JPS6388460A - 免疫診断装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ ここで説明される装置および方法は、形成及び検出が困
難な微粒子複合体、特に免疫複合体の診断検査に役立つ
。微粒子複合体の試験の伝統的方法は、検査を行なうた
めに同じ工程を繰返す必要があり、また実験設備が複雑
なために時間と費用がかかる。さらに、この様な試験に
はしばしば、中間抽出および試料に存在する妨害物質を
取除くための洗浄工程が必要である。

免疫診断試験システムを行なうには検査を完了するのに
使用者が費やす時間を減らすことが肝心である。そのた
め、検査を行なうのに必要な工程数を減らし、最終的に
単一工程にする努力がなされてきた。しかし単一工程は
現在存在しない。

診断試験を行なうのに費やす時間を減らすのに加え、こ
の様なシステムの別の所望の特性は経過時間中室温で安
定していることである。一般に、診断装置には異なる温
度で安定を保つ多数の試薬を含む。これら試薬のいくつ
かは短時間室温で安定性しているが、安定性の少ないも
の、または全く安定しないものもある。試薬の温度の効
果は検査の感度と信頼性を低下させ、欠点を増やす。現
在使用可能な市販されているほとんどの診断装置は、検
査を有効にするために使用される１以上の試薬の安定性
を保証するために低温で維持する必要がある。第１表は
、全診断キットまたはホルモン妊娠キットを製造する３
社の主なキットに存在する試薬は、有効であるために低
温で保存しなければならないということを示す。長時間
室温で安定な診断試験システムは装置において極めて進
歩している。

現在使用されているほとんどの診断装置は“サンドウィ
ッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）″検査を前提とする。

ここでは、分析対象、または検査される物質は固体母材
に結合した過剰な抗体分子によって培養される。次にも
う一つ過剰ではあるが分析対象の第２の決定因子に対す
る第２の抗体が、固体母材に伸管した第１の抗体から形
成される免疫複合体によって培養される。免疫複合体の
表面の標識抗体お存在は使用される標識のタイプに応じ
て適切な手段によって決定される。この種の検査は、抗
原が２つの異なる領域またはエピトープで結合した２つ
の抗体を有するために、通常“サンドウィッチ′または
“２一箇所”検査と呼ばれる。

多くの“サンドウィッチ０検査が特許となっている（例
えば、米国特許第４，３６１，６４７号または同第４，
４９７，８９９号を参照）。しかし広く使用されている
にもかかわらず、その作用には困難な点がある。前述の
ように、連続的手動操作が必要であり、また低感度であ
る。ρｊえば、“サンドウィッチ″技術を使用する免疫
検査を行なうのに一般に使用される工程には以下のもの
がある： １、抗体の希釈度の決定。

２、固体母材の感度を高めるのに使用される過剰抗体の
除去。

３．結合していない抗体から遊離した固体支持母材の洗
浄。

４、母材と試験検査溶液との接触。

５、試験検査試料中で検出される分析対象が抗体に結合
するように長時間培養すること。

６、未反応の物質を取除くための母材の洗浄。

７、母材と標識された第２の抗体との接触。

８、未反応の第２の抗体を取除くための固体母材洗浄。

９、第２の抗体が適切な計数技術を使用して放射標識さ
れる場合には直接、また標識が反応によって検出可能な
色の変化を生じる物質を添加する酵素標識である場合に
免疫複合体の存在を決定すること。

１０、第２の抗体が酵素標識を有する場合、発色が十分
な強度になった後、強アルカリまたは酸によって反応を
停止すること。

時間を多く費やし、比較的感度が低いことに加え、“サ
ンドウィッチ”検査はさらに他の２つの点において制限
がある：まず試料に存在する１以上の抗原物質を検出す
る装置と共に使用するにはあまり適切ではない。多重抗
原試料を試験する場合、試料のアリコツトを個々に検査
しなければならない。第２に、検査試料の使用が非効率
的となり、それによって信頼性のある結果を得るために
多量の試料を検査しなければならない。

これは部分的には、試料が広い表面積の固体母材に付告
するためである。このように、多重抗原の検査を円滑に
しかつ試料の流れを有効に利用するサンドウィッチ技術
を前提とした装置があれば明かな進歩である。

前述のように、現在の診断装置にはない特性は長時間に
亙る室温での安定である。現在不安定であることの理由
は分っていない。しかしながら、固体支持母材に結合し
た抗体が不安定であること、および抗原の存在を検出す
るのに使用される抗体酵素抱合体の凝集体の組成が原因
していることは明かである。固体支持母材に結合した抗
体が不安定であるため２乃至８℃の範囲の温度で抱合体
を貯蔵して凝集体の組成を制御しても満足できる結果は
得られない。この様な温度では凝集体の組成速度は減少
する。しかしながら、この方法は不便で、また低温で診
断装置を貯蔵するのは費用がかかるために室温で安定す
る抗体酵素接合体の開発と、凝集体から生じる欠点を減
少する方法を改良する努力がなされてきた。しかしこれ
らの努力も不成功に終わっている。

診断検査にはまた、抗原を結合せず、従って複合体を形
成する結合反応体から免疫複合体の一部を形成すること
がない免疫反応体を分離する工程がある。未結合の反応
体の存在は検査のバックグラウンドを増やす。そこで実
際には、免疫複合体を洗浄して、未結合の反応体が原因
のバックグラウンドをほぼ取除いても、はとんどの検査
にはさらにバックグラウンドを減らすいわゆる遮断工程
がある。遮断工程には、抗体で被覆した後にタンパク様
の物質で固体支持体を被覆する工程が含まれる。遮断物
質は固体母材のうち抗体で被覆されていない箇所に結合
し、免疫複合体の一部ではない免疫反応体のそれ以降の
非特異的な結合を阻止する。一般に、遮断工程は検査を
行う前に行われるが、米国特許第３，８８８，６２９号
で説明されたようにさらに時間を費やして、固体母材を
遮断剤で含浸し、次いで凍結乾燥して、使用するまでこ
の状態に維持する必要がある。固体表面を遮断物質で予
め処理したり、遮断タンパク質を含む凍結乾燥ろ過器を
使用するのは冗長で時間がががり、また経費がかぎる。

これらの工程を両方とも削除すると所望の診断装置が得
られる。

前述のように、多くの免疫診断装置が存在するが、感度
、簡単さ、診断速度、および長時間の室温での安定が所
望であることは明かである。

［発明の概要］ 本発明の免疫診断検査装置は現在のものよりも利点を有
し、サンドウィッチおよび非サンドウィッチ検査の両方
を行なうのに使用できる。本発明の装置は長時間室温で
結果が叩圧に出、非常に感度が良く、さらに同じ検査溶
液に存在する１以上の抗原を同時に検出することができ
るなど多数の特徴を有する。

ここで説明される診断検査装置は免疫複合体の組成によ
って抗原または抗体のいずれかを検査するのに主に使用
されるが、その適用範囲はかなり広く、これらの分子に
制限されないことは当業者には理解されるであろう。装
置には最少限第２の分子を認識し結合する第１の分子が
あればよい。

第１の分子は通常配位子認識分子と呼ばれ第２の分子は
配位子と呼ばれる。抗体と抗原はそれぞれ配位子認識分
子と配位子の好ましい態様であり、装置は様々な配位子
および配位子認識分子と共に使用される。例えば、ホル
モン受容体分子は配位子認識分子であり、固体母材に付
着できるので、対応するホルモン配位子の検査に使用さ
れる。反対に、ホルモンも母材に付着するので、ホルモ
ン受容体の検査に使用される。免疫診断装置で使用する
のに適した配位子認識分子と配位子の様々な組合イつせ
は当業者には明かであろう。

サンドウィッチまたは非サンドウィッチ検査を本装置で
行なう場合、１以上の別々の抗体を母材に直接噴霧する
新規のプリンターニーダ技術を使用して抗体を母材に含
浸させる。この技術を使用して、１以上の抗原を結合す
るために、抗体を迅速に不連続な環状、線状、または他
の形状に付着させることができる。検査される抗原の数
は明瞭なパターンに付着されるそれぞれの抗体の数の関
数である。

抗体が含浸した母材の下には吸収性物質からなる２つの
層がある。母材の直ぐ下にはバックグラウンドを減らす
物質からなる中間層がある。その下には吸収性物質から
なる第２の層がある。その機能は検査液を吸収・保持し
、また抄々の流体を洗浄することであり、多種の吸収材
料からなっている。

ここで説明するバックグラウンドを低下させる本発明の
別の機能は、適切な遮断物質、特にタンパク様物質で前
置フィルターを含浸することによって達成される。前置
フィルターは母材の上に位置しており、所定の条件下で
フィルターをタンパク様物質と接触させることによって
遮断物質を含浸する。検査を行なう時、適切な量の検査
液は前置フィルターに注がれ遮断物質とともに前置フィ
ルターを通過する。検査液とそれに含まれる遮断物質は
、遮断物質が母材上の非特異性の反応箇所に結合してそ
の箇所を過剰な免疫化学物質によって結合に使用できな
いようにしである、抗体が含浸した母材と接触する。

高感度で長時間室温で安定な本発明の装置は少なくとも
２つの区画を有する室を有する。第１の区画は抗体が含
浸した母材を有し、第２の区画は湿度を吸収する化学物
質を有する。第２の区画は第１の区画と通じ、第１の区
画の乾燥状態を維持するため、検査の感度と信頼性を増
大する。これは前置フィルターの遮断剤の安定性を維持
し、非使用明間中のみ材に抗体をよくなじませる。便利
であるとは言えないが、湿度を吸収する化学物質を他の
手段によって母材になじませることによっても同じ効果
が得られる。

本発明の他の特徴は検査液を母材にアクセスする装置の
上面にある漏斗形のアパーチャーである。

この形状は検査試料を有効に使用し母Ｈのうちの小さい
表面積に付着させることによって次の洗浄を効果的なも
のにする。

免疫診断装置は抗体を母材に結合することによって抗原
を検査すると説明してきたか、その用途は制限されない
ことは当業者には理解されるであろう。抗体に対応する
抗原を母材に結合することによって検査液に存在する抗
体を検査に使用するのにも適１．でいる。本発明のこの
特性は自己免疫の検出と診断に役立つ。

ここで説明された診断装置に関する特性を組合わせるこ
とによって現在使用されている装置より感度が良く、信
頼でき、使用するのに便利で、適用範囲が広く、さらに
機能を損わずに長時間室温で貯蔵できるシステムが提供
される。

この技術に熟練した者には明らかであろうが、この発明
の本質は遮断剤で含浸されたフィルター、抗体で適切に
含浸された母材、過剰の流体を除去するための吸着層、
およびイムノアッセイを行なうために上記のすべてを支
持しまとめる容器である。それ故に、この発明が以下に
詳細に記述されているが、この記述は発明の好ましい具
体例を表現しているのであり、発明を制限するものとし
て解釈してはならない。

