JPS6412280B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫吸着体の製造方法に関する。

生体物質の特異的な分離精製法において、免疫
学的原理に基づいて生体物質を分離することが活
発に研究、開発されている。生体にとつてまつた
く異質の物質（抗原）が生体に与えられたとき、
抗原と反応する物質（抗立）が生体内で作られ
る。抗原とそれに対応する抗体との反応を抗原抗
体反応といい、この反応は非常に特異的である。
この抗原抗体反応による特異性を分離精製法に利
用したのが免疫吸着法であり、たとえば生体の体
液中に存在する抗体（あるいは抗原）は、その抗
体（あるいは抗原）に対応する抗原（あるいは抗
体）と接触させることにより吸着、分離される。
このような方法においては、抗原が結合されるか
あるいは抗体が結合された吸着体を用いるのが、
抗原抗体結合物を遊離の抗原あるいは抗体より容
易に分離できるので有利である。抗原、抗体のよ
うな免疫反応性物質が結合された免疫吸着体の製
造法に関しては種々の方法が提案されている。た
とえばCampbellらは、水不溶性の固体に抗原を
結合させた免疫吸着体を作製した。すなわち、ジ
アゾ化したアミノベンジルセルロースに卵白アル
ブミンを固定化し、この吸着体を用いて抗卵白ア
ルブミン抗体の精製を行なつている。また、最近
では水不溶性固体としてブロムシアンにより活性
化した多糖類を用い、抗原あるいは抗体を結合す
る方法がよく行なわれている。これらの方法にお
いては水に不溶な固体としてセルロース、架橋デ
キストラン、アガロース、ナイロン、ポリアミノ
酸など表面に活性基を有するものあるいは高分子
反応などにより容易に活性基が導入できるものが
用いられている。

しかしながら、これらの方法は活性炭、シリコ
ーン樹脂など直接免液反応性物質を結合しうる活
性基を有せず、また高分子反応により活性基を導
入することも困難であるものにたいしては適用で
きないという欠点があつた。

本発明者らは、かかる現況にかんがみ、活性炭
やシリコーン樹脂などのように活性基を有しない
固体を含め、どのような固体にも免疫反応性物質
を結合できるような処理方法について鋭意研究し
た結果、本発明に到達したものである。

すなわち、本発明はアミノ基および／またはヒ
ドロキシル基と反応しうる官能基を少なくとも２
個有し、２個以上の官能基のうち少なくとも１個
がエポキシ基である試薬とキトサンとを固体表面
上にて反応させて該固体表面上にキトサン皮膜を
形成せしめ、しかるのち該キトサン皮膜と免疫反
応性物質とを結合させることを特徴とする免疫吸
着体の製造方法である。

本発明における固体表面としては、たとえば活
性炭、ガラス、アスベスト、雲母、カオリナイト
ベントナイト、ポリホスフアゼンなどの無機物質
表面、天然ゴム、タンパク質、でんぷん、セルロ
ース、コラーゲン、アガロース、デキストランな
どの天然高分子表面、ポリスチレン、ポリアミ
ド、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、シリコーン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアル
コール、ポリウレタンなどの合成高分子表面など
があげられる。

本発明に用いるアミノ基および／またはヒドロ
キシル基と反応しうる官能基を少なくとも２個有
し、２個以上の官能基のうち少なくとも１個がエ
ポキシ基である試薬（以下、エポキシ含有多官能
性試薬と称する。）としては、たとえば、テトラ
メチレングリコールのジグリシジルエーテル、ジ
エチレングリコールのジグリシジルエーテルなど
のポリエポキシド、エピクロルヒドリン，エピブ
ロモヒドリンなどのエポキシハラドなどがあげら
れる。

本発明に用いるキトサンとは、アミノ多糖類で
詳しくはβ−１，4′−ポリグルコサミンのことで
あり、天然のキチン（β−１，4′−ポリ−Ｎ−ア
セチル−グルコサミン）を脱アセチル化したもの
をいう。

本発明においては、まずこのキトサンとエポキ
シ基含有多官能性試薬とを反応させて固体表面上
にキトサン皮膜を形成させることが必要である。
この場合、本発明においてはキトサン皮膜上に末
反応のアミノ基あるいはイミノ基あるいはヒドロ
キシル基を残す必要があり、そのためエポキシ基
含有多官能性試薬のアミノ基および／またはヒド
ロキシル基と反応しうる官能基に対してキトサン
を過剰に用いることが必要である。

固体表面にキトサン皮膜を形成させるには、た
とえば固体表面をエポキシ基含有多官能性試薬溶
液と接触させてエポキシ基含有多官能性試薬を固
体表面上に吸着させ、しかるのち大過剰のキトサ
ン溶液と接触させて表面に吸着されたエポキシ基
含有多官能性試薬とキトサンとを反応させてもよ
いし、また大過剰のキトサン溶液を固体表面と接
触させて固体表面にキトサンを吸着させたのち、
希薄なエポキシ基含有多官能性試薬溶液で処理し
て固体表面にキトサン皮膜を形成させることもで
きる。

エポキシ基含有多官能性試薬あるいはキトサン
を溶解する溶媒としては、処理すべき固体を溶解
せず、かつエポキシ基含有多官能試薬に対して不
活性ならばどのような溶媒でもよく、必要ならば
溶媒に酸あるいはアルカリあるいは塩などを添加
してもさしつかえない。

エポキシ基含有多官能性試薬あるいはキトサン
の固体表面への吸着は０〜50℃の温度で、必要に
応じて表面を更新しながら行なうのが望ましい。
また、エポキシ基含有多官能性試薬とキトサンと
の反応は０〜150℃の温度にて必要に応じて酸、
塩基などの触媒、脱酸剤の存在下で行なうのが望
ましい。

本発明においては、ついで固体表面上に形成さ
れたキトサン膜と免疫反応性物質とを結合させる
ことが必要である。固体表面に形成されたキトサ
ン皮膜上のアミノ基あるいはイミノ基あるいはヒ
ドロキシル基と免疫反応性物質との反応は公知の
方法を用いて行なうことができる。たとえばＮ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カ
ーボジイミド メト−ｐ−トルエンスルホネー
ト、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カーボジイミド ハイドロクロライドなど
の脱水剤を用いてキトサン皮膜上のアミノ基と免
疫反応性物質のカルボキシル基とを縮合すること
ができる。さらに、前記のエポキシ基含有多官能
性試薬又はグルタルアルデヒド、テレフタルアル
デヒド、イソフタルアルデヒド、ジアルデヒド澱
粉などのポリアルデヒド、ヘキサメチレンジイソ
シアナート、トルエンジイソシアナート、キシレ
ンジイソシアナート、フエニレンジイソシアナー
ト、アニリン−ホルムアルデヒドのイソシアナー
ト誘導体などのポリイソシアナート、塩化アジポ
イル、塩化イソフタロイル、塩化テレフタロイ
ル、塩化シアヌクルなどの酸塩化物、ヘキサメチ
レンチオイソシアナートなどのポリチオイソシア
ナート、Ｎ，N′−エチレンビスヨードアセトア
ミド、Ｎ，N′−ヘキサメチレンヨードアセトア
ミドなどのＮ，N′−ポリメチレンビスヨードア
セトアミド、無水マレイン酸−メチルビニルエー
テル共重合体、無水マレイン酸−エチレン共重合
体、無水マレイン酸−スチレン共重合体などのポ
リカルボン酸無水物、ジビニルスルホン、ジビニ
ルケトンなどのジビニル化合物、Ｎ，Ｎ−エチレ
ンビスマレイミドなどのビスマレイミド、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，N′−ヘ
キサメチレンビスアクリルアミド、Ｎ，N′−ヘ
キサメチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，N′，
N″−トリアクリロイルヘキサヒドロトリアジン
などのポリ（メタ）アクリロイル化合物などのア
ミノ基および／またはヒドロキシル基を少なくと
も２固有する試薬を用いて皮膜上のアミノ基ある
いはイミノ基あるいはヒドロキシル基と免疫反応
性物質との間に結合を形成することができる。こ
のためには、まずキトサン皮膜上のアミノ基に対
して過剰量のアミノ基および／またはヒドロキシ
ル基と反応しうる官能基を少なくとも２個有する
試薬を反応せしめて、その試薬の一部の官能基を
未反応のまま残し、しかるのち未反応の官能基と
免疫反応性物質とを反応せしめればよい。未反応
の官能基と免疫反応性物質との反能は０〜80℃の
温度で行なうのが望ましい。

本発明の方法は、すべての免疫反応性物質に対
して適応できる。たとえば本発明に用いられる免
疫反応性物質としては腎臓の糸球体基底膜から取
り出した抗原、核抗原、タンパク性抗原、ハプテ
ン、酵素、ホルモン、細胞、ウイルス、細菌、ワ
クチンなどの抗原、肝炎の抗原に対する抗体、ｅ
抗体、アンジオテンシンに対する抗体、コーチゾ
ールに対する抗体などの抗体等があげられる。

本発明の方法は種々の形状の固体表面、たとえ
ば粉末、ビーズ、フイルム、皮膜、透過性膜、シ
ート、チユーブ、中空糸、繊維、布、編物などの
表面に適用できる。

本発明の方法により表面に免疫反応性物質を結
合せしめた免疫吸着体に、試料をカラム法あるい
はバツチ法により接触させることにより抗原、抗
体反応に基づき抗原や抗体を分離、精製すること
ができる。たとえば免疫反応性物質に抗原を用い
た免疫吸着体を使用すれば分離、精製される抗体
は免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免疫グ
ロブリンＭなどのクラスに関係なく抗体活性によ
る選別が行なわれる。

本発明においては、アミノ基とヒドロキシル基
の２つの官能基を有するキトサンを用いるので、
キトサンとエポキシ基含有多官能性試薬とにより
生成するキトサン皮膜は膜強度に優れ、高イオン
性溶液に対しても安定であつて、容易に固定表面
から剥がれることはない。

本発明により製造された免疫吸着体には多量の
免疫活性物質が結合しているので、この吸着体を
用いて免疫学的分離、精製および分析を行なう場
合に精度よく、かつ長時間持続して操作できると
同時に生体由来のキトサンを用いているため、毒
性の点からも免疫活性物質の安定性の点からも有
利である。

本発明の方法により製造した免疫吸着体は生体
物質の分離、精製はもとより、疾患の活動度、病
変の進行と密接な関係にある物質（抗原、抗原抗
体結合物など）を選択的に体液中から除去可能で
あるし、また抗原、抗体反応に基づく臨床検査の
測定等にも利用できる。このように本発明の方法
により製造した免疫吸着体は、医療、医薬、臨床
検査の分野にとくに有用である。

以下、実施例をあげて本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例 １ 粒径約0.8mmの活性炭30ｇを0.3％キトサン（酢
酸塩）水溶液600ml中に入れ、30℃で２時間撹拌
し活性炭にキトサンを吸着させたのち濾過し、水
洗の後この活性炭を１規定のカ性ソーダ溶液中に
数分間浸漬し、ついで十分に水洗し、減圧乾燥し
た。このようにして得られたキトサン吸着活性炭
10ｇを１％エピクロルヒドリンジオキサン溶液25
ml中に入れ、60℃で１時間撹拌したのち十分にジ
オキサンで洗浄して減圧乾燥した。このようにし
て表面にキトサン皮膜を形成せしめた活性炭５ｇ
を25％グルタールアルデヒド水溶液2.5mlを含む
0.05Mリン酸バツフアー（PH7.0）27.5ml溶液中に
入れ、20℃で２時間撹拌したのち活性炭を濾過
し、十分水洗した。この活性炭をヒト免疫グロブ
リン〔受身赤血球凝集反応法で抗体価１：32000
を示すHBs（Ｂ型肝炎）抗体含有グロブリン〕溶
液50ml中に入れ、20℃で２時間撹拌して反応させ
た。その後、濾過し1M Naclを含む0.05Mリン
酸バツフアー（PH7.0）で洗浄し水洗した後、１
％水素化ホウ素ナトリウム水溶液25mlで処理し、
ついで十分に水洗後、減圧乾燥して表面にヒト免
疫グロブリンが結合した活性炭を得た。この活性
炭に結合しているグロブリンの量をアミノ酸分析
法により定量したところグロブリンに比較的多い
アミノ酸であるグリシンを基準として0.26重量％
のグロブリンが活性炭表面に結合していた。

このヒト免疫グロブリンを結合せしめた活性炭
を逆受身赤血球凝集反応法（RPHA法）でHBs
抗原価１：8192を示す血球中に入れ、室温で１時
間撹拌ののち活性炭を除去した。

この血液のHBs抗原をRPHA法で測定したと
ころ陰性（１：2⁰）であつた。

比較のために、RPHA法でHBs抗原価１：
8192を示す上記と同じ血液にヒト免疫グロブリの
結合していない活性炭を入れて同様に操作した結
果、血液のHBs抗原価はRPHA法で１：8192で
あつた。

実施例 ２ 実施例１と同様に行ない表面にキトサン皮膜を
形成せしめた活性炭２ｇを25％グルタールアルデ
ヒド水溶液1.0mlを含む0.05Mリン酸バツフアー
（PH7.0）11ml溶液中に入れ、20℃で２時間撹拌の
のち活性炭を濾過し、十分水洗した。

この活性炭をＢ型肝炎ワクチン（RPHA法で
HBs抗原価１：32000）溶液20ml中に入れ、20℃
で２時間撹拌して反応させた。その後、濾過し
1M Naclを含む0.05Mリン酸バツフアー（PH7.0）
で洗浄し、ついで水洗した後、１％水素化ホウ素
ナトリウム水溶液10mlで処理し、再び水洗した
後、減圧乾燥して表面にＢ型肝炎ワクチンが結合
した活性炭を得た。

得られた活性炭を受身赤血球凝集反応法で抗体
価１：8000を示すHBs抗体含有グロブリン溶液
中に入れ、７℃で24時間撹拌ののち活性炭を濾過
し、ついで3Mヨウ化ナトリウムを含有したリン
酸バツフアーで洗浄した。この洗液のHBs抗体
価を受身赤血球凝集反応法で測定したところ１：
320000であつた。

実施例 ３ 厚さ300μ、直径15mmのシリコーン樹脂製デイ
スク10枚をアセトン、引き続き蒸留水により洗浄
したのち下記のように処理した。

(1) 0.5％キトサン（酢酸塩）水溶液100mlに入れ
室温で２時間振とうし、シリコーン・デイスク
にキトサンを吸着させたのち、シリコーン・デ
イスクを水洗し、１規定カ性ソーダ溶液中に数
分間浸漬後、十分水洗し減圧乾燥した。

(2) ついで、１％エピクロルヒドリンジオキサン
溶液100mlに入れ、60℃で１時間振とうした。
得られたデイスクをジオキサンで洗浄した後、
減圧乾燥した。

(3) ついで、無水マレイン酸−メチルビニルエー
テル共重合体４ｇをドライアライトにて脱水し
たアセトン50mlに溶解して得られる溶液中に室
温で振とうしながら１時間浸漬したのち脱水ア
セトンにて洗浄し、ついで減圧乾燥した。

(4) ついで、ヒト免疫グロブリンＧ（ヒトIgG）
に対するウサギの抗血清より調製された（抗ヒ
トIgG）IgG画分を含むリン酸バツフアー（PH
7.0）30ml中に浸漬して室温で一夜放置した後、
上記のリン酸バツフアーにて洗浄した。

上記のようにして得られた（抗ヒトIgG）IgG
が結合されたシリコーン・デイスクを希塩酸水溶
液を用いて40℃で１時間加水分解し、可溶化され
た（抗ヒトIgG）IgGをLowry法で比色したとこ
ろ、シリコーン・デイスク面積１cm²あたり12μｇ
の（抗ヒトIgG）IgGが結合していることがわか
つた。

比較のためキトサン処理をしなかつたシリコー
ン・デイスクを用いた場合は１cm²あたり2μｇの
IgGしか結合していなかつた。

なお、（抗ヒトIgG）IgGが結合されているシリ
コーン・デイスクはヒトIgGの測定に用いられ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アミノ基および／またはヒドロキシル基と反
   応しうる官能基を少なくとも２個有し、２個以上
   の官能基のうち少なくとも１個がエポキシ基であ
   る試薬とキトサンとを固体表面上にて反応させて
   該固体表面上にキトサン皮膜を形成せしめ、しか
   るのち該キトサン皮膜と免疫反応性物質とを結合
   させることを特徴とする免疫吸着体の製造方法。 ２ 免疫反応性物質が抗原である特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法。 ３ 免疫反応性物質が抗体である特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法。