JPS639839B2 - - Google Patents
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- JPS639839B2 JPS639839B2 JP58242347A JP24234783A JPS639839B2 JP S639839 B2 JPS639839 B2 JP S639839B2 JP 58242347 A JP58242347 A JP 58242347A JP 24234783 A JP24234783 A JP 24234783A JP S639839 B2 JPS639839 B2 JP S639839B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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Description
本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼの使用下におけるＮ−カ
ルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬に関
する。 微生物がクレアチニンをＮ−カルバモイルサル
コシンに変換する能力を有することが判明した。
この分解工程の研究のためには、Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンの測定のための特異的方法が望まし
い。更に、この種の方法は、前記のＮ−カルバモ
イルサルコシンへの変換により、クレアチニンそ
のものの測定にも使用できるはずである。 従つて、本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ンの特異的測定を可能にすることを課題とする。 この課題は、被測定物質含有溶液をＮ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを用いて
分解してサルコシンにし、サルコシンを測定する
ことよりなる、Ｎ−カルバモイルサルコシンの測
定法により解決される。 本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ（CSHと略す）の発見
に基づき、これは、次式に従つて、CO2及びNH3
の離脱下に特異的にサルコシンを形成する： 本発明の方法で生じるサルコシンは、例えば、
サルコシン−デヒドロゲナーゼの使用下に、生じ
るNADHを計測するか又はサルコシンオキシダ
ーゼを用いて生じるH2O2又は消費O2を計測する
公知方法で測定することができる。サルコシンオ
キシダーゼの使用下に、生じるH2O2を計測する
ことによる測定が有利である。H2O2は滴定法、
電圧測定法、ポーラログラフイ測定法、比色法、
並びに酵素法で測定できる。これらの中で、カタ
ラーゼ又はペルオキシダーゼ（POD）の使用下
における酵素法は、極めて特異的かつ確実である
ので、有利である。カタラーゼを用いる測定は、
β−ジケトン例えばアセチルアセトン及びメタノ
ールもしくはエタノール又はメチレングリコール
の存在で行なう。ペルオキシダーゼを用いる測定
は、１種以上の色原体の存在で行なう。好適な色
原体の例は、２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸（ABTS）、トリンダー（Trinder）の
指示薬系（Ann.Clin.Biochem.6巻（1969年）、24
〜27頁）であり、この系では、フエノール又は他
の芳香族アルコールもしくは芳香族アミンが４−
アミノフエナゾン又は４−アミノフエナゾン誘導
体と酸化的に結合して色素になる。好適な芳香族
アルコールもしくはアミンは、例えばｐ−クロル
フエノール、アミノフエノール、ナフトール及び
その誘導体、ナフチルアミン及びその誘導体、ア
ミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキ
シフエニル酢酸及び類似物である。４−アミノフ
エナゾンの代りに、４−アミノフエナゾン誘導
体、フエニレンジアミンスルホン酸、メチルベン
ゾチアゾロンヒドラゾン（MBTH）、スルホン化
されたメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン（Ｓ−
MBTH）及びこれらの誘導体を使用することが
できる。 Ｎ−カルバモイルサルコシンの本発明による測
定は、緩衝液中で行なうのが有利である。好適な
PH−値は、約６〜９の間である。 本発明のもう１つの目的は、Ｎ−カルバモイル
サルコシンの測定試薬であり、これは、Ｎ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ及びサ
ルコシン検出系を含有する。 前記種類の有利な試薬は、サルコシンの検出系
としてサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及び発色団を含有する。 もう１つの有利なサルコシンの検出系は、サル
コシンデヒドロゲナーゼ及びNADよりなる。 更に、本発明による試薬はなお、緩衝液（PH６
