JPS645876B2

JPS645876B2 -

Info

Publication number: JPS645876B2
Application number: JP8887984A
Authority: JP
Inventors: Atsuo Tanaka; Kenji Sonomoto; Akira Koshiro; Juzo Ozaki
Original assignee: Toyo Tire and Rubber Co Ltd
Current assignee: Toyo Tire Corp
Priority date: 1984-05-01
Filing date: 1984-05-01
Publication date: 1989-02-01
Also published as: JPS60232089A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業用の利用分野）本発明はイオン基を含有するポリウレタンエマ
ルジヨンによつて生体触媒類を固定化する方法に
関する。（従来の技術）酵素等の生体触媒類を固定化する方法として
は、無機担体としては、多孔性ガラス、金属水酸
化物、金属酸化物等があり、また、最近注目され
ている合成高分子担体としては、ポリアクリルア
マイド、ポリヒドロキシアルキルメタクリレー
ト、エチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ
スチレン、ナイロン、ポリイソブチレン等があ
り、固定化手段からみれば担体結合法、包括法、
架橋法等がある。また、担体が高分子の場合に
は、固定化に用いる出発物質の高分子化の程度に
よつてモノマー法、ポリマー法又はプレポリマー
法がある。これらは、目的物質の用途、生体触媒
の種類によつて適宜選定される。ポリウレタンを担体とする固定化方法は、例え
ば特公昭56−25118号、特公昭56−42908号に記載
がある。これらは親水性を有するポリウレタンプ
レポリマーを用いている。この場合の親水性付与
は、ポリオール成分中のエチレンオキサイドの含
有量を50％以上にすることによりもたらされる。この従来法のウレタンプレポリマーは、いわゆ
るNCO末端のウレタン中間体であるために、微
生物、酵素を固定化するに際し、包括固定するに
しても、この活性NCOが微生物、酵素の活性基
と反応して、化学的結合を起こしていることが推
測され、これによつて固定化後の微生物、酵素は
若干失活することとなる。これはやむを得ないこ
ととしても、微生物、酵素の本来の目的作用にお
けるその効果としては、これを低下させる原因は
極力排除されるべきであつて、これの改良として
本発明がなされたものである。（発明の目的）本発明の目的は微生物や酵素の失活をできるだ
け防止した、これら生体触媒類の固定化方法を提
供することにある。（発明の構成）本発明はイオン基含有ポリウレタンエマルジヨ
ンに生体触媒水溶液又は懸濁液に混合攪拌し、イ
オン基含有ポリウレタンエマルジヨン中に生体触
媒を混入させた後、水分等を除去して固定化する
ことを特徴とするポリウレタンエマルジヨンによ
る生体触媒類の固定化方法に係る。本発明のポリウレタンエマルジヨンは、その分
子中にアニオン又はカチオン性基を有しているた
めに親水性であつて、しかも自己乳化型エマルジ
ヨンであるために分散性が良好で、微生物、酵素
水溶液との親和性に優れているもので、微生物、
酵素の固定に好適である。カチオン性ウレタンエマルジヨンはウレタンポ
リマーの主鎖にカチオン基を導入したもので、こ
れらの製造は例えば特開昭55−52369等に記載さ
れている。これらは例えばイソシアネート化合
物、ポリオール化合物、３級アミノ基を含有する
鎖伸長剤から得られる反応生成物を溶液中で４級
化剤と反応せしめ、次いで溶剤と水との相転換を
図つて自己乳化型水系エマルジヨンとしたものが
主であるが、水中での反応によつて得るものもあ
る。またアニオン性ウレタンエマルジヨンはアニオ
ン基をポリマー鎖に導入したもので、アニオン基
導入の方法は例えば (1) 既にアニオン基をもつた両末端OH含有成分
をポリエステル中に組込んで、これとNCO成
分とを反応させてアニオン基を導入する方法
（特開昭56−135547号）、 (2) 鎖伸長剤としてイオン基形成基又はその塩と
なつたものを用いる方法（特公昭53−38760
号）、 (3) 鎖伸長剤としてポリアルキレンポリアミンを
使用し、後でラクトン、サルトンを作用させて
開環後、イオン基を形成させる方法（特開昭50
−55698号）、更に、 (4) ポリウレタン、ポリウレア又はポリウレタン
ウレア溶液にホルマリンと重亜硫酸ソーダを反
応させて得る方法（特公昭44−15436号）等が
ある。何れにしても、溶剤中での反応が一般的
であつて、反応完了後、１部又は全部の溶剤を
除去して水と相転換が図られる。上記の本発明のイオン基含有ウレタン系樹脂の
代表例を示すと、例えばEM−400、AF−1020
［以上、いずれも東洋ゴム工業(株)製］などを挙げ
ることができる。本発明においては上記イオン基含有ポリウレタ
ンエマルジヨンに生体触媒を混合攪拌して、目的
に適した形状に成形し乾燥することにより樹脂内
に包括固定を行うことができる。乾燥は通常約40
℃以下で行なうことができるるが、一般には室温
で行なうのが好ましい。また必要に応じて減圧下
に乾燥して皮膜化しても良い。形状としては特に
制限はなく、例えばガラス板、金属板などの表面
に塗布、流延もしくは積層し、或いは容器に充填
し、繊維状物体に含浸せしめるなど任意である。本発明の生体触媒としては例えば微生物、酵素
などを挙げることができる。微生物として糸状
菌、酵母などの真核細胞、細菌、放線菌などの原
始核細胞を例示できる。具体例を以下に示すが、
これらは１例に過ぎない。プロテウス・ブルガリ
ス、バチルス・ズブチリス、ストレプトマイセ
ス・リモサス、エシエリヒア・コリ、ラクトバチ
ルス・ブルガリス、アエロバクター・アエロゲネ
ス、アゾトバクター・ビネランデイなど。また酵素としては各種の加水分解酵素、転移酵
素、リアーゼ、シンターゼ、イソメラーゼ等を例
示できる。具体例を以下に示すが、これらは１例
に過ぎない。ウレアーゼ、リパーゼ、インベルタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ア
ミラーゼ、グリコースイソメラーゼ、ラクター
ゼ、アミノアシラーゼ、アスパルターゼ、ペニシ
リンアシダーゼなど。（実施例）以下に本発明の実施例を挙げて説明する。 (1) イオン化ウレタンエマルジヨン以下の方法により２種のイオン化ウレタンエ
マルジヨンを作成した。 EM400の製造例攪拌装置、温度計、還流冷却器を取り付けた２
リツトル容量のセパラブルフラスコに、ブチレン
アジペートジオール（分子量1000）160.0ｇ、ジ
フエニルメタンジイソシアネート150.0ｇを入れ、
70〜80℃で２時間加熱し、次いでメチルエチルケ
トン923ｇ、Ｎ−メチルジエタノールアミン31.0
ｇ、１，４−ブタンジオール12.6ｇを加え、メチ
ルエチルケトンの還流下で、IRスペクトルによ
り、NCOが認められなくなるまで加熱重合させ
る。重合終了後得られた粘調液を50℃に冷却し、
ジメチル硫酸27.8ｇを加え、50〜60℃に１時間加
熱し、４級化反応を完全に行わせる。のち水693
ｇを十分に攪拌しながら滴下し、滴下終了後メチ
ルエチルケトンを留去すると、乳白色のポリウレ
タンエマルジヨンが得られる。得られたエマルジヨンの固形分は40％、粘度は
120cps（25℃）、PHは5.5であつた。 AE−1020の製造例攪拌装置、温度計、還流冷却器を取り付けた２
リツトル容量のセパラブルフラスコに、ブチレン
アジペートジオール（分子量2000）48.0ｇ、ブチ
レンアジペートジオール（分子量1000）120.0ｇ、
ポリオキシエチレングリコール（分子量4000）
76.8ｇ、ジフエニルメタンジイソシアネート90.0
ｇを入れ、70〜80℃で２時間加熱し、次いで５−
ナトリウムスルホービス（β−ヒドロキシエチ
ル）イソフタレート18.0ｇ、エチレングリコール
7.7ｇ、ジメチルホルムアミド25.7ｇの溶液を加
え、ジブチル錫ジラウレート0.09ｇを加えて、80
℃で反応させる。粘度が上昇してきたときにメチ
ルエチルケトンを540ｇ加え、IRスペクトルNCO
基が認められなくなるまで加熱し重合させる。重
合終了後、水770ｇを十分に攪拌しながら添加し、
滴下終了後メチルエチルケトンを留去すると、乳
白色のポリウレタンエマルジヨンが得られる。得られたエマルジヨンの固形分は30％、粘度は
650cps（25℃）、PHは6.5であつた。実施例１（酵素の固定化−カチオン性エマルジヨン） 10mlのビーカーにリパーゼOF360［名糖産業(株)
製］30mlを脱イオン水１ｇに溶解する。この溶液
とEM−400（0.5ｇ）を混合し、12時間放置し風乾
する。このゲル片を５mm立方に切断し、反応に供
した。（反応） 100mlの共栓付三角フラスコに、水20ｇ、オリ
ーブ油20ｇ及び上記の固定化酵素を入れ30℃の恒
温水槽内で、160回／分の往復振とうを行つた。（定量法）反応液約１mlを採取し、10分間煮沸した後、遠
心分離操作により、油分と水分とを完全に分け
る。油分の一部を50mlの三角フラスコに採り（そ
の重量sg）、中性のエタノール・エーテル混合液
（容量比、エタノール／エーテル＝2/3）10mlを加
える。これをフエノールフタレインを指示薬とし
て0.05N−KOH（アルコール性）で滴定（滴定量
ａml）する。加水分解率＝ａ×ｆ＋2.8054／ｓ×202.2として求める
。ｆ：0.05N−KOHの力価 2.8054：１リツトル中のKOHの量（ｇ） 202.8：オリーブ油のケン化価加水分解率と反応時間の関係を第１図に示す。実施例２ EM−400の代りに、アニオン性エマルジヨン
であるAE−1020を使用した他は、実施例１同様
にしてリパーゼを固定化し、以下同様に反応及び
定量を行つた。加水分解率と反応時間の関係を第
２図に示す。比較例１イオン化ウレタンエマルジヨンの代りに、ウレ
タンプレポリマー用を用いた例を示す。 10mlのビーカーにリパーゼOF360「名糖産業(株)
製］30mlを採り、脱イオン水１ｇで溶解する。こ
の溶液にPU−３（0.5ｇ）を入れ、すばやく混合
し、反応させ固定化ゲルを得た。これを５mm立方
に切断し、酵素固定化物を得た。これを反応に供
した。その結果は第３図に示す。（注１） PU−３トリレンジイソシアネート、（TDI）とポリオ
キサエチレンポリオキシプロピレンポリオールか
ら得られたNCO末端プレポリマーであり、ポリ
エーテルポリオールの平均分子量2529、ポリエー
テルポリオール中のエチレングリコール含量は57
％である。尚、実施例１〜２及び比較例１において、加水
分解率0.9に到達する時間を第１表に示した。実施例３（菌体の固定化−カチオン性エマルジヨン）放線菌としてストレプトマイセス・リモサス
（ATCC10970）を使用し、これを下記培養用液体
培地に２％の寒天を含んだPH7.3の培養用ストラ
ント培地において増殖させる。次にこの増殖した菌体の２白金耳量を、予備培
養用培地としての酵母エキス（１ｇ）、肉エキス
（１ｇ）、NZアミン［和光純薬(株)製］（タイプＡ、
２ｇ）、グルコース（10ｇ）を脱イオン水（１リ
ツトル）に溶かした液体培地100mlに接種して予
備培養液を得る。次に、イオン化ウレタンエマル
ジヨンEM−400を120℃で10分間加熱滅菌し、こ
れに上記の予備培養液２mlをすばやく混合し、室
温で一昼夜風乾して得られた固定ゲルを５mm立方
に切つた。得られたゲル片を0.85％食塩水で十分
に洗浄し、100mlの上記液体培地に入れて、30℃、
220回転／分の条件下で本培養した。培養液中の
オキシテトラサイクリン（OTC）の濃度を時間
の経過と共に測定し、その結果を第２表に示し
た。実施例４（菌体の固定化−アニオン性エマルジヨン） EM−400の代りにAE−1020を用いた以外は実
施例３と同様にして実験を行つた。結果を第２表
に示す。（注２） OTCの定量は次のようにして行つた。
即ち培養液を拡散法（ロ紙デイスク寒天平板
法）を用いてその抗菌活性から定量した。 (1) 試験菌 Bacillus cereus var mycoides（ATCC
11778） (2) 試験培地感性デイスク用培地−Ｎ［日本製薬(株)］を使
用した。115℃で15分間高圧蒸気滅菌後、静か
に攪拌して40mlずつニツスイ角シヤーレ滅菌２
号［日水製薬(株)］に分注した。 (3) 接種法スラント培地より１白金耳量の菌体を試験寒
天培地上に接種し、直径３〜５mmのガラスビー
ズを用いて菌体を一様に広げた。 (4) ロ紙デイスクワツトマン抗生物質検定用口紙AAデイスク
６mm。 (5) 測定法ロ紙デイスクを標準溶液あるいは被検溶液に
浸し、余分な液をとつて試験寒天培地上に置い
た。30℃で一昼夜静置後、デイスクの周囲に生
じた透明な阻止円の直径をノギスを使つて測定
した。標準OTCを使つて、OTC濃度の対数と
阻止円直径との関係を求め、培養液中のOTC
の濃度度を計算した。第１〜３図及び第１〜２表から次のことが判
る。 (1) オリーブの加水分解率の測定では、カチオン
性ウレタンエマルジヨン、アニオン性ウレタン
エマルジヨン、ウレタンプレポリマーの順で低
下しており、イオン性エマルジヨンの固定化酵
素が優れていることが判る。 (2) OTC生産性は高く、特にカチオン性エマル
ジヨンタイプのEM−400で最大生産量を示し
た。 (3) 一般に菌体の場合、繰返し使用することによ
りOTC生産は向上した。 (4) イオン性ウレタン樹脂で固定化した菌体は、
明らかにゲル中で増殖していくことが肉眼観察
された。これは両者の生体適合性がすぐれてい
ることを示す。 (5) ウレタン樹脂固定化菌体は繰り返し使用する
ことによつて、ゲルからの菌体の漏出が少なく
なつていくことが観察された。特にイオン性エ
マルジヨンタイプのものは、殆んど菌体の漏れ
がなかつた。すなわち、菌体の固定化物を0.85
％食塩水で充分洗浄し、その洗浄液を採取し (a) この液の濁度を可視スペクトルにて測定す
る。 (b) この液を培地へ接種し、菌体の培養を行
い、菌の生存を調べる。この両者の方法共に、菌の存在は認められなか
つた。従つて漏出菌体はないと考えられる。（発明の効果）本発明の方法による酵素、菌体等の聖体触媒の
固定化効率は高く、特に菌体を繰り返し使用する
ことにより、その生産性は一層向上する。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１〜３図はそれぞれ実施例１〜２及び比較例
１における加水分解率と反応時間の関係を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１イオン基含有ポリウレタンエマルジヨンに生
体触媒水溶液又は懸濁液を混合攪拌して、イオン
基含有ポリウレタンエマルジヨン中に生体触媒を
混入させた後、水分等を除去して固定化すること
を特徴とするポリウレタンエマルジヨンによる生
体触媒類の固定化方法。２イオン基として陽イオンを有するポリウレタ
ンエマルジヨンを用いる請求の範囲第１項に記載
の方法。