を削除して表示しである）。かくして！ラスミドｐＤ
ＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・バリアビリスＣＢ
５４０９５由来のＤＮＡ断片中にはＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼの構造遺伝子が完全にふくま九でいるものと推定
嘔れる。
グ、 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の修飾クローニ
ングされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が大腸渭で
発現する上で障害となシうるＤＮＡ塩基り己列部分をグ
ラスミドｐＤＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・バリ
アビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡ断片から第４図に
示される工程にしたがって削除した。以下に各工程を詳
述する。
ングされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が大腸渭で
発現する上で障害となシうるＤＮＡ塩基り己列部分をグ
ラスミドｐＤＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・バリ
アビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡ断片から第４図に
示される工程にしたがって削除した。以下に各工程を詳
述する。
（１）プラスミ）” ｐＤＡＯｃ２−１２４０ ＡＩを
ＥｅｏＲＩとＨｉｎｄｌｌで切断し、得らｎる約０．４
５ ｋｂの断片を精製した後、その０．８μ９にｄＡＴ
Ｐ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 。
ＥｅｏＲＩとＨｉｎｄｌｌで切断し、得らｎる約０．４
５ ｋｂの断片を精製した後、その０．８μ９にｄＡＴ
Ｐ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 。
ＴＴＰを？−濃度各０．３３ ｍＭ、 ＤＮＡポリメラ
ーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片５単位を加え、１０
ｍＭ トリス−塩酸（ｐ）１７．５）、１０ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１ｒｒＬＭジチオスレイトール、５０ ｍ
Ｍ ＮａＣ４の反応ｉ３０μを中で３０℃、２０分間反
応させた。こｎによシ両端が平滑端にされたＤＮＡ断片
を精製し、その約０．２μｓにＢａｍＨｌリンカ−（０
，０１７５０，Ｄ、）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位を
加え、５０ ｍＭ トリス−塩酸（ｐ）１７．５）、１
０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．０．５ｍＭ ＡＴＰ 、 ５
ｍＭソチ、４−；’し４トールの反応液２０μを中で１
５℃、−夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨｌで両端を切断し、ＥｅｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片として回収した。
ーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片５単位を加え、１０
ｍＭ トリス−塩酸（ｐ）１７．５）、１０ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１ｒｒＬＭジチオスレイトール、５０ ｍ
Ｍ ＮａＣ４の反応ｉ３０μを中で３０℃、２０分間反
応させた。こｎによシ両端が平滑端にされたＤＮＡ断片
を精製し、その約０．２μｓにＢａｍＨｌリンカ−（０
，０１７５０，Ｄ、）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位を
加え、５０ ｍＭ トリス−塩酸（ｐ）１７．５）、１
０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．０．５ｍＭ ＡＴＰ 、 ５
ｍＭソチ、４−；’し４トールの反応液２０μを中で１
５℃、−夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精製し、Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨｌで両端を切断し、ＥｅｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片として回収した。
一方ファージＭｌ ３ｍｐ １ Ｂの２本鎖ＤＮＡをＥ
ｃｏＲｌとＢａｍＨＩで切断した後、こｎに上記のＥｑ
ｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ
で結合させて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部
を組みこんだファージＭ１３Ｍ２−１２−７を造成した
。
ｃｏＲｌとＢａｍＨＩで切断した後、こｎに上記のＥｑ
ｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ
で結合させて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部
を組みこんだファージＭ１３Ｍ２−１２−７を造成した
。
（２） イントロン様配列を削除するために、第４図
に示されるようにイントロン様配列の前後を直結した配
列に相補するオリゴヌクレオチドを合成し、ＤＡＯＥＩ
と命名した。ＤＡＯＥＩ ２５ ｐｍｏｌｅとＭ １３
プライマ−Ｍｌ（全酒造社製） １０ｐｍｏｌｅをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し、メッシング（
Ｍｓｓｓｉｎｇ ）の方法〔文献二メンツズインエンデ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄａ Ｅｎｚｙｍｏｌ、）＋
１０１＋ ２０−７８゜１９８３）にしたがりて調製し
たファージＭ１３Ｍ２−１２−７の１本鎖ＤＮＡ約０．
５ｐｍｏｌｅを加え、９５℃で５分間加熱後室温になる
まで放置した。ついでこｎにｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、 ＴＴＰ（各Ｑ、４ ｍＭ）ｓ ＡＴＰ （
０，４ｍＭ）、ＤＮＡホリメラーゼクレノウ（Ｋｌａｎ
ｏｗ）断片（５単位）、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼ（２単
位）を加え、各７ｍＭのトリス−塩酸（ｐ８７．５）、
ＭｇＣ２２，ＮａＣ２および１４綱のジチオスレイトー
ルの反応液５０μを中で３７℃、３０分間反応させた。
に示されるようにイントロン様配列の前後を直結した配
列に相補するオリゴヌクレオチドを合成し、ＤＡＯＥＩ
と命名した。ＤＡＯＥＩ ２５ ｐｍｏｌｅとＭ １３
プライマ−Ｍｌ（全酒造社製） １０ｐｍｏｌｅをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し、メッシング（
Ｍｓｓｓｉｎｇ ）の方法〔文献二メンツズインエンデ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄａ Ｅｎｚｙｍｏｌ、）＋
１０１＋ ２０−７８゜１９８３）にしたがりて調製し
たファージＭ１３Ｍ２−１２−７の１本鎖ＤＮＡ約０．
５ｐｍｏｌｅを加え、９５℃で５分間加熱後室温になる
まで放置した。ついでこｎにｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、 ＴＴＰ（各Ｑ、４ ｍＭ）ｓ ＡＴＰ （
０，４ｍＭ）、ＤＮＡホリメラーゼクレノウ（Ｋｌａｎ
ｏｗ）断片（５単位）、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼ（２単
位）を加え、各７ｍＭのトリス−塩酸（ｐ８７．５）、
ＭｇＣ２２，ＮａＣ２および１４綱のジチオスレイトー
ルの反応液５０μを中で３７℃、３０分間反応させた。
０．５ＭのＥＤＴＡ５μｔを加えて反応停止後、メッシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法（文献前出）にしたがっ
てエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｅｈｉａ ｃｏ
旦）ＪＭ１０５を反応液でトランスフエクシ１ン処理し
、ファーソ導入菌をプラークとして検出した。出現した
ファージ・プラークをプラーク・ハイプリダイゼーシ慶
ン法〔文献：ベントン（Ｂａｎｔｏｎ）ら（１９７７）
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）＋１９６、１８０−１８
２） によって ＰでフペルしたＤＡＯＥＩトハイプリ
ダイゼーシ首ンさせ、陽性を示したプラークを見出した
。陽性プラーク中のファージを再度エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０５に感染させて、上記と同様にしてＤＡＯＥ
１とノ１イプリダイゼーシツンを示すプラークを純化し
て分離した後、プラーク中に存在するファージを常法忙
よって液体培養し、１本鎖ＤＮＡを分離した。得らｎた
１本鎖ＤＮＡの塩基配列を解析したところ、予定通ジイ
ントロン様配列を欠失した塩基配列をもつトリゴノゾシ
ス・パリアビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡ断片をも
つことが判明したので、このファージをＭ１３ＭＥ１と
命名した。
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法（文献前出）にしたがっ
てエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｅｈｉａ ｃｏ
旦）ＪＭ１０５を反応液でトランスフエクシ１ン処理し
、ファーソ導入菌をプラークとして検出した。出現した
ファージ・プラークをプラーク・ハイプリダイゼーシ慶
ン法〔文献：ベントン（Ｂａｎｔｏｎ）ら（１９７７）
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）＋１９６、１８０−１８
２） によって ＰでフペルしたＤＡＯＥＩトハイプリ
ダイゼーシ首ンさせ、陽性を示したプラークを見出した
。陽性プラーク中のファージを再度エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０５に感染させて、上記と同様にしてＤＡＯＥ
１とノ１イプリダイゼーシツンを示すプラークを純化し
て分離した後、プラーク中に存在するファージを常法忙