〜９）及び場合によつては界面活性剤を含有す
る。 本発明で使用される酵素は、新規酵素Ｎ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
（CSH）である。 この酵素に関して、次の特性が測定された。 安定性 至適安定性：PH６〜6.5；良好な安定性は、燐
酸塩緩衝液中で存在し、最良安定性は、グリセリ
ンの添加時に得られる。 50％グリセリン（PH６）中でのCSH20mg／ml
の20分間の加熱： 残留活性（％）： 40℃／100 50℃／ 48 60℃／ 24 80℃／ ０ ＋４℃、50％グリセリン中では、４週間後の活
性保持は100％である。 特異性：クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダント
インは変換されない。 25℃におけるＮ−カルバモイルサルコシンに関
するミハエリス定数： 0.1M／トリス緩衝液（PH8.0）中：3.3〜3.8
×10-3M。 0.1M／K4P2O7緩衝液（PH8.5）中：50〜7.1
×10-3M。 至適PH： 至適PHは緩衝物質に依る。K4P2O7緩衝液の場
合は、8.5までであり、トリス緩衝液及びヘペス
緩衝液（Hepespuffer）の場合には8.0までである
ことが測定された。 分子量： MG＝約40000（デイスク−電気泳動で測定）。 阻害剤： メルチオレート5μg／mlは95％まで阻害する。 平衡： この平衡は、CSH0.5U／mlを用い、90mM／
（トリス；PH8.0）中で測定した： Ｎ−カルバモイルサルコシン／サルコシン＝12.5
mM／＜0.001mM＝＞１×104 CSHの取得は、適当な微生物の培養及びビオ
マス又は培養液からの酵素の回収により行なう。
アルトロバクター（Arthrobacter）及びモラキ
セラ（Moraxella）属の微生物が特に好適である
ことが立証された。最良の結果は、アルトロバク
ターDSM2563、DSM2564、マイクロコツカス・
spec.DSM2565又はモラキセラPSM2562を用いて
得られた。 微生物は、細胞懸濁液の形で、本発明の測定に
使用することができる。しかしながら、本発明に
とつて、精製された酵素製剤を使用するのが有利
である。この製造のために、Ｎ−メチルヒダント
イン上で培養された、後処理に引き合う量のＮ−
カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを
含有するアルトロバクター、マイクロコツカス又
はモラキセラ属の微生物を慣用法で溶解させ、不
溶分を除く。この溶解のためには、慣用の方法例
えば高圧分散、超音波、分解ミル又はリゾチーム
−添加が好適である。得られる澄明な抽出物に、
ポリエチルアミン0.3〜0.5重量％を添加し、生じ
る沈殿を分離し、上澄みを水で稀釈すると、酵素
が沈殿するから、これを分離することができる。 精製のために、こうして得た酵素を慣用の酵素
精製法に供することができる。前記のようにして
製造した酵素製剤を適当な緩衝液中に溶かし、
1.3M−及び2.2M−硫酸アンモニウムの間で分別
させる。フエニルセフアロース及びDE−52−セ
ルロース上でのクロマトグラフイー並びに、セフ
アクリル（Sephacryl）S200上でのゲル濾過によ
り、異種活性を有せず2U／mg（蛋白質）の特異
活性を有する製剤が、細胞エキス中に予め存在す
る量に対して約70％の収率で得られる。こうして
得られる酵素は、活性損失なしに、50％グリセリ
ン／水溶液（PH6.5）中、＋４℃で、最低半年間貯
蔵できる。 本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異
的に測定することを可能とする。このような方法
は、クレアチニン−物質代謝の解明にとつて殊に
重要に寄与する。クレアチニンをＮ−カルバモイ
ルサルコシンに変じることと関連して、本発明の
方法は、直接クレアチニン測定に使用することも
できる。 次の実施例につき本発明を更に詳述する。 例 １ Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定原理： 試薬：
ン−アミドヒドロラーゼの使用下におけるＮ−カ
ルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬に関
する。 微生物がクレアチニンをＮ−カルバモイルサル
コシンに変換する能力を有することが判明した。
この分解工程の研究のためには、Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンの測定のための特異的方法が望まし
い。更に、この種の方法は、前記のＮ−カルバモ
イルサルコシンへの変換により、クレアチニンそ
のものの測定にも使用できるはずである。 従つて、本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ンの特異的測定を可能にすることを課題とする。 この課題は、被測定物質含有溶液をＮ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを用いて
分解してサルコシンにし、サルコシンを測定する
ことよりなる、Ｎ−カルバモイルサルコシンの測
定法により解決される。 本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ（CSHと略す）の発見
に基づき、これは、次式に従つて、CO2及びNH3
の離脱下に特異的にサルコシンを形成する： 本発明の方法で生じるサルコシンは、例えば、
サルコシン−デヒドロゲナーゼの使用下に、生じ
るNADHを計測するか又はサルコシンオキシダ
ーゼを用いて生じるH2O2又は消費O2を計測する
公知方法で測定することができる。サルコシンオ
キシダーゼの使用下に、生じるH2O2を計測する
ことによる測定が有利である。H2O2は滴定法、
電圧測定法、ポーラログラフイ測定法、比色法、
並びに酵素法で測定できる。これらの中で、カタ
ラーゼ又はペルオキシダーゼ（POD）の使用下
における酵素法は、極めて特異的かつ確実である
ので、有利である。カタラーゼを用いる測定は、
β−ジケトン例えばアセチルアセトン及びメタノ
ールもしくはエタノール又はメチレングリコール
の存在で行なう。ペルオキシダーゼを用いる測定
は、１種以上の色原体の存在で行なう。好適な色
原体の例は、２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸（ABTS）、トリンダー（Trinder）の
指示薬系（Ann.Clin.Biochem.6巻（1969年）、24
〜27頁）であり、この系では、フエノール又は他
の芳香族アルコールもしくは芳香族アミンが４−
アミノフエナゾン又は４−アミノフエナゾン誘導
体と酸化的に結合して色素になる。好適な芳香族
アルコールもしくはアミンは、例えばｐ−クロル
フエノール、アミノフエノール、ナフトール及び
その誘導体、ナフチルアミン及びその誘導体、ア
ミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキ
シフエニル酢酸及び類似物である。４−アミノフ
エナゾンの代りに、４−アミノフエナゾン誘導
体、フエニレンジアミンスルホン酸、メチルベン
ゾチアゾロンヒドラゾン（MBTH）、スルホン化
されたメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン（Ｓ−
MBTH）及びこれらの誘導体を使用することが
できる。 Ｎ−カルバモイルサルコシンの本発明による測
定は、緩衝液中で行なうのが有利である。好適な
PH−値は、約６〜９の間である。 本発明のもう１つの目的は、Ｎ−カルバモイル
サルコシンの測定試薬であり、これは、Ｎ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ及びサ
ルコシン検出系を含有する。 前記種類の有利な試薬は、サルコシンの検出系
としてサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及び発色団を含有する。 もう１つの有利なサルコシンの検出系は、サル
コシンデヒドロゲナーゼ及びNADよりなる。 更に、本発明による試薬はなお、緩衝液（PH６
〜９）及び場合によつては界面活性剤を含有す
る。 本発明で使用される酵素は、新規酵素Ｎ−カル
バモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ
（CSH）である。 この酵素に関して、次の特性が測定された。 安定性 至適安定性：PH６〜6.5；良好な安定性は、燐
酸塩緩衝液中で存在し、最良安定性は、グリセリ
ンの添加時に得られる。 50％グリセリン（PH６）中でのCSH20mg／ml
の20分間の加熱： 残留活性（％）： 40℃／100 50℃／ 48 60℃／ 24 80℃／ ０ ＋４℃、50％グリセリン中では、４週間後の活
性保持は100％である。 特異性：クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダント
インは変換されない。 25℃におけるＮ−カルバモイルサルコシンに関
するミハエリス定数： 0.1M／トリス緩衝液（PH8.0）中：3.3〜3.8
×10-3M。 0.1M／K4P2O7緩衝液（PH8.5）中：50〜7.1
×10-3M。 至適PH： 至適PHは緩衝物質に依る。K4P2O7緩衝液の場
合は、8.5までであり、トリス緩衝液及びヘペス
緩衝液（Hepespuffer）の場合には8.0までである
ことが測定された。 分子量： MG＝約40000（デイスク−電気泳動で測定）。 阻害剤： メルチオレート5μg／mlは95％まで阻害する。 平衡： この平衡は、CSH0.5U／mlを用い、90mM／
（トリス；PH8.0）中で測定した： Ｎ−カルバモイルサルコシン／サルコシン＝12.5
mM／＜0.001mM＝＞１×104 CSHの取得は、適当な微生物の培養及びビオ
マス又は培養液からの酵素の回収により行なう。
アルトロバクター（Arthrobacter）及びモラキ
セラ（Moraxella）属の微生物が特に好適である
ことが立証された。最良の結果は、アルトロバク
ターDSM2563、DSM2564、マイクロコツカス・
spec.DSM2565又はモラキセラPSM2562を用いて
得られた。 微生物は、細胞懸濁液の形で、本発明の測定に
使用することができる。しかしながら、本発明に
とつて、精製された酵素製剤を使用するのが有利
である。この製造のために、Ｎ−メチルヒダント
イン上で培養された、後処理に引き合う量のＮ−
カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを
含有するアルトロバクター、マイクロコツカス又
はモラキセラ属の微生物を慣用法で溶解させ、不
溶分を除く。この溶解のためには、慣用の方法例
えば高圧分散、超音波、分解ミル又はリゾチーム
−添加が好適である。得られる澄明な抽出物に、
ポリエチルアミン0.3〜0.5重量％を添加し、生じ
る沈殿を分離し、上澄みを水で稀釈すると、酵素
が沈殿するから、これを分離することができる。 精製のために、こうして得た酵素を慣用の酵素
精製法に供することができる。前記のようにして
製造した酵素製剤を適当な緩衝液中に溶かし、
1.3M−及び2.2M−硫酸アンモニウムの間で分別
させる。フエニルセフアロース及びDE−52−セ
ルロース上でのクロマトグラフイー並びに、セフ
アクリル（Sephacryl）S200上でのゲル濾過によ
り、異種活性を有せず2U／mg（蛋白質）の特異
活性を有する製剤が、細胞エキス中に予め存在す
る量に対して約70％の収率で得られる。こうして
得られる酵素は、活性損失なしに、50％グリセリ
ン／水溶液（PH6.5）中、＋４℃で、最低半年間貯
蔵できる。 本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異
的に測定することを可能とする。このような方法
は、クレアチニン−物質代謝の解明にとつて殊に
重要に寄与する。クレアチニンをＮ−カルバモイ
ルサルコシンに変じることと関連して、本発明の
方法は、直接クレアチニン測定に使用することも
できる。 次の実施例につき本発明を更に詳述する。 例 １ Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定原理： 試薬：
【表】
試料：
Ｎ−カルバモイルサルコシン０〜35.6μモル／
を含有する水溶液 試験バツチ： 試 薬 ２ml 試 料 100μ 試験法： 試料と試薬を混合し、室温で30分放置し、キユ
ベツト中に入れ、試薬空値に対する試料の吸光度
をλ＝546nmで読み取る。 結果： 試料中のＮ−カルバモイルサルコシン−濃度と
吸光度との間に直線関係が得られる。 例 ２（参考例） (A) Ｎ−メチル−ヒダントイン10mlを含有する培
地（組成は後記）に、アルトロバクター
DSM2563、BMTU2194−１を同じ組成の傾斜
寒天から接種し、100mlエーレンマイヤーフラ
スコ中で28℃、160r.p.m.で約24時間振動させ
る。引続き、同じ組成の培地中に１％を更に接
種して、50−培養装置に対してこの培養段階
物500mlを存在させる（各100ml／500mlエーレ
ンマイヤー中の第１培養液５×１ml、24時間／
28℃及び160r.p.m.）。 この500mlを同じ組成の培地50中に移し、
２個の平板パドル撹拌機／そらせ板を備えた培
養装置中で、空気1000／ｈ、500r.p.m.を用
い、28℃で更に培養させる。 10〜12時間の後に、Ｎ−メチル−ヒダントイ
ン−分解酵素の形成が開始し、これは、対数的
成長期の終りまで保持される。18時間の培養時
間の後に、収獲される。微生物を、冷却遠心分
離中で分離し、ビオマスを引続き0.1M燐酸塩
緩衝液（PH８）中で洗浄し、改めて、遠心分離
しかつ凍結させる。こうして、培養液50から
ビオマス約800ｇが得られた。 培地組成： 試料１：Na2HPO4×2H2O ７ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4×7H2O 0.5ｇ、Ｎ−メチル−ヒ
ダントイン（無菌濾過）10ｇ、酵母エキス／
Difco ５ｇ、少量溶液1*１ml、少量溶液2**
0.1ml、ビタミン溶液***（無菌濾過）１ml。 *少量溶液１＝MnCl2×4H2O 100mg、FeCl3
×6H2O 100ｇ、CaCl2×2H2O 100mgを再
蒸溜水100ml中に溶かし、滅菌する。培地
１当りこの溶液１ml。 **少量溶液２＝CuCl2×2H2O １mg、Cl2 ｌ
mg、（NH4）2M0O4 １mg、CoCl2×6H2O
１mgを再蒸溜水1000ml中に溶かし、滅菌す
る。培地１当りこの溶液0.1ml。 ***ビタミン溶液＝ビオチン0.1mg、ピリドキ
ソール0.1mg、ピリドキサン×HCl 0.1mg、
PABS0.1mg、リボフラビン1.0mg、ニコチ
ンアミド1.0mg、葉酸1.0mg、チアミン×
HCl10.0mgを再蒸溜水100ml中に溶かし、
無菌濾過する。培地１当りこの溶液１
ml。 (B) 洗浄した細胞（乾燥重量１Kg）を燐酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）50mM／中で、15にし、
高圧分散法で約600バール（atu¨）で溶解させ
る。細胞残分を分離する。澄明エキスは、
CSHを含有する。これに、10％ポリエチレン
イミン（Ｇ−35−）溶液（PH6.5）４％を加え
る。核酸の分離の後に、この酵素を水での稀釈
により沈殿させる。この少量の蛋白質沈殿を燐
酸カリウム緩衝液（PH6.5）50mM／中に入
れ、1.3M及び2.2M／の間で硫酸アンニウム
で分別する。引続く、フエニルセフアロースに
よる疎水性クロマトグラフイにより、サルコシ
ンオキシダーゼを完全に除去する。 減少性勾配の燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mモル／（硫酸アンモニウム1.0モル／、
燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）20mM／まで
を含有）において、CSHは硫酸アンモニウム
約0.4M／で溶離される。 この溶離液を、燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mM／に対して冷時に透析させ、同じ緩衝
液で平衡にしたカラム上にDE−52−セルロー
スと共に装入する。CSHを前記緩衝液での
NaCl50〜500mM／の増加性勾配により溶離
させる。溶離液を限外濾過により濃縮させる。 引続く、0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
（Sephacryl−Ｓ−200）中でのゲル濾過の後
に、CSHは53％収率でかつ2.1U／mgの特異活
性で得られる。酵素は、損失なしに、50％グリ
セリン溶液（PH6.5）中、＋４℃で６週間にわた
り貯蔵できる。 詳細を次表に示す。
を含有する水溶液 試験バツチ： 試 薬 ２ml 試 料 100μ 試験法： 試料と試薬を混合し、室温で30分放置し、キユ
ベツト中に入れ、試薬空値に対する試料の吸光度
をλ＝546nmで読み取る。 結果： 試料中のＮ−カルバモイルサルコシン−濃度と
吸光度との間に直線関係が得られる。 例 ２（参考例） (A) Ｎ−メチル−ヒダントイン10mlを含有する培
地（組成は後記）に、アルトロバクター
DSM2563、BMTU2194−１を同じ組成の傾斜
寒天から接種し、100mlエーレンマイヤーフラ
スコ中で28℃、160r.p.m.で約24時間振動させ
る。引続き、同じ組成の培地中に１％を更に接
種して、50−培養装置に対してこの培養段階
物500mlを存在させる（各100ml／500mlエーレ
ンマイヤー中の第１培養液５×１ml、24時間／
28℃及び160r.p.m.）。 この500mlを同じ組成の培地50中に移し、
２個の平板パドル撹拌機／そらせ板を備えた培
養装置中で、空気1000／ｈ、500r.p.m.を用
い、28℃で更に培養させる。 10〜12時間の後に、Ｎ−メチル−ヒダントイ
ン−分解酵素の形成が開始し、これは、対数的
成長期の終りまで保持される。18時間の培養時
間の後に、収獲される。微生物を、冷却遠心分
離中で分離し、ビオマスを引続き0.1M燐酸塩
緩衝液（PH８）中で洗浄し、改めて、遠心分離
しかつ凍結させる。こうして、培養液50から
ビオマス約800ｇが得られた。 培地組成： 試料１：Na2HPO4×2H2O ７ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4×7H2O 0.5ｇ、Ｎ−メチル−ヒ
ダントイン（無菌濾過）10ｇ、酵母エキス／
Difco ５ｇ、少量溶液1*１ml、少量溶液2**
0.1ml、ビタミン溶液***（無菌濾過）１ml。 *少量溶液１＝MnCl2×4H2O 100mg、FeCl3
×6H2O 100ｇ、CaCl2×2H2O 100mgを再
蒸溜水100ml中に溶かし、滅菌する。培地
１当りこの溶液１ml。 **少量溶液２＝CuCl2×2H2O １mg、Cl2 ｌ
mg、（NH4）2M0O4 １mg、CoCl2×6H2O
１mgを再蒸溜水1000ml中に溶かし、滅菌す
る。培地１当りこの溶液0.1ml。 ***ビタミン溶液＝ビオチン0.1mg、ピリドキ
ソール0.1mg、ピリドキサン×HCl 0.1mg、
PABS0.1mg、リボフラビン1.0mg、ニコチ
ンアミド1.0mg、葉酸1.0mg、チアミン×
HCl10.0mgを再蒸溜水100ml中に溶かし、
無菌濾過する。培地１当りこの溶液１
ml。 (B) 洗浄した細胞（乾燥重量１Kg）を燐酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）50mM／中で、15にし、
高圧分散法で約600バール（atu¨）で溶解させ
る。細胞残分を分離する。澄明エキスは、
CSHを含有する。これに、10％ポリエチレン
イミン（Ｇ−35−）溶液（PH6.5）４％を加え
る。核酸の分離の後に、この酵素を水での稀釈
により沈殿させる。この少量の蛋白質沈殿を燐
酸カリウム緩衝液（PH6.5）50mM／中に入
れ、1.3M及び2.2M／の間で硫酸アンニウム
で分別する。引続く、フエニルセフアロースに
よる疎水性クロマトグラフイにより、サルコシ
ンオキシダーゼを完全に除去する。 減少性勾配の燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mモル／（硫酸アンモニウム1.0モル／、
燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）20mM／まで
を含有）において、CSHは硫酸アンモニウム
約0.4M／で溶離される。 この溶離液を、燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mM／に対して冷時に透析させ、同じ緩衝
液で平衡にしたカラム上にDE−52−セルロー
スと共に装入する。CSHを前記緩衝液での
NaCl50〜500mM／の増加性勾配により溶離
させる。溶離液を限外濾過により濃縮させる。 引続く、0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
（Sephacryl−Ｓ−200）中でのゲル濾過の後
に、CSHは53％収率でかつ2.1U／mgの特異活
性で得られる。酵素は、損失なしに、50％グリ
セリン溶液（PH6.5）中、＋４℃で６週間にわた
り貯蔵できる。 詳細を次表に示す。
【表】
【表】
例 ３（参考例）
例２(A)に記載と同様にＮ−メチルヒダントイン
上で培養した培養バツチモラキセラDSM2562
（BMTU2193−１）から、乾燥物質180ｇを得る。
このCSHを例１(B)と同様に精製する。但し、細
胞を高圧分散法の代りに、0.05％リゾチーム
（ｇ／ｇ乾燥物質）を用いて、PH7.0で溶解させ
る。
上で培養した培養バツチモラキセラDSM2562
（BMTU2193−１）から、乾燥物質180ｇを得る。
このCSHを例１(B)と同様に精製する。但し、細
胞を高圧分散法の代りに、0.05％リゾチーム
（ｇ／ｇ乾燥物質）を用いて、PH7.0で溶解させ
る。
【表】
例 ４（参考例）
ｏ−ジアニシジンを用いるCSHの測定原理：
溶液：
１ トリス緩衝液；0.1モル／（PH8.0）
２ オルト−ジアニシジン−溶液；ｏ−ジアニシ
ジン−塩酸塩66mgを緩衝液(1)10ml中に溶かす。 ３ 試験緩衝液；溶液199ml中に溶液21.0mlをピ
ペツト装入し、混合する。＋４℃で１週間保持
可能である。 ４ ペルオキシダーゼ：POD（BM 108090、純度
Ｉ）２mgをH2O １ml中に溶かす。 ５ サルコシン−オキシダーゼ：精製されたサル
コシンオキシダーゼ（ウリカーゼ及びカタラー
ゼ不含）100U／mlをH2O中に溶かす。 ６ Ｎ−カルバモイルサルコシン0.25モル／ 試料： 冷KPO4緩衝液（PH6.5）50mモル／で稀
釈。 実 施 436nm；25℃；Ｖ＝2.00ml；ｄ＝１cm；ε＝8.3
cm2×μモル-1×１ キユベツト中に、 緩衝液 (3) 1.80ml POD (4) 0.01ml サルコシンオキシダーゼ (5) 0.05ml カルバモイルサルコシン (6)0.10ml をピペツト装入し、混合し、約10分間待ち、次い
で、試料を用いて開始し、 試 料 0.04ml と混合し、10分間進行させ、直線相からＥ／min
を算出する： 計算：△Ｅ／min×２×稀釈度／8.3×使用試料ml＝
Ｕ／ml
ジン−塩酸塩66mgを緩衝液(1)10ml中に溶かす。 ３ 試験緩衝液；溶液199ml中に溶液21.0mlをピ
ペツト装入し、混合する。＋４℃で１週間保持
可能である。 ４ ペルオキシダーゼ：POD（BM 108090、純度
Ｉ）２mgをH2O １ml中に溶かす。 ５ サルコシン−オキシダーゼ：精製されたサル
コシンオキシダーゼ（ウリカーゼ及びカタラー
ゼ不含）100U／mlをH2O中に溶かす。 ６ Ｎ−カルバモイルサルコシン0.25モル／ 試料： 冷KPO4緩衝液（PH6.5）50mモル／で稀
釈。 実 施 436nm；25℃；Ｖ＝2.00ml；ｄ＝１cm；ε＝8.3
cm2×μモル-1×１ キユベツト中に、 緩衝液 (3) 1.80ml POD (4) 0.01ml サルコシンオキシダーゼ (5) 0.05ml カルバモイルサルコシン (6)0.10ml をピペツト装入し、混合し、約10分間待ち、次い
で、試料を用いて開始し、 試 料 0.04ml と混合し、10分間進行させ、直線相からＥ／min
を算出する： 計算：△Ｅ／min×２×稀釈度／8.3×使用試料ml＝
Ｕ／ml
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異的に複分
解するが、クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインを
複分解せず、＋４℃〜約40℃の作用適温範囲、安
定PH範囲６〜９及び0.1M K4P2O7緩衝液（PH8.5）
中のミハエリス定数5.0〜7.1×10-3Mを有し、メ
ルチオレートで阻害されるＮ−カルバモイルサル
コシン−アミドヒドロラーゼを用いて被測定物質
含有試料溶液をサルコシンに変じ、後者を測定す
ることを特徴とする、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ンの測定法。 ２ サルコシンオキシダーゼを用い、かつ生じる
H2O2又は消費されるC2を計測することによりサ
ルコシン測定を実施する、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ 変換を、緩衝溶液中、PH値６〜９で実施す
