JPS6377900A - ヤママユガ由来のレクチン様物質及びその分離精製法並びにその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヤママユガ（Ａｎｔｈｃｒａｃａ　ｐｅｒｎｙ
ｉ）由来のレクチン様蛋白質に関する物であり、具体的
にはヤマモユガの輔の体液を出発原料として酸処理した
セファロース系アフィニティークロマトグラフィーを用
いることを特徴とするヤマモユガから得られるレクチン
様蛋白質及びその分離精製方法並びにその用途に関する
物である。

（従来技術） レクチンは動植物あるいは細菌で見出される免疫学的産
物にあらざる糖結合性蛋白質の総称であり古くから植物
由来の血球凝集素が知られている。

近年植物からばかりでなく動物からも数々のレクチンが
見出されており、この中には赤血球のみでなく白血球や
ガン細胞等を特異的に凝集するものも発見されその生理
的意義や特性について注目される所となってきた。

本発明者も先に同じ昆虫であるセンチニクバエよりレク
チン様活性を示す物質（ザルコファーガーレクチン）を
見出し、それがｉｎ　ｖＩｔｒｏ　　でマクロファージ
を刺激して殺腫瘍性物質を産生せしめることを見出して
いる。（特願昭５７−１２３２９８号、特願昭５８−９
４９７２号、特願昭５８８−２１２４３６号、特願昭５
９−６６３３０号）本発明者はこれらの結果から生産性
に有利なりママニガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙ
ｌ）にもセンチニクバエと同様、有用物質存在の可能性
を思慮し誠意検討した結果、新規なレクチン様活性を示
す物質（以下ヤママユガレクチン）を見出し、さらには
本物質か公知のレクチン様物質と比較して特異的活性を
示す事を見出し本発明に到達した物である。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者は医学、薬学的見地からしても、各種のレクチ
ン様物質の利用については不十分であり又工業的実施の
可能性について、多数のレクチンＦ、ｌ蛋白質を精製分
離する研究を行っているが、ヤママユガレクチンの単離
精製に成功すると共にその工業的生産方法を発見し本発
明を完成するに至った。

（問題点を解決する為の手段及び作用、発明の主旨） 本発明は餉に属する昆虫、望ましくはヤママユガの体液
中に存在する新規なりママニガレクチンを単離精製しそ
の作用（用途）を見出し、さらにはその工業的生産方法
を開発したことに基づく４勿である。

すなわちヤママユガの桶に所望により大腸菌等の異種物
質を注入し、得られる体液を酸処理したセファロース系
アフィニティークロマトグラフィー用担体を用いて吸着
、分離、分画して精製し、レクチン様蛋白質を得るもの
である。

かくして得られる本発明のレクチン様蛋白質はＴＳＫゲ
ルＨＷ５５を用いたゲルろ過法では約３８０．０００の
分子量を示し又ＳＤＳゲル電気泳動では分子量約３８．
０００の単一のバンドを示す。従ってこの物は通常の条
件下では分子量約３８．０００のサブユニットの会合体
で存在する物と考えられる。　本発明の＋÷←与＋４→
レクチンは、ガラクトース１、　　　／ ラクトースとＮ−アセチルガラクトサミン及びα−メチ
ルグルコシドに強い親和性を示す。又ウサギ赤血球は凝
集するがヒト及び羊赤血球は凝集しない。

（発明の効果） 本発明によるレクチン様蛋白質はウサギ赤血球及びガラ
クトース、ラクトース並びにＮ−アセチルガラクトサミ
ン、α−メチルグルコシド等に特異的に結合する。

従ってこの性質を利用できる数々の用途が考えられるが
、特にこの物質を利用しての生体内糖含を成分の分布及
び役割の解明及び血液判定に利用できる。さらには癌等
の診断薬等としての利用も期待される物である。

なお所望により桶に大腸菌等の異種物質を注入する操作
を行うことにより、体液中に存在するレクチン収率を向
上させる事が可能であるが、工業業的生産の点では、未
処理状態で蚊体液を原料とするのが好ましい。

（実施例） （１）体液の採取 体液の採取は情の臀部を切断しそこから滲み出る体液を
収集した。かかる操作で約１００匹の成虫から約２３５
ｍ１の体液を得た。これをフェニルチオウレアの結晶を
入れたスピッツ管に採取し１０．０００ｒｐＩｌｌで３
０分間の遠心を行ない、その上澄を体液標本として一２
０度Ｃで保存し出発原料とした。

（２）レクチン様蛋白質の精製分離 体成約２００ｍ１を最初に不純蛋白質を除くと共にその
粘度を低下させるために７０度Ｃで１５分間の熱処理を
行なった。これを水冷後１５．ｏｏｏｒｐｍで２０分間
の遠心を行ない、上澄をアフィニテークロマトグラフィ
ー用サンプルとした。アフィニテー用カラムは約１５０
ｍ１のセファロース６Ｂ（ファルマシア製）を０．２規
定塩酸溶液２４０ｍ１中で５３度Ｃで２時間の酸処理を
行ない、蒸溜水でＰＨが約６になるまで洗浄してカラム
につめ洗浄用緩衝液（０，１３ＭＮａＣ１，５ｍＭＫＣ
ｌ、１ｍＭＣａＣ１上、１０ｍＭＣＨ３ＣＯＯサンプル
をかけ０．２Ｍガラクトースで溶出させた。この時のク
ロマトグラムを図面１−Ａに示す。

サンプルは透析後、血球凝集活性は、ウサギ赤血球を用
いて駒野らの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ’ｅｍ、２５６
．７０８７〜７０８９．１９８１）に従って行ない凝集
力価は凝集活性を示す最大希釈値の逆数で示した。その
結果ガラクトース溶出画分の蛋白質ピークとして血球凝
集活性が認められた。

０．２Ｍガラクトース溶出画分をＳＤＳゲル電気泳動に
かけると図面１−Ｂに示す様に分子量３８．０００の−
に単一のバンドが検出され、血球凝集活性もこのバンド
と一致し精製を完了した。以下表１に精製法をまとめて
示す。

このアフィニテー力ラムの回収率は約３０％であった。

かかる操作で約２５ｍｇの精製品を得ることができる。

表１　　精製法のまとめ （３）本発明物質の細胞凝集素の性質 （Ａ）分子量 精製された細胞凝集素をＴＳＫゲルＨＷ５５によるゲル
ろ過性によって分子量を測定すると、約３８０．０００
であった。

ＳＤＳゲル電気泳動における分子量が３８．０００であ
ることから本血球凝集素は分子ｆｆ１３８．ｏｏＯのサ
ブユニットが１０個会合した形で存在しているものと考
えられる。

（Ｂ）血液型特異性とハブテン糖 本発明のヤママユガレクチンはヒトＡＢＯ式各血液型及
び各動物赤血球に対する血球凝集活性を例えば駒野らの
方法（Ｊ、Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅｍ　、２５５．２９１９〜
２９２４（１９８０））によって測定した結果を以下表
２に示す。凝集力価は３Ｎ／ｍｌの精製レクチンの最大
希釈倍率の逆数で示した。表１かられかるように本発明
物質はウサギ赤血球に対して強い凝集活性を示すがヒツ
ジ赤血球やヒトＡＢＯ各型赤血球にはほとんど反応しな
い事がわかる。

表２ ヤママユガレクチンの血液型反応特異性−は最大濃度で
も血球凝集を示さなかったものを示す。

本発明のレクチンの羊赤血球凝集活性に対する各種糖に
対する阻害活性を駒野らの方法（Ｊ、Ｂｌｏｌ。

Ｃｂｅｍ、２５５．２９１９〜２９２４．（１９ｇ４）
）によって血球凝集を５０％阻害する濃度を測定した結
果を表３に示す。糖ではガラクトース、ラクトース、α
−メチルグルコシドおよびＮ−アセチルガラクトサミン
は計母−ローが特に強い阻害活性をもつことがわかる。

　− 表３ −は最大濃度でも阻害活性を示さなかったものを示す。

（参考例） 異物の注入によるレクチン量の増加 大腸菌によるレクチン収量の向上 ヤママユガの輔に大腸菌を注入した場合と無処理の場合
に、その体液中のレクチン量がどの様に変化するかを両
者の体液を用いて駒野らの方法（Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１．
Ｃｈｅｍ、２５６．７０８７〜７０８９．１９８１）に
よって血球凝集活性を測定した結果を図面２に示す。

菌を注入した方は２日目以後で数倍の活性の上昇が認め
られる。

又菌の注入によって上昇したレクチンは無処理の桶から
得られるレクチンに対する抗体と反応することから、同
じレクチンが増加しているものと考えられる。

（製剤例） 本発明物質は、試薬等として用いる場合は０．１〜ＬＯ
＋ｎｇ／ｍｌとなるように添加して得たる溶液を除菌濾
過し、ついで常法によりバイアル等に２ｍｌ程度分注し
、凍結乾燥させる。

用時に生理食塩水等に溶解して用いる。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａはレクチン様蛋白質のセファロース６Ｂカラム
クロマトグラムパターンを示す。 第１図Ｂはレクチン様蛋白質のＳＤＳ電気泳動パターン
を示す。 第２図は大腸菌注入ににろレクチン収量！］の粁１１．
’１的変化を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ
   ）蛹のホモジネート又は体液を酸処理したセファロース
   系アフィニティークロマトグラフィー用担体を用いて吸
   着、分離、分画し、血球凝集活性を示す分画を精製する
   事により得られる ａ）ゲルろ過法による分子量が約３８０，０００でＳＤ
   Ｓゲル電気泳動で分子量約３８，０００の単一のサブユ
   ニットに分かれ、 ｂ）ウサギ赤血球、ガラクトース、ラクトース、Ｎ−ア
   セチルガラクトサミン及びα−メチルグルコシドに対し
   て特異的結合性を示す、 上記諸性質を有するレクチン様蛋白質。
2. （２）ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ
   ）蛹ホモジネート又は体液を出発原料として、酸処理し
   たセファロースによるアフィニティークロマトグラフィ
   ーを用いることを特徴とするヤマモユガから得られるレ
   クチン様蛋白質の分離精製方法。
3. （３）ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ
   ）蛹のホモジネート又は体液を、酸処理したセファロー
   ス系アフィニティークロマトグラフィー用担体を用いて
   吸着、分離、分画し、血球凝集活性を示す分画を精製す
   る事により得られるａ）ゲルろ過法による分子量が約３
   ８０，０００でＳＤＳゲル電気泳動で分子量約３８，０
   ００の単一のサブユニットに分かれ、ｂ）ウサギ赤血球
   、ガラクトース、ラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサ
   ミン及びα−メチルグルコシドに対して特異的結合性を
   示す、諸性質を有するレクチン様蛋白質を主成分とする
   ウサギ赤血球に対する特異的結合剤。
4. （４）ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ
   ）蛹のホモジネート又は体液を、酸処理したセファロー
   ス系アフィニティークロマトグラフィー用担体を用いて
   吸着、分離、分画し、血球凝集活性を示す分画を精製す
   る事により得られるａ）ゲルろ過法による分子量が約３
   ８０，０００でＳＤＳゲル電気泳動で分子量約３８，０
   ００の単一のサブユニットに分かれ、ｂ）ウサギ赤血球
   、ガラクトース、ラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサ
   ミン及びα−メチルグルコシドに対して特異的結合性を
   示す、諸性質を有するレクチン様蛋白質を主成分とする
   ガラクトース、ラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミ
   ン及びα−メチルグルコシドに対する特異的結合剤。