よって液体培養し、１本鎖ＤＮＡを分離した。得らｎた
１本鎖ＤＮＡの塩基配列を解析したところ、予定通ジイ
ントロン様配列を欠失した塩基配列をもつトリゴノゾシ
ス・パリアビリスＣＢ８４０９５由来のＤＮＡ断片をも
つことが判明したので、このファージをＭ１３ＭＥ１と
命名した。
（３）つぎにＤ−アミノ酸オキシダーゼ蛋白質合成開始
部位（ＡＴＧ）よシも上流にあるトリゴノプシス・パリ
アビリスＣＢ８４０９５由来のアミノ酸非コード領域を
削除するために、第４図に示さｎるようにこの領域の前
後を直結した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し
、ＤＡＯＥ２と命名した。ついでＤＡＯＥ２とファージ
Ｍ１３ＭＥ１の１本鎖ＤＮＡとから、上記工程（２）で
のべた方法と同一の工程にしたがって、イントロン様配
列の削除に加えてＡＴＧより上流のアミノ酸非コード領
域をも削除されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一
部を保有するファージを造成し、こＡ′！ｉ−Ｍ１３Ｍ
Ｅ１２と命名Ｌ７’Ｃ６１０、発現ベクターの造成 本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラス
ミドであるｐＡＫＫＭｌは公知の文献マツダ（Ｍａｔｓ
ｕｃｌｍ）ら（１９８５）ジャーナルオブパクテリオロ
ジー（Ｊ、Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．）、 １６３．１２２
２−１２２８にその造成方法が示されており、β−ラク
タマーゼ遺伝子が不活化さ：ｎ九特徴をもつ。第５図に
示すように、まずｐＡ）ＣＫＭｌをＥｃｏＲＩとＢ ａ
ｍＨＩで切断し。
部位（ＡＴＧ）よシも上流にあるトリゴノプシス・パリ
アビリスＣＢ８４０９５由来のアミノ酸非コード領域を
削除するために、第４図に示さｎるようにこの領域の前
後を直結した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し
、ＤＡＯＥ２と命名した。ついでＤＡＯＥ２とファージ
Ｍ１３ＭＥ１の１本鎖ＤＮＡとから、上記工程（２）で
のべた方法と同一の工程にしたがって、イントロン様配
列の削除に加えてＡＴＧより上流のアミノ酸非コード領
域をも削除されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一
部を保有するファージを造成し、こＡ′！ｉ−Ｍ１３Ｍ
Ｅ１２と命名Ｌ７’Ｃ６１０、発現ベクターの造成 本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラス
ミドであるｐＡＫＫＭｌは公知の文献マツダ（Ｍａｔｓ
ｕｃｌｍ）ら（１９８５）ジャーナルオブパクテリオロ
ジー（Ｊ、Ｂａｃｔ＠ｒｉｏ１．）、 １６３．１２２
２−１２２８にその造成方法が示されており、β−ラク
タマーゼ遺伝子が不活化さ：ｎ九特徴をもつ。第５図に
示すように、まずｐＡ）ＣＫＭｌをＥｃｏＲＩとＢ ａ
ｍＨＩで切断し。
これより約５ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。一方
ｔａｃ ＵＶ５プロモーターをふくむグラスミドｐＲ２
４０２２（米国ライスコンシン大学ダブリュー・レズニ
＝ｙ）（Ｗ、Ｒｅｚｎｌｋｏｆｆ ）博士より入手〕を
ＥｅｏＲＩとＢａｍＨＩで切断することによりムｃ Ｕ
Ｖ５プロモーターを含む９５ ｂｐの断片を調製した。
ｔａｃ ＵＶ５プロモーターをふくむグラスミドｐＲ２
４０２２（米国ライスコンシン大学ダブリュー・レズニ
＝ｙ）（Ｗ、Ｒｅｚｎｌｋｏｆｆ ）博士より入手〕を
ＥｅｏＲＩとＢａｍＨＩで切断することによりムｃ Ｕ
Ｖ５プロモーターを含む９５ ｂｐの断片を調製した。
ついで上記２断片をＴ ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼを用い
て結合させ、発現用ベクターｐ■００２を得た。なお上
記で用いたプラスミドｐＲＺ ４０２２はギ）Ｖ）々−
ト（Ｇ１１ｂｅｒｔ ）らの方法〔文献：プロシーデイ
ンダスオフナシ冒ナルアカデミーサイエンスユーエスエ
ー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
） 、 ７０ 、３５８１−３５８４ 、１９７３ ］
にしたがって］ムｃ−ＵＶ５プロモータをふくむ９５
ｂｐのＡＬｕ ｌ断片をｐｍし、ｐＢＲ３２２のＥｅｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に置換挿入することによって造成
される。
て結合させ、発現用ベクターｐ■００２を得た。なお上
記で用いたプラスミドｐＲＺ ４０２２はギ）Ｖ）々−
ト（Ｇ１１ｂｅｒｔ ）らの方法〔文献：プロシーデイ
ンダスオフナシ冒ナルアカデミーサイエンスユーエスエ
ー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
） 、 ７０ 、３５８１−３５８４ 、１９７３ ］
にしたがって］ムｃ−ＵＶ５プロモータをふくむ９５
ｂｐのＡＬｕ ｌ断片をｐｍし、ｐＢＲ３２２のＥｅｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に置換挿入することによって造成
される。
１１、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現第６図に
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え体の造成