る、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。 ４ Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異的に複分
解するが、クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインを
複分解せず、＋４℃〜約40℃の作用適温範囲、安
定PH範囲６〜９及び0.1M K4P2O7緩衝液（PH8.5）
中のミハエリス定数5.0〜7.1×10-3Mを有し、メ
ルチオレートで阻害されるＮ−カルバモイルサル
コシン−アミドヒドロラーゼ、サルコシンオキシ
ダーゼ、H2O2測定系及びPH６〜９の緩衝液並び
に場合によつては界面活性剤を含有することを特
徴とする、Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE32481454 | 1982-12-27 | ||
| DE19823248145 DE3248145A1 (de) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59132891A JPS59132891A (ja) | 1984-07-31 |
| JPS639839B2 true JPS639839B2 (ja) | 1988-03-02 |
Family
ID=6181852
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58242347A Granted JPS59132891A (ja) | 1982-12-27 | 1983-12-23 | Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
| JP62196139A Granted JPS63102680A (ja) | 1982-12-27 | 1987-08-05 | Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ−ゼ及びその取得法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62196139A Granted JPS63102680A (ja) | 1982-12-27 | 1987-08-05 | Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ−ゼ及びその取得法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4645739A (ja) |
| EP (1) | EP0112571B1 (ja) |
| JP (2) | JPS59132891A (ja) |
| AT (1) | ATE28758T1 (ja) |
| AU (1) | AU545903B2 (ja) |
| CA (1) | CA1210675A (ja) |
| DD (2) | DD216255A5 (ja) |
| DE (2) | DE3248145A1 (ja) |
| DK (1) | DK173112B1 (ja) |
| ES (1) | ES8406541A1 (ja) |
| IE (1) | IE56346B1 (ja) |
| IL (1) | IL70529A (ja) |
| ZA (1) | ZA839522B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3406770A1 (de) * | 1984-02-24 | 1985-08-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung |
| US4812399A (en) * | 1986-04-21 | 1989-03-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for the determination of creatinine or creatine |
| DE3821077A1 (de) * | 1988-02-12 | 1989-08-24 | David Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE4029844A1 (de) * | 1990-09-20 | 1992-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
| DE4103220A1 (de) * | 1991-02-02 | 1992-08-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel |
| BR9600672A (pt) * | 1996-03-08 | 1997-12-30 | Dedini S A Administracao E Par | Processo de hidrólise ácido de material lignocelulósico e reator de hidrólise |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| JPS603480B2 (ja) * | 1980-11-10 | 1985-01-28 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニンおよびクレアチンの定量法 |
| IT1137075B (it) * | 1981-05-28 | 1986-09-03 | Chemical Lab S R L | Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione |
-
1982
- 1982-12-27 DE DE19823248145 patent/DE3248145A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-12-01 AU AU21870/83A patent/AU545903B2/en not_active Ceased
- 1983-12-05 IE IE2856/83A patent/IE56346B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-12-16 US US06/562,072 patent/US4645739A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-16 ES ES528117A patent/ES8406541A1/es not_active Expired
- 1983-12-22 DD DD83258475A patent/DD216255A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 IL IL70529A patent/IL70529A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 CA CA000444052A patent/CA1210675A/en not_active Expired
- 1983-12-22 DD DD83268005A patent/DD222631A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 ZA ZA839522A patent/ZA839522B/xx unknown
- 1983-12-22 DK DK198305925A patent/DK173112B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-12-23 JP JP58242347A patent/JPS59132891A/ja active Granted
- 1983-12-23 DE DE8383113075T patent/DE3372870D1/de not_active Expired
- 1983-12-23 EP EP83113075A patent/EP0112571B1/de not_active Expired
- 1983-12-23 AT AT83113075T patent/ATE28758T1/de not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-08-05 JP JP62196139A patent/JPS63102680A/ja active Granted
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| ZA839522B (en) | 1984-09-26 |
| US4645739A (en) | 1987-02-24 |
| IE56346B1 (en) | 1991-07-03 |
| IL70529A (en) | 1987-10-20 |
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| DD222631A5 (de) | 1985-05-22 |
| AU545903B2 (en) | 1985-08-08 |
| EP0112571A1 (de) | 1984-07-04 |
| IE832856L (en) | 1984-06-27 |
| CA1210675A (en) | 1986-09-02 |
| ES528117A0 (es) | 1984-08-01 |
| DK173112B1 (da) | 2000-01-31 |
| AU2187083A (en) | 1984-07-05 |
| ATE28758T1 (de) | 1987-08-15 |
| DK592583A (da) | 1984-06-28 |
| ES8406541A1 (es) | 1984-08-01 |
| DD216255A5 (de) | 1984-12-05 |
| JPS63102680A (ja) | 1988-05-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |