JPS6387984A - ヒトのインタ−α−トリプシン阻害剤の遺伝子 - Google Patents
ヒトのインタ−α−トリプシン阻害剤の遺伝子Info
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- JPS6387984A JPS6387984A JP62186767A JP18676787A JPS6387984A JP S6387984 A JPS6387984 A JP S6387984A JP 62186767 A JP62186767 A JP 62186767A JP 18676787 A JP18676787 A JP 18676787A JP S6387984 A JPS6387984 A JP S6387984A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
インターα−トリプシン阻害剤（ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈ
ａ−ｔｒｙｐｓｉｎ １ｎｈｉｂｉｔ。
ａ−ｔｒｙｐｓｉｎ １ｎｈｉｂｉｔ。
ｒ）（ＩＴＩ）は、ヒトの血漿および血清中に見出され
るセリンプロテアーゼ阻害剤である。この蛋白質は、蛋
白質分解酵素、トリプシン、キモトリプシンおよび好中
性（ｎｅｕｔ ｒｏｐｈｉ １）エラスターゼを阻害す
ることが報告されている。
るセリンプロテアーゼ阻害剤である。この蛋白質は、蛋
白質分解酵素、トリプシン、キモトリプシンおよび好中
性（ｎｅｕｔ ｒｏｐｈｉ １）エラスターゼを阻害す
ることが報告されている。
しかしながら、阻害剤の特異的ターゲットは未知である
。ＩＴＩはｌより多い分子量の種として存在するという
ことにおいて、血漿プロテイナーゼ阻害剤類のうちで独
特ある。それは１８０キロダルトン（ｋｄ）程度に高い
分子量の形態でありかつ３０ｋｄ程度に低い分子量の種
であることが発見された。この低分子量の種はＨＩ−３
０と表示された。ＨＩ−３０はトリプシンで処理するこ
とによって高分子量の形態から解放されうる。ＨＩ−３
０の断片は、高分子量の形態の抗折白質分解活性のすべ
てを含有する。しかしながら、１８０ｋｄの蛋白質の前
駆体は、血漿中に見出されるＨＩ−３０蛋白賀の前駆体
であることが直接立証されてきていない。ＨＩ−３０は
１８０ｋｄの形態から独立に生産されることが可能であ
る。
。ＩＴＩはｌより多い分子量の種として存在するという
ことにおいて、血漿プロテイナーゼ阻害剤類のうちで独
特ある。それは１８０キロダルトン（ｋｄ）程度に高い
分子量の形態でありかつ３０ｋｄ程度に低い分子量の種
であることが発見された。この低分子量の種はＨＩ−３
０と表示された。ＨＩ−３０はトリプシンで処理するこ
とによって高分子量の形態から解放されうる。ＨＩ−３
０の断片は、高分子量の形態の抗折白質分解活性のすべ
てを含有する。しかしながら、１８０ｋｄの蛋白質の前
駆体は、血漿中に見出されるＨＩ−３０蛋白賀の前駆体
であることが直接立証されてきていない。ＨＩ−３０は
１８０ｋｄの形態から独立に生産されることが可能であ
る。
高分子量のＩＴＩの全体の構造は未知である。
しかしながら、分解生成物、ＨＩ−３０、はヒト尿から
精製され、そして完全なアミノ酸配列は決定された。Ｈ
Ｉ−３０は５０％の炭水化物から構成されており、そし
て２つの直列に連結した（ｔａｎｄｅｍ ｌ ｉ ｎ
ｋｅｄ）抗折白質分解活性ドメイン（ｄ ｏｍａ ｉ
ｎ）を含有する０両者のドメインは低分子量のセリンプ
ロテアーゼ阻害剤のクニッ（Ｋｕｎｉｔｚ）族に構造的
に関係する。
精製され、そして完全なアミノ酸配列は決定された。Ｈ
Ｉ−３０は５０％の炭水化物から構成されており、そし
て２つの直列に連結した（ｔａｎｄｅｍ ｌ ｉ ｎ
ｋｅｄ）抗折白質分解活性ドメイン（ｄ ｏｍａ ｉ
ｎ）を含有する０両者のドメインは低分子量のセリンプ
ロテアーゼ阻害剤のクニッ（Ｋｕｎｉｔｚ）族に構造的
に関係する。
１８０ｋｄのＩＴＩは一本鎖の糖蛋白質として記載され
てきたが、最近の実験は、ＩＴＩを構成するポリヌクレ
オチドの遺伝情報を指定する多数のメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）がヒビ肝臓中に存在することを示して
いる。これらのｍＲＮＡ（７）１つは、ＩＴＩ軽鎖（ｌ
ｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と呼ばれる４２ｋｄの蛋白質
の遺伝情報を指定する。この蛋白質はＨＩ−３０に対し
て特異的な抗体と反応する。ブーアグニオン（Ｂ ｏ
ｕ ｒ ｇｕｎｉｏｎ）ら、１９８３参照、ＩＴＩの軽
鎖の相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）クローンは、ヒト肝臓
ｍＲＮＡライブラリーから他のものによって分離され、
そして第２ドメインの阻害部分に対してして部分的に配
列決定された。この研究は、アミノ酸配列のデータと対
照的であり、ＨＩ−３０がＩＴＩ軽鎖のカルボキシ末端
に存在することを示し “た、ブーアグニオ
ン（Ｂｏｕｒｇｕｎｉｏｎ）ら、１９８３参照。
てきたが、最近の実験は、ＩＴＩを構成するポリヌクレ
オチドの遺伝情報を指定する多数のメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）がヒビ肝臓中に存在することを示して
いる。これらのｍＲＮＡ（７）１つは、ＩＴＩ軽鎖（ｌ
ｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と呼ばれる４２ｋｄの蛋白質
の遺伝情報を指定する。この蛋白質はＨＩ−３０に対し
て特異的な抗体と反応する。ブーアグニオン（Ｂ ｏ
ｕ ｒ ｇｕｎｉｏｎ）ら、１９８３参照、ＩＴＩの軽
鎖の相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）クローンは、ヒト肝臓
ｍＲＮＡライブラリーから他のものによって分離され、
そして第２ドメインの阻害部分に対してして部分的に配
列決定された。この研究は、アミノ酸配列のデータと対
照的であり、ＨＩ−３０がＩＴＩ軽鎖のカルボキシ末端
に存在することを示し “た、ブーアグニオ
ン（Ｂｏｕｒｇｕｎｉｏｎ）ら、１９８３参照。
遺伝子クローニング技術を使用すると、ＨＩ−３０解読
領域を含有するＩＴＩ軽鎖のための遺伝子のｃＤＮＡコ
ピーは、ヒト肝臓ｍＲＮＡライブラリーから分離された
。最長のクローン（コロニーのハイブリダイゼーション
によって同定された）の全ヌクレオチド配列は決定され
た。これによって、ＨＩ−３０のための遺伝子は遺伝子
の３゛末端に存在し、これは蛋白質のカルボキシ末端に
相当することが確証された。アミノ酸構造（これはヌク
レオチド配列から遺伝暗号の゛転写によって誘導される
）は、一般に、前に報告されたＨＩ−３０蛋白質配列か
ら入手できるデータと一致する。しかしながら、ＨＩ−
３０のためのこの構造遺伝子に対して５′は、血清蛋白
質、α−１−ミクログロブリンを暗号化するオープンリ
ーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒ
ａｍｅ）であることが、今回、発見された。
領域を含有するＩＴＩ軽鎖のための遺伝子のｃＤＮＡコ
ピーは、ヒト肝臓ｍＲＮＡライブラリーから分離された
。最長のクローン（コロニーのハイブリダイゼーション
によって同定された）の全ヌクレオチド配列は決定され
た。これによって、ＨＩ−３０のための遺伝子は遺伝子
の３゛末端に存在し、これは蛋白質のカルボキシ末端に
相当することが確証された。アミノ酸構造（これはヌク
レオチド配列から遺伝暗号の゛転写によって誘導される
）は、一般に、前に報告されたＨＩ−３０蛋白質配列か
ら入手できるデータと一致する。しかしながら、ＨＩ−
３０のためのこの構造遺伝子に対して５′は、血清蛋白
質、α−１−ミクログロブリンを暗号化するオープンリ
ーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒ
ａｍｅ）であることが、今回、発見された。
α−１−ミクログロブリンは、また、蛋白質ＨＣとして
知られている。α−１−ミクログロブリンは、血漿、尿
および脳を髄液中に見出される３１ｋｄの糖蛋白質であ
る。この蛋白質は、構造が、それを蛋白質ＨＣと表示す
る他の研究者らによって分離された蛋白質に類似する。
知られている。α−１−ミクログロブリンは、血漿、尿
および脳を髄液中に見出される３１ｋｄの糖蛋白質であ
る。この蛋白質は、構造が、それを蛋白質ＨＣと表示す
る他の研究者らによって分離された蛋白質に類似する。
すべての意図および目的に対して、α−１−ミクログロ
ブリンおよび蛋白質ＨＣは同一蛋白質から誘導され、そ
して構造の差はアミノ酸配列の決定方法から生ずるアー
チファクトを表わすと考えることができる。
ブリンおよび蛋白質ＨＣは同一蛋白質から誘導され、そ
して構造の差はアミノ酸配列の決定方法から生ずるアー
チファクトを表わすと考えることができる。
蛋白質ＨＣは黄褐色の発色団の基を含有し、そして、シ
アル酸の炭水化物の残基を酵素ノイラミニダーゼで除去
した後でさえ、アガロースゲルの電気泳動の時異質に帯
電した蛋白質として移動する。α−１−ミクログロブリ
ンは、遊離の形態でおよびＩｇＡとの複合体として血漿
中に存在する。最近、α−１−ミクログロブリンは好中
性走化性を変調する上で重要であることが示唆された。
アル酸の炭水化物の残基を酵素ノイラミニダーゼで除去
した後でさえ、アガロースゲルの電気泳動の時異質に帯
電した蛋白質として移動する。α−１−ミクログロブリ
ンは、遊離の形態でおよびＩｇＡとの複合体として血漿
中に存在する。最近、α−１−ミクログロブリンは好中
性走化性を変調する上で重要であることが示唆された。
ＨＩ−３０とα−１−ミクログロブリンとの会合は、従
来文献中に報告または示唆されてきていない。
来文献中に報告または示唆されてきていない。
本発明は、ＩＴＩの軽鎖のＨＩ−３０解読領域（ｃｏｒ
ｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をもつ配列中のα−１−ミ
クログロブリンを暗号化する（ｅｎｃｏｄ ｉ ｎｇ）
ｃＤＮＡ配列に関する。また、α−１−ミクログロブリ
ンとクローニングされたＤＮＡ配列から生産されたＨＩ
−３０との融合蛋白質を開示する。
ｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をもつ配列中のα−１−ミ
クログロブリンを暗号化する（ｅｎｃｏｄ ｉ ｎｇ）
ｃＤＮＡ配列に関する。また、α−１−ミクログロブリ
ンとクローニングされたＤＮＡ配列から生産されたＨＩ
−３０との融合蛋白質を開示する。
α−１−ミクログロブリンおよびＩＴＩのＨＩ−３０部
分の遺伝情報を指定することが発見された、この新規な
遺伝子の分離に対するアプローチは、特異的の長いオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドのプローブを使用して、遺
伝子のライブラリーをスクリーニングして、ＨＩ−３０
遺伝子を含有する推定上のクローンを同定することであ
った。
分の遺伝情報を指定することが発見された、この新規な
遺伝子の分離に対するアプローチは、特異的の長いオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドのプローブを使用して、遺
伝子のライブラリーをスクリーニングして、ＨＩ−３０
遺伝子を含有する推定上のクローンを同定することであ
った。
これらのプローブは、コドンの縮重が低いＨＩ−３０の
アミノ酸領域を選択し、そしてこのアミノ酸配列を、最
も好ましいヒトコドン、すなわち、ヒト蛋白質の遺伝情
報を指定するを遺伝子中に最も使用されるコドンを使用
して、独特ＤＮＡ配列に転化（逆翻訳）することによっ
て表示された。
アミノ酸領域を選択し、そしてこのアミノ酸配列を、最
も好ましいヒトコドン、すなわち、ヒト蛋白質の遺伝情
報を指定するを遺伝子中に最も使用されるコドンを使用
して、独特ＤＮＡ配列に転化（逆翻訳）することによっ
て表示された。
この設計において利用された蛋白質配列および調製され
た合成オリゴマーを第１図に記載する。１つのプローブ
はＭｅｔ−４９からＰｈｅ−６６までのアミノ酸配列を
表わし、これはＨＩ−３０の第１抗蛋白質分解ドメイン
に位置する。他のプローブはアミノ酸Ｃｙｓ−１１５〜
Ｃｙｓ１３２上に基づいて設計され、これは第２ドメイ
ン中に見出された。各プローブは２つの３３ヌクレオチ
ド長さのオリゴマーから構成し、これは中央領域におい
て１２の相補的オリゴヌクレオチドによって重複されて
いた。
た合成オリゴマーを第１図に記載する。１つのプローブ
はＭｅｔ−４９からＰｈｅ−６６までのアミノ酸配列を
表わし、これはＨＩ−３０の第１抗蛋白質分解ドメイン
に位置する。他のプローブはアミノ酸Ｃｙｓ−１１５〜
Ｃｙｓ１３２上に基づいて設計され、これは第２ドメイ
ン中に見出された。各プローブは２つの３３ヌクレオチ
ド長さのオリゴマーから構成し、これは中央領域におい
て１２の相補的オリゴヌクレオチドによって重複されて
いた。
オリゴヌクレオチドのプローブの合成
オリゴヌクレオチドのプローブは、固相合成法［アルキ
ンソン（Ａｌｋｉｎｓｏｎ）ら、１９８４］を使用して
調製した。オリゴヤ−の合成の計画は、プロトン活性化
され、保護された２゛−デオキシ−リボヌクレオチドホ
スホルアミダイト［ペアウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）
ら、１９８１］を利用して、マッテウチ（Ｍａｔｔｅｕ
ｃｃｉ）ら（１９８１）によって概説された。すべての
順次のステップは、自動化された方法において、アプラ
イド・バイオシステムス３８０型ＤＮＡシンセサイザー
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄ
ｅｌ ３８０ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
）で、保護されたヌクレオチド、溶媒、化学物質および
試薬を使用して実施し、それらのすべてはアプライド・
バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉ ｏ
ｓ ｙ ｓ ｔ ｅｍＳ）、米国カリフォルニア州フォ
スター市、から入手した。固相支持体［また、アプライ
ド番バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）から入手した］は調節された孔のガラスで
あり、これに出発３”−ヌクレオチドはすでに取付けら
れていた。製造会社の推奨に従って、ある種の修正を自
動化された反応サイクルに導入した。合成が完結したと
き、オリゴマーを脱ブロッキングし、そして製造会社の
推奨に従ってＤＮＡ合成装置内で固体の支持体から切り
離した。
ンソン（Ａｌｋｉｎｓｏｎ）ら、１９８４］を使用して
調製した。オリゴヤ−の合成の計画は、プロトン活性化
され、保護された２゛−デオキシ−リボヌクレオチドホ
スホルアミダイト［ペアウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）
ら、１９８１］を利用して、マッテウチ（Ｍａｔｔｅｕ
ｃｃｉ）ら（１９８１）によって概説された。すべての
順次のステップは、自動化された方法において、アプラ
イド・バイオシステムス３８０型ＤＮＡシンセサイザー
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄ
ｅｌ ３８０ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
）で、保護されたヌクレオチド、溶媒、化学物質および
試薬を使用して実施し、それらのすべてはアプライド・
バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉ ｏ
ｓ ｙ ｓ ｔ ｅｍＳ）、米国カリフォルニア州フォ
スター市、から入手した。固相支持体［また、アプライ
ド番バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）から入手した］は調節された孔のガラスで
あり、これに出発３”−ヌクレオチドはすでに取付けら
れていた。製造会社の推奨に従って、ある種の修正を自
動化された反応サイクルに導入した。合成が完結したと
き、オリゴマーを脱ブロッキングし、そして製造会社の
推奨に従ってＤＮＡ合成装置内で固体の支持体から切り
離した。
オリゴマーを含有する水溶液を濃水酸化アンモニウムと
一緒に５５℃に４〜２４時間密閉バイアル内で加熱する
ことによって、ブロッキング基の除去を完結した。得ら
れる溶液を蒸発させ、残留物をｏ、ｏｉモルの重炭酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７，０（ＴＥＡＢ緩
衝液）中に溶解した。この溶液をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）−Ｇ５０＠ゲルろ過樹脂のクロマトグラ
フィーにかけた。この方ラムは同一のＴＥＡＢＩ衝液中
で調液中、かつその緩衝液で溶離した。空隙体積で溶離
する物質をプールし、そして溶液を蒸発した。残留物の
一部（２６０ｎｍにおける吸収単位の１０〜４０％）を
装入緩衝液（組成二０．１％のブロモフェノールブルー
、０．１％のキシレンシアツール、ｌＯミリモルのＥＤ
ＴＡ二ナトジナトリウムムアミド中）中に溶解し、さら
にポリアクリルアミトンのゲル上の電気泳動によって精
製した。ゲルの大きさは１８Ｘ３２Ｃｍ、厚さ１．５ｍ
ｍであった。この方法において精製した各オリゴマーの
ためのウェル（ｗｅｌｌ）の大きさは幅２〜５ｃｍであ
り、そして５種類までのオリゴマーを単一のゲルで精製
した。ゲル中のアクリルアミドの濃度は、所望生成物の
鎖長に依存して、１４〜２０％で変化した。より長いオ
リゴマーについて、１４％のゲルは好ましいが、より短
いオリゴマーは２０％までのアクリルアミドのゲルで精
製した。ゲルは、また、７モルの尿素およびトリス−ホ
ウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（０，１モルのトリス、０．１
モルのホウ酸塩、２ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）
を含有した。展開緩衝液は同一のトリス−ホウ酸塩−Ｅ
ＤＴＡ緩衝液であった。電気泳動は２０〜６０ワツトの
一定電力において、６〜１８時間実施した。
一緒に５５℃に４〜２４時間密閉バイアル内で加熱する
ことによって、ブロッキング基の除去を完結した。得ら
れる溶液を蒸発させ、残留物をｏ、ｏｉモルの重炭酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７，０（ＴＥＡＢ緩
衝液）中に溶解した。この溶液をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）−Ｇ５０＠ゲルろ過樹脂のクロマトグラ
フィーにかけた。この方ラムは同一のＴＥＡＢＩ衝液中
で調液中、かつその緩衝液で溶離した。空隙体積で溶離
する物質をプールし、そして溶液を蒸発した。残留物の
一部（２６０ｎｍにおける吸収単位の１０〜４０％）を
装入緩衝液（組成二０．１％のブロモフェノールブルー
、０．１％のキシレンシアツール、ｌＯミリモルのＥＤ
ＴＡ二ナトジナトリウムムアミド中）中に溶解し、さら
にポリアクリルアミトンのゲル上の電気泳動によって精
製した。ゲルの大きさは１８Ｘ３２Ｃｍ、厚さ１．５ｍ
ｍであった。この方法において精製した各オリゴマーの
ためのウェル（ｗｅｌｌ）の大きさは幅２〜５ｃｍであ
り、そして５種類までのオリゴマーを単一のゲルで精製
した。ゲル中のアクリルアミドの濃度は、所望生成物の
鎖長に依存して、１４〜２０％で変化した。より長いオ
リゴマーについて、１４％のゲルは好ましいが、より短
いオリゴマーは２０％までのアクリルアミドのゲルで精
製した。ゲルは、また、７モルの尿素およびトリス−ホ
ウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（０，１モルのトリス、０．１
モルのホウ酸塩、２ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）
を含有した。展開緩衝液は同一のトリス−ホウ酸塩−Ｅ
ＤＴＡ緩衝液であった。電気泳動は２０〜６０ワツトの
一定電力において、６〜１８時間実施した。
電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックのラップ内に包
み、そしてオリゴマーを紫外線のシャドウィング（ｓｈ
ａｄｏｗｉｎｇ）によって可視化した。このシャドウィ
ングは、ラップしたゲルを蛍光性薄層クロマトグラフィ
ー板上に置き、そしてゲルを単波長の紫外線源で見るこ
とによって達成した。所望生成物は、このシャドウィン
グ技術によて、最も遅く移動する主要なブルーの帯とし
て現れた。所望の帯をゲルから切り取った。ＤＮＡオリ
ゴマーをゲルのスプライスから、エビジーン（ＥｐＧｅ
ｎｅ）［バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、米国マリ
−ランド州ＩＤ−Ｇｅｔ＠電気泳動装置を使用して、粉
末状ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース上に
溶離した。オリゴマーをセルロースから１モルのＴＥＡ
Ｂｆｉｔｉ液で溶離して回収した。オリゴマーを含有す
る緩衝液を蒸発し、残留物を０．０１モルのＴＥＡＢ緩
衝液中に溶解し、次いで前述のようにセファデックス（
Ｓｅ ｐｈａｄｅｘ）−Ｇ５０＠ｃ７）カラムに通過さ
せて脱塩した。空隙体積中に溶離される物
”質をプールし、そして凍結乾燥して最終生成物を得た
。これらの手順を使用して、約０．５〜約５．０Ａ２６
０単位の精製したオリゴマーの各々を得た。
み、そしてオリゴマーを紫外線のシャドウィング（ｓｈ
ａｄｏｗｉｎｇ）によって可視化した。このシャドウィ
ングは、ラップしたゲルを蛍光性薄層クロマトグラフィ
ー板上に置き、そしてゲルを単波長の紫外線源で見るこ
とによって達成した。所望生成物は、このシャドウィン
グ技術によて、最も遅く移動する主要なブルーの帯とし
て現れた。所望の帯をゲルから切り取った。ＤＮＡオリ
ゴマーをゲルのスプライスから、エビジーン（ＥｐＧｅ
ｎｅ）［バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、米国マリ
−ランド州ＩＤ−Ｇｅｔ＠電気泳動装置を使用して、粉
末状ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース上に
溶離した。オリゴマーをセルロースから１モルのＴＥＡ
Ｂｆｉｔｉ液で溶離して回収した。オリゴマーを含有す
る緩衝液を蒸発し、残留物を０．０１モルのＴＥＡＢ緩
衝液中に溶解し、次いで前述のようにセファデックス（
Ｓｅ ｐｈａｄｅｘ）−Ｇ５０＠ｃ７）カラムに通過さ
せて脱塩した。空隙体積中に溶離される物
”質をプールし、そして凍結乾燥して最終生成物を得た
。これらの手順を使用して、約０．５〜約５．０Ａ２６
０単位の精製したオリゴマーの各々を得た。
精製したオリゴヌクレオチドのプローブは、個々のオリ
ゴマーをアニーリングし、そして残留する一本釦領域中
のクレノー断片および放射性ヌクレオチドを次の方法に
よって充填することによって放射線標識した。オリゴマ
ーを、まず、０．１モルのＮａＣ１中の２００鉢ｇ ／
ｍ ｌの濃度で７ニーリングした。この混合物を６５
℃で１０分間、３７℃で２０分間、１５℃で２０分間お
よび４℃で２０分間加熱した。プローブは、大腸菌（Ｅ
、ｃｏ ｌ １）ＤＮＡポリメラーゼエからのクレノー
断片および適当な放射性ヌクレオチドを酵素的に充填す
ることによって放射性とした０合成反応混合物は、０．
２ＪＬｇのアニーリングしたオリゴマー、４００ｗモル
のｄＴＴＰ、４００ｐモルのｄＡＴＰ、１００μＣｉの
α−Ｐ３２−ｄＣＴＰ（３０００キユリ一／ミリモル）
、１００ルＣｉのα−Ｐ３２−ｄＧＴＰ （３０００キ
ユリ一／ミリモル）、５０ミリモルのトリス（ｐＨ７。
ゴマーをアニーリングし、そして残留する一本釦領域中
のクレノー断片および放射性ヌクレオチドを次の方法に
よって充填することによって放射線標識した。オリゴマ
ーを、まず、０．１モルのＮａＣ１中の２００鉢ｇ ／
ｍ ｌの濃度で７ニーリングした。この混合物を６５
℃で１０分間、３７℃で２０分間、１５℃で２０分間お
よび４℃で２０分間加熱した。プローブは、大腸菌（Ｅ
、ｃｏ ｌ １）ＤＮＡポリメラーゼエからのクレノー
断片および適当な放射性ヌクレオチドを酵素的に充填す
ることによって放射性とした０合成反応混合物は、０．
２ＪＬｇのアニーリングしたオリゴマー、４００ｗモル
のｄＴＴＰ、４００ｐモルのｄＡＴＰ、１００μＣｉの
α−Ｐ３２−ｄＣＴＰ（３０００キユリ一／ミリモル）
、１００ルＣｉのα−Ｐ３２−ｄＧＴＰ （３０００キ
ユリ一／ミリモル）、５０ミリモルのトリス（ｐＨ７。
２）、１０ミリモルのＭｇＣｌ２．０．０１ミリモルの
ジチオスレイトール、５０ｇｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミン、および１０単位のクレノー断片から、体積３０Ｉ
Ｌｌにおいて、成っていた。この反応を２３℃で６０分
間インキュベーションし、次いで標識されないｄＣＴＰ
およびｄＧＴＰに関して４００ｇモルとした。２３℃に
おいて１５分後、反応をＩＩＬｌの１０％のドデシル硫
酸ナトリウム（Ｓ Ｄ Ｓ）で停止し、そして標識され
たオリゴマーをセファデックス（Ｓｅｐ、ｈａｄｅｘ）
−Ｇ５０＠のクロマトグラフィーによって精製した。こ
の方法を用いて、１１０９ｃｐ／ｇ遺伝子の比活性に日
常的に到達した。２つの充填したプローブを、ライブラ
リーの初期のスクリーニングのためのプールした。
ジチオスレイトール、５０ｇｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミン、および１０単位のクレノー断片から、体積３０Ｉ
Ｌｌにおいて、成っていた。この反応を２３℃で６０分
間インキュベーションし、次いで標識されないｄＣＴＰ
およびｄＧＴＰに関して４００ｇモルとした。２３℃に
おいて１５分後、反応をＩＩＬｌの１０％のドデシル硫
酸ナトリウム（Ｓ Ｄ Ｓ）で停止し、そして標識され
たオリゴマーをセファデックス（Ｓｅｐ、ｈａｄｅｘ）
−Ｇ５０＠のクロマトグラフィーによって精製した。こ
の方法を用いて、１１０９ｃｐ／ｇ遺伝子の比活性に日
常的に到達した。２つの充填したプローブを、ライブラ
リーの初期のスクリーニングのためのプールした。
ｍＲＮＡライブラリーの構成
ヒトｍＲＮＡの入ｇｔ １１ ＣＤＮＡ７フージライブ
ラリーは、フイツク（Ｈｕｙｎｈ）ら、１９８５に記載
されているようにして構成した。ライブラリーは１０６
の独立のクローンから成り、その包装されたファージの
７１％はインサートを含有した。ライブラリーはベント
ン（Ｂｅｎｔ。
ラリーは、フイツク（Ｈｕｙｎｈ）ら、１９８５に記載
されているようにして構成した。ライブラリーは１０６
の独立のクローンから成り、その包装されたファージの
７１％はインサートを含有した。ライブラリーはベント
ン（Ｂｅｎｔ。
ｎ）ら、１９７７に記載されているようにしてスクリー
ニングした。
ニングした。
合計１０６の独立ファージを、宿主大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）菌株Ｙ１０８８上に３７５フア一ジ／ｃｍ２の密度
でプレイティングした。
ｉ）菌株Ｙ１０８８上に３７５フア一ジ／ｃｍ２の密度
でプレイティングした。
プラークのリフト（１ｉ ｆ ｔ）に使用したニトロセ
ルロースのフィルターを、２０％のホルムアミド、２×
デンハルトの溶液、５ＸＳＳＰＥ （２０ＸＳＳＰＥは
３ 、６モルｃ７）ＮａＣ１、２００ミリモル（７）Ｎ
ａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７，４，２０ミリモルのＥＤＴＡ、
ｐＨ７，４である）、０．１％のＳＤＳ、１００ルｇ
／ ｍ ｌの剪断した一本鎖のサケ精子ＤＮＡ中で３７
℃において少なくとも４時間予備ハイブリダイゼーショ
ンした。次いで、リフトしたプラークを含有するフィル
ターを、同一条件下に、１１０６ｃｐ／ｍｌの放射線標
識したオリゴマーのプローブ混合物と一夜ハイブリダイ
ゼーションした。プローブ混合物を１００°Ｃで１０分
間インキュベーションした後、フィルターに添加した。
ルロースのフィルターを、２０％のホルムアミド、２×
デンハルトの溶液、５ＸＳＳＰＥ （２０ＸＳＳＰＥは
３ 、６モルｃ７）ＮａＣ１、２００ミリモル（７）Ｎ
ａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７，４，２０ミリモルのＥＤＴＡ、
ｐＨ７，４である）、０．１％のＳＤＳ、１００ルｇ
／ ｍ ｌの剪断した一本鎖のサケ精子ＤＮＡ中で３７
℃において少なくとも４時間予備ハイブリダイゼーショ
ンした。次いで、リフトしたプラークを含有するフィル
ターを、同一条件下に、１１０６ｃｐ／ｍｌの放射線標
識したオリゴマーのプローブ混合物と一夜ハイブリダイ
ゼーションした。プローブ混合物を１００°Ｃで１０分
間インキュベーションした後、フィルターに添加した。
フィルターを０．２ＸＳＳＰＥ、Ｏ。
１％のＳＤＳ中で３７℃において洗浄し、そして−７０
℃においてデュポン社のハイ−プラス（Ｈｉ−Ｐｌｕｓ
）増強スクリーニングを使用してコダック（Ｋ ｏ ｄ
ａ ｋ） ＸＡＲ−２フイルムに露出した。
℃においてデュポン社のハイ−プラス（Ｈｉ−Ｐｌｕｓ
）増強スクリーニングを使用してコダック（Ｋ ｏ ｄ
ａ ｋ） ＸＡＲ−２フイルムに露出した。
これらの方法により、１００より多い陽性のクローンが
、スクリーニングした４２６．０００フアージにおいて
同定された。１２の陽性のクローンを選択し、そして単
一のファージのプラークの分離によって精製した。これ
らの個々のクローンを、それらの溶融温度、すなわち、
各プローブとの二本鎖プローブ−ＤＮＡ複合体の熱変性
温度を特性づけ、そして挿入されたＤＮＡの大きさを決
定することによって分析した。すべての１２のクローン
は各個々のブローブヘハイブリダイゼーションした。ド
メインＩについてのプローブは、０．ｌＸ５ｓＰＥ、０
．１％（７）ＳＤＳ中で６０℃においてクローンの各々
ヘハイブリダイゼーションしてとどまった。ドメインＩ
Ｉについてのプローブは、５０℃〜６０℃において洗浄
除去された。インサートの大きさは、同定された組換え
体からＥｃ ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで除去した
後、クローニングした断片のポリアクリルアミドゲルの
電気泳動によって決定して、約７００〜約１３００ヌク
レオチドの範囲であった。
、スクリーニングした４２６．０００フアージにおいて
同定された。１２の陽性のクローンを選択し、そして単
一のファージのプラークの分離によって精製した。これ
らの個々のクローンを、それらの溶融温度、すなわち、
各プローブとの二本鎖プローブ−ＤＮＡ複合体の熱変性
温度を特性づけ、そして挿入されたＤＮＡの大きさを決
定することによって分析した。すべての１２のクローン
は各個々のブローブヘハイブリダイゼーションした。ド
メインＩについてのプローブは、０．ｌＸ５ｓＰＥ、０
．１％（７）ＳＤＳ中で６０℃においてクローンの各々
ヘハイブリダイゼーションしてとどまった。ドメインＩ
Ｉについてのプローブは、５０℃〜６０℃において洗浄
除去された。インサートの大きさは、同定された組換え
体からＥｃ ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで除去した
後、クローニングした断片のポリアクリルアミドゲルの
電気泳動によって決定して、約７００〜約１３００ヌク
レオチドの範囲であった。
最大のインサートをもつクローンを、ＤＮＡ配列決定に
よるそれ以上の分析のために選択した。
よるそれ以上の分析のために選択した。
ＤＮＡの配列決定
ファージのベクター中に挿入されたＤＮＡ断片を、制限
酵素のＥｃｏＲＩを使用してベクターから切出した。解
放した断片をゲル精製し、そしてデイニンガー（Ｄｅ
ｉ ｎ ｉ ｎｇｅ ｒ）、１９８３の超音波処理技術
を用いて、Ｍ１３ベクター、ｍｐ−１８中のより小さい
断片の不規則ライブラリーを発生させるために使用した
０個々のＭ−１３クローンを、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）ら、１９７７のジデオキシ鎖停止法（ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して
ＤＮＡ配列を決定した０次いで、４つのオリゴデオキシ
ヌクレオチドのブライマーを設計し、そして合成した。
酵素のＥｃｏＲＩを使用してベクターから切出した。解
放した断片をゲル精製し、そしてデイニンガー（Ｄｅ
ｉ ｎ ｉ ｎｇｅ ｒ）、１９８３の超音波処理技術
を用いて、Ｍ１３ベクター、ｍｐ−１８中のより小さい
断片の不規則ライブラリーを発生させるために使用した
０個々のＭ−１３クローンを、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）ら、１９７７のジデオキシ鎖停止法（ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して
ＤＮＡ配列を決定した０次いで、４つのオリゴデオキシ
ヌクレオチドのブライマーを設計し、そして合成した。
これらのプライマーを使用して、不明量のあ配列の残る
領域を確証した。遺伝子中の各ヌクレオチドを、少なく
とも３回その領域を配列決定することによって確証し、
そしてヌクレオチドの９５％は４回配列決定した。
領域を確証した。遺伝子中の各ヌクレオチドを、少なく
とも３回その領域を配列決定することによって確証し、
そしてヌクレオチドの９５％は４回配列決定した。
ショットガンＤＮＡ配列決定からのデータを、ゲルΦプ
ログラム・オブ・インテリジェネチックス（ＧＥＬ
ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）を使用して整列した。インターナショナル・バ
イオテキノリジーズψインコーボレーテッド（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、ＩｎＣ０）、米国コネチカット州ニューヘブン、か
ら購入したＤＮＡ−蛋白質配列分析ソフトウェアで、オ
ープンリーディングフレームのサーチを実施した。決定
されたＤＮＡ配列は第２図に示されている。第２図から
明らかなように、このクローンのＥｃｏＲＩは１，２３
２ヌクレオチドの長さである。断片は３５２アミノ酸の
オープンリーディングフレームを含有し、これはヌクレ
オチド位置５１においてメチオニンコドンで開始し、そ
してヌクレオチド１１０６において出発する停止コドン
で終る。クローンは、また、３°末端におけるＥｃｏＲ
Ｉ部位に隣接して、アデニレート残基の８ヌクレオチド
のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含有する。ポリ（Ａ
）付加、ＡＡＴＡＡＡＡ、のシグナルは、ポリ（Ａ）テ
イルより上流の１９ヌクレオチドに存在する。プローブ
の構成に使用したオリゴヌクレオチドは、決定したＤＮ
Ａ配列と高い相同性を有する。ドメインＩのプローブは
ｃＤＮＡと９４％の相同性を有し、そしてドメインＩＩ
のブロークは９１％の相同性を有する。これらの高いレ
ベルの相同性は、これらのプローブの溶融特性と一致す
る。
ログラム・オブ・インテリジェネチックス（ＧＥＬ
ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）を使用して整列した。インターナショナル・バ
イオテキノリジーズψインコーボレーテッド（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、ＩｎＣ０）、米国コネチカット州ニューヘブン、か
ら購入したＤＮＡ−蛋白質配列分析ソフトウェアで、オ
ープンリーディングフレームのサーチを実施した。決定
されたＤＮＡ配列は第２図に示されている。第２図から
明らかなように、このクローンのＥｃｏＲＩは１，２３
２ヌクレオチドの長さである。断片は３５２アミノ酸の
オープンリーディングフレームを含有し、これはヌクレ
オチド位置５１においてメチオニンコドンで開始し、そ
してヌクレオチド１１０６において出発する停止コドン
で終る。クローンは、また、３°末端におけるＥｃｏＲ
Ｉ部位に隣接して、アデニレート残基の８ヌクレオチド
のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含有する。ポリ（Ａ
）付加、ＡＡＴＡＡＡＡ、のシグナルは、ポリ（Ａ）テ
イルより上流の１９ヌクレオチドに存在する。プローブ
の構成に使用したオリゴヌクレオチドは、決定したＤＮ
Ａ配列と高い相同性を有する。ドメインＩのプローブは
ｃＤＮＡと９４％の相同性を有し、そしてドメインＩＩ
のブロークは９１％の相同性を有する。これらの高いレ
ベルの相同性は、これらのプローブの溶融特性と一致す
る。
ＨＩ−３０の完全なアミノ酸配列は、オープンリーディ
ングフレームの３゛末端における塩基６５５〜１１００
の間のヌクレオチドコドンから翻訳することができる。
ングフレームの３゛末端における塩基６５５〜１１００
の間のヌクレオチドコドンから翻訳することができる。
ＤＮＡ配列によって予測できるＨＩ−３０のアミノ酸配
列は、ヒトの尿から精製されたＨＩ−３０について決定
したものとほとんど同一である。２つの位置に小さい差
異が存在する。前に発表された蛋白質の配列は、アミノ
酸位置８６−８７にＶａｌ−１１ｅおよび位置１３８に
Ｇｌｕを割当てる。ＩＴＩ軽鎖についてここで決定した
ＤＮＡ配列は、それぞれ、これらの位置についてｌ１ｅ
−Ｖａｌ対およびＧｌｙを割当てる。ＤＮＡ配列は、ヒ
ト肝臓からのｃＤＮＡクローンについて他の研究者らに
よって前に決定されたものとほとんど同一である。これ
らの研究者らは、同様なｍＲＮＡの最後の２６４ヌクレ
オチドのみを報告している［ブーアギノン（Ｂ ｏ ｕ
ｒｇｕｉｎｏｎ）ら、１９８５］、これらの２つの配列
の唯一の差異は、３′非翻訳領域における位置１１８３
に存在する、本発明の配列中の余分のシスティンである
。
列は、ヒトの尿から精製されたＨＩ−３０について決定
したものとほとんど同一である。２つの位置に小さい差
異が存在する。前に発表された蛋白質の配列は、アミノ
酸位置８６−８７にＶａｌ−１１ｅおよび位置１３８に
Ｇｌｕを割当てる。ＩＴＩ軽鎖についてここで決定した
ＤＮＡ配列は、それぞれ、これらの位置についてｌ１ｅ
−Ｖａｌ対およびＧｌｙを割当てる。ＤＮＡ配列は、ヒ
ト肝臓からのｃＤＮＡクローンについて他の研究者らに
よって前に決定されたものとほとんど同一である。これ
らの研究者らは、同様なｍＲＮＡの最後の２６４ヌクレ
オチドのみを報告している［ブーアギノン（Ｂ ｏ ｕ
ｒｇｕｉｎｏｎ）ら、１９８５］、これらの２つの配列
の唯一の差異は、３′非翻訳領域における位置１１８３
に存在する、本発明の配列中の余分のシスティンである
。
オープンリーディングフレームのアミン末端は、１８０
ｋｄ（７）ＩＴＩｔたはＨＩ−３０のいずれでも従来同
定されなかった２０５アミノ酸配列を含有する。この蛋
白質配列が他の血清蛋白質のそれと関係することがある
かどうかを決定するために、この配列を使用してナショ
ナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンディジョン
−プロティン・シーフェンス会テータベース（Ｎａｔｉ
。
ｋｄ（７）ＩＴＩｔたはＨＩ−３０のいずれでも従来同
定されなかった２０５アミノ酸配列を含有する。この蛋
白質配列が他の血清蛋白質のそれと関係することがある
かどうかを決定するために、この配列を使用してナショ
ナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンディジョン
−プロティン・シーフェンス会テータベース（Ｎａｔｉ
。
ｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ）をサーチした。こ
のデータベースは、アイファインド・プログラム・オプ
・イテリジェネティックス（ＩＦＩＮＤ ｐｒｏｇｒ
ａｍ ｏｆ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）で
サーチした。同一販売会社からのアライン・プログラム
（ＡＬＩＧＮ ｐｒ。
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ）をサーチした。こ
のデータベースは、アイファインド・プログラム・オプ
・イテリジェネティックス（ＩＦＩＮＤ ｐｒｏｇｒ
ａｍ ｏｆ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）で
サーチした。同一販売会社からのアライン・プログラム
（ＡＬＩＧＮ ｐｒ。
ｇｒａｍ）を使用して、陽性の合致の同定後、配列を整
列した。この配列は、２つの蛋白質、α−１−ミクログ
ロブリンおよび蛋白質ＨＣの配列とほとんど完全な合致
を示した。しかしながら、蛋白質Ｈｅの配列はより完全
であった。蛋白質ＨＣに関係して、位置５５における不
一致および位置５６および５７における２つのアミノ酸
ギャップが存在した。この配列はＨＩ−３０の第１アミ
ノ酸に隣接してＡｒｇ−Ａｒｇジペプチドを欠く３つの
アミノ酸で停止する。α−１−ミクログロブリン配列お
よび蛋白質ＨＣ配列の両者は、ＩＴＩ軽鎖のアミノ末端
ドメインノ位置Ｇ １ ｙ−２ｏで開始する。
列した。この配列は、２つの蛋白質、α−１−ミクログ
ロブリンおよび蛋白質ＨＣの配列とほとんど完全な合致
を示した。しかしながら、蛋白質Ｈｅの配列はより完全
であった。蛋白質ＨＣに関係して、位置５５における不
一致および位置５６および５７における２つのアミノ酸
ギャップが存在した。この配列はＨＩ−３０の第１アミ
ノ酸に隣接してＡｒｇ−Ａｒｇジペプチドを欠く３つの
アミノ酸で停止する。α−１−ミクログロブリン配列お
よび蛋白質ＨＣ配列の両者は、ＩＴＩ軽鎖のアミノ末端
ドメインノ位置Ｇ １ ｙ−２ｏで開始する。
第３図は、ＩＴＩ軽釦の構造を要約する。それはシグナ
ル配列および引続いてα−１−ミクログロブリンの配列
を含有する。α−１−ミクログロブリンとＨＩ−３０と
の接合部において、解読領域は２つのアルギニン残基で
ある。ＨＩ−３０の配列はこれらの残基の直後に監視し
、そして追加の５ｅｔ−Ａｓｎジペプチドで終る。この
蛋白質は４２ｋｄの計算分子量を有し、これは大きさが
ヒビ肝臓中で合成されたＩＴＩ軽鎖に類似する。
ル配列および引続いてα−１−ミクログロブリンの配列
を含有する。α−１−ミクログロブリンとＨＩ−３０と
の接合部において、解読領域は２つのアルギニン残基で
ある。ＨＩ−３０の配列はこれらの残基の直後に監視し
、そして追加の５ｅｔ−Ａｓｎジペプチドで終る。この
蛋白質は４２ｋｄの計算分子量を有し、これは大きさが
ヒビ肝臓中で合成されたＩＴＩ軽鎖に類似する。
生体外ＲＮＡ転写
この新しく発見された蛋白質の構造を立証するために、
ＩＴＩ軽鎖のｃＤＮＡクローンからのｍＲＮＡ転写体を
次のようにして合成した。特異的ｍＲＮＡを調製するた
めに、ストラタジーン・クローニング拳システムス拳イ
ンコーボレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍＳ、Ｉｎｃ、）（米国カリフ
ォルニア州すンジエゴ）から購入したブルースクライブ
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉ ｂｅ・）ＲＮＡ発現ベクター（７
）ＥｃｏＲＩ部位の中に、ＩＴＩ軽鎖のクローンを連結
した。この構成物をＨｉ ｎｄＩ Ｉ Ｉで切断し、次
いでクリーブ（Ｋｒｉｅｇ）、ら、１９８４の方法に従
いＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して生体外で転写した
。これはＩＴＩ軽釦ＤＮＡインサートのｍＲＮＡコピー
を生成した。ゲル電気泳動により転写生成物を分析する
と、ｍＲＮＡはＤＮＡの全長のコピーであることが示さ
れた。次いで、このｍＲＮＡ転写体をフェノールで抽出
し、そしてエタノールで沈殿させた。翻訳の前に、下を
参照（ｉ ｎｆ ｒａ）、ＲＮＡの転写体をワクシニア
ウィルスゲアニリルトランスフェラーゼでキャップした
０反応混合物は、５０終モルのトリス（ｐＨ７，９）、
１．２５１ＬモルのＭｇＣｌ２．６ミリモルのＫＣＩ、
２．５ミリモルのジチオスレイトール、１１００ＪＬ／
ｍｌのウシ血清アルブミン、１００ＩＬモルのＳ−アデ
ノシルメチオニンおよび３３０ｇモルのＧＴＰを含有し
た。ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅＳ）から購入した酵素の１単位を、ｍＲＮＡの１ｇｇ
につき使用した。この反応は３７℃で４５分間実施した
０反応をＳＯ３の添加（０，５％に）により停止し、次
いでフェノールの抽出を実施した。
ＩＴＩ軽鎖のｃＤＮＡクローンからのｍＲＮＡ転写体を
次のようにして合成した。特異的ｍＲＮＡを調製するた
めに、ストラタジーン・クローニング拳システムス拳イ
ンコーボレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍＳ、Ｉｎｃ、）（米国カリフ
ォルニア州すンジエゴ）から購入したブルースクライブ
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉ ｂｅ・）ＲＮＡ発現ベクター（７
）ＥｃｏＲＩ部位の中に、ＩＴＩ軽鎖のクローンを連結
した。この構成物をＨｉ ｎｄＩ Ｉ Ｉで切断し、次
いでクリーブ（Ｋｒｉｅｇ）、ら、１９８４の方法に従
いＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して生体外で転写した
。これはＩＴＩ軽釦ＤＮＡインサートのｍＲＮＡコピー
を生成した。ゲル電気泳動により転写生成物を分析する
と、ｍＲＮＡはＤＮＡの全長のコピーであることが示さ
れた。次いで、このｍＲＮＡ転写体をフェノールで抽出
し、そしてエタノールで沈殿させた。翻訳の前に、下を
参照（ｉ ｎｆ ｒａ）、ＲＮＡの転写体をワクシニア
ウィルスゲアニリルトランスフェラーゼでキャップした
０反応混合物は、５０終モルのトリス（ｐＨ７，９）、
１．２５１ＬモルのＭｇＣｌ２．６ミリモルのＫＣＩ、
２．５ミリモルのジチオスレイトール、１１００ＪＬ／
ｍｌのウシ血清アルブミン、１００ＩＬモルのＳ−アデ
ノシルメチオニンおよび３３０ｇモルのＧＴＰを含有し
た。ベチェスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅＳ）から購入した酵素の１単位を、ｍＲＮＡの１ｇｇ
につき使用した。この反応は３７℃で４５分間実施した
０反応をＳＯ３の添加（０，５％に）により停止し、次
いでフェノールの抽出を実施した。
体外翻訳および蛋白質の生成
上の反応において生成したキャップドｍＲＮＡを、プロ
メガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）、米国ライスコンシン州マディソン、から購入した、
ミクロコックスのヌクレアーッゼ処置つサギ網状赤血球
すゼイトの翻訳系中で、対応する蛋白質に翻訳した。翻
訳はペルハム（Ｐｅｌｈａｍ）ら、１９７６に記載され
るようにして実施した。
メガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）、米国ライスコンシン州マディソン、から購入した、
ミクロコックスのヌクレアーッゼ処置つサギ網状赤血球
すゼイトの翻訳系中で、対応する蛋白質に翻訳した。翻
訳はペルハム（Ｐｅｌｈａｍ）ら、１９７６に記載され
るようにして実施した。
次いで、このようにして得られた蛋白質生成物を、α−
１−ミクログロブリンおよびインターα−トリプシン阻
害剤に対する抗体で対抗させた。
１−ミクログロブリンおよびインターα−トリプシン阻
害剤に対する抗体で対抗させた。
これらのウサギ抗体（Ｉ ｇＧ分画）は、アキュレイト
・ケミカル・アンド・サイエンティフィック中コーポレ
ーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国ニューヨー
ク州ウェストバリー）から購入した。免疫沈殿はドラパ
ースティン（Ｄ ｏ ｂ ｂ ｅｒｓｔｅｉｎ）ら、１
９７９に記載されるように実施した。免疫沈殿させた生
成物は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７９に記載
されるように実施した。試料を４％のＳＤＳおよび５０
ミリモルのジチオスレイトール中で１０分間沸騰させた
後、ゲル上に装入した。これらの実験の結果を第４図に
示す。
・ケミカル・アンド・サイエンティフィック中コーポレ
ーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国ニューヨー
ク州ウェストバリー）から購入した。免疫沈殿はドラパ
ースティン（Ｄ ｏ ｂ ｂ ｅｒｓｔｅｉｎ）ら、１
９７９に記載されるように実施した。免疫沈殿させた生
成物は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７９に記載
されるように実施した。試料を４％のＳＤＳおよび５０
ミリモルのジチオスレイトール中で１０分間沸騰させた
後、ゲル上に装入した。これらの実験の結果を第４図に
示す。
生体外翻訳生成物は４２ｋｄの蛋白質（レーンＧ）であ
り、これは新しくクローニングした遺伝子中のオープン
リーディングフレームによって予測した大きさと一致し
た。蛋白質の帯はリゼイト中の同時に移動する蛋白質に
よってわずかに歪んでいる。新しい蛋白質生成物は、α
−１−ミクログロブリンおよび１８０ｋｄのＩＴＩ
（レーンＥおよびＦ）の両者に対する抗体で沈殿させる
。非免疫抗体、抗β−ガラクトシダーゼ抗体によって、
あるいは抗体を添加しないとき、有意な量の蛋白質生成
物は沈殿しない（それぞれ、レーンＢ、Ｃ１およびＤ）
、こうして、ＩＴＩ軽鎖ｍＲＮＡは、ＨＩ−３０をもつ
α−１−ミクログロブリンのアミノ酸配列を含有する新
規な蛋白質を暗号化する。融合蛋白質生成物の両者の領
域は、明らかに適切にフォルディングして（ｆ Ｏｌ
ｄ）エピトープを表わし、これらのエピトープは成熟し
た３１ｋｄのα−１−ミクログロブリンおよびＩＴＩの
高分子量の形態に対してして作られた特異的抗体によっ
て認識される。
り、これは新しくクローニングした遺伝子中のオープン
リーディングフレームによって予測した大きさと一致し
た。蛋白質の帯はリゼイト中の同時に移動する蛋白質に
よってわずかに歪んでいる。新しい蛋白質生成物は、α
−１−ミクログロブリンおよび１８０ｋｄのＩＴＩ
（レーンＥおよびＦ）の両者に対する抗体で沈殿させる
。非免疫抗体、抗β−ガラクトシダーゼ抗体によって、
あるいは抗体を添加しないとき、有意な量の蛋白質生成
物は沈殿しない（それぞれ、レーンＢ、Ｃ１およびＤ）
、こうして、ＩＴＩ軽鎖ｍＲＮＡは、ＨＩ−３０をもつ
α−１−ミクログロブリンのアミノ酸配列を含有する新
規な蛋白質を暗号化する。融合蛋白質生成物の両者の領
域は、明らかに適切にフォルディングして（ｆ Ｏｌ
ｄ）エピトープを表わし、これらのエピトープは成熟し
た３１ｋｄのα−１−ミクログロブリンおよびＩＴＩの
高分子量の形態に対してして作られた特異的抗体によっ
て認識される。
当業者は理解するように、ＩＴＩ軽釦のためのｃＤＮＡ
を利用する蛋白質の生成は、また、生体内で達成できる
０例えば、ＩＴＩの軽鎖のｃＤＮＡは、適当なりローニ
ングベクター（すなわち、伝達ベクター）１例えば、あ
る種のバクテリオファージのＤＮＡのプラスミドの中に
組込むことができる。プラスミドのベクター類は、環状
化（ｃｉ ｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ）プラスミド構造を開
き、次いでＤＮＡ配列を前記ベクター中に結合するため
に適当な種々の制限部位を含有する（あるいは、含有す
るように操作することができる）、バクテリオファージ
のＤＮＡは、ある種の必須ではないファージ遺伝子の代
わりに異型ＤＮＡの挿入されたセグメントを有すること
ができる。いずれの場合においても、ベクターは異型配
列を宿主中に導入するために手段を提供し、前記ベクタ
ーは、また、その中の自己複製の提供に必要な遺伝情報
を有する。宿主細胞は、遺伝子の発現に使用される、こ
の分野において現在普通の種々の原核宿主および真核宿
主の中から選択できる。このような有機体は、例えば、
大腸菌（Ｅ。
を利用する蛋白質の生成は、また、生体内で達成できる
０例えば、ＩＴＩの軽鎖のｃＤＮＡは、適当なりローニ
ングベクター（すなわち、伝達ベクター）１例えば、あ
る種のバクテリオファージのＤＮＡのプラスミドの中に
組込むことができる。プラスミドのベクター類は、環状
化（ｃｉ ｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ）プラスミド構造を開
き、次いでＤＮＡ配列を前記ベクター中に結合するため
に適当な種々の制限部位を含有する（あるいは、含有す
るように操作することができる）、バクテリオファージ
のＤＮＡは、ある種の必須ではないファージ遺伝子の代
わりに異型ＤＮＡの挿入されたセグメントを有すること
ができる。いずれの場合においても、ベクターは異型配
列を宿主中に導入するために手段を提供し、前記ベクタ
ーは、また、その中の自己複製の提供に必要な遺伝情報
を有する。宿主細胞は、遺伝子の発現に使用される、こ
の分野において現在普通の種々の原核宿主および真核宿
主の中から選択できる。このような有機体は、例えば、
大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂｃｉ １１ｕｓ ５ｕｂｔｉ
１ｉｓ）、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの種
々の菌株を包含する。さらに、宿主は性質が哺乳動物で
あることができ、そしてベイビーハムスター（ｂａｂｙ
ｈａｍｓｔｅｒ）腎細胞、チャイニーズハムスター
（Ｃｈａｉｎｅｓｅ ｈａｍＳｔｅｒ）卵巣細胞、ヘ
ラ（ＨｅＬａ）およびベロ（Ｖ Ｅ ＲＯ）細胞系のよ
うな細胞系を包含する。
１ｉｓ）、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの種
々の菌株を包含する。さらに、宿主は性質が哺乳動物で
あることができ、そしてベイビーハムスター（ｂａｂｙ
ｈａｍｓｔｅｒ）腎細胞、チャイニーズハムスター
（Ｃｈａｉｎｅｓｅ ｈａｍＳｔｅｒ）卵巣細胞、ヘ
ラ（ＨｅＬａ）およびベロ（Ｖ Ｅ ＲＯ）細胞系のよ
うな細胞系を包含する。
このような生体内蛋白質の生成は、次のように例示する
ことができる。ＩＴＩ軽釦を暗号化するｃ Ｄ Ｎ Ａ
配列線、ファーマシア争インコーポレーテッド（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）［モＬ／キュラー・バイオロ
ジカルスＯカタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ Ｃａｔａｌｏｇ）、６３ページ、１
９８４］から商業的に入手可能である発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３の独特ＥｃｏＲＩ部位の中に連結する０次
いで、正しい向きにおけるＩＴＩ軽鎖のｃＤＮＡ配列の
挿入は、制限プラスミドを生ずる制限マツピング技術に
よって決定する１次いで、前記プラスミドを使用して、
普通の技術によって、大腸菌（Ｅ。
ことができる。ＩＴＩ軽釦を暗号化するｃ Ｄ Ｎ Ａ
配列線、ファーマシア争インコーポレーテッド（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）［モＬ／キュラー・バイオロ
ジカルスＯカタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ Ｃａｔａｌｏｇ）、６３ページ、１
９８４］から商業的に入手可能である発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３の独特ＥｃｏＲＩ部位の中に連結する０次
いで、正しい向きにおけるＩＴＩ軽鎖のｃＤＮＡ配列の
挿入は、制限プラスミドを生ずる制限マツピング技術に
よって決定する１次いで、前記プラスミドを使用して、
普通の技術によって、大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５細胞を形質転換する０次いで、形
質転換されたバクテリアを生長に適当な条件下に培養す
る。ＩＴＩ軽鎖を暗号化するｃＤＮＡの発現は、イソプ
ロピル−β−チオガラクトシドを使用する誘導によって
達成する。この分野において標準の微生物の処理に引続
いて、得られるα−１−ミクログロブリン−Ｈｌ−３０
融合蛋白賀を分離する。
質転換されたバクテリアを生長に適当な条件下に培養す
る。ＩＴＩ軽鎖を暗号化するｃＤＮＡの発現は、イソプ
ロピル−β−チオガラクトシドを使用する誘導によって
達成する。この分野において標準の微生物の処理に引続
いて、得られるα−１−ミクログロブリン−Ｈｌ−３０
融合蛋白賀を分離する。
前述のように、ＩＴＪはヒトの血漿および血清中に見出
されるセリンプロテアーゼ阻害剤である。この蛋白質は
、蛋白質分解酵素、トリプシン、キモトリプシンおよび
好中性エラスターゼを阻害することが報告された。！ｆ
３療的観点から、最も重要なプロイテナーゼ阻害活性は
、ヒトの身体内のいくつかの源から放出されうる、加水
分解酵素エラスターゼの阻害である。ＩＴＩは、加水分
解酵素の過剰の放出、ことに種々の源からのエラスター
ゼから生ずる病気を処理するために１ｔＩ療的に使用で
きる。例えば、膵臓エラスターゼの過剰の放出は膵臓炎
を生ずる。過剰の血清エラスターゼのレベルはアテロー
ム性硬化症に関係づけられてきており、そして過剰の好
中性エラスターゼは、すべての結合組織、血管壁への傷
害および肺の組織の壊死および変性を生ずる急性および
優性の炎症において観測される。免疫学的プロセス、例
えば、リウマチ性関節炎のための炎症において、リソン
ームの酵素、とくに好中性エラスターゼ、が演する部分
は等しく重要である。
されるセリンプロテアーゼ阻害剤である。この蛋白質は
、蛋白質分解酵素、トリプシン、キモトリプシンおよび
好中性エラスターゼを阻害することが報告された。！ｆ
３療的観点から、最も重要なプロイテナーゼ阻害活性は
、ヒトの身体内のいくつかの源から放出されうる、加水
分解酵素エラスターゼの阻害である。ＩＴＩは、加水分
解酵素の過剰の放出、ことに種々の源からのエラスター
ゼから生ずる病気を処理するために１ｔＩ療的に使用で
きる。例えば、膵臓エラスターゼの過剰の放出は膵臓炎
を生ずる。過剰の血清エラスターゼのレベルはアテロー
ム性硬化症に関係づけられてきており、そして過剰の好
中性エラスターゼは、すべての結合組織、血管壁への傷
害および肺の組織の壊死および変性を生ずる急性および
優性の炎症において観測される。免疫学的プロセス、例
えば、リウマチ性関節炎のための炎症において、リソン
ームの酵素、とくに好中性エラスターゼ、が演する部分
は等しく重要である。
引用文献
この明最初中において言及した文献は、次の通りである
： １、 アルキンンン（ＡＩｋｉ ｎ５ｏｎ）Ｔ。
： １、 アルキンンン（ＡＩｋｉ ｎ５ｏｎ）Ｔ。
ら、「オリゴヌクレオチドの合成−実際のアプローチ（
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。
ｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ｈ）」、英国オフスフオード、１９８４（第３章）。
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ｈ）」、英国オフスフオード、１９８４（第３章）。
２、 ペアウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）Ｓ。
ら、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅ
ｔ、 Ｌｅｔ、）２ヱ、１８５９−１８６２ （１９
８１）。
８１）。
３、 ベントン（Ｂｅｎｔ ｏｎ）Ｗ、ら、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）↓旦ｊ、１８０−１８２ （１９７
７） 。
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）↓旦ｊ、１８０−１８２ （１９７
７） 。
４、 ブーアゲニオン（Ｂｏｕｒｇｕｎｉ。
ｎ）Ｊ、ら、ＦＥＢＳ レターズ（Ｌｅｌ１、）よ旦
ヱ、２７９−３８３ （１９８３）。
ヱ、２７９−３８３ （１９８３）。
５、 ブーアゲニオ７（ＢＯｕｒｇｕｎｉＯｎ）Ｊ、ら
、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、）上１ユ
、１１４６−１１５３ （１９８５）。
、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、）上１ユ
、１１４６−１１５３ （１９８５）。
６、 デイニンガー（Ｄｅ ｉ ｎ ｉ ｎｇｅ ｒ）
Ｐ１、アナリティ力ルΦバイオケミストリー（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１２９．２１６−２２３
（１９８ ３）。
Ｐ１、アナリティ力ルΦバイオケミストリー（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１２９．２１６−２２３
（１９８ ３）。
７、 ドラパースティン（Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ）
Ｂ、ら、細胞（Ｃｅｌｌ）１ヱ、７５９−７６９ （１
９７９）。
Ｂ、ら、細胞（Ｃｅｌｌ）１ヱ、７５９−７６９ （１
９７９）。
８、 フイ７７ （Ｈｕｙｎｈ）Ｔ、ら、ＤＮＡクロ
ーニング、グロウバー（Ｇｌｏｖｅｒ）Ｄ、、編、ＩＲ
Ｌプレス、英国オフスフオード（Ｖｏ１、Ｉ、４９−７
８．１９８５）。
ーニング、グロウバー（Ｇｌｏｖｅｒ）Ｄ、、編、ＩＲ
Ｌプレス、英国オフスフオード（Ｖｏ１、Ｉ、４９−７
８．１９８５）。
９、 （Ｋｒｉｅｇ）Ｐ、ら、核酸の研究（Ｎｕｃ１
、、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）１２．７０３５−７０５
６ （１９８ ４）。
、、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）１２．７０３５−７０５
６ （１９８ ４）。
１０、 ラエムリ （Ｌａｅｍｍｌ ｉ）Ｕ 、ら
、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイア
テイ（Ｊ、 Ａｍｅｒ。
、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイア
テイ（Ｊ、 Ａｍｅｒ。
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、）よ旦１、３１８５（１９８１
）。
）。
１２、 ベルハム（Ｐｅｌｈａｍ）Ｈ，ら、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）６７．２４７−２５６
（１９７６）。
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）６７．２４７−２５６
（１９７６）。
１３、 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ、ら、プロシー
ディンゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒ。
ディンゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒ。
ｃ、 Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ、 Ｓ ｃｉ 、
）ＵＳＡ、ヱＡ、５４６３−５４６７（１９７７）。
）ＵＳＡ、ヱＡ、５４６３−５４６７（１９７７）。
１４、 ワラチャ−（Ｗａｃｈｔｅｒ）Ｅ、ら。
ホッペーセイラーのツァイツシュリフツ・ツーエル・フ
ィジオロジッシェ・ヘ ミ−（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏ１、 Ｃｈｅｍ、）３６２．１
３５１−１３５５ （１９８１）。
ィジオロジッシェ・ヘ ミ−（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏ１、 Ｃｈｅｍ、）３６２．１
３５１−１３５５ （１９８１）。
第１図は、ＩＴＩ軽鎖のｃＤＮＡクローンの分離に使用
するオリゴヌクレオチドのプローブを示す、プローブの
設計に使用する蛋白質配列は、ワラチャー・アンド・ハ
ッチスタッサー（Ｗａｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｃ
ｈＳｔ ｒａｓｓｅｒ）、１９８１から採用する。ドメ
イン■からの配列は、Ｍｅｔ−４９〜Ｐｈｅ−６６、そ
してドメインＩＩからの配列はＣｙｓ−１１５〜Ｃｙｓ
１３２である。 第２図は、ＩＴＩ軽釦軽鎖クレオチドおよび蛋白質配列
を示す、α−１−ミクログロブリン（α−１−ミク）の
配列は、ヌクレオチド１０８で開始し、そしてヌクレオ
チド６５６に及ぶ、ＨＩ−３０はヌクレオチド６６６で
開始し、そしてヌクレオチド１１００に及ぶ、ドメイン
エはヌクレオチド７２９で開始し、そしてドメインＩＩ
はヌクレオチド８９７で始まる。オリゴヌクレオチドの
プローブの設計に使用したアミノ酸配列は、下線を付し
である。尿から精製したＨＩ−３０の蛋白質配列と異な
る位置は、長方形で囲まれている。 第３図は、ＩＴＩ軽鎖の蛋白質構造を表わす。 Ｍｅｔはオープンリーディングフレームの第１アミノ酸
である。「Ｓ」はシグナル配列を示し、そしてＡｌａ−
ＧＩＹは潜在的なシグナルのペプチダーゼ切断部位であ
る。Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチドは、α−１−ミクログロ
ブリン領域とＨＩ−３０領域との境界に存在する。「Ｌ
」はクニッ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインＩおよびＩＩの
前に存在する２１アミノ醜配列である。５ｅｔ−Ａｓｎ
ジペプチドはオープンリーディングフレームの端に存在
する。 第４図は、軽鎖ｍＲＮＡの翻訳生成物の免疫沈殿を示す
、ＲＮＡはブルースクライブ（ＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅΦ
）発現ベクター中にクローニングされたインサートから
転写される。ＲＮＡは生体外でキャップ（ｃａｐ）され
、モして３５−Ｓメチオニンを組込んだミクロコックス
のヌクレアーゼ処置したウサギ網状赤血球リゼイトで翻
訳された。レーンＡはＲＮＡを添加しない翻訳であり、
そしてレーンＧは軽鎖ｍＲＮＡの翻訳である。 レーンＢ、Ｃ，Ｄは、非免疫抗体、抗β−ガラクトシダ
ーゼで沈殿させ、抗体を含まない、軽鎖ＲＮＡ翻訳であ
る。レーンＥおよびＦは、それぞれ、抗α−１−ミクロ
グロブリンおよび抗インターα−トリプシン阻害剤で沈
殿させた。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコボレー
テッド ドメイン エ Ｍｅｔ Ａｈａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ｇｕｙ５’−ＡＴＧ
ＧＣＣＴＧＣＧＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＴＡ
ＣＧＧＣ３’−ＡＴＧ ＣＣＧ ド′芦イフ ＸＩ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｕｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ５′−ＴＧＣＣ
ＡＧ ＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧ ＴＴＣＴ
ＡＣ３’−ＡＡＧ ＡＴＧ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｇｕｙ Ａｓｎ Ａｓｎ ＰｈｅＧＧＣＴＧＣ−
３１ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＡＣＣＣＧ ＴＴＧ ＣＣＧ ＴＴ
Ｇ ＴＴＧ ＭＧ−５’Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｙｒ ＣｙｓＡＧＣＣ
ＡＧ−３’ ＴＣＧ ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＯＴＣＴ ＣＴＣＡＴ
Ｇ ＡＣＧ−５’訂 目謬 西 Ｖ
するオリゴヌクレオチドのプローブを示す、プローブの
設計に使用する蛋白質配列は、ワラチャー・アンド・ハ
ッチスタッサー（Ｗａｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｃ
ｈＳｔ ｒａｓｓｅｒ）、１９８１から採用する。ドメ
イン■からの配列は、Ｍｅｔ−４９〜Ｐｈｅ−６６、そ
してドメインＩＩからの配列はＣｙｓ−１１５〜Ｃｙｓ
１３２である。 第２図は、ＩＴＩ軽釦軽鎖クレオチドおよび蛋白質配列
を示す、α−１−ミクログロブリン（α−１−ミク）の
配列は、ヌクレオチド１０８で開始し、そしてヌクレオ
チド６５６に及ぶ、ＨＩ−３０はヌクレオチド６６６で
開始し、そしてヌクレオチド１１００に及ぶ、ドメイン
エはヌクレオチド７２９で開始し、そしてドメインＩＩ
はヌクレオチド８９７で始まる。オリゴヌクレオチドの
プローブの設計に使用したアミノ酸配列は、下線を付し
である。尿から精製したＨＩ−３０の蛋白質配列と異な
る位置は、長方形で囲まれている。 第３図は、ＩＴＩ軽鎖の蛋白質構造を表わす。 Ｍｅｔはオープンリーディングフレームの第１アミノ酸
である。「Ｓ」はシグナル配列を示し、そしてＡｌａ−
ＧＩＹは潜在的なシグナルのペプチダーゼ切断部位であ
る。Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチドは、α−１−ミクログロ
ブリン領域とＨＩ−３０領域との境界に存在する。「Ｌ
」はクニッ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインＩおよびＩＩの
前に存在する２１アミノ醜配列である。５ｅｔ−Ａｓｎ
ジペプチドはオープンリーディングフレームの端に存在
する。 第４図は、軽鎖ｍＲＮＡの翻訳生成物の免疫沈殿を示す
、ＲＮＡはブルースクライブ（ＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅΦ
）発現ベクター中にクローニングされたインサートから
転写される。ＲＮＡは生体外でキャップ（ｃａｐ）され
、モして３５−Ｓメチオニンを組込んだミクロコックス
のヌクレアーゼ処置したウサギ網状赤血球リゼイトで翻
訳された。レーンＡはＲＮＡを添加しない翻訳であり、
そしてレーンＧは軽鎖ｍＲＮＡの翻訳である。 レーンＢ、Ｃ，Ｄは、非免疫抗体、抗β−ガラクトシダ
ーゼで沈殿させ、抗体を含まない、軽鎖ＲＮＡ翻訳であ
る。レーンＥおよびＦは、それぞれ、抗α−１−ミクロ
グロブリンおよび抗インターα−トリプシン阻害剤で沈
殿させた。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコボレー
テッド ドメイン エ Ｍｅｔ Ａｈａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ｇｕｙ５’−ＡＴＧ
ＧＣＣＴＧＣＧＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＴＡ
ＣＧＧＣ３’−ＡＴＧ ＣＣＧ ド′芦イフ ＸＩ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｕｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ５′−ＴＧＣＣ
ＡＧ ＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧ ＴＴＣＴ
ＡＣ３’−ＡＡＧ ＡＴＧ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｇｕｙ Ａｓｎ Ａｓｎ ＰｈｅＧＧＣＴＧＣ−
３１ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＡＣＣＣＧ ＴＴＧ ＣＣＧ ＴＴ
Ｇ ＴＴＧ ＭＧ−５’Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｙｒ ＣｙｓＡＧＣＣ
ＡＧ−３’ ＴＣＧ ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＯＴＣＴ ＣＴＣＡＴ
Ｇ ＡＣＧ−５’訂 目謬 西 Ｖ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、インターα−トリプシン阻害剤の軽鎖のＨＩ−３０
解読領域をもつ配列中のα−１−ミクログロブリンを暗
号化することを特徴とするｃＤＮＡ配列。 ２、前記ｃＤＮＡ配列に対して分泌先導配列５′の遺伝
情報を指定するＤＮＡ配列をさらに含む特許請求の範囲
第１項記載のｃＤＮＡ配列。 ３、特許請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡ配列を含んで
なることを特徴とする組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー。 ４、特許請求の範囲第２項記載のｃＤＮＡ配列を含んで
なることを特徴とする組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー。 ５、特許請求の範囲第３項記載のクローニングベクター
によって形質転換された微生物。 ６、特許請求の範囲第４項記載のクローニングベクター
によって形質転換された微生物。 ７、α−１−ミクログロブリンおよびＨＩ−３０を含ん
でなることを特徴とするインターα−トリプシン阻害剤
の軽鎖の融合蛋白質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89146986A | 1986-07-29 | 1986-07-29 | |
| US891469 | 1986-07-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6387984A true JPS6387984A (ja) | 1988-04-19 |
Family
ID=25398250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62186767A Pending JPS6387984A (ja) | 1986-07-29 | 1987-07-28 | ヒトのインタ−α−トリプシン阻害剤の遺伝子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0255011A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6387984A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005070954A1 (ja) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Toray Industries, Inc. | 分画装置および分画方法 |
| JP2005232156A (ja) * | 2004-01-21 | 2005-09-02 | Toray Ind Inc | 生体成分精製溶液、生体成分分離方法および生体成分分離装置 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2066033T3 (es) * | 1989-05-13 | 1995-03-01 | Bayer Ag | Inhibidores de las proteinasas, procedimiento para su preparacion y composiciones farmaceuticas que los contienen. |
| CA2055425A1 (en) * | 1990-11-13 | 1992-05-14 | Hideaki Morishita | Polypeptide, dna fragment encoding the same and process for producing the same, and enzyme inhibition process, drug composition and methods of treating using the same |
| US5166133A (en) * | 1991-04-17 | 1992-11-24 | Cetus Corporation | Method for inhibing adhesion of white blood cells to endothelial cells |
| DE4309391C2 (de) * | 1993-03-23 | 1996-10-24 | Harald Prof Dr Tschesche | Verwendung von Angiogenin und/oder dessen Fragmenten als Wirkstoff zur Verhinderung oder Begrenzung der Sekretion von Proteinen aus Leukozyten |
| JP3570558B2 (ja) * | 1993-05-01 | 2004-09-29 | 持田製薬株式会社 | Ｄｎａ断片およびそれを含むベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該ベクターを用いる蛋白質の産生方法 |
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| US6103691A (en) * | 1994-03-23 | 2000-08-15 | Tschesche; Harald | Utilisation of angiogenin and/or α1 -microglobulin and/or complement factor D in order to inhibit the secretion of proteins |
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