第１図および第２図は、この発明に使用し得る適切な免
疫診断用試験装置の代表例である。第１図は装置を組み
上げた図を、第２図は装置の立体分解図を示す。第１図
に示したように、それは分離可能な頂部１２、および底
部１４およびろ過装置２８を有する容器１０よりなる。

第２図はさらに容器１０の頂部１２および底部１４を示
す。発明の好ましい態様では、底部１４は２つの室１Ｂ
および１８に分離されている。室１６には中間層２２か
らの流体を受けとめる吸収材２０が置かれている。中間
層２２は順番に母相２４からの流体を受ける。第２図に
はまた、頂部１２および底部１４が接合した際に圧力平
衡のための排気口として作動する切れ口４０が示されて
いる。

後者は分析の実行に要する時間を減少させるが、分析を
実行するために必須のものではない。

容器１０の頂部１２の内部には開口部２６がある。底部
の穴１５に適合する頂部に付いた柱材１３によって頂部
１２が底部１４と合わされた時に、開口部２６は母材２
４の上に位置する。さらに、頂部１２はろ過装置２８と
も符合する。流体がろ過装置２８に適用された時、ろ液
が開口部２Ｇを通過して母材２４に接触するように、ろ
過装置２８は開口部２６の上に位置する。

ろ過装置２８は、多くの手段のうちのいずれか一つによ
って頂部１２と結合している。装置２８の角に、頂部１
２に位置する受は穴３２に適合する柱材３０を設けるこ
とによってこれを成し遂げると都合が良い。

開口部２６とろ過装置２８は共に、漏斗型の外形を有す
ることが好ましい。この型は、多量の試料流体を表面積
の小さい母材２４に通すことを可能にする。開口部２６
およびろ過装置２８の両者の寸法は装置の性能に影響を
与えることなく相当変化させることが可能であるが、本
発明者らは、おおよそ以下の寸法が満足できるものであ
ることを見い出した；底の直径が１．Ｏａ、上部の直径
が２．０ｃｍ、および深さ　０．３α。

ろ過装置２８中の試薬、および母材２４を劣化させるこ
となく長期保管を可能にするこの発明の特徴は、室１８
に置かれた水分吸収化学薬品である。そのような化学薬
品は水分が試薬に接触し、活性の損失を引起こすことを
妨げる。この技術に熟練した人々に良く知られた様々の
化学薬品は、この目的に有益である。この発明の有効性
は、水分吸収化学薬品を保持するための部屋１８を有す
る装置に完全に頼っているのではないことは明らかであ
る。

単独の室でも、化学薬品が池の方法、例えばそれを外壁
に付着させることによって、機能させられるならば充分
に機能するであろう。

第３図はこの発明の拡大断面図を示す。ろ過装置２８は
、穴３２に内挿される柱材３０によって頂部１２に取付
けられる。頂部１２および底部１４もまた、頂部にあり
底部の穴１５に適合する柱材１３によって接合される。

第１図ないし第３図に示された診断用装置を形成する容
器は平らな形をしているが、発明はこの形に限られない
ことは、この技術に熟練した人々によって認識されるで
あろう。実際、それが上述した要素で組立てられるなら
ば、いかなる形でも充分に機能するであろう。

この診断用装置は、固体表面上の配位子−配位子識別分
子複合体の検８に有益である。配位子または配位子識別
分子のいずれかが母材２４と結合可能であるならば、複
合体の相応する構成要素を検出するために使用されるこ
とに注目することは重要である。すなわち、配位子識別
分子が母材に結合したならば、一般に、配位子は分析し
？５る；配位子が母材２４に結合したならば、配位子識
別分子が分析し得る。

配位子は一般に、しかし必然的にではなく、薬物、ペプ
チドホルモン、および他の生物活性分子のように低分子
量分子である。一方、配位子認識分子は一般に、しかし
また必然的にではなく、高分子量分子であり、しばしば
蛋白質、特に抗体分子である。それ故、この診ＩＩ用装
置が具体例として提示しているのは、それぞれ配位子お
よび配位子識別分子としての抗原および抗体（モノまた
はポリクローナル）であるが、発明はこの配位子および
配位子識別分子の使用に限定されないことは、この技術
に熟練した人々には理解されるであろう。

しかしながら、これらはしばしば診断用分析法に使用さ
れるため、この発明はそれらに倣って記述される。

ここに記述されている診断用装置は、しばしば抗体およ
び抗原で形成された「サンドウィッチ」免疫複合体を検
出するために用いられ、それ故、標識されていない最初
の抗体の結合に適する支持材を母材２４として用いる。

しかしながら、装置は同様に非サンドウィッチ分析、特
に競合結合分析を行なわせ得ることは認められるであろ
う。後者は、単一の抗体結合部位を有するか、または、
その大きさのために、立体障害によって１個以上の抗体
の結合を妨げるかのいずれかの低分子量分子の分析にし
ばしば使用される。それ故、この発明は薬物、ステロイ
ド等に使用し得る。

抗体の固体母材への付着は、直接に、またはこの技術に
熟練した人々に良く知られた種類のリンカ−を用いて、
吸収または共有結合によって行なわれる。多くの種類の
中で、これらの手順を実行する適切な方法は、例えば、
Ｂ↓ｏｃｈｃｍｉｃａｌＪ　ｏｕｒｎａｌ　（１９７２
）　、第　１２９巻；第２５５頁におけるアイマン（Ｉ
　ｍａｎ　）およびホーンビー（Ｈｏｒｎｂｙ）、Ｂ　
　１ｏｃｈｅ１ｃａｌ　　　　Ｂ　　１ｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ　　　Ａ　ｅｔａ　　　（１９７５ン　、第３８４
巻；第３０７頁におけるキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ
　）　、ホーンビー、およびモリス（Ｍｏｒｒｉｓ　）
、およびＦ、　Ｅ、Ｂ、　　Ｓ、　１ｅｔｔｅｒｓ　　
（１９７７）　、第１０４巻；第７８頁におけるマチス
ン（Ｍ　ａｔｔ　１ｓｓｏｎ）およびニルソン（Ｎ　１
ｌｓｓｏｎ）によって与えられている。そのうえ、抗体
との結合に適した化学的に前処理された物質は、商業的
にも開発され得る。

多くの材料が支持材の組立てに利用され得る。

そのような材料は一般に合成または天然の高分子である
。有益な合成高分子の例は、ポリエチレン、ポリアクリ
ルアミド、ナイロン、樹脂、ポリ塩化ビニル、およびポ
リスチレンである。典型的に用いられる天然高分子はセ
ルロース、ポリサツカリド、セファロース、アガロース
、および種々のデキストランである。支持材の組立てに
使用され得る添加材料は、シリカ、特にガラス、コラー
ゲン、およびポリヌクレオチドである。上述の多くの材
料がこの発明において充分に機能するが、好ましい態様
はナイロンからなる材料である。

本診断装置の重要な観点は、固体母材２４に抗体を適用
する方法である。現在おこなわれているほとんどの方法
では、抗体は母材２４の全表面に非選択的に付着する。

これでは、しばしば高価であり、得ることか困難である
抗体か無駄にされ、さらには同じ試料中に存在するｌを
越える抗原の検査が排除されることとなる。本発明者ら
は、抗体を稀薄流体中にスプレィ搬送しこれを母材上に
付着させることによて、上記両方の問題点を回避できる
ことを見い出した。この手法は、抗体を含む溶液を小孔
ノズル内を通過させ、その際溶液を、音波振動その他の
手段を用いて個々の小滴にフラグメント化することによ
って最も効果的におこなうことができる。ついで、小滴
を、電場を通過させることによってＧ１電し、母材上に
偏向させる。

この方法を達成するための方法は、米国特許第３゜２８
１．８６０号および第４，１２１，２２２号に記載され
ている。

上記方法は、ビデオジェット・システムズ・インターナ
ショナルによって製造されている市販の印刷装置を用い
ることによって最も容易におこなえる。この装置はビデ
オジェット　コーダー／プリンターと呼ばれ、種々の条
件下でおよび種々の流れ幅において抗体の流れを提（共
する。この装置を用いると、異なる抗原特異性をＨする
抗体をそれぞれ含有する一連の線その他のパターンを母
材上に形成することができる。

抗体を母材にスプレィで適用することは、抗体を単に吸
収によって母Ｈに結合させるか、化学的に前処理された
母料と共有結合させるかのいずれかの場合に適している
。

第２図は、固体母材の下側に中間層２２が設けられてい
ることを示している。この中間層は、吸収材料２０と母
材２４との間に位置し、検査流体のバックグラウンドを
減少させる作用をなす。検査流体は母材２４を通過した
後、中間層２２と接触しこれを通じてろ過される。中間
層は、未反応試薬の逆流を減少させることによって検査
流体のバックグラウンドを低下させ、また未反応試薬が
母材と再び接触することを防止する。中間層２２を形成
するために、種々の材料を用いることができる。特に好
適な材料は米国特許第３，８６０゜００３号、第４，０
８１，３０１号および第４゜５１５．５９５号に記載さ
れている使い捨てオムツに普通に使用されている不織ポ
リプロピレン材料である。

中間層２２に加えて、バックグラウンドが低く使用の簡
便性を向上させる本診断装置のいま１９の特徴は、頂部
１２に設置されているろ過装置２８である。この装置は
、検査をおこなうに必要な検査流体を一度に収容できる
ろう斗状中央領域３８と、把持して装置２８を取り外す
ことのできるタブ３４を有する。ろ過装置２８の底部に
は、フィルター３６が設置されている。このフィルター
は、検査をおこなうために必要であり検査流体がろ過装
置２８に適用されたとき検査流体とともに母材上に運ば
れる１種以上の試薬によって含浸されている。

ろ過装置２８のフィルターを作製するために、種々の材
料を用いることができる。確かに、はとんどの場合、母
材を構成する上記材料をフィルターにも好適に用いるこ
とができる。本発明者らは、ガラス繊維が特に適してい
ることを見出した。その例を挙げると、ポール社から市
販されているウルチボールＣＦフィルターＵ６−４０で
ある。

フィルター３６には種々の試薬を含浸しておくことがで
きる。特にタンパク遮断試薬を含浸させておくと都合が
よい。遮断試薬の種類は重要ではない。種々のタンパク
性物質、アミノ酸、ペプチドを用いることかできる。し
かし、発明者らは乳タンパク質が満足のできるものであ
ることを見出し、カーネーション社の脱脂粉乳を常用し
た。もし固体母＋第２４を抗体と共有結合させるため化
学的に前処理する場合には、グリシンのような低分子量
のアミノ反応試薬を用いるのが好ましい。

遮断試薬をフィルター３６によく馴染ませるためには、
乾燥した試薬材料が均一にフィルターに塗布されるよう
に十分な時間接触させるのが好ましい。これはフィルタ
ーに十分な接着性のない物質を除去した後も、遮断試薬
をフィルター材料に接触させておくことによって達成で
きる。

これに代って遮断試薬をフィルター３６に馴染ませる方
法が、フィルターを遮断試薬を含む溶液に含浸させ、後
にそのフィルターを凍結乾燥するのものであるならば一
応評価されるだろう。この方法は低分子量の遮断試薬（
例えばグリシン）を用いる場合に有益である。このよう
に処理されたフィルターは本装置においてよく機能する
が、凍結乾燥はフィルターを硬化させるため、溶液がフ
ィルターに浸透するのに時間がかかり好ましいものでは
ない。さらに９祠２４に遮断試薬が不均一に付着してバ
ックグラウンドの増加を招く。

遮断試薬をフィルター装置２８のフィルター３６になじ
ませることの他に、他の試薬を検査に用いられる部品に
含浸させておくことも好ましい。

これによってこれらの試薬を分離工程において添加する
必要がなくなるからである。例えば抗体−抗原複合体の
存在を明らかにするのに用いられる試薬、即ち抗体酵素
抱合体又は酵素基質を同様にフィルター３６に馴染ませ
ることができる。

本発明の第２の特徴は、底部１４にある室に適当な乾燥
剤を用いることである。これは診断装置の長期にわたる
室温での安定を保つ上で重要である。母材２４又はフィ
ルター３６の安定性又は在勤寿命は、装置を取巻く湿度
の関数である。現在使われている診断装置の室温下にお
ける有効寿命は６力月以下であるが、本発明のそれは］
年である。本発明者らは乾燥剤を診断装置に適用するこ
とによって試薬が安定になり、上記の期間にわたって使
用可能になることを見出した。乾燥剤は公知の様々なも
のが使用できる。

母材２４における免疫複合体の存在を検出するためには
、標識された第２の検出分子を用いることが必要である
。複合体が免疫複合体である場合には、第１の抗体に結
合した抗原に特異性をもち、かつ第１の抗体が結合した
箇所と離れた箇所で抗原に結合する第２の抗体か検出分
子に用いられる。

抗原の存在を検出する伝統的な方法においては標識され
た第２の抗体を用いる。標識は通常放射性のトレーサー
、また最近では無色の基質を加水分解して検出の可能な
着色変化を起こさせる酵素が用いられる。これによって
免疫複合体の存在を明らかにできる。この場合酵素は、
適当な基質と組合わせれば様々なものを用いることがで
きる。例えばホースラディツシュ・パーオキシダーゼ、
ベーターガラクトシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ
、アルカリホスファターゼなど当業者によく知られたも
のを用いることができる。これらの酵素の大半に適した
２！質は、ジアゾニウム又はテトラゾリウム塩である。

アルカリホスファターゼに用いられる前者の例としては
、ナフトールＡＳ−ｋｉ　Ｘ−ホスフェート及びジアゾ
２−アミノ−５−クロローアニゾールがある。

酵素を第２の抗体に結合させる方法は当業者にはよく知
られているが、主として酵素を抗体にカップリングする
ことからなる。抗体を架橋によってカップリングする手
法は、オサリバンとマークス″静素学における方法１９
８１年、（７３：１４７）アカデミツク◆ブレス、ニュ
ーヨークに記載されている。ホースラディツシュ・パー
オキシダーゼを用いる場合の適当なカップリング方法は
、ナカネとカナオイ”組織学と細胞化学”１９７４年（
８２：１０８４）にある。この方法は効果的にかつ直接
に酵素を抗体に抱合する。しかし他の方法もよく知られ
ている。例えばバイオチン−アビジン・ブリッジは、ア
ビジンに架橋したホースラディツシュ・パーオキシダー
ゼを有する第２の抗体上に形成される。

酵素をカップリングして第２の抗体−酵素抱合体にする
代わりに、酵素を抗体に組込むこともてきる。それには
例えば抗体結合部位と酵素活性部位の両方をもつハイブ
リッド分子を遺伝工学的に操作すればよい。例えば抗体
は、ＤＮＡ組換え技術によって修飾することができる（
二ニーバーガーら”組換え抗体を有する新しいエフェク
ターの関数”、ネイチャー、１９８４年（３１２：６０
４））。この種の酵素抱合体は直接フィルター３６に吸
収され、又はこれに続く工程に添加されて母材２４上の
免疫複合体の存在を明らかにする。

母材２４上に付芒した抗体又は抗体−酵素抱合体からな
る抗体かモノクローナル又はポリクローナルであるかは
当業者には知ることができる。抗体−酵素抱合体が母材
２４に浸透して、抗体酵素抱合体の抗原への結合を最大
にするのに十分な時間が経過した後、適当な酵素基質を
含む溶液を添加して検査試料中の抗原の存在の指標とし
て、着色するかをみる。たいていの場合は抱合体を浸透
した後、基質を加える前に洗浄工程が必要である。

これは開口部２６の漏戸の形状が多量の基質溶液が母Ｈ
の小さな表面積を通過できるようにするからである。基
質溶液の添加は洗浄としての役割を果たす。また不必要
なバックグラウンドを除去するため洗浄工程が必要なこ
ともある。

以下実施例によって本発明を説明する。

実施例１ 絨氾性性腺刺（敦ホルモン（ｈＣＧ）の検出この実施例
は第１図及び第２図を参照して説明する。ｂＣＧ２５ｍ
　Ｉ　Ｕ／ｍ、＆を含む尿約０．５ｍ、７？をろ過装置
２８に入れた。采はろ過装置２８のフィルターに接し、
フィルターに含浸されたタンパク遮断剤の乳タンパク質
とともにフィルターを通過する。遮断剤を含むろ液は上
面１２にある開口部２６を通過して母＋、（’　２４に
接触する。母＋７１２４はｈＣＧに対する抗体で含浸さ
れている。母材は当業者によく知られたナイロンでてき
ている。

母＋９２４の含浸は、米国特許第３．２８１，８６０号
及び同第４，１２１，２２２号にあるように、プリンタ
／ニーダ・マシーンを用いて、ｈＣＧのα鎖に対するマ
ウスのモノクローナル抗体を含む母相２４に、細い液流
を通すことによって行なった。抗体は、約１．５ｍｒの
広い流れにした。装置の最終需要者のために、抗体は免
疫グロブリンクラスのヤギの反マウス抗体の水平方向に
対して垂直方向に印刷される。これは後で詳述する。マ
ウスのモノクローナル抗体を１ν当り４．刃含む溶液を
、適当な緩衝液中のｈ　ＣＧ　α鎖に対してスプレーす
る。りン酸塩を含む生理食塩水がば新液として適当であ
る。この緩衝液は１５０ｍＭの塩化ナトリウムに１０　
ｍ　Ｍのリン酸ナトリウムを含むもので、ｐＨは７．１
である。加えてこの溶液は１ｍｌ当り１０μグのフルオ
レセイン及びバクテリア静止剤、例えば０．１％のアジ
化ナトリウム、を含む。フルオレセインは、母材２４上
の抗体のパターンを視覚的に評価できるように溶液に入
れる。ろ液はフィルター３６を通った後、母　′材２４
と接触する。ろ液中のｈＣＧは母材２４に含浸したｈＣ
Ｇ抗体と結合する。さらにこれと同時にフィルター３６
中の遮断剤がモノクローナル抗体が結合した母材２４の
箇所と異なる箇所で結合する。そうするとその箇所は後
に添加される反応試薬と反応しなくなる。ろ液が母材２
４と接触してから短時間の後に、マウスの第２のモノク
ローナル抗体−酵素抱合体を含む溶液を２層滴下する。

第２の抗体はｈＣＧのベータサブユニットに対するもの
で、母材に封管している第１の抗体が結合しているエピ
トープと異なるエピトープに結合する。抱合体の酵素成
分はアルカリホスファターゼである。抗体−酵素抱合体
はフィルター３６を通り、抱合体が、第１の抗体に結合
したｈＣＧと反応・結合するのに十分な時間母材２４と
接触する。通常これは約１分間である。

母材２４上に形成された複合体を視覚的に明らかにする
ため、アルカリホスファターゼであるリン酸インドキン
ル用の基質を含む溶液を直接母材２４に注いだ。約１分
間で母材２４上に青色が“＋”印に現われて検査試料が
ｈＣＧを含むことを示した。もし”−”印が現われたな
ら、試料は有意な量のｈＣＧを含むとはいえないことに
なる。

４ｍＭのリン酸インドキシルを含む基質溶液ならば、約
０．５ｉあれば十分である。

最後に適当な反応静止溶液を母材２４に添加する。それ
には０，１％の酢酸溶液が０．５ｉあれば十分である。

上述のように“＋″印は、垂直方向の第１の抗ｈＣＧ抗
体を水平方向の第２の抗体−酵素抱合体、酵素単独又は
マギの反マウス抗体のいずれかで処理すると得られる。

この中ではヤギの反マウス抗体が好ましい。なぜならば
”十”印の垂直成分をつくるのに用いられる試薬（即ち
タンパク抗体）とよく合うからである。即ち一つの試薬
における経時的な活性の損失は、他の試薬における対応
する損失によってバランスが保たれる。水下成分をつく
るのに用いられる試薬は、その種類に拘らず、母材２４
上に噴霧される。

実施例２ 室温における安定性 実施例１て用いた物質と方法をここでも用いた。

診断装置を１年間室温で保管した後、この装置を２５ｍ
１Ｕ／ノのｈＣＧを含む試料を検査するのに用いた。

実施例３ 母材への抗原の含浸 本発明の装置は抗原の検出に限定されるものでないこと
は当業者には明らかであろう。免疫システムを調べる患
者の体液中にあって体内を循環する抗体を検出すること
もできる。これにはまず免疫反応を引起こす抗原を毎月
に付６゛させ、次いで抗体の存在を検査すればよい。こ
うすればこの診断装置を自己免疫又はアレルギ一体質の
患者のモニターに使える。この使用法を実証するため不
活性の風疹ウィルスを実施例１で述べたプリンタ／ニー
ダ・マシーンで第２図の母材２４に付着させた。次いで
検出すべき抗ウイルス抗体を含む溶液をろ過装置２８に
注ぐと、この溶液はフィルター３６を通って、開口部２
６を通過したろ液が得られる。ろ液はウィルスが付着し
た母材２４と接触する。すると抗風疹抗体は母材上のウ
ィルスと結合する。次いでろ液中の抗風疹抗体の検出を
抗体−酵素抱合体を含む溶液を通過させることによって
行なう。ここで抗体は結合した抗風疹抗体に対するもの
である。抱合体の抗体成分は抗風疹抗体のエピトープを
確認できるものであればよい。検査される抗風疹抗体か
ヒトのものならば、抱合体の抗体成分は抗ヒト抗体でな
ければならない。以後の工程は実施例１と似たようなも
のである。最終的には検査試料中に抗風疹抗体の存在力
・認められる母（第２４の発色があった。

実施例４ アッセイ試薬のフィルター材料への含浸診１ｔｌｉ装置
の究極の目的の一つは、手動操作のほとんど要らない装
置を開発することである。検査試薬をフィルター３６の
原料になじませることによって、試薬を母材２４に別々
に添加する工程を省くことができる。

脱脂粉乳（カーネーション社製）から大粒のものを除い
て得られた乳タンパク質を粉砕してタンパク性の遮断剤
をフィルターに含浸する。次いでガラスファイバー製の
フィルター（パース社製プレフィルタ−級のウルチポー
ルＧＦフィルター０６−４０）を２α角に切り出し、適
当な乾燥剤とともに封止した容器内で保存する。次いで
フィルターを、粉砕された脱脂粉乳と一緒にして、十分
な時間、通常３時間くらい脱脂粉乳をフィルターに含浸
させる。乳タンパク質をフィルターに均一になじませる
ためには、フィルターと乳タンパク質とをよくかきまぜ
ればよい。

過剰な乳タンパク質は、ふるいによって角状のフィルタ
ーから除去する。次いでフィルターを容器内に写し、よ
くなじんでいない乳タンパク質をふるい落とすため十分
時間をかけて揺り動かす。

この時ＬＦ７は通常１時間である。この工程の後もう一
度まだ除かれていない乳タンパク質を除去する工程にか
ける。フィルターは適当な乾燥剤とともに容器内に保存
する。こうして得られたフィルターは直接診断装置に用
いることができる。

実施例５ 多重抗原の検出 この実施例における物質と方法は、次に述へるものを除
き実施例１と同様である。母材２４は、抗原に対して顕
著な特異性を有する２つの抗体で処理する。１９は黄体
形成ホルモン（ＬＩ（）のベータサブユニットに対する
抗体であり、もう一つは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の
ベータサブユニットに対するものである。実施例１で説
明したプリンタ／ゴーダ・マシーンを用いて抗体を母相
２４上に飛び飛びに付着させた。ＬＨ又はＦＳＨのどち
らも検出てきる抗体−酵素抱合体からなる第２の抗体は
、ＬＨ及びＦＳＨの共通のエピ＋−−ブを識別できる単
一のモノクローナル抗体及び、ＬＨ及びＦＳＨで異なる
エピトープに結合する２つのモノクローナル抗体のいず
れでもよい。後者の場合、顕著な発色反応を引起こす２
つの異なる酵素は、モノクローナル抗体と結合して顕著
な“十“印を発現させる。これには例えばアルカリホス
ファターゼ及びβ−ガラクトシグーゼを用いることがで
きる。前者は適当な基質と合わせると、赤色を呈し、後
者は青色を呈する。

ＬＨ及びＦ　Ｓ　Ｈの”十″印の水平成分は実施例１て
説明したように形成される。

実施例６ 診断装置の感度 実施例１で述べた物質と方法を用いて、本発明の装置と
市販の装置の５度及び診断に要する時間を比較した。市
販の装置については、その製造者のいう手続に従った。

種々の量のｈｃＧを含む溶液を診断した。第２表に装置
の検出限界及び感度を示す。同表にはその他検査の前提
となる方法、才１しイ］；　とン　２　、　メＬＺ−”
Ｆ７萱　ノニ　り’＝　　Ｌ−たｇチ　個　ｌ　乃ジ　
し　７　Ｊう　モ５゜第１表 第２表 十ト体４Ｘ型、及−び１し査−１３表ζした一時一間一
も、−示−して嘗駐石Ｔ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の診断装置の中核部分の斜硯図、第２図
は同部分の分解図、及び第３図は第１図の３−３線に沿
った拡大断面図である。 ２４・・・・・・母材、２８・・・・・・ろ過装置、３
６・・・・・・フィルター。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）２つ以上の室に分割可能な容器と、抗体または抗
   原を含有する母材と連結する、液を吸収する手段を具備
   する第１の室と、前記第１の室に通じ、前記第１の室か
   ら湿分を吸収するための吸収手段を具備する第２の室と
   、前記第１の室と第２の室の圧力を均衡させるための手
   段と、前記母材の上に位置するフィルター保持手段とか
   らなり、前記母材は前記第１の室の頂部にある開口部を
   通して前記第１の室の外部に通じており、前記フィルタ
   ー保持手段は前記第１の室の頂部にある開口部を通して
   前記母材に通じており、前記フィルター保持手段は生体
   液中に存在する妨害物質を除去し、前記母材に試薬を提
   供し、前記母材と共同して分子の検出を行なうための前
   記保持手段に結合するフィルターを具備している、生体
   液の免疫診断装置。
2. （２）前記吸収手段は、気孔質層と中間層とからなり、
   前記中間層は、前記母材と気孔質層との間に位置する、
   特許請求の範囲第１項記載の装置。
3. （３）前記母材は、ホルモン、ホルモンレセプタ、酵素
   、およびそれらの誘導体または組合せからなる群から選
   択された試薬を更に含む、特許請求の範囲第２項記載の
   装置。
4. （４）前記母材は、前記抗体または抗原を含む溶液を前
   記母材に供給し、この供給した溶液を所定のパターンに
   偏向させることにより前記母材に吸収させた抗体または
   抗原を含む、特許請求の範囲第３項記載の装置。
5. （５）前記開口部はファンネル形である、特許請求の範
   囲第３項記載の装置。
6. （６）前記フィルター保持手段はファンネル形である、
   特許請求の範囲第５項記載の装置。
7. （７）前記フィルターにより提供される化学物質は蛋白
   質物質である、特許請求の範囲第６項記載の装置。
8. （８）前記蛋白質物質は、抗体、抗体−酵素抱合体、お
   よび酵素基質からなる群から選択されたものである、特
   許請求の範囲第７項記載の装置。
9. （９）前記化学物質は、粉末状で前記フィルターと接触
   させることにより前記フィルターに付着する、特許請求
   の範囲第８項記載の装置。
10. （１０）免疫物質を溶液に溶解する工程、前記溶液の細
    流を形成する工程、前記細流を分割して液滴を形成する
    工程、前記液滴を電場中を通過させて、母材上において
    前記液滴を所定のパターンに偏向させる工程を具備する
    、免疫診断分析に用いられる、母材に免疫物質を含有さ
    せる方法。
11. （１１）前記溶液中の免疫物質は、抗体、抗原およびそ
    れらの誘導体または組合せからなる群から選択されたも
    のである、特許請求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）液から妨害物質を除去し、前記液に遮断剤を供
    給するために、前記液を濾過手段に適用することにより
    前記液の濾液を形成する工程、１種またはそれ以上の第
    １の抗体と１種またはそれ以上の第３の抗体を所定の配
    列で含有する気孔質母材を遮断剤で被覆し、前記濾液を
    前記母材と接触させることにより、前記液中において、
    １種またはそれ以上の抗体とそれに対応する１種または
    それ以上の分子とからなる１種またはそれ以上の複合体
    を形成する工程、過剰の濾液を吸収材と接触させること
    により前記母材から過剰の濾液を除去する工程、前記母
    材を、前記１種またはそれ以上の第１の抗体に結合する
    前記それに対応する１種またはそれ以上の分子に対し結
    合特異性を有する１種またはそれ以上の追跡可能な第２
    の抗体と接触させることにより、前記１種またはそれ以
    上の複合体の存在および／または量を決定する工程、過
    剰の追跡可能な第２の抗体を除去する工程、および前記
    追跡可能な第２の抗体に結合させ前記複合体を表わすた
    め、酵素基質を含む前記母材に溶液を加える工程を具備
    する方法であって、前記１種またはそれ以上の第１の抗
    体は、それに対応して前記液中の前記１種またはそれ以
    上の分子に対し反応性を有し、前記追跡可能な第２の抗
    体は、それに対応して前記液中の前記１種またはそれ以
    上の分子に対し反応性を有し、前記第３の抗体は、それ
    に対応して前記１種またはそれ以上の追跡可能な第２の
    抗体分子に対し反応性を有し、前記液中の前記１種また
    はそれ以上の分子は前記１種またはそれ以上の第１の抗
    体に結合しており、前記遮断剤は前記母材に結合してい
    る、１種またはそれ以上の分子を含有する液を分析する
    方法
13. （１３）前記１種またはそれ以上の第１の抗体分子は、
    それに対応して１種またはそれ以上のホルモンに結合し
    ている、特許請求の範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）前記追跡可能な第２の抗体は、前記ホルモン抗
    原において、前記第１の抗体が結合しているエピトープ
    とは異なるエピトープに結合している、特許請求の範囲
    第１３項記載の方法。
15. （１５）前記第１および第３の抗体は、同一の免疫グロ
    ブリンクラスである、特許請求の範囲第１４項記載の方
    法。
16. （１６）前記遮断剤は蛋白質である、特許請求の範囲第
    １５項記載の方法。
17. （１７）前記吸収材は、気孔質層と中間層とからなり、
    前記中間層は、前記母材と気孔質層との間に位置する、
    特許請求の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）前記１種またはそれ以上の追跡可能な第２の抗
    体は、酵素に結合しているものを含む、特許請求の範囲
    第１７項記載の方法。
19. （１９）前記１種またはそれ以上の追跡可能な第２の抗
    体に結合する酵素は、前記複合体の存在を示す着色を生
    ずる基質を加水分解する、特許請求の範囲第１８項記載
    の方法。
20. （２０）前記１種またはそれ以上の追跡可能な第２の抗
    体は、異なる酵素に結合している、特許請求の範囲第１
    ７項記載の方法。
21. （２１）前記１種またはそれ以上の酵素は、前記母材上
    に形成された種々のホルモン複合存在を示す種々の着色
    を生ずる種々の基質を加水分解する、特許請求の範囲第
    １９項記載の方法。
22. （２２）容器内に位置し、抗体または抗原を含有する母
    材と連結する、液を吸収する手段と、前記容器に通じ、
    湿分を吸収するための吸収手段と、前記母材の上に位置
    するファンネル形フィルター保持手段とからなり、前記
    母材は前記容器の頂部にあるファンネル形開口部を通し
    て前記容器の外部に通じており、前記フィルター保持手
    段は前記容器の頂部にある開口部を通して前記母材に通
    じており、前記フィルター保持手段は生体液中に存在す
    る妨害物質を除去し、前記母材に試薬を提供し、前記母
    材と共同して分子の検出を行なうための前記保持手段に
    結合するフィルターを具備している、生体液の免疫診断
    装置。
23. （２３）前記吸収手段は、気孔質層と中間層とからなり
    、前記中間層は、前記母材と気孔質層との間に位置する
    、特許請求の範囲第２２項記載の装置。
24. （２４）前記母材は、ホルモン、ホルモンレセプタ、酵
    素、およびそれらの誘導体または組合せからなる群から
    選択された試薬を更に含む、特許請求の範囲第２３項記
    載の装置。
25. （２５）前記母材は、前記抗体または抗原を含む溶液を
    前記母材に供給し、この供給した溶液を所定のパターン
    に偏向させることにより前記母材に吸収させた抗体また
    は抗原を含む、特許請求の範囲第２４項記載の装置。