工程を示す。まずファージＭ１３ＭＥ１２の２本鎖ＤＮ
Ａよりｆｌｃ ｏＲＩおよびＢ ａ ｍＨＩ切断によシ
約０．３ｋｂのＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末
端部分をコードするＤＮＡ断片を分離し友。ついでｐＤ
ＡＯｃ ２−１２よりＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ切断に
よＩ）Ｍ１３ＭＥ１２にふくまれている部分をのぞく約
１．２ｋｂのＤ−アきノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部
分をコードするＤＮＡ断片を分離した。さらに発現用ベ
クターｐＥＸ ００２をＢａ ｍＨＩおよび）（ｈｏＩ
で切断した後、上記の２つの断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
！ｊが−ゼで結合反応を行なわせた。その反応液を用
いてエシェリヒア・コリＭＢ６５を形質転換し、カナマ
イシン４０μｇ７ｍｔをふくむＬ−ブゝロス寒天培地上
で生育してくるコロニーを選択した。得られたコロニー
について、Ｄ−メチオニンを基質とし、０−ジアニシジ
ンを用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出（方法
に関する文献前出）を行なった結果、多数の陽性コロニ
ーを得た。この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し
、これをｐＥＤＡｏ １と命名し、制限酵素切断により
第６図に示される構造を確認した。ま念この組換え体を
保有する大腸菌をエシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤ
ＡＯ１と命名した。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え体の造成
工程を示す。まずファージＭ１３ＭＥ１２の２本鎖ＤＮ
Ａよりｆｌｃ ｏＲＩおよびＢ ａ ｍＨＩ切断によシ
約０．３ｋｂのＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末
端部分をコードするＤＮＡ断片を分離し友。ついでｐＤ
ＡＯｃ ２−１２よりＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ切断に
よＩ）Ｍ１３ＭＥ１２にふくまれている部分をのぞく約
１．２ｋｂのＤ−アきノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部
分をコードするＤＮＡ断片を分離した。さらに発現用ベ
クターｐＥＸ ００２をＢａ ｍＨＩおよび）（ｈｏＩ
で切断した後、上記の２つの断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
！ｊが−ゼで結合反応を行なわせた。その反応液を用
いてエシェリヒア・コリＭＢ６５を形質転換し、カナマ
イシン４０μｇ７ｍｔをふくむＬ−ブゝロス寒天培地上
で生育してくるコロニーを選択した。得られたコロニー
について、Ｄ−メチオニンを基質とし、０−ジアニシジ
ンを用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出（方法
に関する文献前出）を行なった結果、多数の陽性コロニ
ーを得た。この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し
、これをｐＥＤＡｏ １と命名し、制限酵素切断により
第６図に示される構造を確認した。ま念この組換え体を
保有する大腸菌をエシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤ
ＡＯ１と命名した。
１２、組換え体を保有する大腸菌によるＤ−メチオニン
およびセファロスポリンＣの酸化 エシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤＡＯ１をカナマイ
シン４０μｌ／ｖＬｌをふくむＬ−ブロス１００ｄに植
菌し、３７℃で２４時時間上う培養した。培讐液を遠心
分離によシ集菌し、７ｄの１００ｍＭピロリン酸緩衝液
（−８，０）に懸濁し、超音波破砕機で細胞を破砕後、
これを遠心分離して得られる上溝を酵素液とした。一方
比較のためトリフ０ノブシス・パリアビリスＣＢＳ ４
０９５を酵母エキス１１２芽エキス１．５％、ＤＬ−メ
チオニン０．２％をふくむ培地１００ｍに植菌し、３０
℃で４８時間振とり培養した。ついで上記と同様にして
集菌し、細胞破砕機（ブラウン社、西独）で処理した後
、細胞破砕上清を酵素液とし友。Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ反応は、Ｄ−メチオニン２７ｍＭ、ビロリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０） ８０ｍＭおよび酵素液からなる３ｄ
の反応液中で３７℃で行ない、酸素電極〔イエロースプ
リングスインストルーメンツ（ＹｅｌｌｏＷＳｐｒ’ｉ
ｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）社（米国）、モデ
ル５１３〕を用いて０２消費量を測定することにより酵
素活性を定量した。反応の１分間に１μｒｎｏｌ＠の０
２を消賛する酵素活性を１単位と定め、比活性を酵素液
中の蛋白質１ダ当りの単位数として表示した。その結果
、エシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤＡｏ １の比活
性は１．６であった。これに対し、トリゴノゾシス・パ
リアビリスＣＢＳ ４０９５の比活性は０．１７であっ
た。
およびセファロスポリンＣの酸化 エシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤＡＯ１をカナマイ
シン４０μｌ／ｖＬｌをふくむＬ−ブロス１００ｄに植
菌し、３７℃で２４時時間上う培養した。培讐液を遠心
分離によシ集菌し、７ｄの１００ｍＭピロリン酸緩衝液
（−８，０）に懸濁し、超音波破砕機で細胞を破砕後、
これを遠心分離して得られる上溝を酵素液とした。一方
比較のためトリフ０ノブシス・パリアビリスＣＢＳ ４
０９５を酵母エキス１１２芽エキス１．５％、ＤＬ−メ
チオニン０．２％をふくむ培地１００ｍに植菌し、３０
℃で４８時間振とり培養した。ついで上記と同様にして
集菌し、細胞破砕機（ブラウン社、西独）で処理した後
、細胞破砕上清を酵素液とし友。Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ反応は、Ｄ−メチオニン２７ｍＭ、ビロリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０） ８０ｍＭおよび酵素液からなる３ｄ
の反応液中で３７℃で行ない、酸素電極〔イエロースプ
リングスインストルーメンツ（ＹｅｌｌｏＷＳｐｒ’ｉ
ｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）社（米国）、モデ
ル５１３〕を用いて０２消費量を測定することにより酵
素活性を定量した。反応の１分間に１μｒｎｏｌ＠の０
２を消賛する酵素活性を１単位と定め、比活性を酵素液
中の蛋白質１ダ当りの単位数として表示した。その結果
、エシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤＡｏ １の比活
性は１．６であった。これに対し、トリゴノゾシス・パ
リアビリスＣＢＳ ４０９５の比活性は０．１７であっ
た。
つぎにエシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐＥＤＡＯ１の酵
素液をセファロスポリンＣに作用させた。反応はセファ
ロスポリンＣ２２，３ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １００ｍＭ、酵素液２００μｌからなる全
量１ｄの反応液中で３７℃で９０分行ない、反応液を高
速液体カラムクロマトグラフィーに供し。
素液をセファロスポリンＣに作用させた。反応はセファ
ロスポリンＣ２２，３ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １００ｍＭ、酵素液２００μｌからなる全
量１ｄの反応液中で３７℃で９０分行ない、反応液を高
速液体カラムクロマトグラフィーに供し。
生成物を定量し之。高速液体カラムクロマトグラムのカ
ラムはコスモシール（Ｃｏａｍｏａｌｌ ） ５ ＣＩ
Ｂ（牛丼化学社製）を用い、移動相としては５優酢酸ア
ンモニウムと１．４％アセトニトリルからなる溶液を用
いて、検出は２８０ ｎｍで行なった。その結果、セフ
ァロスポリンＣは検出されず、７−β−（５−カルボキ
シ−５−オキソペンタンアミド）セファロスボラン酸１
２．５ ｍ）ｗｌと、７−β−（４−カル♂キシブタン
アミド）セファロスポラン酸１１．８ｍＭが生成した。
ラムはコスモシール（Ｃｏａｍｏａｌｌ ） ５ ＣＩ
Ｂ（牛丼化学社製）を用い、移動相としては５優酢酸ア
ンモニウムと１．４％アセトニトリルからなる溶液を用
いて、検出は２８０ ｎｍで行なった。その結果、セフ
ァロスポリンＣは検出されず、７−β−（５−カルボキ
シ−５−オキソペンタンアミド）セファロスボラン酸１
２．５ ｍ）ｗｌと、７−β−（４−カル♂キシブタン
アミド）セファロスポラン酸１１．８ｍＭが生成した。
実施例において詳述したように、本発明者らはセファロ
スポリンＣを酸化するＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子
をクローニングし、大腸菌内において発現可能な形態に
修飾したＤＮＡ断片を取得することによって、飛躍的に
すぐれたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産とそれの広範
な応用の前提条件を与えることができた。公知の常法に
よって上記ＤＮＡ断片の蛋白質合成開始部位の前に任意
のプロモーターとり♂シーム結合部位を結合させ、酵素
蛋白の生産能を増大させ、かつ調節することも可能であ
る。また上記だおいて修飾されたＤＮＡ断片は、大腸菌
の他にも適当な発現ベクターさえあれば、酵母、枯草菌
その他の細胞内において容易に発現される形態を有して
おり、生体内の諸反応と連結してＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼの機能全有益に利用するためのきわめて強力な手段
を提供するものである。
スポリンＣを酸化するＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子
をクローニングし、大腸菌内において発現可能な形態に
修飾したＤＮＡ断片を取得することによって、飛躍的に
すぐれたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産とそれの広範
な応用の前提条件を与えることができた。公知の常法に
よって上記ＤＮＡ断片の蛋白質合成開始部位の前に任意
のプロモーターとり♂シーム結合部位を結合させ、酵素
蛋白の生産能を増大させ、かつ調節することも可能であ
る。また上記だおいて修飾されたＤＮＡ断片は、大腸菌
の他にも適当な発現ベクターさえあれば、酵母、枯草菌
その他の細胞内において容易に発現される形態を有して
おり、生体内の諸反応と連結してＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼの機能全有益に利用するためのきわめて強力な手段
を提供するものである。
第１図はトリゴノゾシス・パリアビリス由来のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。 図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそｎ（
ｎ示す。 第２図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よりｌｉ：ｅｏ
Ｒ１切断により生成する約０．６ ｋｂの断片の塩基配
列の一部を示す。図中で上段は塩基配列を、下段はこれ
に対応するアミノ酸配列を、点線を引いた部分はイント
ロン様配列を示す。 第３図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２の制限酵素開裂
地図を示す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の工程の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Ｃｍｒ、Ｋｍｒ。 ＊ｐｒｈ各々クロラムフェニコール、カナマイシン、ア
ンピシリンに対する耐性遺伝子を、Ｐｔ＊ｃ ＵＶ５は
ｔｈＣＵＶ５プロモーターを示す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工椙の概要を示す。図中でに部分はＤ−アミノ酸
オキシダーゼ（ＤＡＯの略号で表示）のアミノ酸配列コ
ード領域を示す。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第５図
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。 図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそｎ（
ｎ示す。 第２図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よりｌｉ：ｅｏ
Ｒ１切断により生成する約０．６ ｋｂの断片の塩基配
列の一部を示す。図中で上段は塩基配列を、下段はこれ
に対応するアミノ酸配列を、点線を引いた部分はイント
ロン様配列を示す。 第３図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２の制限酵素開裂
地図を示す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の工程の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Ｃｍｒ、Ｋｍｒ。 ＊ｐｒｈ各々クロラムフェニコール、カナマイシン、ア
ンピシリンに対する耐性遺伝子を、Ｐｔ＊ｃ ＵＶ５は
ｔｈＣＵＶ５プロモーターを示す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工椙の概要を示す。図中でに部分はＤ−アミノ酸
オキシダーゼ（ＤＡＯの略号で表示）のアミノ酸配列コ
ード領域を示す。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第５図
Claims (3)
- （１）トリゴノプシス・バリアビリス由来であり、かつ 【遺伝子配列があります】 であらわされるアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸
オキシダーゼの遺伝子を担うＤＮＡ断片。 - （２）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片を大腸菌
の宿主ベクター系で用いられるベクターに組み込んだ組
換え体ＤＮＡ。 - （３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片を組み込
んだ組換え体ＤＮＡで形質転換された大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215878A JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215878A JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6371180A true JPS6371180A (ja) | 1988-03-31 |
| JPH07108225B2 JPH07108225B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=16679753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61215878A Expired - Lifetime JPH07108225B2 (ja) | 1986-09-16 | 1986-09-16 | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108225B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0583817A3 (en) * | 1992-07-27 | 1995-01-11 | Asahi Chemical Ind | Transformer capable of producing D-amino acid oxidase. |
| US5602016A (en) * | 1988-10-13 | 1997-02-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-amino acid oxidase from F. solani and DNA therefor |
| WO2005098000A1 (fr) * | 2004-04-08 | 2005-10-20 | Bioright Worldwide Company Limited | D-amino acide oxydase recombinante |
| WO2007015511A1 (ja) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Kaneka Corporation | Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。 |
| EP2371946A1 (en) | 2010-03-30 | 2011-10-05 | Rijksuniversiteit Groningen | Improved methods and host cells for the production and use of D-amino acid oxidase (DAO). |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707591A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-26 | 东阳市人民医院 | 一种dao蛋白的制备和纯化方法及其应用 |
-
1986
- 1986-09-16 JP JP61215878A patent/JPH07108225B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5602016A (en) * | 1988-10-13 | 1997-02-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-amino acid oxidase from F. solani and DNA therefor |
| US5773272A (en) * | 1988-10-13 | 1998-06-30 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-amino acid oxidase of F. solani and methods for its recombinant production |
| EP0583817A3 (en) * | 1992-07-27 | 1995-01-11 | Asahi Chemical Ind | Transformer capable of producing D-amino acid oxidase. |
| US5453374A (en) * | 1992-07-27 | 1995-09-26 | Asahi Kasai Kogyo Kabushiki Kaisha | Trigonopsis transformant producing D-amino acid oxidase |
| WO2005098000A1 (fr) * | 2004-04-08 | 2005-10-20 | Bioright Worldwide Company Limited | D-amino acide oxydase recombinante |
| US7517677B2 (en) | 2004-04-08 | 2009-04-14 | Jun Wang | Recombinant D-amino acid oxidases |
| WO2007015511A1 (ja) | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Kaneka Corporation | Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。 |
| US8227228B2 (en) | 2005-08-02 | 2012-07-24 | Kaneka Corporation | D-amino acid oxidase, and method for production of L-amino acid, 2-oxo acid, or cyclic imine |
| EP2371946A1 (en) | 2010-03-30 | 2011-10-05 | Rijksuniversiteit Groningen | Improved methods and host cells for the production and use of D-amino acid oxidase (DAO). |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108225B2 (ja) | 1995-11-22 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |